CS245153B1 - Kmeň mikroorganizmu Acremonium chrysogenum - Google Patents

Abstract

Produkčný kmeň mikroorganizmu Acremonium chrysogenura/Thirum et Sukap/ W. Gams CCM F-729 produkuje za aerobných podmienok kyselinu 7-/D-5-amino-5-karboxy-n-valeramido/-3-acetoxymetyl-3-cefem-4-karboxylovů tzv. cefalosporín C vzorca I HOOC-CH -/ch2/3-CO-NH nh2 COOH ch2ococh3 /1/ Cefalosporín C sa používá na přípravu polosyntetickych cefalosporínových antibiotik. Cefalosporín C sa připravuje submerznou fermentáciou v přítomnosti zdrojov síry. Vdčšina priemyselných produkčných kmeftov sd auxotrofné mutanty dependentné na DL-metionín. Kmeň Acremonium chrysogenum CCM F-729 nie je závislý na DL-metioníne, produkuje cefalosporín C na ekonomicky výhodných zdrojoch síry, akým je NajS^O .51^0.

Description

Cefalosporín C sa používá na přípravu polosyntetickych cefalosporínových antibiotik.

Cefalosporín C sa připravuje submerznou fermentáciou v přítomnosti zdrojov síry. Vdčšina priemyselných produkčných kmeftov sd auxotrofné mutanty dependentné na DL-metionín.

Kmeň Acremonium chrysogenum CCM F-729 nie je závislý na DL-metioníne, produkuje cefalosporín C na ekonomicky výhodných zdrojoch síry, akým je NajS^O .51^0.

Vynález sa týká nového priemyselného mikroorganizmu produkujúceho kyselinu 7-/D-5-amino-5-karboxy-n-valeramido/-3-acetoxymetyl-3-cefem-4-karboxylovú, obecného vzorca I, tzv. cefalosporín C /CFS-C/

HOOC-CH-ICHjh-CO-NH

I ' nh₂ ( ch₂ococh₃ /1/

COOH

Cefalosporín C sa používá ako východzia surovina pri príprave polosyntetických cefalosporínovích antibiotik. Produkčný kmeň bol získaný v screeningovom programe, zameranom na izoláciu kmeňov nezávislých na DL-metioníne.

Východzím kmeilom bola kultúra Cephalosporium acremonium WIS OP 163, maxlmálna produkcia cefalosporinu C dosahovaná na pódach s tiosíranom sodným ako zdrojom síry bola 200-400 /ig/ml. Cefalosporínové antibiotiká odvodené od kyseliny 7-aminocefalosporánovej sú vyráběné prevážne pomocou kmeňa Cephalosporium acremonium /po reklasifikácii Gamsom W. v roku 1971 Acremonium chrysogenum/.

Rod Cephalosporium je v systematike zaradený do čelade Moniliceae do triedy Fungi imperfecti /Deuteromycetes/. U rodu Cephalosporium sú spory vytvárané len terminálne na nevětvených konídiofóroch, skoro pravidelné posadených na hlavnom mycéllu. Cephalosporium tvoří septované hýfy, septy delia protoplazmu na menšie úseky.

Konídionoslče sú jednotlivé, silné bazofilné. Známa je reprodukcia nepohlavnou mitózou a buněčnou elongáciou. Nepohlavné spory sú jednobuněčné konédie s jedným jadrom, vytvárané na hýfach.Buňky mycélia aj konídle obsahujú po jednom haploidnom jadre. Tieto vlastnosti si ponechávájú aj pri submerzných kultiváciách.

Cephalosporium ako eukariotický organizmus má membránou ohraničené jádro s chromozomálnou štruktúrou a oytoplazmou s poměrně komplexmou membránovou štruktúrou /mitochondrie, endoplazmatické retikulum/. Významná je najma mimobunečná akumulácia antibiotika spósobená exkréciou cez koncentračný gradient.

V submerznej kultúre sú přítomné štyri typy buniek: septované hýfy, konídie, klíčiace konídie a artrospóry.

Morfológia je rozdielna v závislosti od použitého zdroja síry. Pri fermentácii s použitím DL-metionínu je převaha artrospór, s existenciou ktorých je spojená maxlmálna tvorba antibiotika. Pri použití anorganických zdrojov síry sú v submerznej kultúre v prevahe vláknité formy; hrúbka vlákna je menšia ako pri použití DL-metionínu.

Popisovaný kmeň bol získaný nasledujúcim spósobomi

Povodný kmeň Caphalosporium acremonium WIS OP-163 bol spracovaný chemickým mutagénom N-nitrozometylbiuretom. Najlepší izolát pracovně označený 8c VULM produkoval v submerznej kultivácii 1 800 až 2 000 iig/ml cefalospor inu C.

Izolát 8c VULM bol v ďalšej fáze vystavený posobeníu 0V žiarenia. Získané izoláty boli hodnotené rýchlou screeningovou metodou na valčekoch z agarizovanej živnej pódy s róznymi zdrojmi síry. Valčeky s vyrastenými kolonami na povrchu boli testované na agarovej platni s testovacím mikroorganizmom Alcaligenes faecalis ATCC 8750, Specifickým pre cefalospor ín C.

Izolát s nSjvSčším priemerom Inhibičnej zóny na agarizovanej pode s tiosíranom sodným bol ďalej testovaný v baničkovej fermentácii a v laboratórnych fermentoroch. Izolát mal pracovné označenie 188 VULM, aktivita cefalosporinu C vo filtrátoch fermentačnej pody bola stanovená v 168. kultivačnej hodině spektrofotometrickou metodou /Claridge C. A., Vaughan R. W.: Antimicrob. Agents Chemother., 1969, 131/ a metodou HPLC /vypracovaná VÚLM/. Genealogická schéma kmeňa je označená ako schéma č. 1. Xzolát 188 VULM je uložený v Cs. sbírce mikroorganizmu UJEP v Brně pod číslom CCM F-729.

Posóbenie chemického mutagénu.

Kmeft OP 163 WIS bol deponovaný vo formě lyofilyzovanej konzervy alebo krátkodobé na šikmom agare /sporulačná póda označená NB-II; zloženie uvedené v dalšom texte. Zo šikmého agaru bola připravená vodná suspenzia o koncentrácii 10® až 10® konídií/ml. Suspenzia bola ' přefiltrovaná cez vrstvu vaty. Mutagén N-nitrozometylbiuret bol přidaný v koncentrácii 0,4 i k suspenzii konídií.

Mutangén bol v kontakte s kultúrou počas jednej hodiny na trepacom stroji /4Hz/ pri teplote 27 °C. Po uplynutí expozície bolí zo zmesi mutangén-kultúra připravené riedenia 10l² až 10 konídií/ml. Nariedenými suspenziami boli očkované Petriho misky s agarovou pódou NB-II. Ako kontrola slúžila suspenzia spor bez pridania mutangénu.

Operácie s mutangénom prebiehali bez přístupu denného světla. Spoluprácia na Petriho miskách trvala pri teplote 27 °C 11 dní. Jednotlivé kolonie boli přenesené na šikmý agar NB-II a odskiíšané na produkčnú aktivitu na baničkách.

Pósobenie fyzikálneho mutangénu:

Z kultúry na šikmom agare bola připravená suspenzia konídií zmytím povrchu 10 ml sterilně j vody. Suspenzia bola přefiltrovaná cez vatový filter; zo základnej suspenzie boli prip-12 -13 ravené pracovně riedenia 10 až 10 konídií/ml, ktorými boli naočkované Petriho misky /póda NB-II/. Zdrojom žiarenia bola germicídna OV-lampa /Philips TUV 30W, vlnová dlžka 253,7 nm sa podiela na celkovej spektrálnej energii 93,5 %/.

Povrch agaru s nanesenými konídiami bol exponovaný počas 1 minuty zo vzdialenosti 30 cm. Po ožiarení boli Petriho misky umiestnené v termostate, kde kultúra sporulovala 11 dní pri teplote 27 °C. Z vyrastených kolonií boli ihlovou technikou přenesené spory na povrch agarových valčekov-bločkov.

Po 5 dftoch bol povrch bločkov pokrytý kultúrou. Bločky boli umiestnené na skleněné platné s agarovou pódou s obsahom 25 % kultúry Alcaligenes faecalis ATCC 8750. Inkubácia bločkov trvala 18 hodin pri teplote 37 °C. Hodnotenie izolátov bolo založené na meraní inhibičných zón v okolí bločkov. Najlepší izolát bol z póvodnej kolonie na Petriho miske vyočkovaný na šikmý agar NB-II a odskúšaný v laboratórnej aj štvrťprevádzkovej fermentácii.

Agarová póda NB-II	hmot./obj.
Basto-beef extrakt	0,3
Bacto-pepton	0,5
glukóza	1,0
FeSO4.7H2O	0,005
MgSO4-7H2O	0,005
DL-metionín	0,005
L-cystein	0,005
agar Difco	2,5
pH pódy před sterilizáciou	-6,8.

245153 4

Příprava vegetativneho inokula:

Používali sa 500 ml banky plněné 60 ml inokulačnej pódy o zložení:

sacharóza 1,5 % hmot./obj.

kukuřičný výluh 0,5 octan amonný 0,5 sojový olej 0,2 pH před. sterllizáciou sa upravuje na 7,0.

Na očkovanle sa používá kultúra zo šikmého agaru alebo z jačmennýoh zrn, tzv. jačmenné konzervy. Příprava vegetativneho inokula trvá 72 hodin pri teplote 27 °C na trepaoom stroji /4 Hz/. Vegetatívnym inokulom sa očkujú produkčně pódy rozplnené v 500 ml bankách po 40 ml o zložení:

kukuřičný škrob arašídová múka sacharóza glukóza CaCO₃ ^Na2^S2°3-^5H2° borax kašalotový olej

5,0 % hmot./obj 7,0 0,5 1,25 0,5 0,9 0,05 2,8

Na očkovanle sa používá 8 % obj./obj. vegetativneho inokula. Kultivácla má podmienky totožné s přípravou vegetativneho inokula, dížka kultivácie 168 hodin. Porovnanie produkčnej aktivity kmeňa Cephalosporium acremonium WIS OP-163 s izolátmi 8c VULM a 188 VULM je v tabulke 1. Porovnané sú výsledky dosiahnuté v baničkovej fermentácii:

Tabulka 1

číslo experimentu	kmeň	prod. aktivita /yg/ml/ CFS-C
1	WIS OP-163	350
	8c VULM	1 860
2	8c VULM	1 930
	188 VULM	4 000
3	188 VULM	4 000
	9 VULM	1 680

Kmen používaný vo fermentácii s použitím DL-metionínu ako zdroja síry.

V laboratórnych skleněných tančíkoch /Výv. dielne ČSAV/, objem 2 litre, pracovný objem 1 liter, bola pri podmienkach: vzdušnenie 0,75 objemu vzduchu/objem pódy, miešanie 10 Hz, teplota do 24 kultivačnej hodiny 28 °C, potom do konca fermentácie 23 °C, dosiahnutá produkčně aktivita 5 200 ug/ml za 168 hodin kultivácie.

Morfológia kmeňa:

Morfológiu kmeňa Acremonium chysogenum CCM F-729 je možné popísať nasledujúcim sposobom: Pri monokolÓniovom rozseve tvoří krémové v střede béžovo sfarbené kolonie o priemere 5 až 7 mm. Povrch kolonie je sline vrásčitý, okraje radiálně zbrázděné, střed kolonii je vyvýšený cca 3 nim, tvoří nepravidelný kráter. Septované hýfy majú hrůbku 1,5 až 2,0 jjm. Mycélium je světlo sfarbené. Konídie sú tvaru pretiahnutej elipsy, zachovavajú si hrůbku póvodnej hýfy, ich dlžka je 5 až 6 pm /často sú obalené hlienom/ Kmeň je uchovávaný vo formě konzervy na zmesi hlina-piesok ako lyofilizovaná konzerva, ako šikmý agar na pode NB-II a ako konzerva na sypkom substráte, ktorým je lúpaný jačmeň. Kmeň je stabilizovaný pri pasážovaní šikmý agar-vegetatívne inokulum-sypký substrát-vegetatívne inokulum, ako aj pri pasážovaní šikmý agar-sypký substrát-sypký substrát-vegetatívne inokulum. Všetky materiály sú deponované pri 5 °C, šikmé agary a jačmenné konzervy po dobu 4 mesiacov.

Genealogická schéma kmeňa Acremonium chrysogenum CCM F-729

Cephalosporium acremonium WIS OP-163

N-nitrozometylbiuret . Izolát 8 c VULM

OV světlo

Izolát 188 VULM'/»CCM F-729/

Schéma č. 1

Claims (1)

1. Kmeň mikroorganizmu Acremonium chrysogenum /Thirum et Sukap/W. Gams CCM F-729 produkujúci kyselinu 7-/D-5-amino-5-karboxy-n-valeramido/-3-acetoxymetyl-3-cefem-4-karboxylovú tzv. cefalosporín C vzorca 1.