JPH0716415B2 - 生体触媒の固定化用担体およびそれを用いた固定化生体触媒並びにその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は酵母、菌体等の微生物、生体細胞及び酵素等を
含む生体触媒の固定化用担体、特にセラミックスよりな
る担体、およびかかる担体を用いた固定化生体触媒並び
に上記担体の製造法に関する。

（従来の技術） 近年、固定化酵素は糖類、アミノ酸などの生産用触媒、
分析用触媒等として実用化され、その開発・利用は急速
に進展しつつある。また一方、微生物等の生体が生産す
る酵素を純粋に単離・精製して固定するための煩雑な手
間を省くため、酵素産生菌などの微生物自体を担体に固
定して移用する微生物固定化技術の研究が進められ、例
えば特開昭54−11288号、同59−39290号、同59−198976
号、同60−160885号各公報には、微生物菌体をアニオン
交換繊維、ポリアミン化合物、アセタール化ポリビニル
アルコール繊維、アルギン酸金属塩ゲル体などに固定す
ることが提案され、その他にもポリアクリルアミド、寒
天、ｋ−カラギナン、などの有機質高分子担体を用いた
包括法による菌体固定は公知であり、あるものは既に実
用化されている。しかしながらこのような有機質担体は
機械的刺戟で破壊し易く、また酸素や基質との接触効率
が小さいとう欠点がある。

かかる有機質担体に比してガラス、セラミックスなどの
無機質担体は、寸法安定性が大きいこと、劣化または死
滅した微生物等の生体触媒を燃焼除去して再使用し得る
こと、または細菌および溶液のpH変化や化学的侵食に対
して抵抗性を有することなどの長所の故に、その研究並
びに利用がにわかに活発化しつつある。ところが無機質
担体に対する微生物等、生体触媒の固定は物理的吸着に
よるため、酸素との接触効率は良好であり、調製容易に
して安価である反面、微生物等の生体触媒と担体との結
合力が比較的小さく、生体触媒が流亡し易いという重大
な欠点がある。

（発明が解決しようとする課題） 本発明者は、上述の問題点を解消すべく無機質担体であ
るセラミックスに対する酵素産生微生物等の生体触媒の
物理的吸着挙動について研究を重ねた結果、担体および
生体触媒の水中における表面電荷が両者の結合力に密接
に関連することを知見し、本発明に到達したものであ
る。

本発明の目的は、高い触媒効率を長期間に亘つて維持し
得る生体触媒固定化セラミックスを提供するにある。

本発明の他の目的は、生体触媒固定化用としてのセラミ
ックス担体の適用種類範囲を拡大するとともに、微生物
の適用種類の範囲をも拡げんとするにある。

（課題を解決するための手段） 上述の目的を達成するための本発明の生体触媒の固定化
用担体は、セラミックス多孔質体と、水中において上記
セミックスの表面電荷と反対電荷をもつ複数の原子団を
一分子中に備えた高分子電解質とよりなり、該高分子電
解質は上記セラミックス多孔質体の固体表面を被覆して
それとイオン結合すると共にさらに複数の遊離イオン性
基を備えてなる。

かかる生体触媒の固定化用担体の好ましい態様において
は、前記セラミックス多孔質体が負の表面電荷を有し、
前記原子団がアミンである。この場合最も好ましい高分
子電解質はポリアミンまたはピリジニウム誘導体であ
る。

一方、前記セラミックス多孔質体が正の表面電荷を有す
る場合は、前記原子団はカルボン酸またはスルホン酸で
あることが好ましい。

上記固定化用担体を用いた固定化生体触媒は、セラミッ
クス多孔質体の固体表面を被覆してそれとイオン結合し
ている高分子電解質の上記イオン結合に関与しない複数
のイオン性基上にそれと反対電荷をもつ生体触媒が吸着
固定されてなる。

また、前記生体触媒の固定化用担持体の製造法は、セラ
ミックス多孔質体を、それと反対電荷をもつ複数の原子
団を有する高分子電解質の0.01〜1.0重量％を含む水溶
液中に浸漬し、脱気することにより水溶液をセラミック
ス多孔質体の固体表面と接触させるとともに水溶液中の
高分子電解質を上記多孔質体表面に吸着せしめた後、遊
離高分子電解質を水洗除去することよりなる。

かかる製造法において前記高分子電解質水溶液に更に該
高分子電解質より生じた高分子イオンと反対電荷の１価
イオンを生ずる無機強電解質0.01〜1mol/Lを添加すると
優れた効果を奏する。

本発明に適用するセラミックスは、珪酸塩、金属酸化物
およびこれらの混合物、さらに炭素、ほう素、珪素など
の炭化物、セレン化物などを含むことができ、例えば、
シリカ；カオリナイト、葉ろう石、シリマナイト、ムラ
イトなどの珪酸アルミナ；長石、雲母、モンモリロナイ
ト、リウサイトなどのアルカリ珪素アルミナ；コージェ
ライト、ステアタイト、タルク、フォルステライトなど
の珪酸マグネシウム；スピネル構造のアルミン酸マグネ
シウム；コランダム、サファイア、ボーキサイト、ギブ
サイトなどのアルミナ；その他アパタイト、チタン白、
磁器、煉瓦などを包含し、就中、コージェライト、ムラ
イト、アルミナおよびジルコニアは好適である。これら
は粉末、細粒状として、あるいはそれらの焼結体、多孔
質体として、例えばハニカムなどの貫通型マルチセル構
造の成形体として用いられる。

かかるセラミックスはその結晶を構成するイオンの媒液
中における存在量によって表面が正または負に帯電する
場合、あるいは破砕などによって固体の結合手が切断さ
れ、表面に電荷を帯びる場合など、種々の条件により接
触媒体との界面に電荷をもつ。セラミックスの水中にお
ける表面電荷の正負は、その種類によっても異なり、例
えばアルミナ、ジルコニアなどは正電荷を示すが、石英
を始めコージェライト、ムライトなどその他多くのもの
が負電荷を示すことが実測により確認されている。例え
ばアルミナ、コージェライト、ムライトはそれぞれ＋28
mV,−32mV,−20mVの表面電位を示す。

一方、生体触媒も水中における表面電荷の正負や量は一
定しておらず、例えば第１表に示す如き同一種の酵母、
サッカロマイセス・セレビジェ（Saccharomyces Cerevi
siae）のみについても亜種によって様々な符号と値とを
示すことが実測の結果認められた。

本発明において、高分子電解質とは、高分子鎖中に複数
の解離基を有する高分子物質であって、水に溶解すると
解離して数十価、場合によっては数万価に及ぶイオンを
生ずるものをいう。解離基数が多い場合は分子全体とし
ての荷電量が大でその大きい静電ポテンシャルにより他
物質、特に反対電荷を有する物質への吸着性が著しい。

かかる高分子電解質のうち本発明において特に重要なも
のは、ポリアミンである。ポリアミンは一分子中にカチ
オン性解離基としての１級〜３級窒素を含む原子団複数
個を有し、かかるアミンは４級化していてもよい。本発
明に適用されるポリアミン高分子化合物としてはポリア
クリルアミド、ポリメタアクリル酸アミド、ポリアクリ
ル酸アミノアルキルエステル、ポリメタアクリル酸アミ
ノアルキルエステル、ポリアミド類、ポリイミド類、そ
れらポリアミンの第４級アンモニウム化合物、ピリジウ
ム誘導体等を例示することができる。ポリアミンより生
じた高分子イオンは水中にて負の表面電荷を有するセラ
ミックスに強力に吸着し、イオン結合する。

一方、正の表面電荷を有するセラミックスを用いる場合
は、ポリカルボン酸高分子化合物、ポリスルホン酸高分
子化合物などのアニオン性解離基を有するものが好適に
用いられ、それらの代表的な例としては、アルギン酸、
ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、それらの共重合
物、スルホン化ポリエチレン、ポリスチレンスルホン
酸、それらのアルカリ金属塩などが挙げられる。

上記高分子電解質は、脂肪族と芳香族の双方を含むが、
一般に脂肪族の方が解離度が大きく、より好ましく、ま
たその分子量は、解離基の数その他によって左右される
ため一概には規定できないが、水中で解離して高分子イ
オンとなり、溶解し得る程度であることが好ましい。

上記高分子電解質を以ってセラミックス固体表面を一様
に被覆し両者を結合させるには、約0.01〜1.0重量％、
好ましくは約0.05〜0.2重量％の高分子電解質水溶液中
に該高分子電解質の高分子イオンと反対電荷を有するセ
ラミックス多孔質体を投入し、雰囲気を真空ポンプなど
により減圧して十分な脱気を施す。脱気によってセラミ
ックス多孔質体の細孔中の空気は抜け出し、代わって高
分子電解質水溶液が侵入するため、セラミックス多孔質
体の固体表面は細孔内に至るまで隅無く高分子電解質と
接触する。この状態で一夜静置すれば、セラミックス多
孔質体の微細孔内をも含み、その表面を高分子電解質が
被覆し結合する。余剰の遊離高分子電解質を水洗除去し
た上、セラミックス多孔質体をそれが粉粒体の場合は篩
別、濾過等、適宜な手段により溶液より分離し、必要に
応じ風乾すれば、生体触媒固定用担体を得る。

上記高分子電解質の濃度が0.01重量％未満の場合は、セ
ラミックス上に結合する高分子電解質の量が少な過ぎ
て、生体触媒の意図する固定量が得られず、また1.0重
量％を超えると、高分子電解質の種類や構造・分子量な
どによっては溶液粘度が高くなり過ぎてセラミックスの
微細孔に侵入し難くなる傾向が生ずる場合もある。

上述の方法により得られた担体はその表面に尚多くの遊
離イオン性基を備えており、それと反対電荷を有する生
体触媒とイオン結合をなし得る状態にある。しかしなが
ら、高分子電解質がセラミックス表面に平面的に吸着さ
れた場合は、該高分子中のイオン性基の実質的に総てが
セラミックス表面電荷により中和され、最早や生体触媒
とイオン結合をなし得る遊離基が実質上残らない状態と
なり、本発明の目的に沿わない。

本発明者等は、このような不都合を解消する方途につい
て鋭意研究の結果、少量の無機強電解質を高分子電解質
水溶液中に添加することが極めて有効であることを知見
するに至った。

ここで強電解質とは水中で略々完全に電離していると見
做される、NaCl,KCl,CaCl₂,Na₂SO₄等に代表される無機
塩類であり、本発明においては特に、水溶液中の高分子
電解質より生ずる高分子イオンと反対電荷の１価イオン
を電離によって生ずる塩類を適用する。すなわち高分子
電解質がポリアミンである場合は、例えばCl^-を生ずる
ような塩類を、また高分子電解質がポリカルボン酸また
はポリスルホン酸などの場合は例えばNa⁺,K⁺を生ずるよ
うな塩類を選択することが肝要である。高分子イオンの
カウンターイオンが２価以上である場合は、高分子電解
質がイオン架橋により不溶化するので好ましくない。

強電解質の好適な添加量は、0.01〜1.0mol/L、更に好ま
しくは高々0.5mol/L程度である。それ以上加えても効果
の増大は実質上認められない。

かかる強電解質の添加によって、高分子電解質水溶液の
粘度は顕著に低下し、セラミックスの複雑な表面構造に
も良く沿って微細孔へも侵入し接触するとともに、多く
の遊離イオン性基が保存される。

強電解質添加が上述の効果を奏する機作は高分子電解質
のイオン性基どうしの電気的な分子内反撥が、カウンタ
ーイオンにより弱まり分子形状が恰も糸毬に似た形状と
なるものと推定される。それにより糸毬の円周上に多数
配置されるイオン性基のうちセラミックス表面と接触し
た一部を以てイオン結合をなすが、残る多くのイオン性
基は遊離状態で残存し、接近する生体媒体の捕捉結合に
備えるものと考えられる。

（作 用） 上述の方法により、高分子電解質を被着・固定したセラ
ミックスは表面電荷符号が逆転し、従来セラミックスに
直接吸着することが困難であったセラミックスと同荷電
の生体触媒を良く吸着し、強固なイオン結合を形成す
る。このような作用を利用して適宜に選択された生体触
媒に対して適用すれば、著しい固定量の増大と結合力の
強化が達成される。

このように、本発明になる生体触媒固定化用担体は、表
面電荷という全く新しい観点に立って、セラミックス担
体とそれに吸着担持される生体触媒の吸着固定力を高分
子電解質を介して増大せしめたものであり、表面電荷の
改変を高分子電解質の強大な静電ポテンシャルによる被
着で行なったため、極めて安定して表面電荷が転換増大
する。すなわち高分子電解質のアミンまたはカルボン酸
などの遊離官能基がセラミックスへ強固に結合するた
め、その表面状態は安定に保たれ、容易にその機能を失
うことがない。またそれに微生物を吸着せしめる際に
も、両者の表面電荷の関係を巧みに利用したため、従来
のファンデルワールス吸着に主として依存したものに比
して頗る強固に、しかも多量の微生物が吸着し、反応中
に簡単に流亡することがない。

（実施例） 本発明の優れた作用・効果を例証するため、以下その実
施例について述べる。

実施例中、表面電荷の測定は次の方法によった。

〔生体触媒の電荷〕

〔セラミックスの電荷〕 〔生体触媒の吸着量〕 酵母濃度が1.6×10⁷cells/mlとなるように酵母の懸濁さ
れた３％エタノール溶液にグルコース３重量％を添加溶
解し、pHを3.0に調節した。この懸濁液について波長570
nmの光学濃度（0D₅₇₀）を測定した。次いでこの懸濁液1
0ml中に、粒径１〜1.4mmに粉砕したセラミックス担体1g
を投入し、４℃の温度で３時間振盪後、再び0D₅₇₀を測
定した。

最初の0D₅₇₀の値に対する減少量を吸着量とした。

実施例１ コージェライトを粉砕し、平均粒径１〜1.4mmとなした
ものの水中における表面電荷を測定したところ、負の電
荷を示した。このもの1gを真空吸引装置付き300ml容フ
ラスコ中に、クリフィックス^RCP−604〔栗田工業（株）
製、ポリメタクリル酸アミノエステル系、高カチオン性
ポリアミンの商標名〕所定量を含む水溶液100mlと共に
入れ、1.5Torr.に迄脱気し、コージェライトに吸蔵され
た気体を抜き出し、ポリアミン溶液をコージェライト全
表面と充分に接触させた。その状態で約８時間静置した
後、水溶液を濾別し、コージェライトを水洗して風乾し
た。このものの表面電荷を測定したところ強い正電荷を
示した。

生体接触として、樹液酵母、サッカロマイセス・セレビ
ジェKSC−44（表面電荷：負荷電）を用いて上記のポリ
アミン被着コージェライト担体に対する酵母吸着量を測
定した。

比較例１ ポリアミン処理をしない以外はすべて上記実施例１と同
様にして酵母吸着量を測定した。

その結果を前記実施例１における測定結果とともに第２
表に示す。

上表から明らかな通り、無処理のコージェライトを担体
とした比較例１にあっては、或る程度の酵母吸着量を示
したが、本発明によりポリアミンを以って処理したもの
は吸着量が顕著に増大し、ポリアミンの濃度の上昇と共
に約倍量に迄増加した。また酵母を担持した固定化生体
触媒をバイオリアクターに充填してグルコース溶液を流
通したところ、本発明品にあっては酵母の増殖が観察さ
れたが流亡は殆ど認められず、長時間に亘って良好な活
性を維持することができた。一方、比較例１のものは、
経時的に活性低下が著しく、酵母の固着強度が極めて小
さく、流亡が甚だしかった。

実施例２ ポリアミン水溶液に強電解質としてNaClをそれぞれ0.1m
ol/L,0.2mol/Lおよび0.5mol/L添加してコージェライト
を処理する以外はすべて前記実施例１と同様にして酵母
吸着量を測定した。その結果を前述第２表のデータと共
に第３表に示す。

上表から明らかな通り強電解質の補助的効果は頗る大で
ある。

実施例３ 水中において正の表面電荷を示すアルミナをセラミック
ス担体とし、ポリアミンの代りに水溶性ポリアクリル酸
ナトリウム塩を用いる他は実施例１と同様にして表面電
荷を負に転換した担体を得た。

ポリアクリル酸ナトリウム塩で処理する前後の担体につ
いて、清酒酵母、サッカロマイセス・セレビジェＺ−73
（正電荷）と樹液酵母、サッカロマイセス・セレビジェ
KSC−44（負電荷）のそれぞれの吸着量を測定した。そ
の結果を第４表に示す。

上表から明らかな通り、アルミナの表面電荷は元来正電
荷であるため、表面電荷が同符号のＺ−73は殆ど吸着せ
ず、固定は困難であったが、本発明により担体の表面電
荷を転換することにより、増大した吸着力により、安定
した高率の固定化を示した。これによって、担体及び生
体触媒の組合わせ適用範囲が著しく広がることが理解さ
れよう。

（発明の効果） 以上の説明及び実施例により例証されたところから明ら
かな通り、本発明になる生体触媒固定化用担体は、その
表面に反対電荷を有する高分子電解質がイオン結合によ
り強固に結合しているセラミックスよりなるため表面に
極めて安定な改変された遊離イオン性基を有し、それと
組合された反対符号荷電を有する生体触媒は従来の単な
るファンデルワールス吸着に比して頗る強固な吸着力を
以て多量に吸着し、強力にイオン結合する。その為、生
体触媒と酵素及び基質との接触効率が良好であるという
物理的吸着の長所と相俟って極めて優れた作用活性を示
すとともに、操業中の流亡が減少することから、旺盛な
活性を長期間に亘って維持することができる。

さらに従来の物理的吸着によるセラミックス担体におい
ては、或る生体触媒に対しては適用し得ても別の生体触
媒に対しては満足な吸着を示さず、また生体触媒側を主
体としてみればセラミックスによって吸着の難易に差が
あり、適用可能範囲にそれぞれ制約があった。本発明者
によりかかる吸着機構が解明され、それに基づいて完成
された本発明は上記の制約を解除し、セラミックス担体
の適用範囲並びに生体触媒の適用範囲を随意に拡大し得
たもので、将来の生体触媒固定化技術の発展、工業化に
おける大きな寄与が期待される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 審査官 植野 浩志

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】セラミックス多孔質体と、水中において上
   記セミックスの表面電荷と反対電荷をもつ複数の原子団
   を一分子中に備えた高分子電解質とよりなり、該高分子
   電解質は上記セラミックス多孔質体の固体表面を被覆し
   てそれとイオン結合すると共にさらに複数の遊離イオン
   性基を備えてなる生体触媒の固定化用担体。
2. 【請求項２】セラミックス多孔質体の固体表面を被覆し
   てそれとイオン結合している高分子電解質の上記イオン
   結合に関与しない複数のイオン性基上にそれと反対電荷
   をもつ生体触媒が吸着固定されてなる固定化生体触媒。
3. 【請求項３】セラミックス多孔質体を、それと反対電荷
   をもつ複数の原子団を有する高分子電解質の0.01〜1.0
   重量％を含む水溶液中に浸漬し、脱気することにより水
   溶液をセラミックス多孔質体の固体表面と接触させると
   ともに水溶液中の高分子電解質を上記多孔質体表面に吸
   着せしめた後、遊離高分子電解質を水洗除去することに
   よりなる生体触媒の固定化用担体の製造方法。