CS259200B1 - Kmen mikroorganismu Streptomyces aureofaciens CCM 3978 - Google Patents

Description

Vynález ee týká kmene mikroorganismu Streptomyces aureofaciens CCM 3978 /interní označení R 8/26 / vyznačujícího ee zvýšenou produkcí chlortetracyklinu /CTC/ a zvýSeným poměrem chlortetracyklinu k tetracyklinu /TC/, přičemž je odolný vůči infekci aktinofégy při zachování stability vlastností po řadu generací·

Zvýšení průmyslové výroby antibiotika chlortetracyklinu je možné dvěma způsoby: rozšiřováním výrobních fermentačních provozů, což vyžaduje velké investiční náklady, a zvyšováním výtěžnosti fermentace, která je založena buS na vyšší produkční schopnosti kmenů používaných pro biosyntézu/nebo na lepších fermentačních podmínkách vyplývajících z dokonalejšího řízení fermentace.

Jednou z možností je nalezení, výběr nebo vyšlechtění nového produkčního kmene, který by na půdě obvyklého složení, v běžném zařízení a bez náročných zásahů do průběhu fermentace produkoval chlortetracyklin ve vyšěích výtěžcích než dosud a rovněž v příznivějším poměru k tetracyklinu, který vzniká současně. Pro’ rozšíření výroby bez investičních nákladů je významným činitelem šlechtění produkčních kmenů. Hlavním ukazatelem efektu šlechtění je vzestup celkového množství chlortetracyklinu na jednotlcu objemu fermentace za jednotku času. Kmen je potřeba posuzovat i z dalších hledisek; především podle odolnosti vůči působení aktinofágů, dále podle schopnosti růstu a sporulace na syntetických a přírodních substrátech, rychlosti růstu kmene a jeho odolnosti vůči mechanickému namáhání mycelia v průběhu fermentace.

Uvedených cílů se podařilo dosáhnout novým kmenem Streptomyces aureofaciens podle vynálezu, označeným R 8/26, uloženým v Čs. sbírce mikroorganismů UJEP, Brno, tř.Obránců míru 10, pod Číslem CCM 3978

Kmen podle vynálezu byl získán z kmene Streptomyces aureofaciens CCM 3766 následujícím způsobem:

S.aureofaciens CCM 3766 /interní označení 5/211 / i

S.aureofaciens 5/211-84

I

S.aureofaciens R 8/26

Sporová suspenze kmene Streptomyces aureofaciens CCM 3766 byla bez selekčního tlaku vyseta na ztužené sporulační médium. Vybrané kolonie byly přeočkovány na šikmé agary se sporulačním médiem a testovány na produkční aktivitu následovně:

sporová suspenze

I vegetativní inokulum

I fermentace

Takto byl získán kmen Streptomyces aureofaciens 5/211-84. Tento kmen byl kultivován v kapalném inokulačním médiu s přídavkem fágového lyzátu 48 hodin. Získané fágorezistentní partikule byly potom, přeočkovány do kapalného inokulačního média s přídavkem konečného metabolitu /chlortetracyklinu/ v optimální koncentraci a kultivovány další 24 hodiny. Obekultivace byly prováděny na rotačním třepacím stroji při rychlosti 230 otáček za minutu, s výstředníkem 25 mm, teplota kultivace byla 29°C.

Z takto získané populace byl odebrán vzorek, zředěn v destilované vodě dekadickou řadou a vyset na ztužené nesporulační médium s cílem získat izolované kolonie. Tyto byly po pětidenní kultivaci při 29°C hodnoceny vizuálně a vybřané kolonie byly přeočkovány kovovou špachtlí na ztužené sporulační médium. Získané izoláty s dobrou sporulací byly dále hodnoceny fermentačně á byla stanovována výše produkce. Izoláty s vyšší produkcí CTC než poskytuje původní kmen Streptomyces aureofaciens CCM 3766 byly zakonzervovány v kapalném dusíku a po oživení opět testo259200

- 3 vány na výši produkce antibiotika již uvedeným způsobem, Produkčně vyhovující izoláty byly dále testovány na schopnost růstu a sporulace na přírodním substrátu /loupaném prose/ a opět hodnoceny na výši produkce chlortetracyklinu a procentuelní zastoupení chlortetracyklinu a tetracykliňu. Dále byly tyto izoláty posuzovány podle odolnosti vůči infekci aktinofágem, rychlosti růstu a odolnosti mycelia vůči mechanickému namáhání* Tímto způsobem byl získán.kmen podle vynálezu Streptomycee au* reofaciens CCM 3978 <

Kmen Streptomyces aureofaciens CCM 3978 tvoří na ztuženém eporulačním médiu okrouhlé kolonie se zvrásněným středem, které pigmentují tmavohnědě a tmavošedě sporulují. Růst kmene je na ztužených i kapalných mediích rychlejší než růst výchozího kmene Streptomyces aureofaciens CCM 3766, Odolnost kmene vůči infekci směsí aktinofágů je nejméně 95%. Kmen podle vynálezu produkuje chlortetracyklin v množství o 10 až 15 % větším v porovnání s kmenem Streptomyces aureofaciens CCM 3766, a rovněž procentuelní zastoupení chlortetracyklinu a tetracykliňu ve fermentační směsi je u kmene podle vynálezu mnohem příznivější.

Příklad 1 '

Permentace v laboratorním měřítku

A/ Příprava vegetativního inokula

Vegetativní inokulum se připravuje v 500 ml varných Baňkách s 80 ml inokulačního média, které obsahuje tyto základní živiny: sacharózu jako zdroj uhlíku, sojovou mouku, kukuřičný výluh a síran amonný jako zdroje dusíku, dále uhličitan vápenatý a chlorid sodný. Médium se zaočkuje sporami z třetiny povrchu šikmého agaru /případně odpovídajícím množstvím spor z povrchu Petriho misky nebo sporami z prosné konzervy/. Kultivace probíhá 29 hodin na rotačním třepacím stroji s rychlostí otáček 230 za miríútu, s výstředníkem 25 mm. Kultivační teplota je 29°C.

B/ Příprava chráněného vegetativního inokula

Při tomto způsobu přípravy vegetativního inokula je inokulum chráněno proti nežádoucím kontaminacím konečným metabo259200

- 4 litem /chlortetracyklinem/. Kultivační médium se připravuje v 500 ml varných baňkách a obsahuje: dextrin bílý jako zdroj uhlíku, yeast extract a močovinu jako zdroje dusíku, dále síran hořečnátý a síran železnatý a chlorid sodný. Baňky jsou plněny 50 ml média, ke kterému se dále přidává chlortetracyklin v koncentraci 10 až 50 ^ug/ml. Kultivace probíhá 48 hodin na rotačním ' třepacím stroji s rychlostí 230 otáček za minutu, s výstředníkem 25 mm, při 29°C. Potom jsou pomocí 1 ml obsahu těchto baněk zaočkovány baňky s inokulačním médiem uvedeným výše. Při tomto^způsobu chránění inokula nedochází k poklesu produkční aktivity kmene, ani ke zhoršení jiných parametrů důležitých při fermentaci.

C/ Produkční hodnocení fágorezistentního kmene podle vynálezu Laboratorní fermentace„probíhá v 500 ml varných baňkách se 40 ml produkčního média, které obsahuje sacharózu jako zdroj uhlíku, sojovou mouku, kukuřičnou mouku, kukuřičný výluh a sí-. ran amonný jako zdroj dusíku, dále uhličitan vápenatý, chlorid sodný a ostatní anorganické soli potřebných stopových prvků.

Na začátku fermentace se do média přidává benzylrhodanid v ojptimální koncentraci. Baňky se zaočkují 10% narostlého inokula. Kultivace probíhá za stejných podmínek jako v případě A. Vzorky pro stanovení celkového obsahu tetracyklinů jsou odebírány v 91. a 115. hodině kultivace. Stanovení celkového obsahu tetracyklinů a samotného chlortetracyklinu probíhá tak, že v 8 ml 6% kyselinyr šťavelové se promíchají 4 ml odebraného vzorku. Po 30 minutách stání je stanoven celkový obsah tetracyklinů fosforečnanovou metodou. Poměr zastoupení chlortetracyklinu a tetracyklinu je určen papírovou chromatografií.

Výše uvedeným způsobem Se dosahují produkce 5800 až 6000/ig chlortetracyklinu na 1 ml média v laboratorním měřítku. Pří aplikaci do výrobního měřítka je dosahováno kmenem podle vynálezu přibližně 15000yug CTC na 1 ml média za 130 kultivačních hodin.

Příklad 2

Příprava vegetativního inokula i fermentace jsou prováděny obdobně jako v příkladě 1, s tím rozdílem, že probíhají ve

- 5 velkoobjemové aparatuře. Inokulum se připravuje v tanku.s objemem 5 m , který je naplněn 3 m inokulačního média. Vegetativním inokulem se očkuje produkční médium ve fermentoru s objemem 50 nP, který je plněn 29 m^ produkčního média. Při udržování koncentrační hladiny amonných iontů, sacharózy a pH je dosahováno v běžném fermentačním cyklu 12000 až 14000/ug chlortetracyklinu na 1 ml média. V případě prodlouženého fermentačního cyklu na 130 hodin pokračuje produkční rychlost kme°ne podle vynálezu lineárně.

Claims (1)

1. Kmen mikroorganismu Streptomyces aureofaciens CCM 3978 se zvýšenou produkcí chlortetracyklinu a zvýšeným poměrem chlortetracyklinu k tetracyklinu, přičemž je odolný vůči infekci aktinofágy.