RO107661B1

RO107661B1 - Derivați peptidici, inhibitori ai serinproteazei și procedeu pentru prepararea acestora

Info

Publication number: RO107661B1
Application number: RO92-200147A
Authority: RO
Inventors: Metternich Rainer
Original assignee: Sandoz Ltd
Priority date: 1992-02-13
Filing date: 1992-02-13
Publication date: 1993-12-30

Abstract

Invenția se referă la derivați peptidici, inhibitori ai serinproteazei, cum ar fi trombina, factorul Xa, kalikreina și plasmina, cât și alte serinproteaze, cum ar fi prolil endopeptidaza și proteaza IgAI, compuși care conțin cel puțin o a - aminoacid nenatural, având o catenă laterală, hidrofobă și prezintă formula generală I: Qi / W-Y^H-B (I) R» Rs Q2 în care W reprezintă hidrogen sau o grupă Nprotectoare, Y reprezintă o secvență de aminoacizi, Q, și Q2 sunt diferiți, sau împreună formează un rest dielic, R4 reprezintă hidrogen sau alchil, R5 reprezintă o grupă -A-X sau R4 și R5 formează împreună o grupă trimetilen, precum și la procedee pentru prepararea acestora.

Description

Prezenta invenție se referă la derivați peptidici inhibitori ai serinproteazei. cum ar fi trombina, factorul Xa, kalikreina și plasmina cât și alte serinproteaze, cum ar fi prolil endopeptidaza și proteaza I_eAI, 5 precum și la procedee pentru prepararea acestora.

Trombina, ultima enzimă din sistemul de coagulare, scindează fibrinogenul solubil la fibrină, care ulterior reticulează 10 și formează un gel insolubil care constituie matricea pentru un trombus. Când un vas de sânge este deteriorat, procesul de mai sus este necesar pentru a opri sângerarea. în condiții normale nu există o 15 cantitate măsurabilă de trombină în plasmă. Creșterea concentrației de trombină poate duce la formarea cheagurilor, care provoacă boli tromboembolice. una din cele mai serioase probleme ale medi- 20 cinii actuale.

Trombina contribuie la controlul hemostatic prin câteva reacții biologice. Pe lângă funcția ei primară, transformarea fibrinogenului în fibrină, trombina ac- 25 tivează factorul XIII care este răspunzător de reticularea fibrinei. Trombina acționează, de asemenea, printr-un mecanism de feed-back pozitiv, implicând activarea factorilor V și VIII, care sunt 30 necesari pentru propria ei formare din protrombină. Trombina are încă un rol esențial: legarea ei la plachete inițiază eliberarea plachetelor și agregarea care este responsabilă de hemostaza primară. 35

Reacțiile trombinei sunt, în continuare, controlate de inhibitorii naturali din plasmă. Cei mai importanți dintre aceștia sunt antitrombina III și heparina. Acești doi compuși au fost izolați și sunt utilizați în 40 scop terapeutic și profilactic în cazurile în care există un dezechilibru în mecanismul hemostatic cu riscul pentru activarea protrombinei.

Inhibitorii sintetici ai trombinei, care 45 prezintă activitate orală, constituie o alter2 nativă utilă la administrarea parenterală a acestor inhibitori naturali. Multele cercetări în acest domeniu au condus la sinteza unor inhibitori buni ai trombinei in vitro, dar nu constituie încă un candidat bun pentru uzul terapeutic oral. Prin imitarea secvenței de aminoacizi din fibrinogen, substratul natural important al trombinei, s-au obținut câteva substraturi peptidice bune pentru trombină. Aceste substraturi peptidice au fost, de asemenea, transformate în inhibitori ai enzimei. Astfel, substratele cromogenice DPhe-Pro-Arg-PNA și D-Phe-Pip-Arg-PNA mimează secvența care precede ruperea legăturii de către trombină. Inhibitorii ireversibili și reversibili corespunzători, DPhe-Pro-Arginal și D-Phe-Pro-Arg-CH₂C1 prezintă inhibare in vitro în domeniul 10’ ⁸M.

Clorometilcetonele sunt, în general, prea nespecifice pentru a fi ideale pentru uz terapeutic și peptidaldehida exemplificată mai sus, are o valoare LD_S0 scăzută.

Factorul Xa este enzima de coagulare răspunzătoare de generarea trombinei prin protcoliza limitată a zimogenului ei, protrombina.

Factorul Xa este de cel puțin 10 ori mai trombogenic in vivo decât trombina. Aceasta provine din faptul că factorul Xa este o etapă superioară trombinei în sistemul de amplificare în cascadă, astfel că o moleculă de factor Xa poate genera multe molecule de trombină din precursorul ei. Potența lui poate proveni și din îndepărtarea destul de lentă a factorului Xa din corp. Trombina, spre deosebire de factorul Xa, este rapid curățită din circulația sanguină pe pozițiile cu afinitate înaltă ale pereților vaselor. Poziția centrală a factorului Xa la intersecția celor două căi intrinsecă și extrinsecă, îl face să fie o țintă adecvată pentru modularea mecanismului hemostatic.

Kalikreina se formează din prekalikreină prin acțiunea factorului XII, când este localizată pe o suprafață încărcată negativ.

La rândul ei, kalikreina poate cliva factorul XII la factorul Xlla. Sistemul de contact este probabil seminificativ ca un mecanism de apărare mediat de suprafață și o activare pe scară largă a sistemului are loc normal în timpul șocului sau a coagulării diseminate intravasculare (DIC). Rolul kalikreinei în această etapă este de a cliva kininogenul cu masă moleculară mare, cu eliberarea bradikininei care este vasodilatator. Bradikinina produce, de asemenea, creșterea permeabilității vasculare, durerii și migrarea leucocitelor neutrofile. Inhibitorii formării chininei s-au dovedit benefici în anumite tipuri de inflamații, incluzând artritele, pancreatita și pot fi folosiți și în tratamentul astmului. Singura substanță care a atins importanță clinică ca inhibator de kalikreină, este aprotinina (Trasylol). Aprotinina este o polipeptidă cu masa moleculară 6500 și formează un complex stabil cu proteazele, având o constantă de legătură de IO¹⁰ 1O'’M.

Fibrinoliza este procesul care produce dizolvarea enzimatică a cheagurilor de fibrină și fibrinogen. Plasma conține o proteină, plasminogenul, care sub influența diferiților activatori este transformată la plasmină, o enzimă proteolitică, activitatea căreia este asemănătoare cu a tripsinei. Plasmina descompune fibrinogenul și fibrina la produși de degradare.

în condiții normale, sistemul de fibrinoliză este în echilibru cu sistemul de coagulare. Micile trombus formate în fluxul de sânge pot fi dizolvate enzimatic și circulația prin vas poate fi restabilită prin activarea sistemului fibrinolitic în corp. Dacă activitatea fibrinolitică este prea mare, ea poate produce o sângerare prelungită. Activitatea poate fi inhibată de către inhibitorii naturali din sânge. Prolil endopeptidaza clivează legăturile peptidice la poziția carboxilică a reziduului prolinic cu catena peptidică. Serinproteaza este cea care degradează ușor un număr de neuropeptide incluzând substanța P, neurotensina, hormonul care eliberează tirotropina și hormonul care eliberează hormonul de luteinizare și care a fost asociată cu capacitatea celulei de a produce interleukină 2(IL-2). Enzima este inhibată de benziloxicarbonil-prolil-prolinal cu o Ki de 14 nM. în ciuda faptului că nu se cunoaște aproape nimic despre rolul fiziologic al prolil endopeptidazei, ea poate juca un rol important în reglarea activităților biologice ale diferitelor neuropeptide.

Clivarea IgA catalizată de proteinaza IgA, care este forma perdominantă de anticorp care constituie prima linie de apărare împotriva infecțiilor, separă Fc de regiunile Fab de legare a antigenului. Această clivare ar fi de așteptat să micșoreze sau chiar să anuleze activitatea antimicrobiană a acestuia. Toate proteinazele IgA identificate clivează la restul prolinic al zonei de articulare a IgA umane. Acizii peptidici prolil-boronici inhibează proteinazele IgA 1 din Neisseria gonorrhoea și Hemophilus influenzae, indicând că aceste enzime aparțin familiei serinproteazei a enzimelor proteolitice.

Rolul multiplu jucat de trombină într-o varietate de procese fiziologice asociate cu tulburări patologice, cum ar fi cancerul, activitatea inflamatorie și neuronală, sugerează o utilizare potențială a inhibitorilor trombinei în anumite situații nu neapărat legate de sistemul cardiovascular.

Multe celule tumorale s-au dovedit a prezenta activitate procoagulantă asociată cu generarea trombinei. Ca urmare, are loc depunerea fibrinei și coagularea, factori importanți pentru creșterea tumorii. în plus, datorită efectului ei asupra celulelor endoteliale, trombină poate facilita extravazarea celulelor tumorale în timpul metastazei, de aceea, inhibitorii trombinei s-au dovedit a fi benefici nu numai în tratamentul anumitor cancere, dar și în reducerea hiperco107661 agulabilității observate frecvent la pacienții afiați sub chimioterapie.

Activarea de către trombină a celulelor endoteliale induce un număr de modificări pro-inflamatorii. cum ar fi sinteza și eliberarea interleukinei-1, prostglandinei și a factorului de activare a plachetelor. în plus, trombină induce expunerea GMP140 și CD 63, două molecule adezive responsabile pentru alipirea leucocitelor la suprafața endotelială. Trombină mărește, de asemenea, permeabilitatea vasculară la proteine, acțiune care implică neutrofile și clivează proteina precursoare de interleukină-8, peptidă presupusă a fi implicată în tulburările respiratorii, artrite reumatoide și colite ulceroase.

Implicarea ei în toate aceste procese pro-inflamatorii face ca aceasta să fie o țintă potențială pentru tratamentul terapeutic cu inhibitori de trombină în tulburările patologice inflamatorii.

Activitatea proteazei nexin-1, un modulator al creșterii nervilor și un antagonist specific natural al trombinei este micșorată specific și pronunțat la pacienții cu boala Alzheimer. Aceasta împreună cu observația că activitatea similară cu a trombinei a fost crescută în creierele cu boala Alzheimer, sugerează că inhibitorii de trombină pot avea un efect de limitare sau chair de revenire a modificărilor neuronice asociate cu hiperactivitatea trombinei.

Au fost studiați acizii boronici ca inhibitori ai diferitelor serin esterazelor și proteazelor. Primul aminoacid conținând acid boronic, folosit ca un inhibitor al proteazei, a fost acidul boronic analog al N-acetil L-fenilalaninei, care s-a folosit ca inhibitor al chimotrisinei, subtilizinei și elastazei.

Interacția acizilor boronici cu proteazele în sistemele biologice este cunoscută și diferiți acizi boronici simpli s-au dovedit a fi suficient de netoxici pentru uz uman. Inhibitorii de acid boronic peptidic ai elastazei au fost recent testați pe animale cu emfizem. Spre deosebire de peptid-clorometil cetonele, nu s-a observat toxicitate la nivelurile biologic efective de dozare.

Este cunoscută prepararea peptidelor care conțin derivați cu acid boronic la atomul de carbon terminal al lizinei, ornitinei și argininei. cât și folosirea lor ca inhibitori ai serinproteazei de tipul tripsinei. Ceilalți aminoacizi din peptide sunt toți fie în formă D-, fie în formă L, a celor 20 de aminoacizi naturali. (EP 293881).

S-a găsit că compușii, având proprietăți superioare ca inhibitori ai serinproteazei de tipul tripsinei, se obțin atunci când peptida conține cel puțin un a -aminoacid nenatural, având o catenă laterală hidrofobă.

Invenția lărgește gama derivaților peptidici, inhibitori ai serinproteazei, cu noi compuși conținând cel puțin un cz -aminoacid nenatural având o catenă laterală hidrofobă, care prezintă structura corespunzătoare formulei generale I:

în care W reprezintă hidrogen sau o grupă N-protectoare aleasă dintre HțCPfCHjO),,-, R₆CO-, R₇OCO- sau R_gSO₂- în care p este 3 ... 30, R₆ este alchil C,_₆, R₇ este alchil C,.₆, fenil, benzii sau naftil și R₈ este fenil, naftil sau alchilfenil C,.₄, Y reprezintă o secvență de aminoacizi astfel că peptida /7+1 aminoacizi Y-Lys sau Y-Arg are afinitate pentru poziția activă a proteazei de tipul tripsinei, n fiind un număr întreg de la 1 la 10 și în care cel puțin un aminoacid este un aminoacid nenatural, având o catenă laterală hidrofobă; Q, și Q, sunt identici sau diferiți și sunt aleși dintre -OH, -COR,, -CONR,R₂, —NR,R₂sau -OR, sau Q, și Q₂, luați împreună formează un rest diolic; R,, R₂ și R, pot fi identici sau diferiți și reprezintă alchil C,_ _l0, arii C₆._l0, aralchil C₆__l0 sau fenil substituit cu trei grupe alese dintre alchil C,.₄, halogen și alcoxi C,_₄; R₄ reprezintă hidrogen sau alchil C,._l0; R, reprezintă o grupă -A-X, în care A este -(CH₂)_- în care z este 2, 3, 4 sau 5; -CH(CH,)(CH₂)₂-, -CH₂-CH(CH₃)-CH₂, -(CH₂)₂CH(CH₃)₂-, -CH(CH₃)-(CH₂)₃-, -ch₂CH(CH₃)-(CH₂)₂-, -CH₂-CH₂-CH(CH₃)CH₂-, (CH₂),-CH(CH,)-, -(CH₂)₃-C(CH₃)₂, arii C₆._l0, aralchil C₆._l0 și X reprezintă NH₂. -NH-C(NH)-NH₂, -S-C (NH)-NH₂, -N„ alcoxi C_l4, alchiltio C,_₄ sau Si(CH,), sau R₄ și R, formează împreună o grupă trimetilen și atomul de carbon marcat prin asterisc are configurația Dsau L- sau reprezintă un amestec al acestora.

Derivații peptidici cu formula generală I, definiți mai sus, se obțin prin următoarele procedee:

i) când X este -NH-C(NH)-NH₂, reacția compusului cu formula I în care X este -NH₂ cu cianamidă, efectuată întrun solvent organic, în condiții acide puternice;

ii) când X este -NH₂, hidrogenarea compusului cu formula I în care X este -N₃, efectuată utilizând un catalizator de Pd/C;

iii) când X este -N„ reacția compusului cu formula VI:

în care Q, și Q₂ sunt definiți mai sus și R_l3este -A-Br, -A-Si(CH₃)₃ sau -A-O-alchil cu LiN/Si(CHurmată de hidroliză acidă și cuplare cu o peptidă protejată cu for5 mula VIII:

O

W-Y-0-w (VIII)

W-Y-NH-CH-B

I r_[2 ^xQ₂ (VI) în care W, Y, Q, și Q, sunt definiți mai sus și R|, este -A-Br, A fiind definit mai sus. cu azidă de sodiu, într-un solvent aprotic polar cum ar fi dimetilsulfoxid;

iv) când X este -Si(CH₃)₃ sau O-alchil, reacția compusului cu formula VII:

o în care W și Y sunt definiți mai sus, hidroliza acidă fiind efectuată cu 3 mol echivelenți de acid și cuplarea cu un compus cu formula VIII este efectuată într-un solvent polar aprotic uscat, cum ar fi tetrahidrofuran. la o temperatură cuprinsă între -78°C și temperatura ambiantă.

Compușii cu formula generală I, obținuți conform invenției, prezintă ca avantaje activitate orală, activitate rapidă și toxicitate joasă, precum și o utilizare specială în tratamentul indivizilor care sunt hipersensibili la compuși de tipul heparinei.

în compușii cu formula generală I, prin aminoacid nenatural se înțelege orice alt aminoacid în afară de D-, sau L- Ala, Arg, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, Ue, Lou, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr sau Val.

Pentru W grupele protectoare preferate sunt cele cu formula R'₇OCO- în care R'_?este fer/-butil (notat Boc) și în care R'₇este benzii (notat cu Z).

De preferință, R_s este R'_s unde R’₅ este -(CH₂),-X’ în care X’ este NH₂, -NH-C(NH)-NH₂, -N, sau -Si(CH₃)₃ și z’ este 2, 3 sau 4.

Compușii preferați sunt cei cu formula la:

W-Y-N-CH-B /ORg \qR (Ia)

R.

io

Cl-CH-By I ^XQ₂ ^R13 în care W, Y, R₄ și R_s sunt definiți mai sus și R₉ și R_l0 reprezintă un rest de compus dihidroxi.

(VII)

Exemple de asemenea compuși sunt: 2,3-butandiol, catechol, 2,3-dimetilbutandiol-2,3, ciclohexandiol, etilenglicol, 1,2hexandiol, 2,3-hexandiol, dietanolamină sau compuși alifatici sau aromatici, având grupe hidroxi care sunt substituite la carbonul adiacent sau la atomii de carbon substituiți prin alți atomi de carbon.

Se preferă, în mod special, acei compuși în care Q, și Q-, luați împreună reprezintă grupa OPin cu formula a) sau grupa cu formula b):

_d) b)

Aminoacizii care formează Y sunt aaminoacizi care pot fi aleși dintre L-aminoacizii naturali care se găsesc în proteine, cnantiomerii lor corespunzători, D-aminoacizii sau α-aminoacizii modificați chimic, cum ar fi acid gama-piperidinglutarnic (Glu N0) sau acid pipecolic (Pip), cu condiția ca cel puțin un aminoacid să fie aminoacid nenatural având o catenă laterală hidrofobă.

Aminoacizi nenaturali preferați sunt cei cu formula II:

O în care R_tl este o grupă hidrofobă. Grupe hidrofobe preferate constau dintr-o grupă metilen legată printr-o grupă polară la o grupă aromatică sau o grupă aliciclică având cel puțin două cicluri, dar fără substituenți polari sau la o grupă re/-/-butil sau trimetilsilil. De preferință, R,, esteR'_u unde R'_N este o grupă cu formula c), d), e). f), g), h) sau i):

-prolină (Pro) cu formula:

Aminoacizii nenaturali cu formula II pot fi în forma D- sau L- sau amestecuri ale acestora, dar se preferă forma D-.

Cei mai preferați compuși sunt inhi- 25 bitorii de trombină cu formula I în care Y este o secvență de doi aminoacizi dintre care aminoacidul cu N-terminal este aminoacidul nenatural, iar celălalt este L-

Cei mai preferați compuși sunt cei cu formula Γ:

W- NH - CH(R] J - CO - Pro - N - CHR₅ - B R₄ (Γ)

în care W, R₄, R₅, R_u, Q, și Q, sunt definiți anterior.

Compuși preferați, în mod special, sunt cei cu formula I”:

W - NH - CH(R,,) - CO - Pro - N - CH R’_s - Bl

d) în care W, R₄, R_s și R_H sunt definiți mai sus.

/Si Mc ₃

N

Cei mai preferați compuși sunt compușii cu formula III:

(III) compușii cu formula IV:

(IV) și compușii cu formula V:

(V)

O peptidă este considerată a avea afinitate pentru poziția activă a proteazelor, tip tripsină, dacă respectiva peptidă are o valoare de la 10'³M sau mai mică a constantei de disociere.

în procedeele de preparare arătate mai înainte, intermediarii cu formula VII pot fi obținuți prin metoda Matteson ș.a., Organometallics 3, 1284-8 (1984).

Peptidă protejată cu formula VIII poate fi preparată prin metode convenționale din chimia peptidelor, pronind de la un aminoacid nenatural. Asemenea aminoacizi sunt fie accesibili pe cale comercială (de exemplu aminoacidul în care R,, este grupa c), fie pot fi preparați prin metode analoage celor descrise în literatură, de exemplu Angw.Chem. 93, 793 (1981) și J.Am.Chem. Soc. 109, 6881 (1987).

Se dau, în continuare, exemple de realizare a invenției, în care simbolurile au următoarele semnificații:

Ζ = benziloxicarbonil; Boc - z-butiloxicarbonil; Ac - acetil; MeOH - alcool metilic; EtOAc = acetat de metil; DCC = = diciclohexilcarbodiimidă; HONSu = Nhidroxisuccinimidă; OPin = pinandiol; THF = tetrahidrofuran; n-Bu = n-butil; N_p = p-nitrofenol; TLC = cromatografie în strat subțire; Bzl = -NH-CH-(CH₂CH₂CH₂Br)B-; Bzl - benzii; TMSal = trimetilsililalanină; Adal = adamantilalanină; Naphal = 2-naftilalanină; BoroOrn = —NH-CH-(CH₂CH₂CH₂NH₂)B-; BoroArg= = -NH-CH/CH₂CH₂CH₂NHC(NH) NH,/B-; Adgly = 1-adamantilglicină; BoroProOPin= - analog prolinei în care grupa -COOH este înlocuită cu B-Opin; BoroLys = -NH-CH-(CH₂CH₂CH₂CH₂ NH₂)B; BoroHArg = -NH-CH-(CH₂CH₂ CH₂CH₂NHC (NH)NH₂)B-; BoroMpg = -NH-CH-(CH₂CH₂CH₂-OCH,)B-; /;-OH-Me-Phal = /?-hidroximetil-fenilalanină; /r-TBDPS-O-MePhal = /?-ter/-butil-difenil-silil-oximetilfenilalanină.

Exemplul 1. Boc-D-TMSal-Pro-NHCH/(CH₂)₃N/BOPin

A. Boc-D-TMSal-OH. Se dizolvă 21,5 g (113,7 mMol) ester etilic de D-TMSal, preparat conform procedeului descris în Angew.Chem. 93, 793 (1981), în CH₂C1₂și se adaugă o soluție de Boc₂O în CH₂C1₂. După 15 h, la temperatura camerei, se adaugă 500 ml acid clorhidric 0,25 N răcit cu gheață. Stratul organic se spală cu o soluție de NaHCO, și saramură, după care se usucă pe Na₂SO₄ și se concentrează în vid.

Materialul brut (ulei incolor) se folosește direct în etapa de saponiftcare. El se dizolvă în metanol, se răcește la 0°C. se amestecă cu 510 ml NaOH IN și se agită, la 0°C, timp de 3 h. După acidulare la /;H=1 cu HC1 IN amestecul se extrage de câteva ori cu eter. Straturile organice se combină, se spală cu saramură și se usucă pe Na₂SO₄ și se concentrează sub vid. Produsul (29,7 g ulei) se folosește în etapa următoare fără altă purificare.

B. Boc-D-TMSal-Pro-ONSu. Se dizolvă 29,7 g (113,7 mMol) și 19,0 g (136,3 mM) /;-nitrofenol în EtOAc. După răcire la 0°C, se adaugă 23,4 g (113,6 mMol) DCC și se agită amestecul, timp de o oră, la 0°C și apoi 15 h, la temperatura camerei. Precipitatul se filtrează și se spală cu EtOAc, iar filtratul se concentrează în vid. Uleiul rezultat este purificat prin cromatografie în flacără (9 : 1 hexan/EtOAc) și se obțin cristale albe de Boc-D-TMSal-ONp.

Se dizolvă 51,6 g (1 13,7 mMol) Boc-DTMSal-ONp în THF la care se adaugă o soluție apoasă formată din cantități echimolare de prolină și Et,N. După 20 h, la temperatura camerei, se îndepărtează THF în vid și reziduul apos se diluează cu apă și apoi se extrage de câteva ori cu EtOAc. Se ajustează pH-ul stratului apos la 3 prin adăugare de acid citric 10%. Produsul uleios rezultat este extras de câteva ori cu EtOAc. Straturile organice combinate se spală cu saramură, se usucă pe Na₂SO₄ și se concentrează în vid. Uleiul incolor se recristalizează din eter/hexan și se obține dipeptida Boc-D-TMSal-Pro-OH, compus cristalin alb, cu punct de topire 176°C.

Se dizolvă 26,0 g (72,5 mMol) din dipeptida rezultată în EtOAc. După răcire la 0°C, se adaugă 9,8 g (85,5 mMol) HONSu și 14,9 g (72,3 mMol) DCC. Amestecul se agită, timp de 3 h, la 0°C și apoi încă 15 h la temperatura camerei. Amestecul este răcit din nou la 0°C, diciclohexilureea se filtrează și se spală de câteva ori cu EtOAc. Filtratul se spală de câteva ori cu Na₂CO, 0.1 M și apoi cu soluție apoasă de KHSO₄ 2%. După uscare pe Na₂SO₄ și concentrare în vid se obține Boc-D-TMSalPro-PNSu sub forma unei spume albe.

C. Boc-D-TMSal-Pro-Baa-OPm. Acest procedeu este format din trei etape care cuprind formarea in situ a unui chiral a(bistrimetilsilil)amidoboronat, hidroliza a două grupe trimetilsilil și cuplarea a-aminoboronatului astfel format cu esterul activ (Boc-D-TMSal-Pro-ONSu) preparat în etapa B. întreaga succesiune de reacții se efectuează în atmosferă de argon.

Se dizolvă 1,75 g (5,0 mMol) de chiral a-cloroboronat/(+)-Pinandiol-(S)-l-cloro4-bromobutan-l-boronat/ în 2,5 ml THF și se adaugă la 5 ml soluție 1,0 M de hexametildisilazan (5,0 mMol) în hexan, prerăcită la -78C. După agitare, 30 min, la -78C, soluția se încălzește, peste noapte, la temperatura camerei. După răcire, din nou la -78°C, se adaugă 3 mol echivalenți de HC1 în dioxan. Amestecul se încălzește la temperatura camerei și se agită, timp de 2 h. la această temperatură. După răcire la -20C. se adaugă 2.28 g (5,0 mMol) soluție de ester activ din etapa B în 6 ml CH-,C1₂ urmată de adăugarea a 1,39 ml (10,0 mMol) trietil amină. Amestecul se agită, timp de o oră, la -13°C, se încălzește la temperatura camerei și se agită, timp de 2 h, la această temperatură. Amestecul se filtrează, filtratul se concentrează în vid, reziduul se diluează cu eter și se spală cu HC1 2N, NaHCO, și saramură. Stratul organic se usucă pe Na₂SO₄ și se concentrează în vid. Reziduul a cristalizat și s-a obținut chiral peptidboronatul sub forma unui compus cristalin alb.

D. Boc-D-TMSal-Pro-NH-CH/ /(CH^iNABOPin. Se dizolvă 804 mg (1,2 mMol) din produsul etapei C, Boc-DTMSal-Pro-Baa-OPin în 13 ml DMSO și azidă de sodiu, în cantitate de 156 mg (2.4 mMol) este adăugată. Amestecul se agită 3 h, la temperatura camerei. Se adăugă eter/apă cu gheață și din amestec precipită imediat cristale albe. Precipitatul alb se filtrează și se spală cu eter, obținându-se 0,6 g azidă sub forma unui compus cristalin alb.

Exemplul 2. Boc-D-TMSal-Pro-BoroOrn-OPin.

Se dizolvă 569 mg (0,9 mMol) azidă din exemplul 1 în 25 ml EtOAc și se hidrogenează în prezența a 0,5 g Pd/C 10%. După 2,5 h se îndepărtează catalizatorul și soluția se concentrează în vid. Se obține o spumă albă care se recristalizează din EtOAc/eter și se obține produsul dorit sub forma unui compus cristalin alb, cu P^unctde topire 200 ... 202°C, la/ „ = -11,6° (c = 0,5 în MeOH).

Exemplul 3. Boc-D-TMSal-Pro-boroArgOPin (benzensulfonat).

Se dizolvă 250 mg (0,412 mMol) Boc-DTMSal-Pro-borozenOrn-OPin, din exemplul 2, în 2 ml etanol. Se adaugă 65,2 mg (0,412 mMol) acid benzensulfonic și se agită, timp de 15 min, la temperatura camerei, după care se adaugă 86,6 mg (2,06 mMol) cianamidă și se încălzește la reflux. Mersul reacției se urmărește prin RP-TLc, în care se observă dispariția spotului ninhidrinei pentru amina inițială și apariția benzii Sakaguchi. După 7 zile, nu se mai poate detecta amina și soluția se concentrează în vid. Reziduul s-a dizolvat în MeOH și s-a cromatografiat pe o coloană de 5 X 55 cm cu SephadexLH-20 cu MeOH. Produsul dorit s-a obținut ^su^ forma unei spume albe, /a/= -45,3° (c - 1 în CH₂C1₂).

Exemplul 4. Boc-D-TMSal-Pro-NH-CH (CH₂)₄NflB-OPin

A) (+)-pinandiol-(S)-I-cloro-5-brompentan-1 -boronat. 20,8 ml (203,3 mMol) 4bromo-l-butenă reacționează cu 24,4 g (203,3 mMol) catecholboran la 100°C, timp de 16 h. Produsul brut se distilează sub vid, obținându-se 4-bromobutan-l -boronat sub forma unui compus cristalin alb. 27,7 g (163 mMol) (+)-pinandiol se dizolvă în THF și se adaugă 41.6 g (163 mMol) 4bromobutan-1 -boronat sintetizat mai sus. După o oră, la temperatura camerei, se îndepărtează THF în vid și reziduul se purifică prin cromotografie în flacără (690 : 10 hexan/EtOAc) și se obține (-t-)-pinandiol-4-bromobutan-l-boronat sub forma unui ulei incolor.

(+)-Pinandiolul-(S)-1 -cloro-5-bromopentan-l-boronatul dorit se prepară conform procedeului descris în Organometallics 3, 1284 (1984). Astfel, 9,8 ml clorură de metilen în THF se răcește la -100°C și se adaugă 71,6 ml (114,5 mMol) soluție 1,6 M n-butillitiu, timp de 20 min. După 15 min, la -100^uC, se adaugă 32,8 g (104,1 mMol) soluție rece (-78C) de (+)pinandiol-5-bromopentan-1 -boronat în THF. După încă o oră, la -100C, se adaugă 7,1 g (52,0 mMol) ZnCl₂ în THF. După încă 15 min, la - 100°C, amestecul de reacție se încălzește la temperatura camerei și se agită timp de 2 h, la această temperatură. Solventul se îndepărtează sub vid, reziduul se diluează cu hexan/apă și se extrage de câteva ori cu hexan. După uscare pe Na₂SO₄ și îndepărtarea solventului în vid, s-a obținut (+)-pinandiol-(S)~ 1 -clor-5-brompentan-1 boronat sub forma unui ulei galben care se folosește direct în următoarea etapă, fără purificare suplimentară.

B) Boc-D-TMSal-Pro-NH-CH(CH₂)₄Br)B-OPin. 65,2 ml soluție 1,0 M de LiN(SiMo₃)₂ (65,2 mMol) în THF se răcește la -78°C. Se adaugă 23,7 g (65,2 mMol) α-cloroboronat din etapa A în THF. După agitare, timp de o oră, la -78°C, amestecul se agita timp de 15 h, la temperatura camerei. După această perioadă, amestecul de reacție se răcește la -78°C și se adaugă 29,8 ml soluție HC1 6,56 N (196 mMol) în dioxan, se agită, timp de 45 min, la -78°C și apoi 2 h. la temperatura camerei. Amestecul se răcește la -15°C, se adaugă 29.7 g (65.2 mMol) Boc-TMSal-Pro-ONSu din exemplul 1 în CH₂C1₂, înainte de adăugarea a 18,1 ml (130,4 mMol) trietilamină, pentru a începe reacția de cuplare. După agitare, la -15°C, timp de o oră, amestecul se agită, timp de 2 h, la temeratura camerei. Amestecul se filtrează pe Hyflo și se conIX centrează în vid. Reziduul se diluează cu eter/apă și se extrage de câteva ori cu eter. După uscare pe Na₂SO₄ și concentrare în vid s-a obținut Boc-D-TMSal-Pro-NH-CH (CH₂)₄Br)B-OPin. după cristalizare din eter/hexan, sub forma unui compus cristalin alb, cu punct de topire 74°C.

C) Boc-D-TMSal-Pro-NH-CH(CH₂)₄N_}) B-OPin. Se dizolvă 33,3 g (48,6 mMOl) produs din etapa B) în DMSO și se adaugă 6,3 g (97.2 mMol) azidă de sodiu. Amestecul se agită, timp de 6 h, la temperatura camerei. Se adaugă eter/apă cu gheață și amestecul se extrage de câteva ori cu eter. După uscare pe Na₂SO₄ și concentrare în vid, uleiul rezultat s-a cristalizat și s-a obținut Boc-D-TMSal-Pro-NH-CH (CH₂)₂N.)B-Pin sub forma unui compus cristalin, cu punct de topire 69 ... 70°C; a_n= -74,4° (c = 1,0 în MeOH).

Exemplul 5. Boc-D-TMSal-Pro-BoroLysOPin

Se dizolvă 22,0 g (34,0 mMol) azidă, din exemplul 4, în EtOAc și se hidrogenează în prezența a 4,0 g Pd/C 10%. După 9 h, catalizatorul se îndepărtează și soluția se concentrează în vid. Spuma rezultată se dizolvă în EtOAc și se cristalizează. Se obține Boc-D-TMSal-ProBoroLys-OPin sub formă de cristale albe, cu punct de topire 128 ... 129°C; a_D= -59,6° (c = 1,0 în MeOH).

Exemplul 6. Boc-D-TMSal-Pro-BoroHArg-OPin (benzensitlfonat)

Se dizolvă 800 mg (1,03 mMol) benzensulfonat Boc-D-TMSal-Pro-BoroLys-OPin, din exemplul 5, în etanol. Se adaugă 210 mg (5,0 mMol) cianamidă și amestecul se încălzește la reflux. Mersul reacției este urmărit prin RP-TLC, prin care se observă dispariția spotului aminei și apariția benzii Sakaguchi, caracteristică produsului. După 7 zile, nu s-a mai putut detecta amina și soluția s-a concentrat în vid. Reziduul se dizolvă în MeOH și se cromotografiază pe o coloană 5 X 55 cm Sophadex LH-20 cu MeOH. Produsul dorit se obține sub forma unei spume albe, c/= -40,8° (c = 0,5 în CH₂CI₂).

Exemplele 7 ... 29. Prin metode similare celor prezentate în exemplele 1 ... 6 s-au obținut compușii cu formula genera- 5 lă:

W - NH - CH - CO - AA - N - CH - B

R, r₄r₅ /^Q· ^xQ₂ în care R₄, R'_s, R_n, Q,+Q₂ și AA au semnificațiile din tabelul care urmează:

Tabelul I

Exemplu	W	R„	r₄	R's	Ql+Q2	AA	, t -0 /a/ _D	C	Solvent
7	Boc	C)	H	-(CH₂),-NH₂	a)	Pro	-27,8	0.5	EtOH
8	Boc	c)	H	-(CH₂),NHC(NH)NH₂	a)	Pro	-75,0°	1,0	CH₂CI₂
9	Boc	c)	H	-(CH₂)₄N₃	a)	Pro	-64,7°	0.51	ch₂ci₂
10	Boc	c)	H	-(CH₂)₂SiMe,	a)	Pro	-57,0	0.5	ch₂ci₂
11	Boc	d)	H	-(CH₂)₃SiMe₃	a)	Pro	-59,3°	1.0	ch₂ci₂
12	Ac	c)	H	-(CH₂)₃NHC(NH)NH₂	a)	Pro	-80,2	0.5	ch₂ci₂
13	Boc	c)	H	-(CH₂),NHC(NH)NH₂	a)	Pro	-42,3	0.5	ch₂ci₂
14	Boc	c)	H	-(CH₂)₄NHC(NH)NH₂	a)	Pro	-18,8	0,5	EtOH
15	Boc	c)	H	-(CH₂)₄NHC(NH)NH₂	a)	Pro	-61,7°	0,41	CH₂C1₂
16	Boc	c)	H	-(CH₂)₄NH₂	a)	Pro	-52,4°	0,54	ch₂ci₂
17	Boc	d)	H	-(CH₂),NHC(NH)NH₂	b)	Pro	-35,8°	1,0	EtOAc
18	Boc	c)	H	-(CH₂),-NH₂	a)	Pro	-10,6°	0,5	CH₂C1₂
19	Boc	d)	H	-(CH,)₃NHC(NH)NH₂	b)	Gly	+8,8°	0,5	EtOAc
20	Ac	c)	H	-(CH₂)₃-NH₂	a)	Pro	-78,6°	0,75	CH₂C1₂
21	Boc	i)	H	-(CH₂)₃-NH₂	b)	Gly	-4,4°	0,5	ch₂ci₂
22	Boc	f)	H	-(CH₂)₃-N₃	a)	Pro	-76,0	0,5	ch₂ci₂
23	Boc	f)	H	-(CH₂)₃-N₃	a)	Pro	-25,4°	0,5	ch₂ci₂
24	Boc	0	H	-(CH₂)₃NHC(NH)NH₂	a)	Pro	-38,4°	0,5	ch₂ci
25	Boc	d)	H	-(CH₂)₄NHC(NH)NH₂	a)	Gly	-14,7	1.0	MeOH
26	Boc	d)	H	-(CH₂)₄NH₂	a)	Gly	-30,6°	0,5	EtOH
27	Boc	d)	H	-(CH₂)₄NH₂	a)	Asp	-18,4°	0,5	MeOH
28	H	d)	H	-(CH₂)₃NH₂	a)	Pro	-53,6°	0,32	MeOH
29	Boc	d)	H	-(CH₂)₄OC₂H₅	a)	Pro	-54,2°	0,5	MeOH —

Exemplul 30. Boc-D-TMSal-Pro-BoroMpg-OPin

A) (+)-Pinandiol-(S)- l-cloro-4-metoxibutan-1-boronat. 6.0 g (83,3 mMol) 3-metoxi-1-propenă reacționează cu catecholboran în cantitate de 10,0 g (83,3 mMol), la 100°C, timp de 24 h. Produsul brut este distilat în vid și se obține 3-metoxipropan-lboronat, ulei incolor, 10,6 g (62,5 mMol) (-t-)-pînandioI se dizolvă în THF și se adaugă 12,0 g (62,5 mMol) 3-metoxipropan-lboronat sintetizat mai sus. După o oră, la temperatura camerei, se îndepărtează THF sub vid și reziduul se purifică prin cromatografie în flacără (80 : 20 hexan/EtOAc) și se obține (+)-pinandiol-3-metoxipropan-lboronat, ulei incolor. (+)-Pinandiol-(S)-lcloro-4-metoxibutan-l-boronat se prepară conform procedeului prezentat în Organometallics 3, 1284 (1984). 2,2 ml clorură de metilen în THF se răcesc la -100°C și se adaugă 13,8 ml soluție 1,6 M (22,0 mMol) u-butillitiu, timp de 20 min. După 15 min, la -100°C, se adaugă 5,04 g (20 mMol) soluție de (+)-pinandiol-3-metoxipropan-lboronat în THF, urmată de 1,42 g (10,0 mMol) ZnCl₂. După încă 15 min, la 100°C, amestecul de reacție se încălzește la temperatura camerei și se agită, timp de 2 h, la această temperatură. Solventul se îndepărtează în vid, reziduul se diluează cu eter și se spală cu apă. Stratul organic se usucă pe Na₂SO₄ și se concentrează, obținându-se un ulei care este purificat prin cromatografie în flacără (9 : 1 hexan/ EtOAc). Produsul este (+)-pinandiol-(S)-Ιοί oro-4-metoxibutan-1-boronat sub forma unui ulei incolor.

B) Boc-D-TMSal-Pro-BoroMpg-OPm. 5 ml soluție 1,0 M (5,0 mMol) de LiN (SiMo₃)₂ în THF se răcesc la -78°C. Se adaugă 1,53 g (5,0 mMol) a-cloroboronat din etapa A) în THF. După agitare, timp de o oră, la -78°C, amestecul este agitat timp de 15 h, la temperatura camerei. După această perioadă, amestecul de reac22 ție este răcit din nou la -78C și se adaugă 2,7 ml soluție HC1 5,65N (15 mMol) în dioxan. Soluția se agită, timp de 30 min, la 78C și apoi 2 h. la temperatura camerei. Amestecul este răcit la -15C și se adaugă 2,28 g (5,0 mMol) Boc-TMSal-Pro-ONSu din exemplu 1, în CH,CL înainte de adăugarea a 1,39 ml (10,0 mMol) trietilamină pentru a iniția reacția de cuplare. După agitare, la -15°C. timp de o oră. amestecul se agită 2 h, la temperatura camerei. Amestecul este filtrat pe Hyflo și este concentrat în vid. Reziduul este diluat cu EtOAc și este spălat cu HC1 0,2 N Na HCO, 5% și, în final, cu saramură. După îndepărtarea solventului se obține un ulei care este purificat prin cromatografie în flacără (EtOAc). Se obține BocD-TMSal-Pro-BoroMpg-OPin sub forma unei spume albe, a_D=48,8 (c = 0.25 CH,C1₂).

Exemplul 31. Boc-D-(p-(TBDPS-O)metil)Phal-Pro-BoroOrn-OPin

A) Boc-D-[p-l( 1,I-dimetiletil)difenilsililjoxijnietilfenilalanină. Pentru a reduce selectiv grupa azido în substrat, se adaugă 7,27 g (66,0 mMol) tiofenol la o suspensie de 3,12 g (16,5 mMol) SnCl₂ în CH₂C1₂. Se adaugă 6,8 ml (49,5 mMol) trietilamină și se obține o soluție galbenă. Se adaugă, înainte, 4,8 g (22,0 mMol) Boc-anhidridă sub formă de soluție, în CH₂C1₂, la 6,8 g (% de > 95, 11,0 mMol) [3(2S), 4S-3-[2azido-3-[p-[( 1, l-dimetil)difenilsilil]oximeti 1] feni 1-1 -oxopropil]-4-(fenilmetil)-2-oxazolidinonă, preparată conform procedeului din J. A. Chem. Soc. 109, 6881 (1987). După agitare, timp de 2,5 h. la temperatura camerei, amestecul se diluează cu EtOAc/ /NaOH 2N și se filtrează pe Hyflo. Stratul organic este spălat cu soluție apoasă 2 % de NaHSO₄, soluție apoasă 5 % de NaHCOj și, în final, cu saramură. După uscare pe Na₂SO₄ și concentrare în vid, uleiul galben obținut s-a purificat prin cromatografie în flacără și s-a obținut [3(2S),4S]3-[(2-[((fer/-butiloxi)-carbonil]amino)]-3-[p[[1,1 -dimeti leti 1 )difenil si 1 i 1]σ.χ7] -metil]-feni 1 107661

-1 -oxopropi l]-4-(fenilmetil)-2-oxazolidinonă sub forma unei spume albe. Compusul, în cantitate de 2,0 g (2,88 mMol) s-a dizolvat în THF/apă și s-a hidrolizat in situ cu 5,76 mMol LiOOH, la 0C, generat in situ. După 1,75 h, la 0°C, s-a adăugat 1,25 g (9,9 mMol) Na,SO_; în apă. THF s-a îndepărtat în vid și pH-ul reziduului s-a ajustat la 1 ... 2 și amestecul s-a extras de 3 ori cu EtOAc. Straturile organice combinate s-au spălat cu apă, s-au uscat pe Na,SO₄ și s-au concentrat în vid. După cristalizare din hexan/eter s-a obținut oxazolidinona sub forma unor cristale albe. Filtratul s-a concentrat în vid și s-a obținut compusul din titlu sub forma unei spume albe.

B) Boc-D-(p-((( l, I-diinetil)ilifenilsilil)oxi)-metil)fenilalanină-Pro-ONSu. 0,59 g (2,88 mMol) DCC este adăugat la un amestec format din compusul obținut în etapa A), în cantitate de 1,6 g (2,88 mMol) și 0,43 g (3,12 mMol) p-nitrofenol în EtOAc la 0°C. Amestecul de reacție este agitat, timp de 16 h, la temperatura camerei. După răcire, la 0°C, se filtrează precipitatul și se spală cu EtOAc rece. Filtratul se concentrează în vid. Uleiul rezultat (Boc-D-(p-TBDPS-O-Me)-PhalONp) este folosit în etapa următoare fără altă purificare.

2,2 g (2,88 mMol) Boc-D-(p-TBDPSO-Me)-Phal-ONp se dizolvă în THF și se adaugă o soluție apoasă de 365 mg (3,17 mMol) L-prolină și 0,86 ml (6,33 mMol) Et,N. După 15 h, la temperatura camerei, se îndepărtează THF în vid. Se ajustează pH-ul la 3. prin adăugare de acid citric 10%. Produsul uleios, rezultat, este extras de câteva ori cu EtOAc. Straturile organice s-au spălat cu saramură, s-au uscat pe Na₂SO₄ și s-au concentrat în vid. Uleiul incolor s-a purificat prin cromatografie în flacără (9 : 1 CH₂C1₂/ /EtOH pentru a elua p-nitrofenolul, apoi cu 80 : 20 CH₂Cl₂/EtOH) pentru a obține

Boc-D-(p-TBDPS-O-Me)-Phal-Pro-OH sub forma unei spume albe. Această dipeptidă în cantitate de 1,3 g (2,06 mMol) s-a dizolvat în EtOAc. După răcire la 0°C. s-au adăugat 220 mg (2,47 mMol) HONSu și 330 mg (2,06 mMol) DCC. Amestecul se răcește din nou la 0ⁿC. se îndepărtează prin filtrare diciclohexilureea și s-a spălat de câteva ori cu EtOAc rece. Filtratul s-a spălat cu soluție apoasă 0.1 M Na.CO,, NaHSO₄ 8% și apoi cu saramură. După uscare pe Na₂SO₄ și concentrare în vid, compusul din titlu Boc-D-(p-TBDPS-OMe)-Phal-Pro-ONSu s-a obținut ca o spumă albă.

C) Boc-D-(p-TBDPS-0-Me)-Plial-ProBaa-OPin. Compusul din titlu s-a obținut prin procedeul în trei etape descris pentru sinteza Boc-D-TMSal-Pro-Baa-OPin din exemplul 1/C. Intermediarul a-aminoboronat, care rezultă din reacția chiralului acloroboronat ((-t-)-pinandiol-(S)-1 -cloro-4bromobutan-l-boronat, în cantitate de 650 mg (2,0 mMol) cu 2,0 mMol LiN(SiMej₂și hidroliza cu HC1 este supus reacției cu 1,45 g (2,0 mMol) ester activ din etapa B), în prezența a 4,0 mMol Et,N pentru a obține compusul din titlu care este purificat prin cromatografie în flacără (1:1 hexan/ /EtOAc).

D) Boc-D-(p-TBDPS-0-Me)-Phal-ProBoroOrn-OPin. Produsul din etapa C). în cantitate de 680 mg (0,72 mMol) este dizolvat în DMSO și se adaugă 94 mg (1,44 mMol) azidă de sodiu. Amestecul este agitat 4h, la temperatura camerei. Se adaugă eter/apă cu gheață și imediat precipită cristale albe din amestec. Precipitatul alb este filtrat și spălat cu apă pentru a da Boc-D-(p-TBDPS-O-Me)-Phal-ProNH-CH(CH₂)₃B-OPin, compus cristalin alb. Această azidă, în cantitate de 272 mg (0,3 mMol) s-a dizolvat în EtOAc și s-a hidrogenat în prezență de catalizator Lindlar. După 8 h, se îndepărtează catalizatorul și soluția se concentrază în vid. Produsul brut este purificat prin cromatografie în flacără (EtOAc apoi EtOH) pentru a obține compusul din titlu sub forma unei spume albe, α_υ= -32° (c = 0,25 în MeOH).

Exemplul 32. Boc-D-(p-OH-Me)-PhcdPro-BoroOrn-OPin

Boro-ornitina din exemplul 31 în cantitate de 132 mg (0,15 mMol) se dizolvă în THF și este reacționată cu n-Bu₄NF în cantitate de 0,3 ml (0.3 mMol) sub formă de soluție 1,1 M. După 45 min, la temperatura camerei, se adaugă apă cu gheață și amestecul rezultat este extras de câteva ori cu EtOAc. Stratele organice s-au combinat și s-au uscat pe Na_;SO₄ și s-au concentrat în vid. Uleiul rezultat s-a purificat cromatografie (EtOAc apoi EtOH) și s-a obținut compusul din titlu sub forma unei spume albe, a_D= -34,0 (c = 0,1 în MeOH).

Exemplul 33. Boc-D-TMScd-AdglyboroPro-OPin

A. L-1 -Adamantilglicină. Se dizolvă 9,86 g (% de > 95, 25,0 mMol) [3(2S), 4S]-3-(2-azido-2-adamant-1 -i 1-1 -oxoetil)4-(fenilmetil)-2-oxazolidonă, preparată conform procedeului descris în J.Am. Chem.Soc. 109, 6821 (1987), în 320 ml amestec THF/H₂O (3 : 1), se răcește la 0^aC, se amestecă cu 4 echivalenți de apă oxigenată și 2,0 echivalenți LiOH. Amestecul rezultat se agită la 0°C, până la consumarea substratului (30 min) și peroxidul (percarboxilatul) este stins la 0°C cu un exces de 10% soluție apoasă de Na₂ SO₃ 1,5N. După tratarea cu soluție apoasă tampon, de NaHCO,. cu /?H de 9 ... 10, amestecul este extras de câteva ori cu EtOAc pentru a îndepărta chiralul oxazolidinonei auxiliar. Acidul carboxilic care constituie produsul, s-a izolat prin extracție cu EtOAc și acidularea fazei apoase la pH= 1 ... 2, uscare pe Na₂SO₄ și concentrare în vid. Acidul (S)-azidoadamant-l-ilacetic s-a izolat sub forma unor cristale albe, în cantitate de 5,29 g și s-a utilizat în etapa următoare, fără altă purificare. Se dizolvă 5,29 g (22,5 mMol) acid 2(S)-azidoadament-l-ilacetic în 110 ml EtOH și 1 1,3 ml HC1 2N și se hidrogenează în prezența a 0,7 g Pd/C 10%. După 2.5 h, catalizatorul s-a îndepărtat și soluția s-a concentrat în vid, obținându-se aminoacidul dorit sub formă de clorhidrat. Clorhidratul obținut s-a suspendat în 40 ml H43 și s-a tratat cu 1,9 g NaHCO, solid. Aminoacidul obținut s-a filtrat și s-a spălat de câteva ori cu apă. După uscare în vid, L-l-adamantilglicina s-a obținut sub forma unui compus cristalin alb lal~^= +3,0 (c =1,0 în MeOH).

B) Boc-D-TMSal-Adgly-ONSit. Se dizolvă 7,71 g (20,2 mMol) Boc-D-TMSalONp, din exemplul 1. în THF și se adaugă o soluție apoasă formată din cantități echivelante molare de 1-adamantilglicină și Et,N. După 20 h, la temperatura camerei, se îndepărtează THF în vid și reziduul apos este diluat cu 150 ml HC1 0,IN și apoi se extrage de câteva ori cu EtOAc. Straturile organice combinate sunt spălate cu saramură, uscate pe Na₂SO₄ și concentrate în vid. Produsul uleios este cromatografiat pe silicagel (CH₂C1₂) și s-a obținut dipeptida Boc-D-TMSal-Adgly-OH sub forma unui ulei. 6,9 g (15,2 mMol) Boc-D-TMSal-Adgly se dizolvă în 80 ml EtOAc. După răcire la 0°C, se adaugă 2,1 g (18,0 mMol) HONSu și 3,1 g (15,2 mMol) DCC și se agită, timp de 3 h, la 0°C și încă 15 h, la temperatura camerei. Amestecul s-a răcit din nou la 0°C, diciclohexilureea s-a filtrat și s-a spălat cu EtOAc. Filtratul s-a spălat cu soluție apoasă 0.1 M NaHCO, și apoi cu soluție apoasă 2% de KHSO₄. După uscare pe Na₂SO₄ și concentrare în vid, s-au obținut 7,2 g Boc-D-TMSal-Adgly-ONSu sub forma unei spume albe.

C) Boc-D-TMSal-Adgly-boroPro-OPin. Compusul din titlu s-a obținut prin folosirea procedeului în 3 etape descris pentru sin107661 teza Boc-D-TMSal-Pro-Baa-OPin din exemplul 1/C. Datorită împiedicării sferice a esterului din etapa B, acesta are reactivitate scăzută și se obține în cantitate de 2,7 g (5,0 mMol); intermediarul aaminoboronat, care rezultă din reacția a 1,7 g (5,0 mMol) de chiral a-cloroboronat ((+)-Pinandiol-(S)-1 -cloro-4-brombutan-1 boronat cu 5,0 mMol hexametildisilizan și hidroliza cu HC1, ciclează la derivatul de boroprolină, care reacționează apoi cu esterul activ din etapa B pentru a forma Boc-D-TMSal-Adgly-boroPro-OPin, ca produs majoritar. Prin cromografie în flacără (2 : 1 hexan/EtOAc) s-au obținut 0,48 g produs din titlu, sub forma unei spume albe, din care prin purificare ulterioară prin recristalizare din eter/hexan se obține produsul dorit, Boc-D-TMSalAdfgly-boroPro-OPin, sub forma unui compus cristalin alb, cu punct de topire 187 ... 188°C, /α/θ= +2,8 (c =1,0 în CH₂C1₂).

Compușii cu formula generală I sunt utili ca inhibitori ai proteazelor de tipul tripsinei și pot fi folosiți in vitro pentru diagnosticare și pentru studiul mecanic al acestor enzime. Mai mult, datorită acțiunii lor inhibitoare sunt indicați pentru folosire în prevenirea sau tratamentul bolilor cauzate de excesul unei enzime într-un sistem regulator, de exemplu pentru controlul coagulării sistemului de fibrinoliză.

Acei compuși ai invenției care sunt inhibitori ai factorului Xa și ai trombinei au proprietăți anti-trombogenice și pot fi folisiți când este necesar un agent antitrombogenic. în general, acești compuși pot fi administrați oral sau parenteral pentru a obține un efect anti-trombogenic. în cazul mamiferelor mari, cum este omul, compușii pot fi administrați singuri sau în amestec cu un purtător farmaceutic sau un diluant, la o doză de la 0,02 la 15 mg/kilocorp și, de preferință, de la 1 ... 10 mg/kg pentru a obține efect anti-trombogenic și pot fi dați în doză unică sau împărțiți în mai multe doze sau într-o receptură cu eliberare susținută. Pentru testare, se administrează intravenos pacientului o doză de 0,1 ... 1 mg/kg. Pentru întregul sistem sanguin este necesară o doză de I ...10 mg per litru pentru a preveni coagularea. Ca diluanți farmaceutici se folosesc zaharuri. amide și apă care se folosesc pentru a obține tablete, capsule, soluții injectabile ș.a. Compușii, conform invenției, pot fi adăugați pentru prevenirea coagulării sângelui în conteinerele de colectare sau distribuire, tubulatura sau aparatura care se implantează și care vine în contact cu sângele.

Parametrii cinetici k_jț k_r și k, sunt determinați din inhibarea hidrolizei catalizate de enzime a peptid-arg-pNA. Această hidroliză conduce la p-nitroanilină și formarea ei funcție de timp, evaluată din densitatea optică măsurată la 405 nm, permite determinarea vitezelor inhibate și neinhibate.

Măsurătorile cinetice s-au realizat pe o placă cu 96 de microcavități, combinată cu un dispozitiv de înregistrare cinetică cu o singură celulă. Trombina umană cu pozițiile active titrate s-a dizolvat în soluție tampon de fosfat 0,lM, /?H= 7,4, conținând 0,1 M NaCl și 0,1% albumină bovină la o soluție stoc conținând 400 nM enzimă activă. Pentru determinările cromogenice această soluție s-a dizolvat în aceeași soluție tampon la 0,4 nM. Substratul, 2AcOH-H-D-ciclohexil-ala-arg-pNA se dizolvă în aceeași soluție tampon la o concentrație de 0,5 mM. Inhibitorii s-au dizolvat inițial în cromofor/etanol 1 : 1 și apoi s-a diluat cu apă distilată la o soluție stoc lmM. Diluările ulterioare s-au făcut cu soluție tampon de fosfat descrisă mai sus.

încercările s-au început prin adăugirea a

100 μΙ soluție de enzimă la un amestec conținând 100 ml inhibitor și 50 μΐ soluție de substrat. Eliberarea //-nitroanilinei prin hidroliza substratului peptidil-/?-nitroanilidă este urmărită timp de 30 min. până la 1 h, prin măsurarea creșterii densității optice la 405 nm. Datele obținute s-au folosit pentru calculul parametrilor cinetici, în prezența sau absența inhibitorilor. Deși nu sunt excluse și alte mecanisme de acțiune, această clasă de inhibitori ai trombinei se caracterizează prin două mecanisme de bază. unul rapid și reversibil și unul lent. Constantele cinetice ale inhibitorilor care acționează după un mecanism de legare rapidă și reversibilă, (viteza inițială v₀ a probei de control > v₍, cu inhibitor) la I,» Et (concentrația totală de inhibitor/concentrația totală de enzimă) s-au calculat prin regresia liniară din curbele 1/v funcție de concentrația de inhibitor /1/. Valoarea Kj s-a calculat din ordonata la origine K, cu ecuația (1):

K_iapi, = Κ,α+S/KM) (1)

Dacă viteza de interacțiune cu enzime este lentă (v_o nu este afectat de inhibitor) și strânsă (Kj este apropiat sau mai mic decât E,) astfel că viteza stării staționare inhibate este atinsă lent, formarea pNA este descrisă de relația:

(K-v.)

P- V t ₊ . ⁰ .. L/l-exp(-k_i>hst)l (2) în care P este cantitatea de pNA format la timpul t, V_o este viteza inițială, V_s viteza stării staționare și k_obs viteza de reacție globală aparentă funcție de E,. I_t, Kj și constanta vitezei de ordinul doi observată (k'_un) pentru interacția inhibitorului și enzimei. Datele măsurătorilor inibării prin legare strânsă și lentă sunt în concordanță cu ecuația (2) printr-o analiză de regresie neliniară care dă valorile estimate ale kobs. Valorile pentru k’_on, k_off și K_{i app} sunt apoi obținute din reprezentarea k_l)bs funcție de /1/. Valoarea Iui k_ol-, este dată de intersecția verticală în timp ce valorile k' și K, sunt calculate din pantă și din intersecțiile orizontale, folosind ecuația (1).

Claims

Revendicări

1. Derivați peptidici, inhibitori ai serinproteazei, conținând cel puțin un a-aminoacid nenatural, având o catenă laterală hidrofobă, caracterizați prin aceea că prezintă structura corespunzătoare formulei generale I:

în care W reprezintă hidrogen sau o grupă N-protectoare, Y reprezintă o secvență de aminoacizi, astfel că peptida n+1 aminoacizi Y-Lys sau Y-Arg are afinitate pentru poziția activă a proteazei de tipul tripsinei, n este un număr întreg de la 1 la 10 și în care cel puțin un aminoacid este un aminoacid nenatural, având o catenă laterală hidrofobă, Q, și Q₂ sunt identici sau diferiți și sunt aleși dintre -OH, -COR,, -CONR,R_n, -NR|R₂ sau -OR, sau Q, și Q, luați împreună formează un rest diolic, R,, R₂ și R, pot fi identici sau diferiți și reprezintă alchil C|._1O, arii C₆_,_o, aralchil C₆._l0 sau fenil substituit cu trei grupe alese dintre alchil 0,.4, halogen și alcoxi C,_₄, R₄ reprezintă hidrogen sau alchil C,._]0, R, este o grupă -A-X, în care A este -(CH₂), - în care z este 2,3,4 sau 5, -CH(CH,)-(CH₂)₂; -CH₂-CH (CH,)CH₂. -(CH₂)₂-CH(CH,)-, -(CH₂)₂-C (CH,)₂-, -CH(CH,)-(CH₂)„ -CH₂-CH (CH₃)-(CH₂)₂-; -CH₂-CH₂-CH(CH,)-CH₂-; (CH₂) ,-CH(CH,)-; -(CH₂),-C(CH,)₂; arii C₆.₎₀, aralchil C₆.₁₀ și X reprezintă -NH₂, -NH-C(NH)-NH₂, -SC(NH)-NH₂-, -N„ alcoxi C,.₄, alchiltio C,_₄sau -Si(CH,), sau R₄ și R_s formează împre107661 ună o grupă tri- metilen și atomul de carbon marcat prin asterisc are configurația D- sau L- sau reprezintă un amestec al acestora.
2. Derivați peptidici, conform revendicărilor 1, caracterizați prin aceea că W este H(CH₂CH₂O),,-, R_ftCO-, R₇COO- sau R₈SO₂- în care p este
3...30, R₆ este alchil C,_₆; R₇ este alchil C,_₆, fenil, benzii sau naftil și R_x este fenil, naftil sau alchilfenil C_M3. Derivați peptidici, conform revendicărilor 1 și 2, caracterizați prin aceea că prezintă formula generală Ia:

cărilor 1 sau 2, caracterizați prin aceea că Q, și Q₂ reprezintă împreună o grupă cu formula (a) sau (b):

Rd

I

R, ,OR_C ''VlR (Ia) io 'Μ ‘'3 în care W, Y, R₄ și R₅ sunt definiți în revendicările 1 sau 2 și R₉ și R₁₀ reprezintă un rest de compus hidroxi.
4. Derivați peptidici, conform revendia) b)
5. Derivați peptidici. conform revendicărilor 1 ... 4, caracterizați prin aceea că aminoacidul nenatural prezintă formula II:

Rn

I (ii)

-NH-CH-CII o

în care R,, este o grupă hidrofobă.
6. Derivați peptidici, conform revendicării 5, caracterizați prin aceea că R,, este R'_n și reprezintă o grupă cu formula (c), (d), (e), (f), (g), (h) sau (i):

-CH₂-C(CH₃)₃I)
7. Derivați peptidici, conform revendicării 1, caracterizați prin aceea că Y este o secvență de doi aminoacizi dintre care aminoacidul cu N terminal este un 25 aminoacid nenatural și celălalt aminoacid este L-prolină.
8. Derivați peptidici, conform revendicării 1, caracterizați prin aceea că prezintă formula III:

(III)
9. Derivați peptidici, conform revendicării 1, caracterizați prin aceea că prezintă formula IV:

zintă formula V:

(IV)
10. Derivat peptidic, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că pre- (V)
11. Procedeu pentru prepararea derivaților peptidei cu formula I și definiți în revendicarea 1, caracterizat prin aceea că atunci:

i) când X este -NH-C(NH)-NH, compusul cu formula I în care X este -NH, reacționează cu cianamidă, într-un solvent organic, în condiții acide puternice;

ii) când X este -NH₂, compusul cu formula I în care X este -N₃ se hidrogenează utilizând un catalizator de Pd/C;

iii) când X este -N₃, compusul cu formula VI:

W-Y-NH-CH-B /Q, (VI)

Cl-CH-B •q₂ în care W, Y, Q, și Q-, sunt definiți în revendicarea 1 și R_l2 este -A-Br, A fiind definit în revendicarea 1, reacționează cu azidă de sodiu, într-un solvent aprotic polar cum ar fi dimetilsulfoxid;

iv) când X este -Si(CH,), sau -O-alchil, compusul cu formula VII:

X'2 (VII) în care Q, și Q₂ sunt definiți ca în revendicarea 1 și R_n este -A-Br, -A-Si(CH₃), sau -A-O-alchil, reacționează cu LiN/Si (CH,),/₂ urmată de hidroliză acidă și cuplare cu o peptidă protejată cu formula VIII:

(VIII) o

în care W și Y sunt definiți ca în revendicarea 1, hidroliză acidă fiind efectuată cu 3 moli echivalenți de acid și cuplarea cu un compus cu formula VIII este efectuată într-un solvent polar aprotic uscat, cum ar fi tetrahidrofuran, la o temperatură între -78°C și temperatura ambiantă.
12. Derivați peptidici, conform cu ori107661 care dintre revendicările de la 1 ... 10. caracterizați prin aceea că se utilizează ca inhibitori ai serinproteazelor de tipul tripsinei cum sunt trombină. factorul X.,. kalikreina, plasmina. prolilendopeptidază 5 și proteaza I„AI, singuri sau în amestec cu un suport farmaceutic sau diluant într-o doză de la 0.02 la 15 mg/kg pentru a obține un efect antitrombogenic, administrați într-o doză mică sau împărțit în mai multe doze sau într-o formulare cu eliberare susținută.