CS249368B1 - Method of pearls detran materials production for gel chromatography - Google Patents

Description

249368

Vynález se týká způsobu výroby perlových dextranových materiálů pro gelovou chromato- grafii.

Je známo několik druhů materiálů pro gelovou chromatografii. Mezi nimi mají významnémísto materiály na bázi dextranu, které se komerčně dodávají a běžně používají již déle než15 let. Tyto materiály, tvořené částečkami kulovitého tvaru, jsou dodávány v řadě, jejížčleny mají definované vlastnosti, které jsou kvantitativně odstupňovány. Základní důležitouvlastností je zejména hustota sítování, která ovlivňuje velikost pórů, což se projeví přiaplikaci jako takzvaná vylučovací mez, to je molekulová hmotnost látek, které již nemohoupronikat dovnitř částic. S hustotou sítování souvisí rovněž botnavost, která se udává bud jako zádrž vody v mlvody odstředěném vzorku, připadajícím na 1 g sušiny, nebo jako objem vrstvy, což je objem,který zaujme 1 g suchého vzorku po rovnovážném nabotnání. Tyto vlastnosti leží u používanýcha dodávaných gelů v širokém rozmezí molekulových hmotností 700 až 200 000 u vylučovacíchmezí a v rozsahu 1 až 20 ml/g u zádrže vody.

Další důležitou vlastností těchto materiálů je jejich chemická čistota, zvláště pak ne-přítomnost ionogenních skupin, zejména karboxylových, které by jinak způsobovaly nežádoucísorpce a tím snižovaly účinnost gelově chromatografického dělení.

Dextranové gely se vyrábějí způsobem, který je známý a je chráněn patenty. V základnímpatentu NSR 1 292 883 (1969) se popisuje použití sítovaných dextranových gelů, vzniklýchreakcí s l-chlor-2,3-epoxypropanem v bloku, hotový gel se rozdrtí, promyje a rozdělí nasítech na žádané zrnění a je tvořen částicemi nepravidelného tvaru. Podle následného patentuBrit. 974 054 (1964) se v suspenzním procesu připravují perlové dextranové gely, kde vzni-kají částice dokonalého kulového tvaru. Přitom se v typickém pokusu rozpustí dextran vevodě, přidá se roztok hydroxidu sodného a směs se disperguje ve vhodné s'vodou nemfsitelnékapalině, s výhodou v toluenu nebo v dichloretanu, za přídavku stabilizátoru, zahřívánímza přítomnosti sítovadla se částečky zesítují, načež se vzniklý gel izoluje, promyje, odbot-ná a vysuší. Podle jiného analogického postupu (D. Stojanovič, D. Cvetkovič, B. Pekič, S. Jovanovič: Hem. Ind. 33 (1979) 139) se jako disperzní prostředí používá minerální olej. V dalším postupu (Brit. Pat. 1 087 964 - 1967) je disperzním prostředím přebytečný 1-chlor--2,3-epoxypropan, který funguje zároveň jako sítovadlo.

Tyto známé postupy mají však určité nevýhody. Použití minerálního oleje způsobí obtížepři praní a čištění produktu. Při sítování v přebytku l-chlor-2,3-epoxypropanu je třebaomezit jednostrannou reakci, která dává vzniknout visícím glycidylovým a glycerylovým sku-pinám. Kromě toho dextran použitý jako surovina pravidelně obsahuje laktony v množství okolo20 až 50 umol/g sušiny. Tyto laktony se během přípravy gelů v alkalickém prostředí hydroly-zují, a to má za následek, že výsledný gel obsahuje odpovídající množství volných karboxylú.

Další nevýhodou popsaných způsobů je, že se obtížně dosahuje požadované hustoty síto-vání. U vzorků připravených za jinak konstantních podmínek se ukazuje, že závislost zádrževody na poměru reagujících komponent, to je množství sítovadla k množství dextranu, má cha-rakteristický parabolický průběh. Příkladem mohou sloužit data pro výchozí koncentraci dex-tranu 40 %, uvedená v následující tabulce. g l-chlor-2,3-epoxypropanuna 100 g dextranu 7,4 8,0 8,6 12,0 17,7 25,1 zádrž vody ml/g sušiny 13,3 10,9 8,7 5,6 3,6 3,3 Z těchto údajů je vidět, že v oblasti řídce zesítěných gelů (zádrž vody 10 až 20 ml/g)je tato závislost velmi strmá. Důsledkem toho je, že vedení suspenzního procesu, při kterémprobíhá sítování, je velmi citlivé na malé náhodné změny v navážkách a v dodržování teplot- 3 249368 ního i míchacího režimu a rovněž v kvalitě suroviny. Dochází často k nereprodukovatelným vý-sledkům, zejména v hustotě sítování produktů. Nezřídka se várka zkazí například tím, že ne-dojde k úplnému zesítění ve standardní reakční době a při zpracování se pak suroviny znehod-notí.

Také na opačné straně užitečného rozsahu hustoty sítování, v oblasti zádrže vody 1 až1,5 ml/g, je příprava podle známých postupů spojena s obtížemi. Ani velký přebytek 1-chlor--2>J-epoxypropanu sám o sobě nestačí, je nutno zpracovávat velmi koncentrované roztoky dex-tranu. Přitom nastávají závažné potíže technického rázu. Není snadné připravit roztok dextra-nu o koncentraci 60 % hmot. Je k tomu třeba speciální zařízení typu hnětače, rozpouštěnía homogenizace roztoku trvá značnou dobu, narůstá spotřeba energie a někdy dochází ke sníženíkvality suroviny. Koncentrované dextranové roztoky mají velkou viskozitu, a to přináší dalšíobtíže při jejich dispergaci. Překvapivě bylo zjištěno, že tyto nevýhody se dají poměrně snadno obejít způsobem podlevynálezu. Předmětem vynálezu je způsob výroby perlových dextranových materiálů pro gelovou chro-matografii v suspenzním procesu, kde se alkalický roztok dextranu ve vodě nejprve suspendujeve s ním nemísitelné kapalině obsahující stabilizátor suspenze a případně ještě povrchověaktivní činidlo, na suspenzi se pak působí epichlorhydrinem při zvýšené teplotě a vzniklýperlový gel se promyje a vysuší, vyznačený tím, že se roztok dextranu před nebo během suspenzního procesu podrobí redukci v alkalickém prostředí působením natriumborohydridu v množství0,1 až 30 g činidla na 1 kg dextranu a že se požadovaná zádrž vody hotového produktu řídíkoncentrací výchozího roztoku dextranu, která je v rozsahu 5 až 70 % hmot., přičemž se vznik-lý gel případně podrobí ještě dostatečnému sířování. S výhodou se použije natriumborohydrid v množství 2 až 10 g na 1 g dextranu. Může sepostupovat tak, že se po redukci dextran izoluje a výchozí roztok pro suspenzní proces sepřipraví z tohoto izolovaného redukovaného dextranu. Nebo se po redukci dextran neizolujea redukovaný roztok se použije přímo v suspenzním procesu, případně se redukce natriumboro-hydridem dokončí až při vlastním suspenzním sítování.

Vynález využívá toho, že karboxyly ve formě laktonů je možno snadno redukovat natrium-borohydridem. Experimentálně bylo prokázáno, že ani v složitém suspenzním systému není tatoreakce brzděna a že se obsah karboxylů tímto způsobem sníží na hodnotu 2 až 6 umol/g sušiny.Je ovšem možno provést také redukci před započetím suspenzního procesu, tedy přidat k roz-puštěnému dextranu hydroxid sodný a natriumborohydrid a začít se suspenzním sítováním až podokončené redukci a nebo je možno vycházet přímo z takzvaného hydrogenového dextranu, to jemateriálu, který byl redukován předem a izolován. Také různé kombinace těchto způsobů vedouke stejnému cíli.

Například je také možno v první fázi redukovat hlavní množství a redukci dokončit přisuspenzním sítování. K řízení hustoty sířování v oblasti malých hustot, charakterizovaných zádrží vody v roz-sahu 10 až 20 ml/g je vhodné vycházet ze zředěných roztoků dextranu v koncentraci 5 až 20 %hmot. Ukázalo se, Že poměr sířovadla k dextranu nutný k dosažení stejné zádrže vody, závisísilně na koncentraci dextranu ve výchozím roztoku o koncentraci 40 % l-chlor-2,3-epoxypropanv množství 8,6 g/100 g dextranu, při 30% koncentraci 16 a při 25% koncentraci již 27 g 1--chlor-2,3-epoxypropanu/100 g dextranu. Při použití roztoků o nižší koncentraci se tedy do-stáváme v parabolické závislosti, jaká byla popsána dříve, do oblasti ustálené, kde malázměna podmínek vyvolává jen malou změnu v procesu i v kvalitě produktu. Tím se odstraní jižuvedené nevýhody, navíc se poněkud zvýší výtěžek tím, že se zmenší extrahovatelný podíl ataké následné zpracování produktu, promývání, odbotnání a sušení, se usnadní. V oblasti velkých hustot sířování, to je při přípravě gelů se zádrží vody 0,8 až 2 ml/g 249368 4 se nevýhody známých postupů odstraní podle 'Vynálezu tak, že se pracuje ve dvou stupních. Nej-prve se připraví gel o střední hustotě sítování, se zádrži vody v rozmezí 2 až 7 ml/g a tense v následující operaci znovu suspenduje, podrobí dodatečnému sítování, izoluje, promyje,odbotná a vysuší. Výhodou tohoto postupu je, že odstraňuje práci s velmi koncentrovanýmiroztoky dextranu. Umožňuje rovněž hodnotit neúspěšné šarže, které v prvním stupni neposkytlygely o očekávané zádrži vody. Přitom reakce ve druhém stupni není již tak náročná jako vestupni prvém. Již hotové pevné částice nemají tendenci se slepovat, takže není třeba užívatstabilizátorů, pracuje se s výhodnějším fázovým poměrem. Důkladné praní produktů se provádíjen jednou, a to až po druhém stupni. V dalším je vynález ilustrován několika příklady provedení. Příklad 1 100 g dextranu bylo rozpuštěno v roztoku 11,8'g hydroxidu sodného v 390· ml převařenédestilované vody, k roztoku bylo přidáno 1 g práškového natriumborohydridu a směs ponechánav klidu 2 hodiny. Do reaktoru opatřeného temperačním pláštěm a kotvovým míchadlem bylo vlo-ženo 1 000 ml toluenu obsahujících 30 g póly(vinylacetátu) a 3 g kyseliny olejové. Za míchánipři 500 ot/min byl pomalu přidáván roztok dextranu. Pak byla během 30 minut teplota zvýšenana 50 °C,.bylo přidáno 59 g l-chlor-2,3-epoxypropanu a směs byla míchána při 50 °C po dobu16 hodin. Po ochlazení byl produkt oddělen dekantací a promyt pokaždé třikrát postupně tolu-enem, ethanolem a vodou, zneutralizován titrací zředěnou kyselinou sírovou a promyt ještědvakrát vodou. Po odbotnání v ethanolu a vysušení byl získán perlový dextranový gel ozrnění50 až 300 um, zádrži vody 15 ml/g. Titrační stanoveni karboxylů poskytlo hodnotu 4,2 umol/g. Příklad 2 100 g dextranu bylo zpracováno stejně jako v příkladu 1. K redukovanému roztoku bylovšak po dvou hodinách přidáno ještě 0,2 g natriumborohydridu, načež byl dispergován a zpra-cován stejně jako v příkladu 1, avšak množství l-chlor-2,3-epoxypropanu činilo pouze 30 g.Vysušený perlový gel měl zrnění 50 až 300 um, zádrž vody 22 ml/g a obsah karboxylů 2,5 umol/g. Příklad 3 , 100 g dextranu bylo rozpuštěno v 150 ml vodného roztoku obsahujícího 11,8 g hydroxidu sodného. Potom bylo k roztoku přidáno 0,8 g natriumborohydridu a roztok byl ihned dispergovánv 500 ml toluenu s 10 g rozpuštěného póly(vinylacetátu). Po 1 hodině bylo k míchané směsipřidáno při 50 °C 25 g l-chlor-2,3-epoxypropanu. Další postup byl stejný jako v příkladu 1,vysušený perlový gel měl zrnění 100 až 1 000 um, zádrž vody 3,3 ml/g a obsah karboxylů3,5'umol/g. Přikládá

Provedení bylo analogické jako v příkladu 3, ale bylo použito předem redukovanéhodextranu. Na rozpuštění 100 g dextranu bylo použito 11,8 g hydroxidu sodného v 140 ml vodya roztok dispergován v 500 ml toluenu s přísadou 10 g póly(vinylacetátu) a 1 g cdejové kyse-liny, po 30 minutách bylo při 50 °C přidáno 25 g l-chlor-2,3-epoxypropanu. Postupem popsanýmv příkladu 1 byl získán suchý perlový gel o zrnění 50 až 600 um, zádrži vody 3,4 ml/g a obsa-hu karboxylů 5,0 um/g. Příklad 5 100 g předem redukovaného dextranu bylo rozpuštěno v roztoku 22 g hydroxidu sodnéhov 380 ml převařené destilované vody. K dispergaci bylo použito 1 1 toluenu s 30 g póly(vinyl-acetátu) a 3 g olejové kyseliny a k sítování 41 g l-chlor-2,3-epoxypropanu. Jinak bylo postu-pováno zcela analogicky jako v přikladu 1. Perlový gel z částicemi perfektního kulového tvaru

Claims (7)

1. Způsob výroby perlových dextranových materiálů s různou a definovatelnou zádrží vodypro gelovou chromatografii v suspenzním procesu, kde se alkalický roztok ve vodě nejprvesuspenduje ve s ním nemísitelné kapalině obsahující stabilizátor suspenze a případně ještěpovrchově aktivní činidlo, na suspenzi se pak působí epichlorhydrinem při zvýšené teplotěa vzniklý perlový gel se promyje a vysuší, vyznačený tím, že se roztok dextranu před neboběhem suspenzního procesu podrobí redukci v alkalickém prostředí a výhodou působením natrium-borohydridu v množství 0,1 až 30 g činidla na 1 kg dextranu, přičemž se požadovaná zádržvody hotového proudktu řídí koncentrací výchozího roztoku dextranu, která je v rozsahu 5 až70 % hmot., a vzniklý gel· se případně podrobí ještě dostatečnému sířování.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se k redukci dextranového roztoku použijenatriumborohydrid v množství 2 až 10 g na 1 kg dextranu.

3. Způsob podle bodu 2, vyznačený tím, že se po redukci dextran izoluje a výchozí roz-tok pro suspenzní proces se připraví z tohoto izolovaného redukovaného dextranu.

4. Způsob podle bodu 2, vyznačený tím, že se po redukci dextran neizoluje a redukovanýroztok se použije přímo v suspenzním procesu.

5. Způsob podle bodu 2, vyznačený tím, že se redukce natriumborohydridem dokončí až přivlastním suspenzním sítování.

5 249368 měl zrnění 100 až 500 um, zádrž vody 9,5 ml/g a obsah karboxylů 5,5/umol/g. Příklad 6 Pokus byl proveden zcela analogicky jako v příkladu 5, lišil se pouze nižší koncentracívýchozího dextranového roztoku. K rozpuštění 100 g dextranu bylo použito roztoku 22 g hydro-xidu sodného v 540 ml vody, ostatní vstupní hodnoty i postup zůstaly stejné jako v příkladu5. Vysušený perlový gel měl zrnění 50 až 300jum, zádrž vody 23 ml/g a obsah karboxylů6 umol/g. Příklad 7 100 g předem redukovaného dextranu bylo zpracováno stejně jako v příkladu 4. Po skon-čení zahřívání byla suspenze dekantována třikrát toluenem a třikrát ethanolem, přebytečnýethanol odsát a zbytek odpařen ve vakuu. Suchý primární gel byl dispergován v 300 ml toluenuobsahujícím 0,5 g kyseliny p-dodecylbenzensulfonové. Ke směsi bylo pak přidáno 81 ml 20%hydroxidu sodného a po 1 hodině 52 g l-chlor-2,3-epoxypropanu. Po 16 hodinách míchání při50 °C byla směs ochlazena, odsáta, promyta ethanolem a vodou do neutrální reakce odbotnánav ethanolu a vysušena. Produkt měl zrnění 50 až 300 jum, zádrž vody 1,1 ml/g a obsah karboxylů5,5 yumol/g. Příklad 8 Pokus byl proveden analogicky jako v příkladu 7, pouze s tím rozdílem, že při dodateč-ném sítování bylo k disperzi primárního gelu přidáno 51 ml 35% hydroxidu sodného a množstvíl-chlor-2,3-epoxypropanu činilo 67 g. Vysušený produkt měl zrnění 50 až 300 um, zádrž vody0,8 ml/g a obsah karboxylů 6,5 umol/g. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

6. Způsob výroby perlových dextranových materiálů se zádrží vody v rozmezí 10 až20 ml/g, podle bodu 1, vyznačený tím, že koncentrace výchozích roztoků dextranu je 5 až · 20 % hmot. 249368

7. Způsob výroby perlových dextranových materiálů se zádrží vody v rozmezí 0,8 až2 ml/g, podle bodu 1, vyznačený tím, že dextranový gel o zádrži vody v rozmezí 2 až 7 ml/g sepodrobí zkrácenému promývání a v odbotnalém stavu se znovu disperguje a dodatečně zesíiuje,promyje a vysuší.