CS249117B2

CS249117B2 - Testing strip for analytic purposes

Info

Publication number: CS249117B2
Application number: CS819512A
Authority: CS
Inventors: Hans Lange; Edda Geisler; Wolfgang Werner
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1980-12-23
Filing date: 1981-12-18
Publication date: 1987-03-12
Also published as: ATE14936T1; DE3048799A1; DE3171828D1; AR226398A1; JPH0252824B2; DD201944A5; EP0054679B1; JPS57168159A; US4605629A; HU185981B; EP0054679A1

Description

(54) Zkušební proužek pro analytické účely

Řešení se týká zkušebního proužku pro analytické účely s držadlem, na jehož spodním konci je upevněn nosič, impregnovaný reakčním činidlem spolu se sítí o otvorech 5 až 250 /jm z vlákna o tloušťce 10 až 50 μπι, která je natmelena na protilehlé straně nosiče na držadle. Nosič pro reakční složku sestává z inertního materiálu, například papíru nebo rouna z bavlny, celulózy nebo plastické hmoty, který je podložen další natmelenou sítí z přírodního vlákna nebo z plastické hmoty, například polyamidových nebo polyesterových vláken.

Zkušební proužek podle vynálezu je vhodný k analýze jednotlivých složek kapalin.

OBR. !b

I

Vynález se týká nového reakčního proužku pro analytické účely a způsobu chemické analýzy složek kapalin, zejména nového způsobu přidávání pevných reakčních složek pomocí zkušebního proužku.

Protože přímá fyzikální nebo fyzikálně chemická analýza je možná pouze ve zvláštních případech, představuje chemická analýza, prováděná přidáním příslušných reakčních činidel a stanovením takto vzniklé reakce stále ještě nejdůležitější kvalitativní a kvantitativní metodu pro stanovení složek kapalin. Reakční činidlo se v těchto případech často přidávají к přebytku, jindy je nutno je přidávat v přesném množství, zejména v případech kinetického stanovení. Aby bylo možno zajistit dobré dávkování, rozpustí se obvykle pevná reakční činidla ve vhodném rozpouštědle а к analýze se pak užije příslušný díl získaného roztoku. V případě použití většího počtu reakčních činidel je toto stanovení pracné a náročné na čas i rozpouštědla, z tohoto důvodu se dodávají reakční roztoky dlouhou dobu již hotové a připravené к použití. V tomto případě však je zapotřebí reakční Činidla, která není možno udržet dlouhou dobu v roztoku společně dodávat odděleně a smísit až krátce před použitím. Reakční činidla, která jsou v roztoku nestálá, se běžně dodávají ve formě tablet s přísadou vhodných pomocných prostředků nebo ve formě lyofilizátu v ampulích a těsně před použitím se přidá rozpouštědlo a rekonstituuje se reakční roztok.

Reakční tablety mají tu nevýhodu, že jsou při skladování a zpracování podrobeny otěru, čímž se mění jejich rozměry a tím také množství reakčního činidla, nebo je zapotřebí vyrábět tak tvrdé tablety, že jejich rozpouštění je spojeno s obtížemi. Může také docházet к rušení analýzy pomocnými prostředky pro tabletování, zejména kluznými látkami a látkami, které napomáhají oddělení tablet od formy, což snižuje použitelnost těchto tablet.

Lyofilizace reakčních roztoků v ampulích je z hlediska rekonstituce optimální a mimoto je tímto způsobem možno zpracovávat i reakční složky, které není možno udržet společně deiší dobu v roztoku, například lyofilizací ve vrstvách. Tento způsob je však drahý a nákladný na čas.

V DOS 23 01 999 se navrhuje stabilizovat látky, jinak v roztoku nestálé tím způsobem, že se reakčním roztokem nasytí nosič, například filtrační papír, načež se tento nosič usuší nebo lyofilizuje a části vhodného rozměru a tím i s vhodným množstvím reakčního činidla se natmelí na držadlo, které je vyrobeno například z plastické hmoty. Při míchání v odpovídajícím množství rozpouštědla nebo zkušebního vzorku se reakční činidlo z nosiče vymývá a získá se hotová směs. Přestože je tento způsob zásadně použitelný, ukázalo se, že z takto vyrobeného nosiče je možno vymýt rychle a úplně pouze velmi rozpustné látky, ostatní reakční činidla se vymývají neúplně. Další nevýhody spočívají v tom, že je nutno impregnovat nosič zbytečně velkým množstvím reakčního činidla a mimoto závisí vymývané množství ještě také na podmínkách vyjímání jako je čas, rychlost míchání, teplota, viskozita a podobně, takže není možno zaručit žádnou přesnou koncentraci látky ve výsledném roztoku.

Bylo by tedy zapotřebí svrchu uvedený reakční proužek zlepšit tak, aby bylo možno ze zdokonaleného zkušebního proužku vymýt reakční činidla rychle, reprodukovatelně a pokud možno úplně.

Předmětem vynálezu je zkušební proužek pro analytické účely s držadlem, na jehož spodním konci je upevněn savý nosič, impregnovaný reakčním činidlem spolu se sítí o otvorech 5 až 250 ^m z vlákna o tloušťce 10 až 50 μΐη, která je natmelena na protilehlé straně nosiče na držadle, jehož podstata spočívá v tom, že nosič pro reakční složku sestává z inertního materiálu, například papíru nebo rouna z bavlny, celulózy nebo plastické hmoty, který je podložen další natmelenou. sítí z přírodního vlákna nebo z plastické hmcty, například polyamidových nebo polyesterových vláken.

Rychlost rozpouštění je možno zvýšit ještě tak, že se silný filtrační papír, nutný pro použití při větším množství reakčních činidel nahradí několika vrstvami papíru o menší tloušťce, takže rozpouštědlo může proudit také mezi jednotlivými vrstvami. Takto oddělené vrstvy papíru mohou také sloužit к tomu, aby na ně byly jednotlivě naneseny reakční složky, které není možno sloučit na jediném nosiči.

Kromě toho je možno zlešit proudění mezi jednotlivými vrstvami a tím i rychlost eluce ještě tak, že se mezi tyto vrstvy papíru nebo mezi papír a držadlo uloží další síť z plastické hmoty. V případě, že různé vrstvy papíru obsahují různá reakční činidla, je uložením mezivrstvy z plastické hmoty možno úplně vyloučit možnost vzájemné reakce.

Přestože je zásadně možno užít sítě z přírodních vláken nebo kovové sítě, je nejvýhodnější vzhledem к jednoduchosti zpracování а к levnosti užít sítě z plastických hmot, například z polyamidu, polyesteru, polyvinylchloridu a podobně, a to jako podložní síť i jako sítě, uložené mezi vrstvami nosiče. Otvory v síti mají mít rozměr 50 až 250 μΐη, s výhodou 100 až 150 μπι v případě krycí sítě, 80 až 250 ^m, s výhodou 100 až 200 μΐη v případě podložní sítě. Tloušťka vláken se obvykle pohybuje v rozmezí 10 až 50 /zrn. Může jít o tkanou i netkanou síť, přičemž jednotlivá vlákna mohou být v místě svého křížení ještě svařena nebo stmelena.

Z nosičů padají v úvahu papírky nebo rouna z bavlny, buničiny, regenerované celulózy, plastických vláken, například z po249117 lyamidu, polyesteru nebo ze směsí těchto materiálů, přičemž jsou přirozeně vyloučeny materiály, které se chemicky váží na reakční činidla nebo s nimi tvoří pevné komplexy.

Vzhledem к snadnému uvolňování látek a dobrému přímému roztoku i snadnému zpracování i po impregnaci řadou reakčních činidel jsou výhodné papírky z polyamidu nebo směsi polyamidu a celulózy.

Zkušební proužky podle vynálezu dovolují také uložení citlivých pevných reakčních činidel ve stálé formě a jejich rychlou rekonstituci na reakční roztok. Koncentraci hotových roztoků reakčních činidel je možno řídit v širokém rozmezí tloušťkou a velikostí použitého nosiče a koncentrací reakčních roztoků, které se užívají к impregnaci tohoto nosiče. Při větší spotřebě reakčního činidla je možno к jednomu držadlu upevnit i větší množství papírků. Rozdělení reakčních činidel na větší počet papírků dovoluje připravit společně reakční papírky pro různé typy zkoušek, například jako směsi pufru a pak tyto reakční papírky kombinovat navařením na držadlo.

Složení zkušebního proužku podle vynálezu je možno lépe popsat v souvislosti s přiloženými výkresy:

Na obr. la je znázorněn pohled ze strany na zkušební proužek podle vynálezu s jedním reakčním papírkem, na obr. lb pohled shora na tentýž proužek. Na obr. 2 je znázorněn pohled ze strany na zkušební proužek s třemi papírky a na obr. 3 pohled ze strany na zkušební proužek s podložní a vmezeřenou sítí.

Na obr. la a lb je znázorněn zkušební proužek opatřený držadlem 1, reakčním papírkem krycí sítí 3, která je spojena s držadlem 1 v místech 4 stmelením.

Na obr. 2 je znázorněn pohled ze strany na zkušební proužek s dvěma od sebe oddělenými reakčními papírky 2 a dalším reakčním papírkem 2, uloženým na opačné straně držadla 1.

Na obr. 3 je znázorněn zkušební proužek, na němž jsou reakční papírky 2 od sebe odděleny vmezeřenou sítí 6 a uloženy na podložní síti 7, která je odděluje od držadla 1.

Technická výroba zkušebního proužku se s výhodou provádí tak, že se kontinuálně svařují nebo tmelí dlouhé pásy reakčního papírku a sítě známým způsobem. Tyto pásy se pak příčné rozdělí na proužky libovolné šířky způsobem, jaký je popsán například v DAS 21 18 455. К účelům, které jsou popsány v následujících příkladech je možno vyrobit zkušební proužky podle vynálezu odpovídajícím způsobem, přestože je samozřejmě možno vyrobit v malých sériích laboratorní vzorky také zvlhčením zkušebních proužků bez jakékoli reakční látky odměřeným množstvím reakčního roztoku s následným usušením.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady:

Příklad 1

Zkušební proužek pro stanovení glutamátoxalacetáttransaminázy (GOT) v séru

Do měřicí kyvety o tloušťce vrstvy 10 mm se vloží zkušební proužek o délce 7 až 8 cm a šířce 6 mm, který byl skladován v suché atmosféře a je stálý 1 rok při teplotě místnosti a na jehož spodním konci jsou od sebe odděleně uloženy dva reakční papírky o ploše 6X6 mm mezi tkaninami s otvorem ok přibližně 120 μΐη a nosnou fólií. Jeden z papírků obsahuje 0,4 ^molu nikotinamidadenindinukleotidu (NADH), 0,2 mg uhličitanu sodného a 0,3 mg hydrogenuhličitanu sodného, druhý papírek obsahuje 28 μηιοίύ μ-ketoglutarátu, 1,7 jednotek laktátdehydrogenázy (LDH), 1,1 jednotku malátdehydrogenázy (MDH) a 0,2 mg tris-(hydroxymethyljaminomethanu (Tris-pufr). Nakonec se přidají 2 ml směsi substrátu a pufru o pH 7,8, stálé při teplotě místnosti 1 rok a obsahující 88 mmolů/litr tris-(hydroxymethyl)aminometh.anu, 264 mmolu/litr sodné soli kyseliny L-asparagové a 0,5 g azidu sodíku. Pak se přidají 0,2 ml séra pipetou, načež se směs míchá zkušebním proužkem přibližně 5 sekund, pak se zkušební proužek odstraní a směs se nechá stát 2 minuty při teplotě místnosti.

Pak se měří aktivita glutamátoxalácetáttransaminázy fotometricky při 334 nm, 340 nm nebo 366 nm při kontinuální registraci nebo odečtením extinkce po určitých časových intervalech, například vždy po 60 sekundách. V případě, že má být vyrobeno větší množství reakčního roztoku, například 10 ml pro sériové měření, znásobí se plocha zkušebního papírku z 0,36 cm² například na 1,8 cm² při šířce reakčního proužku 10 mm a reakční papírky pak mají plochu 18 X 10 mm.

V případě, že se tyto papírky vymývají 5 až 10 sekund v 10 ml svrchu uvedeného pufru, vznikne reakční roztok s následujícím složením.

Tris-pufr (pH = 7,8) L-asparaginát NADH LDH MDH a-ketoglutarát

Tento roztok je možno měření běžným způsobem.

Příklad 2

Zkušební proužek pro stanovení triglyceridů v séru

Do skleněné nádoby, v níž se nechází 13 mililitrů roztoku pufru o pH 8,1, stálého 1 rok při teplotě místnosti a který obsahuje

0,1 mol/litr glycylglycinu, 0,16 mol/litr chlorldu amonného, 1 mmol/litr sodné soli ky88 mmol/litr

264 mmol/litr

0,20 mmol/litr

660 jednotek/litr

460 jednotek/litr

13,2 mmol/litr užít pro sériová seliny žlučové, 0,2 % smáčedla a 1 g/litr azidu sodíku se vloží reakční proužek o délce 100 mm a šířce 10 mm, na němž jsou na sobě uloženy dva reakční papírky o ploše 10 X 15 mm, které jsou na držadlo navařeny podobným způsobem jako v příkladu 1. Aby bylo vymývání roztoku snadnější, jsou tyto reakční papírky uloženy na jedné vrstvě tkaniny o ploše 10 X 15 mm a velikosti ok 250 /im. Reakční papírek, uložený na spodním konci reakčního proužku obsahuje v nosiči 14 mg NAD, druhý papírek obsahuje 3,9 mg 3-(4,5-dimethylthiozolyl-2 )-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT).

Další reakční oblast obsahuje dva nosiče, které obsahují vždy 45 jednotek glycerolhydrogenázy, 6 jednotek diaforázy, 13 jednotek cholesterolesterázy.

Reakční proužek se užije jako míchadlo a rozpouštědlo se 5 sekund intenzívně míchá, pak se nechá 5 minut stát, načež se ještě 5 sekund míchá a pak se zkušební papírek odloží.

Vznikne reakční roztok následujícího složení:

glycylglycin chlorid amonný sodná sůl kyseliny žlučové smáčedlo

MTT

NAD glyceroldehydrogenáza diaforáza cholesterolesteráza

0,1 mol/litr

0,16 mol/litr mmol/litr

0,2 %

270 mg/litr

00 mg/litr к jednotek/litr

400 jednotek/litr

900 jednotek/litr

Obsah triglyceridů v séru se stanoví tak, že se vždy ke 2 ml takto získaného reakčního roztoku přidá 0,020 ml vzorku a po 30 minutách inkubace při teplotě 30 až 25 °C se měří extinkce při 578 nm proti slepé zkoušce (RL). Koncentrace (C) triglycerldů se pak vypočítá ze vztahu

C[mg/100 ml] = 498,5 X [E—E_RL]

Příklad 3

Zkušební proužek pro stanovení kyseliny mečové v séru

Do vhodné skleněné nádoby, v níž se nachází 80 ml při teplotě místnosti 1 rok stálého roztoku pufru o pH 7,0 s obsahem 0,1 M fosforečnanu draselného, 0,5 % smáčedla a 1 mmol/litr N-ethyl-N-(2-hydroxyethyl)-m-toluidinu (EHT) se uloží zkušební proužek o délce 120 mm a šířce 10 mm, na němž jsou uloženy tři oblasti, z nichž každá obsahuje dva na sobě uložené reakční nosiče o ploše 10 X 15 mm stejně jako v předchozích příkladech upevněné pomocí sítí. Oba na spodním konci reakčního proužku natmelené nosiče obsahují v jednom nosiči vždy 2,5 miligramu kyseliny 3-methylbenzthiazolonhydrazon-6-sulfonové (SMBTH) a 1,7 mg K4.[Fe(CN)6] a jeden nosič se 6 jednotkami urikázy. Třetí reakční oblast obsahuje dva nosiče, které obsahují vždy 6 jednotek urikázy, 3 mg tris/citrátového pufru o pH 7 a 20 jednotek peroxidázy (POD). Reakční proužek, který je v suché atmosféře stálý 1 rok při teplotě místnosti se vymývá stejným způsobem jako v příkladu 2.

Tímto způsobem se získá reakční roztok následujícího složení:

pufr s fosforečnanem draselným o pH 7,0 EHT smáčedlo

SMBTH

Kd.[Fe(CN)6] urikáza

POD

0,1 mol/litr mmol/litr

0,5 %

0,2 mmol/litr mg/litr

255 jednotek/litr

470 jednotek/litr

Obsah kyseliny močové v séru se stanoví tak, že se ke 2 ml svrchu uvedeného reakčního roztoku přidá 0,050 ml vzorku a po 20 minutách inkubace při teplotě 30 až 25 °C se stanoví extinkce při 578 nm proti standardu.

Analogickým způsobem je možno nanést na zkušební proužky podle vynálezu známé kombinace reakčních složek pro stanovení následujících látek.

glukóza (GOD/PAP-metoda) cholesterol (CHOD/PAP-metoda) glutamátpyruvát-transamináza (UV-metoda)

Stálost a funkce je srovnatelná s předchozími příklady.

Srovnávací pokus

Ke srovnání elučních rychlostí pro různé nosiče reakčních činidel, které byly až dosud známy a nosiče podle vynálezu byly různé reakční papírky se zesítěným nebo natmeleným 3-(4,5-dimethylthiazolu-2)-2,5-dif enyltetrazoliumbromidem (MTT ] zpracovávány způsobem podle příkladu 2 přihlášky PA 3 944/81 (tj. 5 až 10 sekund třepání, 5 minut stání, 5 až 10 sekund třepání s následnou elucí 13 ml roztoku pufru a měření při λ = 450 nm. Reakční papírek o rozměrech 10 X 15 mm byl vždy nalepen nebo natmelen na držadlo z plastické hmoty). Pro srovnání byl extrahován 15 minut pufrem tentýž papírek bez držadla (celková eluce).

Proužky	n χ m. E.	X % eluce	X % eluce	X % eluce
MTT celková eluce MTT nanesen tmelením (podle	4	290	—	—	—
DE-A 23 01 999) MTT po zesítění (podle DE-B	4	220	75,8	72,4	77,9
21 18 455) enzym/MTT po zesítění (podle	4	22(2	76,5	71,0	79,3
DE-B 21 18 455) tkanina MTT po zesítění (podle	4	211	72,8	67,9	75,9
PA 3 944/81) tkanina/enzym po zesítění	4	272	93,8	91,0	97,9
(podle PA 3 944/81) enzym/tkanina, MTT po zesítění	4	258	88,9	86,2	91,0
(podle PA 3 944/8)	4	257	88,6	85,2	92,8

Je zřejmé, že papírky podle vynálezu jsou podstatně lepší a k jejich eluci dochází rychleji.

Claims

PŘEDMĚT VYNALEZU

1. Zkušební proužek pro analytické účely s držadlem, na jehož spodním konci je upevněn savý nosič, impregnovaný reakčním činidlem, spolu se sítí o otvorech 5 až 250 μΐη z vlákna o tloušťce 10 až 50 ^m, která je natmelena na protilehlé straně nosiče na držadle, vyznačující se tím, že nosič pro reakční složku, uspořádaný na držadle (1) sestává z inertního materiálu, například papíru nebo rouna z bavlny, celulózy nebo natmelenou sítí (7) z přírodního vlákna nebo plastické hmoty, například polyamidových vláken.

2. Zkušební proužek podle bodu 1, vyznačující se 'tím, že na držadle (1) jsou upevněny alespoň dva nosiče vedle sebe nebo na sobě.

3. Zkušební proužek podle bodu 2, vyznačující se tím, že reakční činidlo sestává z alespoň dvou složek, přičemž každá z těchto složek je impregnována na samostatný nosič.

4. Zkušební proužek podle bodů 1 až 3, vyznačující se tím, že síť (7) z plastické hmoty je natmelena jako podložní síť mezi držadlem (1) a nosičem pro reakční složky.

5. Zkušební proužek podle bodů 2 až 4, vyznačující se tím, že síť (7) z plastické hmoty je natmelena mezi dva nosiče jako vmezeřená síť (6J.

6. Zkušební proužek podle bodů 1 až 5, vyznačující se tím, že držadlo (1), síť (7) vytvořená jako podložící a vmezeřená síť (6j jsou vytvořeny z plastické hmoty a nosič sestává z celulózového papíru nebo z polyamidového, popřípadě polyamidového a celulózového rouna.