JPS6229978A - 生理活性物質固定化用担体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野１ 本発明は、新規なキトサン多孔性皮膜を固体表面上に設
けた生理活性物質固定化用担体に関するものである。

［従来の技術１ 従来、固体表面上にキトサン皮膜を形成せしめ、キトサ
ン皮膜を担体として各種物質を担持させたものとしては
、特公昭５７−４１９５０号公報及び特開昭５７−６３
６２号公報に記載のものが知られている。特公昭５７−
４１９５０ｊ３公報には、キト１ノン濃度か約０．１％
の酎・Ｉ１１水溶液に繊維状布を浸漬してぞのまま乾燥
し、キトサンを０．０１〜０．１％位付着さけ、更にこ
のものに銅イオンまたは銀イオンをキレ−１へ結合させ
た殺菌性シート状物質が記載され、また、特開昭５７−
６３６２号公報には、キ１〜サンの約０．３％又は０．
５％の酸性水溶液中に活性炭等を含浸し、塩基性溶液中
でキト１ノンを再生させ、このものを一度乾燥させた後
、多官能性試薬と反応させ、該活性炭等の表面にキトサ
ン皮膜を形成せしめ、その後キトサン皮膜と免疫性物質
とを結合させる免疫吸着体の製造方法が記載されている
。

〔発明が解決しようとする問題点］ 上記公報に開示された方法においては、使用するキ１〜
サンが高分子量であるためにキトサンを酸性水溶液とし
た場合、粘度が高くなるので、低濃度の酸性水溶液を用
いている。そのために固体物質上に付着するキトサン量
、即ち、有効アミノ基数も少なく、このような担体にお
いては、タンパク質などの生理活性物質の結合量が少な
いという欠点がある。又、これら公知の方法においでは
、いずれも固体物質をキ１へサン溶液に浸漬、再生後、
乾燥を行っているために、キトサン自体の有する多孔・
ｈが失われるという欠点をし有する。このような理由か
ら、従来の方法においては、生理活性物質の吸着量か少
なく、得られる効果も低いものであった。

本光明は、上記従来法における欠点を解決するため、低
分子量のキトサンを使用して濃度の高いキトサン酸性溶
液を得、該酸性溶液に固体物質を含浸して塩基性溶液中
で処理した後、乾′操することなく有機ジイソシアネー
トで架橋処理４行なって、固体物質上に多孔性のキトサ
ン皮膜を形成させることにより、生理活性物質を担持す
るのに適した担体を提供することを目的とする。

（問題点を解決するための手段） 本光明は、低分子量キトサンを酸性水溶液中に溶解し、
該溶液を固体表面上に付着させ、塩基性溶液中で処理し
てキトサンを再生させた後、乾燥することなく洗浄処理
を行った後、極性溶媒中てイ１）幾ジイソジノ７ネー１
へと接触架橋さけて、固体表面上に１トリ−ンの多孔竹
皮膜を形成してなる生理活刊物質固定化用ｌｆｊ体に関
するしのである。

本発明においては、平均分子学が１０．０００〜２３０
．０００の低分子−吊Ｎ−１−リンか用いられる。低分
子量キ１〜サンは、ρ１えば、フレーク状高分子吊′Ｆ
＋−υンを過硼酸ソータ水溶液中て加温処理することに
よって、所望の分子量を有する良質なキトサンが得られ
る。低分子量キ１−サンは、醋酸、ジクロル酢酸、　！
１ｉｉ酸の単独又は混合物の水溶液に溶解して使用する
。キト１ナンの溶解液濃度はキト１ナンの分子量によっ
て２〜２０％と取扱いの容易な範囲で自由に選択するこ
とがてき、従来法に比較して安定した高温度溶液どする
ことができる。

本発明において使用される固体としては、活性炭、ガラ
ス、アスベスト、ステンレス、セラミック等の無機物質
、天然ゴム、タンパク質、セルロース等の天然高分子物
質、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリ
プロピレン等の合成高分子物質等いずれてあってもＪ：
＜、その形状も１１１独のジ−１〜状２粒状、チューブ
状等の形状又は編織物等任意のしのが用いられる。本発
明にｄ５いては、先ず、上述の高濃度キトサン酸性溶液
に固体電体を含浸し、フィルム、編織物の場合（」、含
浸又はコーティングにより全面又は片面、部分等に塗布
づ−る等してキトリンを固体物質−にに付着Ｕしめ、塩
基性物質単独又はアルコール類との混合液中にてキトサ
ンを再生させる。塩基性物質としては水酸化すトリウム
、水酸化カリウム、炭酸すトリウム、炭酸カリ１ンム、
アンモニア、エチレンジアミン等のアルカリ性物質、ア
ルコール類としては、メタノール、エタノール等の極性
を有するアルコールを用いる。塩基性溶液の濃度は使用
するキトサン酸性溶液の濃度、所望するキトサンの性状
によって任意に選定する。キトサン皮膜は。

再生の進行と共に多孔性を具備する。多孔性キトサン自
体を有する固体物質は乾燥することなく洗浄処理を行い
、有機ジイソシアネートと接触架橋させるために有機ジ
イソシアネ−１へと不活性である行別溶媒と水を置換す
る操作を行う。

有機ジイソシアネ−１・による架橋処理を行うことによ
り、固体物質トに形成された多孔性キト曇ナン皮膜は、
乾燥後も水に浸漬した場合に多孔性をほぼ完全に再現す
ることができる。ト記イ１機溶媒中で有番幾ジイソシア
ネ−１・と接触架橋したキトサン自体を有する固体物質
は、未反応の有機ジイソシアネ−１〜を充分除去した後
、使用目的によっては乾燥後、又は乾燥をせザ生理活性
物質を（−１看せしめる。

上記架橋処理に用いる有は溶媒としては、メタノール、
エタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール 等のケｌーン類、ジメチル小ルムアミド，ジメチルアセ
トアミド等のアミド類が使用できる。これら行別溶媒は
１種のみを使用しても、また、２種以上を混合して使用
してもよい。又、架橋反応を行わしめる有機ジイソシア
ネート化合物としでは、脂肪族，脂環族及び芳香族のジ
イソシアネートのうち、反応条件下で有は溶媒中で溶解
り−るものすべてが使用で・きる。そのＪ、うな有機ジ
イソシアネ−１・どじでは、　ＩＩえば、１，４′−ジ
フェニルメタンジイソシアネ−１・、１，４−フＬニレ
ンジイソシアネート、２．４−１−リレンジイソシアネ
−１・、ナフクレンジイソシアネート，１，４−シクロ
ヘギ４ノンジイソシアネート１４，４′−ジシクロヘキ
シルメタンジイソシアネ−１〜、ギシリレンジイソシア
ネ−１・、イソフ４０ンジイソシアネート、ヘキリーメ
チレンジイソシアネート等が挙げられる。

本発明で使用Ｊる有ｈジイソシｊ′ネート化合物の濃度
は特に限定はされないが、キトザンのグルコザミン残塁
１モルに対し、０．２〜２．０モルの範囲が好ましい。

架橋化を行う反応条件は、使用する有ＩＩＭジイソシア
ネー１化合物によって適宜選択されるが、用いた極性溶
媒の清白以下の温度で３０分から２４詩間反応させるこ
とにより達成される。

本光明によって得られた固体表面上にキトサンの多孔訃
皮膜を形成した担体上に固定化される生理活性物質とし
ては、各種タンパク質、酵素、ホルモン、細胞、ウィル
ス、ｌＩｌ菌、ワクチン等の抗原、その他の免疫反応性
物質等が挙げられる。キトリン皮膜上への生理活性物質
の固定化は、多官能試薬を用いる等公知の方法によって
行なうことができる。

〔実施例） 次に実施例を挙げて本光明を説明する。

実施例１ 平均分子ｆｆｉ　６４．０００、脱アセデル化度８０％
のキトＩナン７０ｇを酢酸３Ｊ７を含む酸性水溶液９３
０９に溶解（）た。この原液粘度は８，３００ｃ　ｐ　
、　　（２０°Ｃ）であった。ポリエステル繊維のメツ
シュ状織物、試料■（商品８丁［３−４０，旭化成株式
会社製、４０メツシユ）、試料■（商品名Ｔ−７０，旭
化成株式会社製、７０メツシユ）とナイロン繊維のメツ
シュ状織物、試料■（商品名Ｎ−１０９，旭化成株式会
社製、　　１０９メツシユ）を１４３ｍ／　ｍφ円板状
に打抜いた固体を上記キ］・サン酢酸溶液中に含浸させ
た。

次いてキトサンを均一にコーティングした円板状布を取
り出し、直らに１０％Ｎａ０１１７００ｍｆ！と■全ノ
ール３００　ｍｌ！の混合凝固浴中に１５分間入れ、夫
々の固体表面」−に吸着しているキトリーンを再生凝固
さけた後、中性になる迄水洗を行った。

キトサン膜が表面上に形成された各固体をジメチルホル
ムアミド１ｅ中に入れて撹拌する作業を２０分間、４回
繰り返して含水水分をジメチルホルムアミドと完全に置
換させ７ＣＱ次にこのものを１１のジメチルホルムアミ
ド中に入れて、次いてヘキサメチレンジイソシアネート
６ｇを添加してゆっくり攪拌しながら室温で１時間反応
させたのち、これらを取り出し、別々に準備しておいた
１２のジメチルホルムアミド中に入れて２０分間洗浄操
作を行い、この洗浄操作を３回繰り返して未反応へキザ
メヂレンジイソシアネートを完全に除去した。

次いで水洗を４回行い、ジメチルボルムアミドを水と置
換し、Ｒ後に８０℃で２０分間浸漬し、所定の担体を得
た。試料１．　ＩＩ、　ＩＩ［のキトサン（＝１着量と
比表面積の測定結果を表１に示す。尚、比較例として本
発明と同様に低分子量のキトサンを使用して同一の固体
表面上にキトサンを付着、再生後、有機ジイソシアネ−
１・と反応させずに乾燥したものの比表面積を表１に示
した。

・キ１〜サンイ」着量測定方法・・・・・・・・・キ［
・サン酸性溶液に基材を入れ、取り出して均一にコー１
へさせた後、塩基性溶液中で凝固再生させたものを中性
になる迄洗浄し乾燥させる。この重量を測定し、基材の
重量を差引いて単位面積当りに換算して求める。

・比表面積測定方法・・・・・・・・・試料を４　ｃｍ
角に切りとり、さらにこれを１６等分し、水系に戻した
後、液体窒素中で急冷凍結し、１０−４トール（ＴＯＲ
Ｒ）、−４０°Ｃ，８時間真空乾燥し、１４０°Ｃ９４
０分間脱ガス後、比表面自動測定装置（島津マイクロメ
リティックス２２００形にてＢＥＴ法で測定した。

以　　下　　余　　白 表１ 実施例２ 平均分子１６４，０００．脱アセチル化度８０％のキト
サン６０りを酢酸３０ｉ７を含む酸性水溶液９４０９に
溶解した。この原液粘度は４．１００ｃｌｌ（２０’Ｃ
）であった。

このキトサンｆｌｕ水溶液にポリエステル不織布。

試料■（目付７０ｇ／ＴＩｔ、）、６−ナイロン不織布
。

試ｎ、Ｖ（目付１００ｇ／ＴＩｔ）、綿布試料ＶＩ（′
ｌＲ練漂白された目付１１４！？／ｍの綿布）をそれぞ
れ実施例１に記載と同様の処理を行って、生理活性物質
固定化用担体を得た。これらについてキトサン付着量及
び比表面積を実施例１と同様に測定した結甲を表２に示
す。

表２ 応用例１ 実施例１及び２で得られた各担体に生理活性物質として
アシラーゼを固定化する際の方法及び効果について述べ
る。アシラーゼは、天野製薬株式会社製、商品名「アマ
ノ」を使用し、２威のイオン交換水に２４０Ｕの力価を
持つように溶解調整した。但し、１Ｕは３０分間に１μ
モルのし一メチオニンを生成する酵素量とする。

実施例１及び２で得られた各成形担体を各々４ｃｍ角の
大きさに切り取り、１６等分をして５０威の遠６管に入
れ、−（オン交換水３０戴を入れて膨潤させる。イオン
交換水を除去した後、２．５％グルタルアルデヒド溶液
２／Ｒｆ！を加えて室温て２時間反応させる。反応後床
反応のグルタルアルデヒドを濾別除去し、イオン交換水
２０彪を加えて洗浄する操作を４回繰り返す。イオン交
換水を除去し１．：後上記アシラーゼ溶液２威を加えて
室温で２時間反応させる。反応後、イオン交換水４８威
を加えて２８０ｎｉでの吸光度を測定し、原液吸光度と
の差から固定化アシラーゼ量を求めた。

次に固定化アシラーゼの活性を調べるために下記のよう
な操作を行った。

上記操作により調整したアシラーゼ固定化担体を２８０
ｎｎにおける吸光度が０．０２５以下になるまで充分洗
浄した後、クエン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ５
，０）を８戒、　　０．０００５　Ｍ塩化コバルト水溶
液４威を加え、３７℃で５分間反応させる。続いて、基
質溶液として、Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチオニン＜Ｍ　
−Ｗ＝　　１９１．２６）　０．９５６ｙを吊り、水２
０ｍ１と１Ｎ−水酸化すトリウム液５威を加えて溶解し
た後、１Ｎ−水酸化すトリウム液を加えてｐＨ８，０に
調整し、水を加えて５０ｄとする。この基質溶７ｔ２４
　ｍｅを上記のような反応を行った固定化担体液中に加
え３７℃で１５分間反応させる。反応混合物を濾過し、
濾液を１威吊りとり、３分間潟浴中て加熱し反応を停止
させる。尚、ブランクとして基質溶液を加えて直ちに濾
過し、１威吊りとった後は、反応液と同様な操作を行っ
たものを用意した。

反応液を流水で冷却後、２蛇のニンヒドリン溶液及び第
一塩化スズ水溶液０，１威を加え温浴中で２０分間強熱
する。

流水で冷却後、プロパツール／水が１／１の混液ｉｏｍ
Ｉ！を加えて５７０ｎｍにおける吸光度を測定する。

尚、上記に用いたニンヒドリン溶液と塩化第一スズ溶液
は下記の如くにして調整した。

・ニンヒドリン溶液・・・・・・・・・ニンヒドリン（
Ｎ・Ｗ＝　　１７１．１１）１．０９を吊り、エチレン
グリコールモノニーチル（Ｍ　−Ｗ＝　７６．１０　＞
　２５威を加えて溶解した後、クエン耐水酸化ナトリウ
ム緩ｉ１＋ｉ液ｐＨ５，０，２５威を加え振どうする。

・塩化第一スズ溶液・・・・・・・・・塩化第一スス＜
Ｍ・Ｗ＝　　２２５．６５　）　　０．１０　ｇを吊り
、り［ン酸−水酸化ノー１〜リウ八緩衝液ｐＨ５，０，
６，２ｍＩ！を加えで溶解する。

−１−記のような方法で固定化アシラーゼの活性を測定
し、下記の式に基ついてぞれぞれの担体試料の固定化率
、固定化力価、光現力価９発現率を紳出し、表３に示し
た。

以　　下　　余　　白 固定化された吊 固定化率−Ｘ１００ アシラーゼ溶液２ｄ中の酵素量 固定力価−２４０Ｕ　　Ｘ　　固定化率（Ａ１５　　Ａ
ｏ　）　Ｘ８９．７６ 発現力１ｉ［ｆｉ　　Ｕ／　１６ｃｉ＝　　　　　　　
　　　　　　　　Ｘ３２但し、　　　８９．７６：吸光
度差ｉ、ｏｏｏのときの１−−メチオニンのμ３吊て検
量線から求める。

１４９よ一メチオニン１μモルは、１４９μ９３２、試
料希釈倍数Ｘ中位１＠算係数 発現力価 発現率−−ｘ　ｉ　ｏ　。

固定力価 表３ 実施例３ 平均分子ｆｉ６０，０００．脱アセチル化度８０％のキ
トサン３５！Ｊをギ酸１７．５＆、水４４７．５ｇに攪
拌溶解してキトサンギ酸溶液を得た。この原液粘度は、
回転粘度計を用いて２０°Ｃで測定したところ、？、６
００ｃｐであった。このキトサンギ酸溶液に実施例１と
同じ試料■と試料■を各５枚使用し、ジメチルホルムア
ミドをアセトンに変えた以外は同梯の試薬及び条件にて
シート上の担体を得た。試料■、及び■のキトサン付着
量と比表面積の測定結果、及び有はジイソシアネートに
よる処理を行わずに乾燥したものの比表面積とを表４に
示す。

表４ 応用例２ 実施例３て１ｑられた各成形担体に〈１−狸活性物質ど
してに１・−γ−グロブリン、ウシー面清アルブミンを
クルクルアルデヒドを架橋試桑として用いて固定化した
際の方法及び効Ｗについて）ホベる。

実施例３て得られた各成形担体を各々１１　ｃｍ角の大
ぎさに切りとり、１６等分して５０威の遠沈管に入れ、
イオン交換水３０７を入れて膨潤させる。イオン交換水
を除去した後、２，５％グルタルアルデヒド溶液２威を
加えて室温で２時間反応させる。未反応のクルクルアル
デヒドを除去後、イオン交換水２０ＩＩＩｉ！を加えて
洗浄操作を３回繰り返す。イオン交換水を抜き取り、０
．２Ｍ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液２威を入れ２０分間
敢装づる。緩衝液を抜き取り、ウシー血清アルブミン、
ヒトーγ−グロブリンを各々４ｏｒｎｇ、　２０ｍ９含
む０．２Ｍ酢酸−酢酸す］〜リウム緩衝液２ｄを加えて
室温で２時間反応させる。未反応のウシー血清アルブミ
ン、ヒトーγ−グロブリンを抜きとり、更に反応担体を
０．２Ｍ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液６威を加えて室温
て１５分間浸漬り−る操作を３回繰り返し、この洗浄液
と抜き取られた液を合せてこの中のウシー面清アルブミ
ン、ヒトーγ−クロプリン吊を２８０ｎＩｌｌの吸光度
から求める。原液の吸光度と緩衝液中の吸光度から、担
体上に固定化されたウシー面清アルブミンとヒ１〜−γ
−グロブリンの固定化量を求め、表５に示した。尚、比
較例としてキトサンを試料担体上に吸着後、架橋処理を
行わずにそのまま乾燥したものの固定化量を記載する。

表５ （ざｔ明の効果） 本発明による生理活性物質固定化用４１体は、まず、低
分子量キ］・サンを使用しているので固体物買上へのキ
１〜サンの付着量が極めて大きく、実施例においては、
０．５〜６．３ｍｇ／ｃｉの例を記載しているが、必要
に応じキトサンの分子量、固体物質等を任意に選択する
ことにより、広い範囲での応用が可能である。しかも、
本発明による固体物質上に形成されたキトサン皮膜は均
一に微細な細孔を有する多孔性のものであって、本発明
により、形成されたキトサン皮膜を乾燥することなく極
性溶媒中で有機ジイソシアネートで接触架橋せしめるこ
とにより、キトサン皮膜は乾燥後も水に膨潤せしめるこ
とにより多孔性を再現することのできるものであって、
取扱い上、極めて有利なものである。本発明の実施例中
に比較例として架橋化処理を行わずに乾燥したもののキ
トサン皮膜の比表面積、生理活性物質の固定化量を記載
したが、これらの結果からも、本発明によるキトサン皮
膜を有する生理活性物質固定化用担体が極めて優れたも
のであることがわかる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 低分子量キトサンを酸性水溶液中に溶解し、該溶液を固
   体表面上に付着させ、塩基性溶液中で処理した後、極性
   溶媒中で有機ジイソシアネートと接触架橋させて固体表
   面上に多孔性皮膜を形成した生理活性物質固定化用担体
   。