CS230892B1 - Sposob přípravy itnobilizovanej endopolygalakturonizy - Google Patents

Abstract

Vynález sa týká sposobu přípravy imobilizovanej endopolygalakturonázy. Podstata vynálezu spočívá v tom, že na nosič tvořený polymérnou látkou, například na báze póly 2,6-dímetylfenylénoxidu, polykondenzátu melaninu s formaldehydom, alebů polyetyléntereftalátu adsorbuje glutaraldehyd a na aktivovaný nosič sa posobí endopolygalakturonázou.

Description

230892

Vynález sa týká sposobu přípravy mobili-zované) endopolygalakturonázy [póly («-1,4--D-galacturonid) glyconahydrolase, E. C. 3,-2.1.15], Tento enzým, ktorý katalyzuje štie-penie vnútorných glykozidických vázieb D-galakturonanových reťazcov v molekulepektínu sa v praxi uplatňuje v potravinár-skom priemysle, najma v konzervárenstve avinárstve.

Endopolygalakturonázu mobilizovali do-slal' kovalentným viazaním na nerozpustnénosiče na báze agarózy, celulózy a hydroxy-alkyl metakrylátu po ich aktivácii brómkya-nom, alebo na gél kyseliny polyakrylovejpomocou Karbodiimidu [F. van Houdenho-ven, P. de Witt, J. Visser: Carbohyd. Res. 34(1974) 233; W. Bock, M. Krause, H. Gobel,H. Anger, H. J. Schwaller, C. Flemming, A. Ga-bert: Nahrung 22 (1979) 185; li. Rexová-Ben-ková, M. Mráčková, K. Babor: Collect. Czech.Chem.'Commun. 45 (1980) 163], Dalším sp6-sobom imobilizácie endopolygalakturonázyje adsorpcia na polyetyléntereftalát (li. Re-xová-Benková, J. Omelková, V. Kubánek: A.O. 211 694 (1981). Nevýhodou uvedených po-stupov použitých je operačná zložitost akti-vácie nosiča, v niektorých prípadoch nestá-lost zakotvenia enzýmu na nosiči prejavu-júca sa jeho postupným uvolňováním doroztoku a v případe imobilizácie adsorpcioumožnost adsorbovania aj niektorých inýchlátok přítomných v enzýmových preparátochalebo spracovávaných substrátoch, čím sakapacita nosiča voči enzýmu alebo enzýmováaktivita znižujú.

Uvedené nedostatky sú odstránené u pří-pravy imobilizovanej endopolygalakturonázypodlá vynálezu, ktorého podstatou je, že sana nosič tvořený polymérnou látkou, napří-klad na báze póly (2,6-dimetylfenylénoxidu),polykondenzátu melaninu s formaldehydom,alebo polyetyléntereftalátu adsorbuje pri tep-lotě 20 až 25 °C glutaraldehyd z 1 až 15 %vodného roztoku, aktivovaný polymérny no-sič sa oddělí od vodného roztoku filtráciou,potom sa suspenduje v 0,1 mol 1_1 tlmivomroztoku pH 5,0 až 6.0 a působí sa naň endo-polygalakturonázou pri teplote 4 až 30 °C podobu 1 až 48 hodin a mobilizovaná endo-polygalakturonáza sa nakoniec oddělí zosuspenzie filtráciou. Ďalej je v niektorýchprípadoch výhodné, ak sa na polymérny no-sič adsorbuje glutaraldehyd a na vzniklúkompozíciu sa viaže enzým a znovu sa zo-sieťuje glutaraldehydom. Výhodou navrhovaného spósobu přípravyimobilizovanej endopolygalakturonázy oprotidoterajším sposobom je, že aktivácia nosičaumožňujúca kovalentné viazanie enzýmu jepri predmetnom sposobe jednoduchšia, žezakotvenie enzýmu na nosiči je stálejšie, čoumožňuje dlhodobé kontinuálně používanie.Ďalšou výhodou preparátu připraveného po-dlá tohoto sposobu přípravy je, že nosič ne-adsorbuje substrát, ani váčšinu jeho sprie-vodných látok. Imobilizácia enzýmu na po-rézny polymérny sorbent podlá vynálezu prebieha kombináciou prostej sorpcie a ko-valentnej vazby. Aktivita připraveného za-kotveného enzýmu nie je natolko negativnéovlivňována difúznou bariérou alebo dalšíminegativnými vlivmi, ktoré sa prejavujú pripoužití iných imobilizačných sposobov.

Pre praktická aplikáciu mobilizovanýchenzýmov podlá vynálezu je rozhodujúce i to,že sa používajú vhodné a lačné nosiče, resp.sorbenty a jednoduchý sposob imobilizácie.Polymerné sorbenty, resp. nosiče pre imobi-lizáciu enzýmu podl'a vynálezu sa vyrábajúpostupmi, ktoré spočívajú v tom, že sa poly-mer rozpustí v roztavenom rozpúšťadle a poochladení na kryštalickú hmotu, ktorá sapodrobí ďalšiemu mechanickému zpracová-vaniu sa tavné rozpúšťadlo dokonale vyex-trahuje z polymérnej štruktúry extrakčnýmčlnidlom, ktoré rozpásla tavné rozpúšťadloa neatakuje polymer. Získá sa polymér ob-vykle v práškovej formě s mikroporéznoustrukturou a vysokým měrným povrchom.Sorbent na báze póly (2,6-dimetyl)fenyloxidusa připravuje za použitia kaprolaktamu akorozpúštadla polyfenylenoxidu pri teplote145 °C a extrakčné činidla vody. Sorbent mápravidelná mikroporézná štruktáru a ázkudistribúciu pórov so špecifickým povrchomokolo 700 m2/g a bod topenia 252 °C.

Melaninformaldehydový sorbent sa připra-vuje polykondenzáciou melaninu s formalde-hydom za přítomnosti anorganických solí,ktoré sa zabudujú do polykondenzačnéhogélu a po jeho vytvrdení sa táto sol' vyex-trahuje obvykle vodou. Tento sorbent mávefkosť zrna od 0,1 do 0,5 mm a měrný po-vrch 200 m2/g. Sorbent na báze polyetylén-tereftalátu sa připravuje prezrážením bezvo-dého polyetyléntereftalátu z taveniny nie-ktorých cyklických monomérov, ktoré neroz-púšťajú východzí polymér. Tento sorbent máobjem pórov 2 až 3 cm3/g a špecifický povrch50 až 120 m2/g polymeru. V ďalšom je vynález blížšie objasněný napríkladoch, ktoré však rozsah vynálezu ne-obmedzujň. Přikladl 1 g polyfenylénoxidového nosiča o mernompovrchu 560 m2 per g sa postupné premyje50 ml 72-%ného etylalkoholu a 3-krát 50 mlvody a suspenduje sa v 150 ml 5-%ného glu-taraldehydu. Po 30 minutách miešania pri20 °C sa suspenzia oddělí filtráciou cez fritu.Aktivovaný nosič sa suspenduje v 200 ml0,1 mol 1_1 octanového pufru pH 5,2 a k sus-penzii sa přidá 10 mg endopolygalakturoná-zy rozpustenej v 1 ml pufru. Po 4 hodináchmiešania pri laboratornej teplote sa imobili-zovaný systém oddělí filtráciou cez fritu. P r í k 1 a d 2 1 g nosiča na báze polykondenzátu mela-minu s formaldehydom o mernom povrchu

Claims (1)

1. 230 3 165 m2/g a strednom priemere pórov 11 nmsa suspenduje v 50 ml vody a k suspenzii sapřidá 150 ml 5-%ného roztoku glutaraldehy-du a zmes sa mieša 2 hodiny pri 25 °C. Akti-vovaný nosič sa odfiltruje a znovu sa sus-penduje v 200 ml 0,1 mol l-1 octanovéhopufru pH 6,0. K suspenzii sa potom přidá10 mg endopolygalakturonázy rozpustenejv 1 ml roztoku pufru. Po 2 hodinách mieša-nia sa suspenzia odfiltruje a získá sa mobi-lizovaný enzým. Příklad 3 1 g polyetyléntereftalátového nosiča omernom povrchu 120 m2/g sa premyje 50 mlvody a suspenduje sa v 150 ml 15 % glu-taraldehydu. Po 15 minutách miešania pri 25stupňov Celsia sa suspenzia oddělí filtráciou 9 2 6 cez fritu. Aktivovaný nosič sa suspendujev 200 ml 0,1 mol l-1 octanového pufru pH6,0 a k suspenzii sa přidá 10 mg endopoly-galakturonázy rozpustenej v 1 ml pufru. Po2 hodinách miešania pri laboratornej teplotesa imobilizovaný enzým oddělí filtráciou cezfritu. Aktivita imobilizovanej endopolygalaktu-ronázy pripravenej podlá navrhovaného spo-sobu přípravy tvoří 15 až 40 % aktivity roz-puštěného enzýmu použitého k imobilizácii.Imobilizovaná endopolygalakturonáza připra-vená podlá navrhovaného sposobu přípravysa vyznačuje vysokou stálosťou zakotveniana nosiči a vysokou ©peračnou stabilitou pre-javujúcou sa nemeniacou sa aktivitou v prie-behu niekolkomesačného sústavného použí-vania. PREDMET Sposob přípravy imobilizovanej endopoly-galakturonázy, vyznačený tým, že sa na no-sič tvořený polymérnou látkou, například nabáze póly (2,6-dimetylfenylénoxidu), polykon-denzátu melamínu s formaldehydom, alebopolyetylénteraftalátu, ktorá má poréznuštruktúru so specifickým povrchom 1 až700 m2/g najskůr sorbuje pri teplote 20 až 25 °C glutaraldehyd z 1 až 15-°/oného vod-ného roztoku, aktivovaný polymérny nosičsa oddělí od vodného roztoku filtráciou, po-tom sa suspenduje v tlmivom roztoku pH 5,0až 6,0 a posobí sa naň endopolygalakturoná-zou pri teplote 4 až 30 °C po dobu 1 až 48 ho-din a imobilizovaná endopolygalakturonázasa potom oddělí zo suspenzie filtráciou.