CS248491A3 - Borolysine analogs of peptides - Google Patents

Description

Borolysinové analogy peptidů

Oblast techniky

Vynález se týká borolysinových analogů peptidů,které mají vlastnosti inhibitorů serinových proteas.

Dosavadní stav techniky

Vynález se týká inhibitorů serinových proteas,jako je thrombin, faktor Xa, kallikrein a plasmin, jakož ijiných serinových proteas, jako prolylendopeptidasy aIg AI proteasy. Thrombin jako poslední enzym v koagulačnimsystému štěpí rozpustný fibrinogen na fibrin, který se sf-tuje a tvoří nerozpustný gel za vzniku matrice krevní sra-ženiny (thrombu). Při poruše cévy je tento postup nutný,aby se zabránilo krvácení. Za normálních podmínek není vplasmě přítomno měřitelné množství thrombinu, Zvýšená kon-centrace thrombinu může vést ke tvorbě sraženin, které va-dou k thromboembolickému onemocnění, jednoho z nejvážněj?-ších současných lékařských problémů, -

Thrombin přispívá k hemostatické kontrole něko-.lika biologickými reakcemi. Kromě své primární funkce, kon-verse fibrinogenu na fibrin, thrombin aktivuje faktor XIII,který je odpovědný za sítování fibrinu, Thrombin také pů-sobí positivním zpětně působícím mechanismem zahrnujícímaktivaci faktorů V a VIII, které jsou oba nutné pro jejichvlastni tvorbu z prothrombinu, Thrombin má další základní/úlohu : tím, že se váže na krevní destičky, inicijujeuvolňování destiček a jejich shlukováni, děj primárněodpovědný za hemostasu.

Reakce thrombinu jsou dále kontrolovány přiro-zenými inhibitory v plasmě. Nejdůležitější z nich jsouantithrombin III a heparin. Tyto dvě sloučeniny byly iso- ~7 lovány a jsou terapeuticky a profylakticky používány zapodmínek, kdy jsou v nerovnováze v hemostatickém mechanis-

I mu s risikem pro aktivaci prothrombiňu.

Syntetické inhibitory thrombinu s orální účinnostíby byly. použitelnými alternativami pro parenterálni apli-kace., těchto přírodních inhibitorů. Převážná část dosavad-ního výzkumu’v této’oblasti vedla· b-syntese dobrých - inhi-„bítorů thrombinu in vitro, ale až dosud není skutečně dob-rý kandidát pro' orální použití. Několik dobrých krátkýchpeptidických substrátů pro thrombin bylo připraveno imita-cí sekvence aminokyselin ve fibrinogenu. Tyto peptidickésubstráty byly také transformovány na inhibitory enzymu.

Tak chromogenní substráty D-Phe-Pro-Arg-pNA.a D-Phe-Pip-Arg-PNA napodobují sekvenci předcházející štěpení vazbythrombinem. Odpovídající reversibilní a ireversibilní in-hibitory D-Phe-Pro-Arginal a D-Phe-Pro-Arg-CH0C1 vykazují —8 in vitro inhibici v rozmezí 10 M.

Chlormethylketony jsou obecně příliš nespecific-ká roakční činidle, aby byla ideální pro terapeutické po-užití a peptidické aldehydy uváděné jako příklad výše majízcela nízké hodnoty ΟΟ^θ.

Faktor Xa,je koagulační enzym odpovědný za tvor-bu thrombinu^omezenou proteolysou svého zymogenu, pro-thrombinu, In vivo je na bázi hftot,/hmot, faktor'Xa ales-poň 10 x více thrombogenní než thrombin, To vyplývá z fak-tu, že faktor Xa je v rozšiřujícím se kgskádovém systémuo jeden stupeň výše nad thrombinem tak, že jedna molekulafaktoru Xe může generovat ze svého prekursoru mnoho mole-kul thrombinu, Čeho účinnost může také být způsobena po-měrně pomalým odstraňováním faktoru Xa z těla, Thrombinna rozdíl od faktoru Xa se rychle odstraňuje z cirkulují-cí krve do vysoce příbuzných míst na stěně cévy. Centrál-ní posice faktoru Xa na spojení vnitřních a vnějších meta-holických cest může z něj tvořit vhodný objekt pro modu-lace hemostatického mechanismu.

Kallikrein se tvoři z prekallikreinu působenímfaktoru XII při umístění na.povrch s negativním nábojem,Kallikrein naopak může štěpit faktor XII na faktor Xllaa tvořit tak reciproční aktivační systém. Faktor Xlla jeprvním enzymem vnitřní ;části koagulačního systému. Významkontaktního systému spočívá pravděpodobně v povrchovězprostředkovaném obranném mechanismu a aktivaci systémuve velkém, měřítku, které jsou normálně patrné během šokunebo roztroušené intravaskulárni koagulaci (DIC), Rolek a 11 i k r e i nu-. v t omto .stadiu spočívá ve-štěpeni vy so-k.o.m.o.l.e^kulárního kininogenu s uvolňováním vasodilátoru, brady- - - k i n i n u. B r a d y k i n in t a k é ' z p ů s o buje z výš ěn o u va skulárnipermeabilitu, bolest a migraci neutrofilních leukocytŮ,Bylo nalezeno, že inhibitory, tvorby kininu mají positiv- . ,-h~i^v-ý-znam—pp-i-~I-é členi—u^či-tÝch—typů—z-á-ffě^-ůy^vcětŤŤě—aTTlTri^ tidy a pankreatitidy a jsou také použitelné při léčeníastma, Jediná látka, která dospěla jako inhibitor kalli-kreinu. k uplatnění v klinické praxi, je aprotinin (Tra-syl.ol), Aprotinin je popypeptidem molekulární, hmotnosti6500, který'tvoří stabilní komplex s proteasou a má va-zebnou, konstantu 10"10 až 10”'3 M, J Fibrinolysa je proces, který způsobuje enzyma- tické rozpouštěni fibrinogenu a fibrinových chuchvalců.Plasma obsahuje protein plasminogen, který se působenímrůzných aktivátorů převádí na plasmin,.proteolytický en-zym, jehož aktivita se podobá ak-t-i-v.i.t.ě_t-ry-psinu-.—P-l-a-sm-i-nštěpí fibrinogen a fibrin na fibrin/fibrinogen degradač-ní produkty. Z? normálních podmínek je fibrinolytický sys-tém v rovnováze s koagulačním systémem. Malé krevnichuchvalce {thromby)-vzniklé v krevním óběhu se mohou en- zymaticky rozpustit a průtok cévami se může upravit ak-tivací fibrinolytického systému v těle. Jestliže je fib-rinolytická aktivita příliš ‘vysoká, může způsobit delší krvácení. Tato aktivita se může inhibovat přirozenými in-hibitory v krvi.

Prolylendopeptidasa štěpí peptidické vazby nakarboxylové části prolinových zbytků s peptidíckým řetěz-cem, Serín proteaoa pak snadno degraduje řadu neuropepti-dů, včetně látky P, neurotensinu, hormonu uvolňujícíhothyrotropin s hormonu uvolňujícího luteinisační hormon a ~r· r M w- .... η. B ,·· , které jsou spojeny se schopností buněk produkovat irter- "leukin 2 {IL-2). Tento enzym je inhibován benzyloxykarbo-nylprolylprolinalem s Ki = 14 nM, Přestože není téměř nicznámo o fysiologické roli prolylerdq^peptidasy, může tatohrát prominentní roli při regulaci biologických aktivitrůzných neuropeptidů,

Ig A proteinasou katalysované štěpení Ig A, do-minantní forma protilátek, která zahrnuje první liniiobrany proti infekci, odděluje Fc od antigsn-vázejícíchFab oblastí molekuly. Dalo by se očekávat, že toto štěpe-ní by rušilo nebo ničilo sntimikrobiální aktivitu. Veške-ré Ig A identifikované protainasy tak štěpí po prolinovánzbytku v koncové oblasti lidské Ig A, Feptid prolyl-bor.o-nové kyseliny inhibuji Ig A 1 proteinas.y. z Neisseris cono-rrhoea a Hemophilus influenzae, což naznsčuje, že tytoenzymy patři ke skupině serin proteas proteolytických en-zymů, ~; ’ ....... Vícenásobná role, jež má thrombin v různých fy-ziologických procesech, které jsou spojeny s patologický-mi poruchami, jako je rakovina, záněty a nervové poruchy,ukazuje na možnost použiti inhibitorů thrombinu u někte-rých indikaci, které nejsou striktně vázány na kardio-vaskulární systém, ' Bylo nalezeno, že mnoho nádorových buněk vyka-zuje prokóágulační' účinky spojené s vývinem thrombinu, □ako důsledek vzniká lokální fibrinový deposit a koagu-lace, které se zdají být důležité pro růst nádoru. Navíc 5 díky působení ha endotheliálni buňky může thrombin usnad-

** W novat uvolňování nádorových buněk během metastasy mimocé-vy, Inhibitory thrombinu tak mohou být užitečné nejen přiléčení určitých typů rakoviny, ale také pří redukci hyper-srážlivosti, která je často, pozorována u pacientů běhemléčení chemoterapeutickými prostředky.

Aktivace endotheliálních buněk thrombinem indu-kuje řadu změn vyvolávájicích-zánSty,·jako-je syn tesá ' a "* * 'uvolňováni interleukinu-1, prostaglsndinů a faktoru akti-vu íí.PÁÍVři. dest íčky. kPál.g._.th.ronbin . indukuje objeveni-GN?-·!40-a CD03, dvou adhasivnich molekul odpovědných za adhesi —- -1 eu ko cy-t ů-n ε sn ti otheliálnípovr c h,—Thr o mbin^t alíé“ zvyšuj ecévní permeabilitu pro porteiny, jevu, který zahrnujeneurofilní částice ε štěpí interleukin-S^prekursorový ^protol~n,~^p^pvi;dj7^;o~lčtTcčŽ.m—s.e._p.ň.ečlčo^k~-I'ačjá—-ž-e—jie—úča:S:ť:er.=Í=při respiračních poruchách, revmatické arthřititiě ε ža-ludeční kolitidě,

Jeho·zapojení, ve všech těchto procesech vyvolá-vajících zánět poskytuje možnost, že lze thrombin užít;pro léčení chorob vyvolaných zánětem pomocí inhibitorůthrombinu, Účinek proteasy nexinu-1, modulátoru nervovéhorůstu a specifického přírodního antegonistu thrombinu, sevýznamně a specificky snižuje u pacientů s Alzheimerovounemocí. Toto spolu.?s pozorováním, že aktivita obdobnáthrombinu byla zvýšená v mozcích pacientů s Alzheimero-vou nemocí, naznažuje, že inhibiroty thrombinu mohou mítpotenciál pro omezení nebo zvrácení ’ neurálních patolo-..gických změn spojených s’thrombinovou hyperaktivitou.

Boronové kyseliny byly studovány jako inhibi-tory .různých serínových esteras-a proteasyPrvní analogaminokyseliny obsahujíci borano.vo.u kyselinu, .který bylpoužit jako inhibitor proteasy, byl analog boronové ky-seliny od N-acetyl-L-fenylelaninu, který byl použit jakoi n h i bl t-O-r_c.hy mO-t.C-y-p^in.u—a—sub-t-i-l-i-s-i-nu^—Rep-t-i-d-i-s-k-é—so-ro-no-- 6 vé kyseliny byly použity jako inhibitory chymotrypsinu,subtilisinu a elastes.

Interakce boronových kyselin s proteasami v bio-logických systémech je znána a bylo nalezeno, že různéjednoduché boronové kyseliny jsou v podctct.ň retoxické připoužití u lidi. Inhibitory elgstas typu peptidických boro-nových kyselin'byly nedávno použity .v živočišných pokusechve vztahu k rozedmě, Ns rozdíl od peptidických chloruethyl-keton.fi, nebyla uváděna žádná toxicita při biologie ky. účin-ných dávkách,

Evropská přihláška vynálezu ΞΡΑ 293 881 popisujepřípravu peptitíů obsahujících deriváty lysinu, ornithinu oargininu s C-terminálními hororovými kyselinami e jejichpoužití jako inhibitorů serinových proteas podobných tryp-ýýsinu. Ostatní aminokyseliny v peptidech jsou všechny buď &D- nebo L-formy 20 aminokyselin vyskytujících se v pří-rodě.

Podstata vynálezu 5

Nyni bylo zjištěno, že lze získat sloučeniny,které mají vynikající vlastnosti inhibitorů serinovýchproteas podobných trypsinu, jestliže peptid obsahuje ales-poň jednu nepřirodní ^C-aminokyselinu mající hydrofobní """postranní řetězec.

Podstatou vynálezu jsou sloučeniny obecného

vzorce I O,

x / 1W - Y - N - CH ~ B R4 R5 kde IV je atom vodíku nebo N-chránici skupina. (I) Y je sekvence n aminokyselin zvolená tak, žs n+1 pep-. tid s aminokyselinou Y-Lys nebo Y-Arg mó afinitu k aktivnímu místu proteasy trypsinového typu, ko‘en je celé číslo od 1 do 10, s výhodou 1 až 4, a kdealespoň jedna aminokyselina js nepřírodní aminokv-selinou mající hydrofobní postranní řetězec, θΐ s θ2' mohou být stejné nebo různé, jsou vy- brány zě skupiny‘zahrnující -OH, -COR^', -CONR^,-NR^R^ 0^3> nebo 0^ a spolu dohromady tvoři.diolový zbytek, R^, 8 ^3» které nohou být stejné nebo různé, jsou alkylovó skupina s 1 až 10 stonyuhlíku, arylová okup Γη a s 6 _ 10 a t ony _uhlíku, arylalkylová skupina s 6 až 10 atomy uhlíku nebofenylová skupina substituovaná až 3 skupinami vy- ^bKa-η^Γ—z-g^S:k:U:p.rn-yr=z:ab:n.n:uíj:iic-i—s4-k-y-l-ovou—s—=1 az 4 atomy uhlíku, atom halooenu a slkoxvskucinus 1 až 4 atomy uhlíku, R4 Je r-ton vodíku, nebo alkylová skupina s 1. až 10 ato-my uhlíku, . R5 je skupina -A-X, kde A je -(CH2) kde z je 2, 3, 4 nebo 5, -CH(CH3)-(CH2)2~, -CHj-CH(CH3}-CH2-,-(CH2)2-CH(CH3)-, -(ch2)2-c(ch3)2-, -CH(CH3)-(CH2)3-, -CH2-CH(CH3)-(CH2)2~, -CH2-CH2-CH(CH3)-CH2-,-{CH2)3-CH(CH3)-, -(CH2)3»C(CH3)2 : arylová skupina . s 6 až 10 atomy uhlíku, arylalkylová skupina s 6 ežlo atomy uhlíku, a ____ . X je -NH2, -NH-C(NH)-NH2, -S-C(NH)-NH2~, -M alkoxy-skupina s 1 až 4 atomy uhlíku, alkylthioskupins s 1až 4 atomy uhlíku nebo -Si(CH3)3 nebo R4 e R^ spolu dohromady tvoří trimethylenovou skupinu2 asymetrický atom uhlíku označený může mít D- neboL-konfiguraci, nebo znamená jakoukoliv jejich směs.

Nepřírodní aminokyselinou sě rozumí jakákolivaminok-y-s el-i-ne—j-i-n ά—n e-ž—D—ne bp—Ir— k-l-a—Argy^As p“Gys~Grn~7

Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr,

Trp, Tyr nebo Vsi, Výhodnou N-chráníci skupinou je skupina vzor-ce HÍCH^CHjO) -, kde p je 3 až 30, R&CO-, R^OCO- neboRgSO--, kde Rg je alkylová skupině s 1' až' 6 atomy uhlíku,Ry je elkylová skupina s l.až 6 rtomy uhlíku, fenyl, ben-zyl nebo, nafty!, a Rg^jeýfenyl, naftvl nebo alkylfenyl s 1až 4 atomy uhlíku v alkylu, přičemž skupině R^OCO- je vý- .hodná, Nejvýhodn?jší chránící skupiny jsou ty skupinyvzorce R^CCO-, kde R?z je terc.butyl (zde označovaný Eocja kde R?z je benzyl (zde označovaný Z), Výhodnou skupinou R^ je skupina Rgz, kde Rgz je-(CK2)zz-X', kde X' je -MH -NH-C(NH)-NH2, -N3 nebo a·-Si(CH3ý3 s z' je 2, 3 nebo 4, Výhodnými sloučeninami jsou sloučeniny Obecného;· vzorce Is

ORC 'i-

K

CH

I R^ (Is) 'iw 0R10 -kde V7, - Y .-R^-a-R- ,ma j í .výše uvedený význam s Rc a Β,θpředstavují zbytek dihydroxysloučeniny, □ako příklady lze uvést 2,3-butandiol, kate-chol, 2,3-dinethyl-2,3-butandiol ,· cyklohexantíiol, ethylen-glykol, 1,2-hexandiol, 2,3-hexandiol, diethanolamin neboalifatické nebo aromatické sloučeniny s hydroxyskupinami,které jsou substituovány na přilehlých stonech uhlíku ne-bo na atomech uhlíku 'substituovaných jinými atomy uhlíku,

Obzláště výhodné jsou sloučeniny, ve kterýchQl a Q2 ‘:polu dohromady tvoří skupinu OPin vzorce a} ne-bo skupinu vzorce b) 9

. . Aminokyseliny .tvořící Y jsou ^-aminokyseliny, “kTeré mohou I5ýt vybrány z L-aminokyselin přírodně se vy- skytujícich v proteinech, jejich odpovídajících enantio------ merních D-aminokyselin nebo chemicky modifikovanýchC<-aminokyselin, jako je ^-piperidid. glutamové kyseliny( Glu net3° pípěkoTbva~kyselin^. (Pip) , přičemž alespoň jedna aminokyselina je nepřírodní aminokyselino,mající hydrofobní postranní řetězec.

Výhodnými nepřírodnimi. aminokyselinami jsouaminokyseliny obecného vzorce II

- NH - CH - C - (II)

O kde R^ je hydrofobní skupina. Výhodné hydrofobní skupi-ny sestávají z methylenové skupiny vázané na popřípaděpolární skupinou substituovanou aromatickou kupinu nebona alicyklickou skupinu mající alespoň dva kruhy a žádnépolární substituenty, nebo na terč,butylovou skupinu ne-

. · I bo na trimethylsilylovou skupinu^ Výhodnou skupinou R^je skupina Rn j', kde je skupina vzorce cj , d), θ), f)., 9), h) nebo i) - 10

Nepřírodní aminokyseliny vzorce II mohou býtv D- nebo L-form? nebo v jakékoliv jejich smšsi, avšakvýhodná je D-forma.

Jest? výhodnějšími jsou inhibitory thrombinuobecného vzorce I, kde Y je sekvence dvou aminokyselin,z nichž N-terminální aminokyselina je nepřírodní amino-kyselina a druhá aminokyselina je L-prolin (Pro) vzorce

11 (I')

Tyto výhodnější sloučeniny mají obecný vzorec i' NH - CHfR..) - CO - Pro - N - CHRc - 8 1 I 5 R. °-2 kde W, , R^, Rji» Q} a ^2 maJ^· výše uvedený význam.

Zvláště výhodné jsou sloučeniny obecného vzor· < z ...

ce I V - NH - CH(Rn) - CO - Pro - N - CHRS' - (i") \0 kde , R^< a r mají výše uvedený význam.

Nej výhodnějšími sloučeninami jsou sloučeninavzorce,. III.

sloučenina vzorce IV

Civ; 12

a sloučenina vzorce V

(v) U peptidu se předpokládá, že má afinitu k aktivnímu místu proteasy trypsinového typu, jestliže má tentopeptid hodnotu disociačni konstanty 10 M nebo nižší.

Sloučeniny obecného vzorce I, kde X je-NH-C(NH)-NHg lze připravit reakci . sloučeniny obecnéhovzorce I, kde X je -NHg, reakcí s kyanamidem v organickémrozpouštědle za působení silné kyseliny. Sloučeniny, kdeX je -NHg ";'lze"zase připravit hydrogenaci sloučeniny obeněho vzorce I, kde X je -Ng. Hydrogenace se může provádětza standardních podmínek, například za použiti palladiana uhlí jako katalysátoru.

Sloučeniny obecného vzorce I, kde X je -Ng , lzpřipravit reakci sloučeniny obecného vzorce VI

CH - B 12 Z1

I \ (VI) 13 kde 17, Y, Q} a mají výše uvedený význam a R^ Je-A-Er, kde A má výše uvedený význam, s azidem sodnýmv polárním aprotickém rozpouštědle, jako je dimethyl-sulfoxíd, Sloučeniny obecného vzorce I, kde X je alkyl-thioskupina, lze připravit reakci sloučeniny obecnéhovzorce VI s thiolem v přítomnosti organické base, jakoje guanidin,

Meziprodukty obecného vzorce VI, jakož i slou-čeniny obecného vzorce I, kde X je -SifCH^)^ nebo alko-xyskupina., lze připravit reakcí .sloučeniny obecného vzor-ce VII 13

Op

kde 0, a. mají výše uvedený význama R1 je skupina-A-Br, -A-Oalkyl nebo -A-SifCH^jg , kde A má výše uvede-ný význam, se sloučeninou vzorce LiM/Si' načežse provede hydrolysa ne 3 molárními ekvivalenty kyselinya kopulaci s chráněným peptidem obecného vzorce VIII

kde v.' p Y máji výše uvedený význam.

Reakce se s výhodou provádí v bezvodém apro- tickém polárním rozpouštědle, například v tetrahydro-furanu, při teplotě mezi -78 °C a teplotou místnosti. 14

Meziprodukty obecného vzorce VII lze připravitpostupen podle práce Matteson a j. , Organonetsllics 3,1284-8 (1984),

Obráněný 'peptid obecného vzorce VIII lze připra-vovat postupy běžnými v chemii peptidů,, přičemž se vycházíz požadované nepřířodní aminokyseliny. Tyto aminokyselinyjsou bu3 obchodně dostupné ( napři klad .* ninokyselina , kde”ll J2' s'<uí:)ins vzorce cV.nebo jo lze připravit postupyεπεlogickými postupům popsaným v literatuře, napříkladAncew, Chem. £3, 7S3 {1S81) n 3. Am. Chem, Soc. 109, 6881 (1S87).

Sloučeniny obecného vzorce I jsou použitelnéjako inhibitory protaas.trypsinového typu a lze je pou-žit ir, vitro pro diagnostické a mechanické studie těch-to enzymů. Dále je lze, vzhledem k jejich inhibičnimu pů-sobení, použít při prevenci a léčení chorob způsobenýchnadbytkem enzymu v regulačním systému, například ks kon-trole koagulace řibrinolysního systém,u.

Ty sloučeniny podle vynálezu, které jsou inhi-bitory throrsbinu nebo faktoru Xa, mají antithrombogennívlastnosti a lze je použít vždy, je-li třeba podávatantithronbogenní Činidlo, Obecně se tyto sloučeniny podá-vají hostiteli orálně nebo parenterálně, čímž se dosáhne,tantithrombogenního 'účinku, V případě větších savců, jakojsou lidé, se sloučeniny mohou podávat samotné nebo v kom-binaci s farmaceutickými nosiči nebo ředidly v dávce od0,02 do 15 mg/kg tělesné hmotnosti a s výhodou 1 až 10mg/kg, čímž se dosáhne antithrombogenniho účinku. Slouče-niny lze podávat jako jednu dávkutnebo v rozdělených dáv-kách nebo jeko přípravek se zpožděným uvolňováním. Má-libýt pro pacienta zřízen mimotělní krevní oběh, podává se0,1 5Ž 1 mg/kg intravenosně. Pro použití u čisté krve sek zabránění koagulace použije od 1 do 10 mg na 1 litr. 15

Jako farmaceutická ředidla lze použít známé látky, jakocukry, škroby a vodu, jejichž pomocí lze připravit table-ty/ kapsle, iniikovatslné roztoky a pod. Sloučeniny podlevynálezu lze dále přidávat ke krvi za účelem zabránění je-jí koagulace v jejich sběrných nádobách, v trubkách neboimplantačním zařízeních, ve kterých se krev přechovává. Výhodou sloučenin podle vynálezu je jejichorální účinnost, rychlý náběh účinnosti a nízká toxicita.Navíc nají sloučeniny podle vynálezu specielní použitípři léčeni jedinců, kteří jsou hypersensitivní na slouče-.n.iny'_,_].a.k.o—j.e_h.epa.r-in.._—-—:- '""—:--—s-:—i V následujících příkladech mají použité symbolynásledující významy : Z = benzyloxvksrbonyl . .

Boc~ terč.butoxykarbonyl· ňAcMsOHEtOAčDGGHONSuOPinTHF· .n-3uNpTLCBzl -B s a——-————— TMSslAdslMaphal .

BoroCrn

BoroArg

Adgly

Bo roProOPin =—a'ce'ťyl — " = methylalkohol - ethylacetát =. tíicyk lohexylks rbodiimid'. = N-hydroxysukci.nimid’ = pinandiol = tetrahydrofuran= n-butyl= p-nitrofenyl = chromatografie na tenké vrstvě= benzyl =—NH-GH-(-GH-2-CH-2-GH-oBr-}-B—> -- = trimsthylsilýlalsnin= adaman tyla lanin - 2-naftylalsnin =·. -nk-ch-{ch2ch2ck2^h2)b- = -NH-CH-/CH2CH2CH2NHC(NH)NH2/B-= 1-adamantylglycin = anelog prolinu, kde -COGH skupina jenahrazena skupinou D-CPjn _ = -NH-CH«(CH2GH2CH2eH2NH2}B-

BoroLys - J6 -

BoroHArg - -NH-CH-(CH^CI-^CH^CH^NHC(WH)ΗΗ£)B-

BoroHpg = -NH-CH-(CH2CH2CH2-0CH3)B- p-OH-Me-Phal - p-hydroxymethvl-fenylalanin p-T3DP5-O-Me-Phol - p-terc.butyldifenylsilyloxyr.ethyl- fenylalanin.

Kinetické pararetrv K. , l< a l< se stanoví. ... „ 'i on o τr . jako. inhibice enzymem kstaiysovsné hydrolysy peptid-arc-pNa. Hydrolysa poskytuje p-nitroanilin s jeho uvolňovánív závislosti na čase se kvantifikuje měřením optické pro-pustnosti při 405 nm, Stanovují se tak rychlosti inhibo-vsnýcb a neinhibovaných reakcí.

Kinetická měření se provádějí ne testovací des-r;tičce s S6 prohlubněmi kombinované s kinetickým čtecím 7zařízením s jednou buňkou. Aktivní místo lidského throm-binu se titruje tak, že se rozpustí v 0,1 M fosfátovémoufru pH 7,4 obsahujícího 0,1 M NeCl 3 0,1 % albuminu zhovězího sera ne zásobní roztok obsahující 400 nH aktiv- £ního enzymu. Pro chromogenní test se tento roztok rozpas-·;ti ve stejném pufru na 0,4 nM. Substrát, 2AcOH-H-D-cyklo-

: hexyl-ale-arg-pNa, se rozpustí ve stejném puf.ru ne 0,5 mM koncentraci. Inhibitory se nejprve rozpustí ve směsi "" ...............* cremophor/ethanol-1:1a.pak se zředí destilovanou vodou . · na 1 mM zásobní roztok. Další zředění se provádějí výše popsaným fosfátovým pufrem.

Testy se iniciují přidáním 100 ^ul enzymovéhoroztoku ke směsi obsahující 100 ^ul inhibitoru s 50 ^ul .? roztoku substrátu. Uvolňováni p-nitroanilinu hydrolysou Λ psptidyl-p-nitroanilidu jako substrátu se sleduje 30 mi-nut až 1 hodinu měřením zvýšení optické propustnosti při405 nm. Získaná data se použijí pro výpočet kinetickýchparametrů v přítomnosti a . bez pří tomnosti. inhibitoru,· I když se nevylučují jiné mechanismy účinku, charakte-risace této skupiny inhibitorů thrombinu se omezuje nadva hlavrí pozorované mechanismy, jmenovití na rychlou, 17 reversibilní a pomalou, pevně vázanou kompstitivrí inhi-bici. Kinetické konstanty těchto inhibitorů probíhajícírychlým reversibilně vázaným mechanismem, jmenovitě rych-lou vazbou (s počáteční' rychlostí νθ kontroly > v s inhi-bitorem) při » Et (celková inhibiční koncentrace/cel-kova koncentrace enzymu) se vypočítávají lineárně regre-sivní retočou z křivky 1/v proti koncentraci inhibitoru/1/. .Hodnota K se vypočítává ž horizontálního průsečíkuKi,app rovnici (1) K. = K, (1 + S/K.,)i, a p p í ' ' M' □estliže rychlost interakce s enzymem je pomalá (v neníovlivněna inhibitorem) a pevná (K je blízké nebo nižší ^ζ,,Ε^^.^ί^Ίΐ.,—ζ.β^Ξ.Ξ—ϊη^.Ι'όίοΒ-ηο-ν-ηονο-ζ-ηέ—r-yc-h-l-o;s:td—d.ojsaíhi-jrj:»:pouze pomalu, průběh tvorby pNa je pak popsán rovnicí (2) P = V t +r: (V -V 'iK O S ' •/l-exp(-Kobst)/ (2) l< obs kde P je množství vzniklé pNA za dobu t, VQ je původní rychlost, V je rychlost v rovnovážném stavu a K . ieS ODS* zdánlivá celková reakční rychlost jako funkce Ε* , IK, app 5 P°20rovsr|é rychlostní konstanty druhého řádu_(.K )_pjio_i.n.t.ers k ci-m e z i—i n h i-b-l-t o-re m-a—e nz ymem—Ú c z měření pomalé, pevně vázané inhibice se zpracují rov-nici (2) nelineární regresní analysou, která poskytnevýpočty Kob6. Hodnoty pro κ'η , Koff a epp se pakzískají z grafu versus /1/. Hodnoty pro Κθ^ jsou dány vertikálním průsečíkem, zatímco hodnoty Kfa K sé vypočítávají ze strmosti a horizontálníhoprůsečíku , popřípadě použitím rovnice (1), on ιε Příklady provedeni vynálezu Příklad 1

Boc-Trí5al-Pro-NH-CH/(CH0)^N0/DOPin A) Soc-D-TCSnl-Cr · ... D~~M3a1-ethylester (21,5 g, 113,7 mmol), připra-vený postupem podle Ángew, Chem, 93, 793 (1981), $s roz-pustí v CH2GI2 s přidá se roztok nadbytku Boc^O v CH^C^. , Po 15 hodinách při teplotě místnosti se přidá 50G mlledem ochlazené .0,25 N kyseliny chlorovodíkové. Organickávrstva se promyje 5 % NaHCO^ ε roztokem chloridu sodného,potom se vysuší Na^SO^ a zahustí se ze sníženého tisku.

Surová látka (bezbarvý olej) se použije přímove znýdelňovacím stupni. Rozpustí :e v nethsnolu, ochla-dí se na 0 °C, smísí se s 510 ml 1M NaOH a míchá se přiteplotě 0 QC po dobu 3 hodin. Po okyselení 1N kyselinouchlorovodíkovou na pH 1 se směs několikrát extrahuje ethe-rem, Organické vrstvy se spoji, promyji roztokem· chloridusodného, vysuší se Ňa2SO a zahusti se ze sníženého tisku.Produkt (29,7 g oleje) se použije v dalším stupni bez dal- '‘**sího čištěnir**“*^ “ ' " B) Boc-D-TMSal-Pro-ONSu 'Boc-D-TMSal-OH (29,7 g, 113,7 mmol) a p-nitro-* fenol (19,0 g, 136,3 mmol) se rozpustí v EtOAc. Po ochla- zení na 0 °C se přidá DCC (23,4 g,'113,6 mmol) a směs semíchá 1 hodinu při teplotě 0 °C a potom 15 hodin při te-plotě- místnosti, Sraženina se odfiltruje a promyje EtOAca filtrát se zahustí za sníženého tlaku. Vzniklý olej seČistí rychlou chromatografii (9:1 hexan/EtOAc) a získá sepožadovaný produkt Boc-D-TNSal-ONp ve formě bílých krys-talů.

Boc-D-TMSs1-ONp (51,6 g, 113,7 mmol) se rozpus-tí v THF a přidá se vodný roztok ekvimolárních množstvíprolinu a St^N. Po 20 hodinách při teplot’ místnosti ssTHF odstraní za sníženého tlaku a vodný zbytek se zředívodou a potom se několikrát extrahuje EtOAc. U vodnévrstvy se hodnota pH upraví na 3 přidáním 10 % kyselinycitrónové. Vzniklý olejovitý produkt se. několikrát extra-huje EtOAc, Spojené organické vrstvy es proryjí roztokemchloridu sodného, vysuší se Na^GO .? zahusti se za sníže-ného tlaku. Bezbarvý olej se překrystaluje'ze směsi ethe- ru a hexanu a zí"čk_á se dipept"i“d—Boč^D-THSš^l~PrO^OH—j3"k“ob i 1 é_ k rys tel i c k á__s 1 o uč en.i na_, teplot s_ _t á_n i__l 76 _° C,____________ Získaný dipeptid (26,0 g, 72,5 mmol) se rozpus-tí v EtOAc. Po ochlazení ns’ teplotu 0 °C se přidá HGNSu-(-S-r8-e—S5-r^-mme-j-1 —a -DOG —.(-1-4-S-g-—7-2-,-3-m m o-l-i,-—Gm^s^e-e—m-í chá při teplotě C 0 po dobu 3 hodin ? potom při- teplotěmístnosti dalších 15 hodin, Směs se znovu ochladí na Odic.yklohexylmočovire se odfiltruje, a několikrát se pro- myje EtOAc. Filtrát, se- promyj e . vodným- 0,1. H Na^COg a po-,tom vo.d.ným.· 2 % KHSO^,.

Po vysušení Νο^θΟ^ a zahuštění za sníženého tlaku se získá Boc-D-TMSal-Pro-ONSu ve forma bílé pěny. o,. C) Boc-D-TMSsl-Pro-Bas-OPin

Tento příklad popisuje třístupňový postup pro-vačfěný v jedné ná"cioUě~ktérý zahrnujě-iTr"ší“ťu“tvorblTchirálního bistrimethylsilyl}amidoboronátu, hydro- lysu dvou trimethylsilylových skupin a kopulaci taktovzniklého <-aninoboronátu s aktivním esterem (Boc-D-TMSal-Pró-ONSu) připraveným vs stupni 8. Všechny stupněreakce se provádějí v atmosféře argonu, Chirálni5^-chlorboronát (( + j-pinandiol-(S)-l-chlor-4-bron-butan-l-boronát1 (1,75 o, 5,0 mmol) se rozpustí v 2,5ml THF a přidá se k předchlazenému (-78 °C) roztoku - 20 lithiumhexamethyldisilazenu (5 mi 1,0 M roztoku v hexanu, Λ 5,0 mmol), Po 30timinutovér.i míchání při teplotě -78 °C seroztok nechá přes noc ohřát na teplotu místnosti. Potom se «- znovu ochladí ne -78 °C r přidají se 3 molérní ekvivalentykyseliny chlorovodíkové v dioxanu. Směs se. ohřeje na teplo-tu místnosti a míchá se při této teplotě po dobu 2 hodin. 'Po opětovném ochlazení na -20 se přidá roztok aktivní- ho esteru ze stupně E (2,28 g, 5,0 mmol) v 6 ml CH2C12 apak se přidá 1,3£ ml (10,0 mmol) triethylaminu,

Reakční směs se míchá 1 hodinu při teplotě-13 °C, pak se nechá ohřát na teplotu místnosti a míchá sepři této teplotě po dobu 2 hodin. Potom se směs přefiltru-je, filtrát se zahustí za sníženého tlaku, zbytek se zředíetherem a promyje se 2 N kyselinou chlorovodíkovou, 5 %NaHCO^ a roztokem chloridu sodného. Organická vrstva sevysuší NsoS0^ a zahustí se za sníženého tlaku. Zbytekstáním vykrystaluje a získá se požadovaný chirální psp-tid-boronát ve formě bílé krystalické sloučeniny, D) Boc-D-TMSal~Pro-NH-CH/(CH2)3N3/B0Pin

Boc-D-TMSal-Pro-Baa-OPin, produkt ze stupně C,(804 mg, 1,2 mmol) se rozpustí v 13 ml dimethylsulfoxidu -a přidá se azid sodný (155 mg,'2,4 mmol). Směs se míchá" 3 hodiny při teplotě místnosti. Přidá se ether a ledovávoda s ze směsi se ihned začnou vylučovat bílé krystaly.Bílá sraženina se odfiltruje a promyje etherem. Získá se • 0,6 g azidu ve formě bílé krystalické sloučeniny.

Přiklad 2

Boc-D-TMSal-Pro-BoroOrn-OPin

Azid z přikladu 1 (559 mg, 0,9 mmol) se rozpus-tí ve 25 ml EtOAc a hydrogenuje se v přítomnosti 0,5 g

1

C i 21 10 % palladia na uhlí. Po 2,5 hodinách se katclysatór od-straní a roztok se zahustí za sníženého tlaku. Získá sebíl-á-pěns, kt-erá se -překrystelu je- ze -směsi EtOAc..3 ..ethe-ru a získá se požadovaný produkt ve formě bílé krystalic-ké sloučeniny, teplota tání 200 =ž 202 °C, = -11,0 (c - 0,5 v MeOH). Příklad 3

Boc-D-TPISal-Pro-BoroArg-CPin (benzensulfonát)

Boc-D-TMSs1-Pro-BoroOrn-OPin z příkladu 2(-250 mg,, -074Í2 mmol") se r-oz pustlí v.e.2 Γπί 1 e t h a no 1 u. P ř řdáse benzensulfonová kyselina (65.,2 mg, .0,412 mmol)... Reakč-ní směs se míchá 15 minut' při teplotě místnosti, přidá se=lčyaŤŤaWi=d=(-S6=6=m-g==2-=0^=mm-o-l->==a==sn:č:s==s:s=p:O:t:O:m—z3:h:ř-i-y3==k-====^=varu pod zpětným chladičem. Vývoj reakce se sleduje RP-TLC,přičemž se pozoruje úbytek skvrny ninhydrinu z'výchozíhoaminu, a ,objeven.í se Saloguchiho:· pruhu- produktu.Po 7. dnecoykdy již .nebyl· detekován žádný amin , se. roztok zahustí .zasníženého tlaku. Zbytek se- rozpustí v MeOH a chromatogra-fuje se na koloně 5 x 55 cm Sephadexu LH-20 za použitíMeOH.

Požadovaný produkt se získá ve formě bílé pčny,/</D20 = -45,3 0 (c = 1 v CH2C12). ._P_ř—í_k—l_a__ d___4_________________________________ ________

Boc-D-TM3al-Pro-HH-CH((CH7)3N3)B-0Pin A) (+)-pinandiol-(S)-l-chlor-5-brompentan-l-boronát 4-brom-l-butsn (20,8 ml,'203,3 mmol) se nechársacovat s katecholborsnem (24,4 g, 203,3 mmol) při te-plotě 100 °C po dobu 16 hodin. Surový produkt se vakuo- 22 νΐ;: předestiiuje &amp; zinká se 4-brombutan-l-boronát v? for-mě- -b-il.é-4<-py.s£&amp;l.ické_.šlo.u.č.e.oi.c.y,_______________ „ _______ (+)-pinandiol (27,7 o, 163 mmol) se rozpustí v 'THF a přidá se výše připravený 4-brombutsn-l-bůronát (41,6’g, 163 mmol); Po 1 hodině .při teplot’ místnosti se -THrodstření za sníženého tisku ε zbytek se čisti rychlouchromatografií (20:10 hexan/EtOAc), Získá se (+)-pinan-diol-4-brombutan-l-boronát ve forrS bezbarvého oleje.

Požadovaný (+.) -pins ndiol - (S) - l-chlor-5-brom-pentan-l-boronát se připraví’postupem 'podle práce popsanév Organometsllics 3, 1284 (1284), Methylenchlorid (2,8 ml)v THF-se ochladí na -100 °C a během 20 minut se přidán-butyllithium (71,6 ml 1,6 M roztoku, 114,5-mmol). Po15 minutách při teplotě -100 °C se přidá studený (-78 Ό)roztok ( + )-pinandiol-5-brompentsn-l-boronátu (32,8 c, 104,1 mmol) v THF, Po další 1 hodin“ sa při teplotě-100 °C přidá bezvodý ZnCl9 (7,1 g, 52,0 mmol^ v THF,

Po dalších 15 minutách při teplotě -100 UC se reakčnísměs ohřeje na teplotu místnosti a míchá se při této te-plotě po dobu 2 hodin. Rozpouštědlo se odstraní za sní-ženého .tlaku , zbytek se zředí směsí hexanu a vody a ex-trahuje se několikrát hexanem. Po vysušení Na^SQ^, a od-stranění rozpouštědla za sníženého tlaku se získá{+)-pinandiol-(S)-l-chlor-5-brompentan-l-boronát ve for-mě žlutého oleje, který se použije přímo v následujícímstupni bez dalšího čištěni, 8) Boc-D-TMSal-Pro-NH-CH( (CH2)4Br )E5-0Pin

Roztok LiN(Sif'íe3)2 (65,2.ml 1,0 M roztoku, 65,2 mmol) v THF se ochladí na -78 °C, Přidá sě oč-chlor-boronát ze stupně A). (23,7 c, 65,2 mmol) v THF, Směs semíchá při teplotě -78 °C po dobu 1 hodiny a potom přiteplotě místnosti po dobu 15 hodin. Potom se reakční srnčeznovu ochladi na -78 °C, přidá se kyselina chlorovodíková 23 (29,8 ml 6,56 N roztoku, 196 mmol) v dioxenu, roztok semíchá při teplotě -78 °C po dobu 45 minut a potom při te-plotě místnosti po dobu 2 hodin. Směs se ochladí na -15 °C,přidá se Boc-THSal-Pro-ONSu (29,7 g, 65,2 nnol) podle při-kladu l.v methylenchloridu, načež .se přidá triethylanin(18,1 ml, 130,4 mmol), čímž se nastartuje kopulační reakce.Při teplotě -15 °0 se směs míchá 1 hodinu a potom 2 hodinypři teplotě místnosti. Směs se přefiltruje přes Hyflo azahustí se zs sníženého tlaku. Zbytek se zředí směsíetheru a vody a extrahuje se několikrát., etherem. Po. vysu-šení'Na^SO^ a zahuštění za sníženého tlaku se získá poža-dovaný produkt Boc-D-TMSal-Pro-NH-CH( (CHg^Br)B-OPin, "krteΓγ““ρο"Ί<rysta Γί seci"Te“ s”mě si_-st hěrV'V"h‘e)^ír^TI<yYňsbílou krystalickou sloučeninu, teplota tání 74 °C, C) Eoc-D-TMSsl-Pro-NH-CHf ÍCH„) ..N„W-0Pin_ . ..... ______________ - · £. O O ’ -...... .............xi 1

Produkt ze stupně B) (33,3 g, 48,8 mmol) sa roz-pustí v direthylsulfoxidu a přidá se azid sodný (5,3 g, 97,2 mmol). Peakční směs se míchá při teplotě místnostipo dobu 6 hodin, Přidá se ether a ledová voda a směs seněkolikrát extrahuje etherem. Po vysušení Na2S0^ a za-huštění za sníženého tlaku vzniklý olej vykrystaluje. Získá se E3oc-D-TMSel-Pro-NH-CH( (CHO) No)B-0Pin ve forměbílé krystalické sloučeniny, teplota tání 69 až 70 °C,očD = -74,4 0 (c = 1,0 v HeOH). Příklad. 5

Eoc-D-TMSal-Pro-BoroLys-OPin

Azid z přikladu 4 (22,0 g, 34,0 mmol) se roz-pustí v EtOAo a hydrogenuje se v přítomnosti 4,0 g 10 %palladia na uhlí. Po 9 hodinách se katšlysátor odstranía roztok se zahusti za sníženého tlaku. Vzniklá pěna se 24 rozpustí v EtOAc s překrystelováním se získá požadovanýprodukt Boc-D-TMSsl-Pro-BoroLys-OPin vc fornč bílých krys-talů, teplota tání 126 sž 129 °C, = -59,6 ° (c = 1,0 v MeOH).

Prik’l3Ó6 .....

Boc-D-TMSal-Pro-Borowrc-OPin (benzensulfonát'

Benzensulfonát sloučeniny Boc-D-TMSal~Pro-BoroLys-OPin z příkladu 5 se rozpustí v ethanolu, Přidáse kyenanid (210 mg, 5,0 nmol'! a. směs se zahřívá k vsrí.Průběh reakce se sleduje RT-TLC, přičemž se pozoruje úby-tek skvrny ninhydrinu z výchozího aminu a objevení seSskacuchiho pruhu produktu. Po 7 dnech, kdy již nebdetekován žádný amin, se roztok zahustí- ze snížsnéhku. Zbytek se rozpustí v MeOH a chronatografuje se na ko-loně 5 x 55 on Sephadexu LH-2Q za použiti MeOH,

Požadovaný produkt se získá ve forr.ě bílé pony,o c^D = -40(,8 w (c = 0,5 v CH2C12), Příklady 7 až 29

Postupy analogickými postupům podle příkladů1 až 6 se připraví sloučeniny obecného vzorce

W - NH

CH - CO - AA

N - CH

\ R, kde R4 , R5* , R1X , + v následující tabulce I, °2 11 «2 a AA mají významy uvedené Ό X) X) X X3 X X X X X X Ή •Η •H •H •H H rl rl ‘H *rl Ή 1- !_ L. u L 1_ L u U - ·. - ... ........— = o — - o -0- O O O - o -0 0 0- - -O- O- ’ 1 · '— rH rH r-i rH (-1 i—t rH rH rH 44 rH 44 rH - rH X) X JD -C -C -C JO JO J0 *© JO Ό JO >© o o o u o u u u 44 ϋ 4-f o o • 44 c c c c c c c c o r· G £ c >© t—l a) 03 0) 03 o C) rH o o o © © © G © o rH rH rH f—1 rH rH o Γ—1 o (—1 G i—E rH 0 c > s'' r* c > rH rH CL a J© JZ _c jz c~ S1 «3 JO JO >. -Z > c~ <— c. N JL 4-» 4> 4J 4-J J-* (— 44 4-J JO 44 f— 4J 4-» ' o 44 '03 03 © © G o 4-J 03 03 4-> 03 44 o 03 L © e £ E ε ε E 0 Ξ E © Έ G E G rH r—1 M- LT ϋ in o n in o in LT) LCO M· LT o LT LT b- LT O o O t—í o O O o O rH O O O O — - .......- - ' ’ --· -.......-Q_______ ~o_._ 0 _Q.... u o_ o... p_._ o .o... o „o_. o__ C'^_ o O ...-----...--------- O o o (X O CO 04 co o r- X o CD O CD r< in ·? •N CD O 04 co i—1 04 LT O CD CO cm r- ID m 140 CO r-H co in 00 rH 1 1 1 1 1 1 t 1 1 '1 1 1 1 + 1 ----------------- - ··-......— - ------------- .... — - - - - ... - ‘ ’ - ------- .. —-—----------— < o o o o O o o o o c o o v X-*' o CL Iw =CL— Im =Cl— Cl- ±lL“= L> k_ =Cr=:r— kb -lCL =r^ L ΖΌ_ u =P.= u -S= rH L Zq_ —r-n-- ιη04 ·

CG JJ. f-i □ 'J3

CG t-

CM O' + —c O'

CZ

(Z

i—lrH cj .» I—i *rl

CL

r—> <0 CG CD CG r'·’. CO rá CO *— CO co co í^l CO 04 04 04 04 0J 04 X X x X X ". X . '2 z z 2 z 2 r-"- CM X X X X X χ X 2 CO co 2 2 2 z 2 2 © o ·— _04 1 O Σ o CD O O 04 CD co i CO ·Η •H X X X X X . j. 2 ' 2 2 ω ω 2 2 z Z 2 2 1 04 - CO M- CM 04 co CO M" Μ1 M- CO 00 X ·— x— y—κ a - cm 04 - 04 04 CM 04 04 CM ' 04 04 04 i- X X X X x- X X X X .. X . i cd : CD o1 CD (D CD CD CD CD CD CD

_0J ž

I I 04 04

X X2 2I I X. X.O o

I I I I X X X X X X X X X u. X j. X X X ιΤ·- u O e 0) O υ G o G © Ό © Ό u o ó υ ϋ o O o O . O U u O L) O o o 0 o υ O o O O O o Ó u O' ω m G3 £0' m < ω ω £□ m CD CQ ca < a i^coooncMco^finioisoci o 04 pokračování tabulky

n Ό Ό rl Ή 1_ 1_ 1_ o o o O 1-1 rH rH rH Ό X X X X!) u o o c c c f—1 r—1 rH r-í >U) (D o 0) o ř-l o o o □ i—1 r—1 ι—1 c o e e c o > >- >· o E CD CQ <3 a X X X X ro X X r~ N J-J 4-» X 4-t +-f o G (D o C) +J o o o (. E E E E o Έ ,E Ξ CM 0 U"> in in O in LO n LO » * “ * « · * “ * o o o i—l o o o o o CM o o o 0 0 0 0 o O > o 'í ta N tů CO CM č to m M- ’ΐ o co ' n r* CM ω rH co 1—1 LO tf> ' 1 1 1 1 1 1 1 1 < 0 O o > > a o 0 < 1_ 1- 1_ r-S t—ΐ ω 1_ u Cl X Cl o o < a CM O* + 1—l Χ~Λ x—Λ X"^ χ—. χ-^ O1 (0 CD CQ co <c co <0 <0 CM CM J. X z Z χ-^ z X s z z LO in CM X or CO I o ό CM CM CJ CM Z Z X JL X X X O 1 i z z z —? z O n CO ω M· Tt co χ—s *—·» x—\ x-^ X" CM CM CM CM CM CM OJ CM X X X X X X X X O υ O O O O o o t 1 1 1 1 1 1 Tt C£ X I X X X X X X rH r~j x-v X“> X^v X**·· Qí 4- 4- o TO Ό Ό TO o u o o o o o 5 o o o 0 O O o CQ co ta ω CO CD X CD * i—l Ή K. CM CO 'Μ- to to Cs CO 0) a CM (M CM CM CM CJ CM CM 27 Přiklad 30

Boc-D-THSal-Pro-BoroE-ipg-OPin· A) (+}-pinandio1-(S)-1-chlor-4-methoxybutan-l-boronát 3-msthoxy-l-propen (6,0 g, 83,3 mmol) ss necháreagovat s kstecholboransm (10,0 g, S3,3’mmol) při teplotě 100 °C po dobu 24 hodin. Surový produkt se předestiluje za sníženého tlaku a získá ss 3-methoxypropsn-l-boro- _ná-t—v-e—f-o-rn.’_b-ez.ba.r-v-ého_o.l.ej-s.í_(_+_)_^pi.n.a.n.di.o.l_(.10:,^_g.,_: 62,5 mmol) se rozpustí v THF a přidá se k němu výše při-pravený 3-methoxypropar-í-bororiát (12,0 g, 62,5 mmol).

Po 1 hodině při teplotě místnosti se THF odstření za snízeného tlaku s zbytek se čistí rychlou chromatografií_(O0T20_lŤ®^^ĚT0ě^')T^^!cá—š^(^)^dí~haŤŤ3rbd?^O—mo-t-hb-x^^^^2propan-l-boronát ve formě bezbarvého ůle-je.

Požadovaný ( +)-pinandiol-(3)-l-chlor-4-mothoxybutan-l-boronát se připraví postupem podle Orgsno-mstallics 3, 1284 (1084). Methylsnchlorid (2,2 ml) v THF.se ochladí na teplotu -ICO’°C e. běhen'20 minut se'přidá'n-butyllithium (13,8ml 1,6 M roztoku, 22,0 mmol). Po 15minutách při teplo.t" -10C °C ss přidá roztok (+)-pinsn-diol-3-msthoxypropan-l-boronátu (5,04 g, 20 mmol) v THFa dála 53 přidá bezvodý ZnCÍ2 (1,42 g, 10,0 mmol). Podalších 15 minutách oři -.100. °C sa reakční směs ohřeje· -n a—te p-l-o-t-u—m-í-s-t-n o s-t-i—a—p ř-i—t-é-t-o—t-o-p 1 o-t-ě_se—m.i.c.h ó-p.o_d.Oj=-bu 2 hodin, Rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku,zbytek ss zředí etherem a promyje se vodou. Organickávrstva se vysuší Na^SG^ a zahustí sa na olej, který sečistí rychlou chromátogrsfií (S:l hexan/ntOAc) a získáse požadovaný (+)-pinandiol-(S)-1-chlor-4-metnoxybutan-1-boronát ve formč bezbarvého oleje. 28 B) Boc-D-TFiSs 1 -Pro-8oroHpg-OPin

Roztok LiN(Siřt33)2 (5 ml 1,0 l·; roztoku, 5,0mmol) v THF se ochladí na -78 °C, Přidá se c/--chlo rboro-nát ze stupo“’ A> (1,53 g,,.5,0 mmol) v THF, Smis ss míchá. 1 hodinu při -78 °C e'potom 15 hodin při teplotě místnosti.Potom se reekční''snšs znovu ochladí ne'-78 °C, přidá ss ’ ·kyselina chlorovodíková (2,,7 ml 5,65 N roztoku, 15,0 mmol)v dioxanu a roztok 'se míchá 30 minut při teplotě -78 °C opotom 2 hodiny při teplotě místnosti. Směs se ochladí na-15 °C, přidá se Boc-TMSal-Pro-ONSu (2,28 g, 5,0 mmol) zpříkladu 1 v CH^Cl^ < načež -e přidáním triethyiaminu(1,35 ml, 10,0 mmol) nastartuje kopulsční reakce. Směs «. se míchá 1 hodinu při teplotě -15 °C a potom 2 hodiny přiteplotě místnosti. Směs se přefiltruje přes Hyflo a za-husti ss za sníženého tlaku. Zbytek se zředí EtOAc a pro-myje se 0,2 N HC1, 5 % NaHC03 a nakonec roztokem chloridusodného, Po odstranění rozpouštědla se získá olej, kterýse čistí rychlou chromátografií (EtOAc) a získá se Boc-D-TMSsl-Pro-BoroMpg-OPin ve formě bílé pěny, cC - -48,8 0. (c = 0,25 v CH2C12). P ř i k 1 s d 31

Boc-D-(p-(TBDP5-0)methyl)Phal-Pro-BoroOrn-OPin A) Boc-D-(p-((1,1-dimethýlethyl)difenylsilyl)oxy)methyl-fenylalanin

Aby se selektivně redukovala ázidoskupina v sub-strátu, přidá se thioferol (7,27 g, 66,0 mmol) k suspen-si SnCI2 (3,12 g, 16,5 mmol) v CH2C19 , Přidá se triethyl-amin (6,8 ml, 4S,5 mmól) a získá se žlutý roztok. Dále sepřidá Boc-anhydrid (4,8 g, 22,0 mmol) a potom (3(25),45-3-(2-azido-3-(p-((1,1-direthyl)difenyl-silyl)oxynethyl)- fenyl-l-exopropyl)-4-(fer.ylmethyl)-2-oxazolidinon (%óe £5 ,6,8 g, 11,0 mmol), připravený postupem podle 0, Am, Chem,Soc, 1QS, 6881 (1987), ve formě roztoku v CH^Cl^ . Směs semíchá 2,5 hodiny při teplotě místnosti, potom se zředísmísí EtOAc a 2 Ν’ NaOH í přefiltruje se přes Hyflo. Organická vrstva se proryje 2 %' vodným NsHSO^, 5 % vodnýmNaHCO^ a nakonec roztokem chloridu sodného, Po vysušeníNs-30^ ε zahuštění za sníženého tlaku se získá žlutý olej,který se čistí rychlou chromatogra.fií a získá se (3(2S),-4S)-3-(2-(((terc.butoxy)-ka rbonyl)amino)-3-(p-(((1,1-dimet hýla thyl.) ci.f enylsilyl) oxy)-methyl)-ý e.nyl-l-o.xoprcypyl)-4-(fenylmethyl)-2-oxazolidinon ve formě bílé pěny.

Tato sloučenina (2,0 a, 2,88 mmol> se rozpustí ve směsiTHF a vody s hydrolysuje se in šitu vytvořeným LiOOH(5,76 mmol) při teplot.ě 0-°C,. Po 1,75 hodiny při - teplotě QE^l3_sa—p.čí^ž^Na^SO^E^ěl^25Eěč22ě£~-£-i^'lě)--A/-e^o7d;ě^7ETH;F2:s:s........... odstraní za sníženého tlaku, pH zbytku se upraví na 1 až2 a směs se extrahuje třikrát ctOA.c, Spojené organickévrstvy se. promyjí vodou vysuší.-.NagSO^ a zahusti .se zasníženého.·: tla.ku.. Po krystalisaci. ze směsi··..hexanu., a· ethe-ru se získá· oxszolidínon. .ve formě bílých .krystalů. Fil-trát se zahustí za sníženého tlaku a získá se požadova-ná Sloučenina uvedená v názvu ve formě bílé pěny, B) Boc-D-(p-(((I,l-dimethylethyl)difenylsilyl)oxy)-methyl)-fenylalanin-Pro-ONSu

Ke směsi titulní sloučeniny ze stupně A) (1,6 g, 2,88 mmol) a p-nit rof.enolu (0,43 g, 3,12 mmol)v EtOAc se při teplotě 0 °C přidá DCC (0,59 g, 2,88mmol). Reakční směs se míchá při teplotě místnosti podobu 16 hodin. Po ochlazení na O °C se sraženina od-filtruje a promyje'studeným EtOAc, Filtrát se zahustíza sníženého tlaku. Vzniklý olej (Boc-D-(o-TBDPS-O-Me)-Phal-CNp) se použije v dalším stupni bez dalšího Čistě- 30

Boc-0-(p-TBDPS-O-Me)-Phsl-ONp (2,2 c, 2,88t mmol) se rozpustí v THF a přidá se vodný roztok L-pro- linu (365 mg, 3,17 mmol) a Et^N (0,88 ml, 6,33 mmol).

Po 15 hodinách při teplotě místnosti se THF odstraní za sníženého tlaku. Hodnota pH se upraví na- 3 přidáním-10kyseliny citrónové. Vzniklý olejovitý produkt se extrahu-je několikrát EtOAc. Spojené organické vrstvy* se pronyjíroztokem chloridu sodného, , vysuší se NagSO^ a z.ahustí seza sníženého tlaku. Bezbarvý olej se čistí rychlou chro-matogrsfií (9:1 CH^Clg/EtOH k eluci p-nitrofanolu a potom80:20 CH^Cl^/EtOH) o získá se Boc-Q-(p-TBDPS-O-Me)-Phal-Pro-OH ve formě bílé pěny.

Tento dipeptid (1,3 g, 2,06 mmol) se rozpustí,v EtOAc, Po ochlazení na teplotu 0 °C se přidá HONSu - (220 mg, 2,47 mmoV a DCC (330 mg, 2,06 mmol), Směs seznovu ochladí na C °C, dicyklohexylmočovir.a se odfiltrujea promyje několikrát studeným EtOAc, Filtrát se proryjevodným 0,1 M NagCO^ , 8 % NaHSO^ a potom roztokem chlori-du sodného. Po vysušení Na2S04 a zahuštění za sníženého'-'tlaku ss získá sloučenina uvedená v názvu Boč-D-(p- A-TBDPS-C-Με)-rhal-Pro-CNSu ve formě bílé pěny.

’‘W C) Boc-D-(p-TBDPS-O-Me)-Phal-Pro-Baa-OPin n. ;*a

Sloučenina uvedená v názvu se připraví použi-tím třístupňového postupu prováděného v jedné nádobě, jakbyl popsán pro syntesu Boc-D-TMSal-Pro-Baa-OPin v při-kladu 1/C, Tedy meziprodukt oí-aminoboronát,vzniklý re- akci chirálního o^-chlorboronátu ((+)-pinandiol-(S)-l-chlor-4-brombutan-l-boronátu) (659 mg, 2,0 mmol) sLiN(SiMe3)2 (2,0 mmol) a hydrolysou s HC1, ss necháreagovat s aktivním esterem ze stupně B) (1,45 g, 2,0mmol) v přítomnosti Et^N (4,0 mmol) a získá se slouče- ,nina uvedená v názvu, ktérá se čistí rychlou chromato-grafií (1:1 hexan/EtOAc), .31 D) Boc-D-(p-i BDP3-0-Me) -Phal-Pro-BoroOrn-Orin " Produkt ze' stupně C)' '(68C’mg, 0,72 nnol)’se roz-pustí v dimethylsulfoxidu a přidá se azid sodný (04 nc,1,44 mmol). Reakční srnč-s se.míchá pří teplotě místnostipo dobu 4 hodin. Přidá se směs etheru a ledové vody aihned se z reakční směsi začnou srážet bílé krystaly.

Tato bílá sraženina se odfiltruje ε promyje vodou. Získáse Boc-D-(p-TBDPS-0-Me)-Phel-Pro-NH-CH((CHO)3N AB-OPinve formč bílé krystalické sloučeniny, -—.........~ —T-én-tb—azid—(-2.7.2—mg-,—Q-,-3—fnmb'li)A-'s.s—'roz.p.u.'s'-t:i—v'.......

EtOAc a hydrogenuje se v přítomnosti Lindlarova kataly-zátoru, Po 8 hodinách se katalysátor odstraní s roztok sezahustí za sníženého tisku. Surový produkt se čisti rych-· _lou chromatografií (EtOAc a pak EtOH) a získá se cožado- vsT"á—ε'Ι'οΐτδ'θ'ΓΓϊ'η'θ-uve'd'e'n'á—v—názvu-ve-fOTnrř^btrFé^běTŤyč^ ' ot = -32,4 0 (c - 0,25 v MeOH). Příklad 32

Boc-D-(p-OH-Me)-Phal-Pro-BoroOrn-OPin

Boro-ornithin z příkladu 31 (132 mg, 0,15mmol) se rozpustí v THF a nechá se reagovat f <j-Eu,.NP ’Τ (0,3 ml 1,1 M roztoku, 0,3 mmol), Po 45 minutách přiteplotě místnosti se přidá ledová vods a vzniklá sm’s ---se-e-x-t-r-ahu^-e-ně-k-o-l-l-k-Fá-t—E-t-OAc—Spo^ené-o-rgar-ic-k.é—v-r-š-t^ vy se vysuší Na2S04 a zahustí’ se za sníženého tlaku. Vzniklý olej se čistí rychlou chromatografii (EtOAc apak EtOH) a získá se požadovaná sloučenina uvedená vnázvu ve formě bílé .pěny, = -34,0 (c = 0,1 vMeOH), ' " , Λ 32 Přiklad 33

Boc-D-TMS-a1-Adgly-EoroPro-OPin A) L-l-atíamantylglycin (3(25) ,45 Ί-3-(2-azido-2-adamia nt-l-yl-l-oxoet hyl)4-{fenylmsthyl)-2-oxazolidon (%dex>25, £',86 g, 25,0 mmol),připravený podle postupu popsaného v 3, Am, Ohem. Soc. 10£6881 (1287), se rozpustí v 320 mí směsi THF a vody (3:1),ochladí se na 0 °C, smísí se sa 4 ekvivalenty peroxidu vo-díku a 2,0 ekvivalenty LiQH. Vzniklá rei’s se míchá při te-plotě 0 °0, až se substrát spotřebuje (30 minut), a per-oxid (psrkarboxylát) se propláchne při teplotě 0 °C 10 %nadbytkem 1,5 N vodného Ns^SO-,. Přidá se pufr, vodný NaHCO(pH £ ?z 10) g směs se extrahuje několikrát EtOAc, čímž seodstraní oxazolidínon jako pomocný chirální prostředek.Produkt, karboxylová kyselina, se isoluje extrakcí EtOAcokyselené vodní fáze (pH 1 až 2), vysuší se Na^SO^ azahustí se za sníženého tlaku. Požadovaná (5)-azidoadarant1-yloctová kyselina se isoluje ve formě.bílých krystalů(5,22 g) a ta se použije v následujícím stupni bez dalšíhočištění. 2(5)-azidoadamant-l-yloctová kyselina (5,22 g,22,5 íiinol) se rozpustí v,e 110 ml EtCH a 11,3 ml 2 N HC1 ahydrogenuje se v přítomnosti 0,7 g 10 % palladia na uhlí.Po 2,5 hodinách se katalysátor odstraní a roztok se za-hustí za sníženého tlaku. Získá se požadovaná aminokyse-lina ve formě hydrochloridu. Získaný hýdrochlorid se sus-penduje ve 40 ml vody s nechá se reagovat s 1,2 g pevnéhoNaHCOg, Získaná aminokyselina se odfiltruje a promyje ně-kolikrát vodou. Po vysušeni ze sníženého tlaku se získá L-1-ads'má'ntylglycin ve formě bílé krystalické sloučeniny, . /^/d2° = + 3,0 ° (c = 1,0 v MeCH). 33 -

B) Boc-D-TkiSal-Adgly-ONSu I

«I

Soc-D-TM.Sál-ONp (7,71 g, 2C,2 mmol) ž příkladu 1’se rozpustí v THF - přidá ss vodný roztok ekvimolárr í'ch o. množství l-ader.sntylglyc.inu . a Et^N. 20.hodinách při te-plotě místnosti ss THF odstření za sníženého tisku, vodnýzbytek se zředí 150 ml 0,1 N HCl » potom ss extrahuje ně-kolikrát EtOAc, Opojené organické vrstvy se promyjí roz-tokem chloridu sodného, vysuší se Na^SG^ a zahustí- se za-sníženého tlaku, Olejovitý produkt se chromstografuje na —-sinhiVa-gOlu-CCH^Clay-)— a—zí-ská—se—ďi-pept-i-ď—Boc-D-;T-MSe-1—Áďg-l-y--- OH ve formě oleje, Boc-D-TM5a 1-Adoly-OH (6,£ g, .15,2 mmol)se rozpustí v 80 ml EtOAc, Po ochlazení na 0 °C se přidáHONSu (2,1 g, 18,0 mmol·)' a DC3 (3,1. g, 15,2 mmol). Směs -se-michá—p-ř-i_t-3.pl.o-tjě_O_Ec___po dobu 3 hodin a potom _;_ dalších'15 hodin nři teplotě místnosti, Sm7s se znovu ~ ochladí na teplotu 0 UC, dicyklohexylnočoyina se odfil- truje a promyje EtOAc, Filtrát se promyje vodným 0,1 MNaHC03 a potom vodným 2 ýj KHSO^, Po vysušení NSgSC^ a za-huštění za sníženého tlaku.se získá Boc-D-TMSa1-Adgíy-ONSu (7,2 g) ve formě bílé pěny, ’ i C) Boc-D-TMSsl-Adgly-BoroPro-OPin. ?

Sloučenina .'.uvedená v názvu se připraví analo-gickým třístupňovým postupem prováděným v jedné nádobě,kferV^byl “popsán pro připraví? ~Boc-D-T-MSai - Pro - Baa-GPi-n— -v příkladu 1/C. Díky nízké í/ktivitě'stericky bráněnéhoaktivního esteru ze stupně B (2,7 g, 5,0 mmol) mezipro-dukt, cC-aminoboronát, který vznikne reakcí chirálníhoc/.-chlorboronátu (( + ) - pinondiol-(S) -l-chlor-4-bronbut5n- 1-boronát) (1,7 g, 5,0 mmol) s lithiumhexamethyldisila-zanem (5,0 mmol) a hydrolysou s HCl,.cyklisuje na boropro-linový derivát, který potom reaguje s aktivním esteremze stupně B za vzniku neočekávaného Boc-D-TMSal-Adgly- 34

BoroPro-OPin jako hlavního produktu. Rychlou chromatogra-fii (2:1 hexan/EtOAc) surového produktu se získá slouče- • niny uvedená v názvu (0,48 g) ve formě bílé pěny, která se.dále čisti rekrysta l.isscí ze směsi etheru a hexanu a získá * se požadovaný produkt Boc-D-TMSal-Adgly-BoroPro-OPin veformě bílé krystalické sloučeniny, teplota tání 187 ež' 183 °C, /<Z/D2° = +2,8 °.(c = 1,0 v CH2C12).

Průmyslová využitelnost '

Borolysinové analogy peptidů podle vynálezu lzepoužit jako inhibitory serinových proteas.

Claims (15)

1. 35

   1, ..Sloučeniny. obecného vzorce I x V/ - Y - N - CH «1

   (i) R„ □ kde—W_j é—a-tOm_v-od.ík.Li—ne.bo_N^c.h.mán.ícd—skupina-,_: 1Ξ — Y je sekvence aminokyselin zvolená tak, že n + 1 pep-tid s aminokyselinou Y-Lys nebo Y-Aro mé afinituk aktivnímu místu proteasy trypsinového typu, kde _n je celé číslo od 1 do 10 s kde alespoň jedna ami-_ ^ňO~kys'el~i~ha~j~e~n'ep'řTřd'dKÍ=^7i:TÍo:ký>s'éžňin'OU~ma-jlRfí=h:yd^ —— rofobní postranní řetězec, 0^ a , které mohou být stejné nebo různé, jsou vy-brány ze skupiny zahrnující -OH, -CCRp -CONR^R?, -NR^R^ nebo -CR3, nebo a Q2 spolu dohromady tvo-ří diolový zbytek, R^, R2 a Rg· které mohou být stejné nebo různé, jsou.alkylová skupina s 1 až 10 atomy uhlíku, arylováskupina s 6 až 10 atomy uhlíku, arylalkylová skupi-na s 6 až 10 atomy uhlíku nebo fenylová skupinasubstituovaná až 3 skupinami vybranými ze skupiny ——z-ahrnuJ-ící-a-lk-ylo-v-O-u_sk.u.p.in.u_s—l_a.žl4.-a.t_o.m_y__u.h.l.í.k.u^_______________ atom halogenu a alkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, R^ je atom vodíku nebo alkylová skupina s 1 ež 10 ato-my uhlíku, $ R^ je skupina -A-X, kde A je -(CH2)z-, kde z je 2,3, 4 nebo 5, -ch(ch3)-(ch2)2-, -ch2-ch(ch3)-ch2-. -(ch2)2-ch(gh3)-, -(CH2)2-C(CH3)2- , -CH(CH3)-(CH2)3-, -CH2-CH(CH3)-(CH2)2-f -CH2-CH2-CH(CH3)-CH2-, 36 “(CH^) g-CH(CH^) (CHg) g-C(CHg)2 : arylová skupina s 6 až 10 atomy uhlíku, arylalkylová skupina s 6 gž10 stony uhlíku, a je -NH2, -NH-C(NH)-NH2, -S-C{NH)-NHq, -Ng, slkoxy-skupina s 1 až 4 atomy uhlíku, alkylthioskupina s1 až- 4 atomy uhlíku nebo -Si(CHg)g nebo s Rg spolu dohromady tvoří trimethylenovou skupinua asymetrický atom uhlíku označený * může mít D- neboL~konfiouraci nebo znamená jakoukoliv jejich smčs.
2. 2, Sloučenina podle nároku 1, kde W jeH(CH2CH2O) -, RgCO-, R?OCO- nebo RgSO^/kde p je 3 až 30, Rg je alkvlová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku, R_, je slkylová skupina o 1 až 6 atomy uhlíku, fenyl, ben-.zyl nabo naftyl, a Rg je fenyl, naftyl nebo alkylfenvl s 1 až 4 atomy uhlíkuv alkylu.
3. 3, Sloučenina podle nároků 1 nebo 2 obecného vzorce Ia OR, (Ia) OR 10 kde V», Y, R4 a Rg mají význam uvedený v nárocích 1 nebo 2a Rg a R^g znamenají zbytek dihydroxysloučeniny. ' 4. Sloučenina podle nároků 1 nebo 2, kde Ο^ aOg spolu dohromady znamenají skupinu vzorce (a) nebo (b) 37
4. 5, Sloučenina podle kteréhokoliv z nároků 1 až-------------4, kde nepřirodní aminokyselina má obecný vzorec II---- - NH - R1X 1 CH - C[/0 (II) kde je hydrofobni skupina.
5. 6. Sloučenina podle nároku 5, kde R^jesku-pina Rji' a je to skupina vzorců (c), (d), (e), (f), (g) ,(h) nebo (i)

   38

   .7.'Sloučenina podle nároku 1, kde Y je sekvencedvou aminokyselin, z nichž N-terminélni aminokyselina jenepřírodní aminokyselina a druhá aminokyselina je L-pro-lin.
6. 8, Sloučenina podle nároku 1 vzorce III

   (III)
7. 9, Sloučenina podle nároku 1 vzorce IV 39
8. 10, Sloučenina * podle nároku 1 vzorce V
9. 11, Způsob přípravy sloučenin obecného vzorce Ipodle nároku 1, vyznačený tím, že i) když X je -NH-C(NH)-NH?, nechá se reagovat slouče-nina obecného vzorce I, kde X. je -NHj, s kyanamidem, ii)_když X je -NHg, hydrogenuje se sloučenina obecného_ vzorce I, kde X je , _ 40 λ <* , < iii) když X je -Ng, nechá se reagovat sloučenina obecné-ho vzorce VI W - Y - NH - CH - E (VI) R, kde 17, Y, a Q- máji význam uvedený v nároku 1 a*12 je -A -Br, kde A má význam uvedený v nároku 1,s azidem sodným, iv) když X je -SifCH^)^ nebo O-alkyl, nechá se reagovatsloučenina obecného vzorce VII Cl CH

   (VII) kde a mají význam uvedený v nároku 1 3 R13je -A-SiíCH^jg nebo O-alkyl, s LiN/Si(CH^)g/2 ,načež následuje kyselá hydrolysa a kopulace s chrá-něným peptidem obecného vzorce VIII í!

   (VIII) kde W s Y máji význam uvedený v nároku 1, 41 a 'i ÍVi
10. 12. Použití sloučenin podle kteréhokoliv z ná- roků 1 82 10 jako inhibitorů serinových proteas trypsino-vého" typu. ...... ........ '
11. 13. Terapeutický prostředek obsahující slouče-ninu podle kteréhokoliv z nároků 1 e.ž 10 spolu s femaceu-ticky přijatelnými přísadami a/rsbo ředidly.
12. 14. Použiti terapeutického prostředku podle ná-roku 13 pro inhibici serinových proteas- trypsinového typu. ,__15. Použití podle nároků 12 a 14, vyzná,čené tín,_ že serinovými proteasami trypsinového typu jsou throubin,faktor Xa, kallikrein, plasma, prolylendopaptidssa sIg AI proteasa._; / co
13. 15. Terapeutický-prostředek mají/ertithrombo-gsnni účinnost obsahující sloučeninu podle kteréhokolivz nároků 1 až 10 spolu s farmaceuticky'přijatelnými přísadami a/nebo ředidly,
14. 17, Foužití sloučenin podle kteréhokoliv z ná-roků 1 až 10 jako inhibitorů thror.binu.
15. 18, Nepřirodni aminokyselina obecného vzorce Ha ' i· i’'·'' «J H2N - CH - C - OH (Ha) 0 kde R·,]/' je skupina vzorců (d), (e), (f), (g), (h) nebo(i), jak jsou definovány v nároku 8.

    170409/0T Zastupuje :