CN115006583B - 一种医用敷料、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医用敷料技术领域，具体涉及一种医用敷料、制备方法及应用，该医用敷料包括基材，所述基材的表面含有季铵盐抗菌剂和明胶凝胶层；其中，所述季铵盐抗菌剂通过贻贝仿生化学策略稳定吸附在基材表面，再通过物理吸附将明胶凝胶沉积在附有季铵盐抗菌剂的基材上，所述季铵盐抗菌剂分别与明胶凝胶层和基材通过氢键、共价键及π‑π相互作用连接，在基材表面形成凝胶微孔结构。本发明的医用敷料同时具有快速止血和高效抗菌的功能，且通过季铵盐抗菌剂与明胶凝胶在基材表面形成凝胶微孔结构，使得该敷料可在快速吸水促进止血并发挥高效抗菌能力的同时，还能有效集聚细胞，维持水分，促进伤口愈合。

Description

一种医用敷料、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及医用敷料技术领域，具体涉及一种医用敷料、制备方法及应用。

背景技术

临床管理急性伤口的首要原则是快速止血和清创消毒，虽然常用的棉无纺布敷料能以绷带形式包扎和保护伤口，并通过快速吸收血液和凝聚激活血小板来发挥止血作用；也可以遮蔽伤口，并通过气体交换和吸收渗液来促进结痂。但传统的棉无纺布敷料止血缓慢且不具抗菌效果，容易导致血液流失过量和细菌滋生，从而诱发感染，延缓伤口愈合进程，尤其在感染多药耐药菌后，还有引起败血症、器官衰竭和死亡等巨大风险。因此，设法提高棉无纺布敷料的止血和抗菌特性，对于急性出血伤口的修复、减少细菌感染和降低医疗成本至关重要。

尽管目前已开发出诸如氧化再生纤维素纱布羧甲基化棉纤维高岭土/无纺布等新型止血性棉敷料；也利用各种抗菌剂整理开发出了多种抗菌性棉纱敷料；但几乎没有研究开发可同时快速止血和高效抗菌的棉纱敷料，并将其用于急性伤口的治疗。因此若能采用一些新技术或工艺将止血剂和抗菌剂同时稳定地整合到棉纱敷料上，或许能构建出一些可同时快速止血和高效抗菌的多功能棉纱敷料。

为实现上述目标，贻贝仿生化学可能是一种简单、适用且富有成效的功能化改性策略。该策略可通过先将含有邻苯二酚基团的小分子化合物分别化学接枝到止血剂或抗菌剂上，而后利用邻苯二酚介导的相互作用(如氢键、金属配位、迈克尔加成和席夫碱反应等)将止血剂和抗菌剂同时整合到棉纱敷料上。事实上，贻贝仿生化学作为一种简单、高效的表面功能化改性策略，已被研究用于棉纱敷料的表面功能化改性。如研究者利用贻贝启发的邻苯二酚/氨基化学，将两性粒子聚(羧基甜菜碱-共-多巴胺甲基丙烯酰胺)@银纳米颗粒(PCBDA@Ag NPs)通过共价和非共价作用轻松而牢固地固定在了氨基修饰的医用棉纱布上，构建出了一种具有优异抗菌能力的抗菌棉纱布，其不仅具有优异的细菌抗粘连和杀菌活性，还具有良好的血液相容性和细胞相容性，利于伤口包扎和愈合。

发明内容

针对棉无纺布处理急性伤口存在的止血性不佳和伤口感染问题，本发明的目的在于提供一种制备简单、功能丰富、促进愈合的快速止血抗菌功能棉无纺布，以用于急性伤口护理，达到快速止血，高效抗菌，吸收渗液，维持伤口湿润愈合环境，促进伤口愈合的作用。

根据本发明目的的第一方面，提供一种医用敷料，包括基材，还包括：

季铵盐抗菌剂，其通过贻贝仿生化学策略稳定吸附在基材表面；

明胶凝胶层，其通过物理吸附将明胶凝胶沉积在附有抗菌剂的基材上；

其中，所述抗菌剂分别与明胶凝胶层和基材通过氢键、共价键及π-π相互作用连接，在所述基材表面形成有凝胶微孔结构。

优选的，所述明胶与季铵盐抗菌剂的质量比为5:3，所述季铵盐抗菌剂为邻苯二酚化季铵盐壳聚糖；

优选的，所述基材为棉无纺布，所述棉无纺布采用无水乙醇进行预处理。

根据本发明目的的第二方面，提供一种前述医用敷料的制备方法，包括以下步骤：

S1、使用无水乙醇超声清洗棉无纺布(NF)，去除表面杂质，随后烘干备用；

S2、将S1处理得到的NF浸入Tris-HCl缓冲液溶解的季铵盐抗菌剂溶液中，37℃下沉积24h，之后取出无纺布用乙醇和去离子水清洗3次，60℃下干燥2h，获得CQCS改性的NF样品CQCS@NF(CNF)；

S3、将S2制得的CNF浸入PBS溶解的明胶(Gel)溶液中，一定温度的水浴条件下震荡一定时间沉积均匀，之后取出样品挤压至相同湿重，并置于4℃的冰箱中5h以形成CQCS/Gel水凝胶层，最后在去离子水中浸泡10s，去除无纺布上未附着的水凝胶。冷冻干燥后得到Gel凝胶包覆CQCS修饰的棉无纺布复合敷料Gel-CQCS@NF(GCNF)。

优选的，所述步骤S1中，无水乙醇清洗时间为20min，干燥温度为60℃。

优选的，所述步骤S2中，Tris-HCI缓冲液的pH为8.5，溶液浓度为10mMol。

优选的，所述步骤S2中，季铵盐抗菌剂溶液为邻苯二酚化季铵盐壳聚糖溶液，其浓度为10-40g/L，NF与邻苯二酚化季铵盐壳聚糖溶液的浴比为1：30-50。

优选的，所述步骤S3中，一定温度为40-60℃，一定时间为1.5-24h。

优选的，前述邻苯二酚化季铵盐壳聚糖的制备包括以下步骤：

X1、将壳聚糖溶于冰醋酸配成悬浮液，在第一温度区间下连续搅拌并将缩水甘油基三甲基氯化铵(GTMAC)溶液缓慢加入其中，继续反应18-24h，之后取出混合物，室温下离心除去不溶的聚合物，将上清液通过布氏漏斗在减压下过滤，并将滤液在预冷的无水乙醇中沉淀，过滤，洗涤三次，之后置于真空烘箱中干燥3天得到淡黄色的季铵盐壳聚糖(QCS)固体；

X2、首先将QCS溶于去离子水配成溶液，随后加入溶于去离子水的3,4-二羟苯基丙酸(DHPA)溶液，并调整溶液pH至5.5。再称量碳二亚胺(EDC)溶于去离子水与无水乙醇(1:1，v/v)的混合溶液中，加入反应溶液中，调整pH至5.5，室温下剧烈搅拌4h，期间每间隔1h调整一次pH，保持其在5.5左右。反应结束后使用分子量为3500规格的透析袋在pH＝5.5的去离子水溶液中透析48h，冷冻干燥，得到邻苯二酚化季铵盐壳聚糖(CQCS)。

优选的，所述步骤S1中，壳聚糖溶液浓度为30g/L，冰醋酸溶液浓度为0.2％。

优选的，所述步骤S1中，反应的第一温度区间为60-75℃，缩水甘油基三甲基氯化铵与壳聚糖的质量比为1.2：1。

优选的，所述步骤S1中，纯化过程的离心速度为5000rpm，离心时间为10min。

优选的，所述步骤S2中，季铵化壳聚糖溶液浓度为20g/L，3,4-二羟苯基丙酸溶液浓度为100g/L，碳二亚胺溶液浓度为50g/L，且三种材料的摩尔比依次为5：2.5：1。

根据本发明目的的第三方面，提供一种前述医用敷料在快速止血和高效抗菌领域的应用。

根据本发明目的的第四方面，提供一种前述医用敷料在伤口修复领域的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1.本发明的医用敷料，采用简单的逐层沉积工艺将邻苯二酚化季铵盐壳聚糖和明胶依次沉积到棉无纺布表面，邻苯二酚化季铵盐壳聚糖可与棉无纺布的纤维素单元和明胶长链之间通过氢键及静电相互作用连接，其分子内部也能通过氢键、共价键和π-π相互作用连接，在棉无纺布表面形成一个稳定的交联凝胶结构，从而有效吸收并扩散水分子，促进红细胞和血小板的聚集活化，加速血凝块的形成，实现止血；同时，明胶凝胶层适宜的微孔结构既能保证季铵盐抗菌剂的良好抗菌效果，还能通过吸水膨胀保留水分，进而维持伤口愈合所需的湿润环境，有效降低伤口感染机会并促进愈合。

2.本发明的医用敷料，明胶和季铵盐抗菌剂在棉无纺布表面形成的交联凝胶结构，将季铵盐抗菌剂包裹在三维网络内，遮蔽了部分季铵阳离子的暴露，随着接触时间的延长，表层明胶逐渐脱落降解，被遮蔽的季铵阳离子逐渐暴露出来，参与抗菌过程，且邻苯二酚结构稳定、粘附性强，使得沉积的季铵阳离子能够长久粘附，从而使敷料具有稳定的持久抗菌活性。

3.本发明将阳离子聚合物的优异抗菌性和明胶的天然生物相容性相结合，确保了功能化棉无纺布在具有优异的阳离子穿膜杀菌性能的同时，还具有很好的生物安全性，不会对细胞增殖造成影响。

4.本发明通过简单的逐层沉积和浸渍干燥工艺，无外加交联剂，便可制得具有快速止血和高效抗菌性能的新型棉无纺布，制备工艺简单、原料成本低廉、性能优越、安全性好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明的医用敷料的制备流程图。

图2是本发明所述的邻苯二酚化季铵盐壳聚糖的合成示意图

图3a是实施例2中CS、QCS和CQCS的FT-IR谱图。

图3b是实施例2中CS、QCS和CQCS的UV-vis谱图。

图3c是实施例2中CS、QCS和CQCS的¹HNMR谱图。

图4a是实施例3中NF、CNF、GCNF-1、GCNF-5和GCNF-10的FT-IR谱图。

图4b是实施例3中NF、CNF、GCNF-1、GCNF-5和GCNF-10的XPS谱图。

图4c是实施例3中NF、CNF、GCNF-1、GCNF-5和GCNF-10的荧光标记及SEM图。

图5是实施例4中NF、CNF、GCNF-1、GCNF-5、GCNF-10和MHS的液体吸收测试图

图6a是实施例5中NF、CNF、GCNF-1、GCNF-5、GCNF-10和MHS的BCI测定结果。

图6b是实施例5中NF、CNF、GCNF-1、GCNF-5、GCNF-10和MHS的血液凝固动力学行为。

图6c是实施例5中NF、CNF、GCNF-1、GCNF-5、GCNF-10和MHS的体外止血效果。

图6d是实施例5中NF、CNF、GCNF-1、GCNF-5、GCNF-10和MHS的表面红细胞/血小板粘附行为。

图7a是实施例6中NF、CNF和GCNF-5对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的抑菌圈结果。

图7b是实施例6中NF、CNF和GCNF-5对金黄色葡萄球菌的吸光度结果。

图7c是实施例6中NF、CNF和GCNF-5对大肠杆菌的吸光度结果。

图7d是实施例6中NF、CNF和GCNF-5对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的点板计数结果。

图7e是实施例6中CNF和GCNF-5对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌在30min内的菌落计数结果。

图7f是实施例6中NF、CNF和GCNF-5对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌在24h内的菌落计数结果。

图8a是实施例7中用不同pH的PBS浸泡CNF达7天的洗脱率变化情况。

图8b是实施例7中用不同pH的PBS浸泡GCNF-5达7天的洗脱率变化情况。

图8c是实施例7中用不同pH的PBS浸泡GCNF-5达7天的荧光标记变化情况。

图9a是实施例7中用不同pH的PBS浸泡GCNF-5达7天对金黄色葡萄球菌的抗菌率变化情况。

图9b是实施例7中用不同pH的PBS浸泡GCNF-5达7天对大肠杆菌的抗菌率变化情况。

图9c是实施例7中用不同pH的PBS浸泡GCNF-5达7天的BCI结果变化情况。

图10a是实施例8中NF、CNF和GCNF-5的实际溶血结果。

图10b是实施例8中NF、CNF和GCNF-5的溶血率计算结果。

图10c是实施例8中NF、CNF和GCNF-5的处理L929细胞和EA.hy926细胞的活死染色结果。

图10d是实施例8中NF、CNF和GCNF-5处理L929细胞后的细胞存活率比较图。

图10e是实施例8中NF、CNF和GCNF-5处理EA.hy926细胞后的细胞存活率比较图。

图11a是实施例9中的小鼠肝损伤模型示意图及NF、CNF、GCNF-5和MHS的止血效果显示。

图11b是实施例9中NF、CNF、GCNF-5和MHS处理肝损伤模型的失血量比较图。

图11c是实施例9中NF、CNF、GCNF-5和MHS处理肝损伤模型的止血时间比较图。

图11d是实施例9中的小鼠断尾出血模型示意图及NF、CNF、GCNF-5和MHS的止血效果显示。

图11e是实施例9中NF、CNF、GCNF-5和MHS处理断尾出血模型的失血量比较图。

图11f是实施例9中NF、CNF、GCNF-5和MHS处理断尾出血模型的止血时间比较图。

图12a是实施例10中NF、CNF、GCNF-5和MHS作用后伤口随时间的宏观愈合变化图。

图12b是实施例10中NF、CNF、GCNF-5和MHS作用后伤口的闭合率比较图。

图12c是实施例10中NF、CNF、GCNF-5和MHS作用后皮肤伤口的组织菌落效果图。

图12d是实施例10中NF、CNF、GCNF-5和MHS作用后皮肤伤口的组织菌落计数比较图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本公开中参照附图来描述本发明的各方面，附图中示出了许多说明的实施例。本公开的实施例不必定意在包括本发明的所有方面。应当理解，上面介绍的多种构思和实施例，以及下面更加详细地描述的那些构思和实施方式可以以很多方式中任意一种来实施。

结合图1，本发明提供了一种医用敷料，采用简单的逐层沉积工艺将邻苯二酚化季铵盐壳聚糖和明胶依次沉积到棉无纺布表面，邻苯二酚化季铵盐壳聚糖可与棉无纺布的纤维素单元和明胶长链之间通过氢键及静电相互作用连接，其分子内部也能通过氢键、共价键和π-π相互作用连接，在棉无纺布表面形成一个稳定的交联凝胶结构，在保证季铵盐抗菌剂的良好抗菌效果，还能通过吸水膨胀保留水分，进而维持伤口愈合所需的湿润环境，有效降低伤口感染机会并促进愈合。

在具体的实施例中，提供一种医用敷料，包括基材，所述基材的表面含有季铵盐抗菌剂和明胶凝胶层；其中，所述季铵盐抗菌剂通过贻贝仿生化学策略稳定吸附在基材表面，再通过物理吸附将明胶凝胶沉积在附有季铵盐抗菌剂的基材上，所述季铵盐抗菌剂分别与明胶凝胶层和基材通过氢键、共价键及π-π相互作用连接，在基材表面形成凝胶微孔结构。

在优选的实施例中，所述明胶与季铵盐抗菌剂的质量比为5:3，所述季铵盐抗菌剂为邻苯二酚化季铵盐壳聚糖。

在优选的实施例中，所述基材为棉无纺布，所述棉无纺布采用无水乙醇进行预处理。

在另一个优选的实施例中，提供一种前述医用敷料的制备方法，包括以下步骤：

S1、使用无水乙醇超声清洗棉无纺布(NF)，去除表面杂质，随后烘干备用。

S2、将S1处理得到的NF浸入Tris-HCl缓冲液溶解的季铵盐抗菌剂溶液中，37℃下沉积24h，之后取出无纺布用乙醇和去离子水清洗3次，60℃下干燥2h，获得CQCS改性的NF样品CQCS@NF(CNF)。

S3、将S2制得的CNF浸入PBS溶解的明胶(Gel)溶液中，一定温度的水浴条件下震荡一定时间沉积均匀，之后取出样品挤压至相同湿重，并置于4℃的冰箱中5h以形成CQCS/Gel水凝胶层，最后在去离子水中浸泡10s，去除无纺布上未附着的水凝胶。冷冻干燥后得到Gel凝胶包覆CQCS修饰的棉无纺布复合敷料Gel-CQCS@NF(GCNF)。

在优选的实施例中，所述步骤S1中，无水乙醇清洗时间为20min，干燥温度为60℃。

在另一个优选的实施例中，所述步骤S2中，Tris-HCI缓冲液的pH为8.5，溶液浓度为10mMol。

在优选的实施例中，所述步骤S2中，季铵盐抗菌剂溶液为邻苯二酚化季铵盐壳聚糖溶液，其浓度为10-40g/L，NF与邻苯二酚化季铵盐壳聚糖溶液的浴比为1:(30-50)。

在另一个优选的实施例中，所述步骤S3中，明胶溶液的溶解温度为60℃，溶解浓度为10-100g/L，CNF与明胶溶液的浴比为1:(30-50)。

在优选的实施例中，所述步骤S3中，一定温度为40-60℃，一定时间为1.5-24h。

结合图2，本发明提供了一种医用敷料用抗菌剂，所述抗菌剂为邻苯二酚化季铵盐壳聚糖，壳聚糖首先经季铵化处理得到季铵盐壳聚糖，再通过酰胺化反应引入邻苯二酚基团，使其在具有良好阳离子抗菌性的同时，可凭借邻苯二酚基团表现出强粘附性，从而有效用于棉敷料的表面改性。

在具体的实施例中，提供一种医用敷料，包括抗菌剂，所述抗菌剂为邻苯二酚化季铵盐壳聚糖；其中，所述抗菌剂由壳聚糖经季铵化处理得到季铵盐壳聚糖，再通过酰胺化反应引入邻苯二酚基团，所述抗菌剂含有阳离子季铵基团和邻苯二酚基团，既具有良好阳离子抗菌性，又表现出强粘附性，易用于棉敷料改性。

在优选的实施例中，提供一种季铵盐抗菌剂的制备方法，包括以下步骤

X1、将壳聚糖溶于冰醋酸配成悬浮液，在第一温度区间下连续搅拌并将缩水甘油基三甲基氯化铵(GTMAC)溶液缓慢加入其中，继续反应18-24h，之后取出混合物，室温下离心除去不溶的聚合物，将上清液通过布氏漏斗在减压下过滤，并将滤液在预冷的无水乙醇中沉淀，过滤，洗涤三次，之后置于真空烘箱中干燥3天得到淡黄色的季铵盐壳聚糖(QCS)固体。

X2、首先将QCS溶于去离子水配成溶液，随后加入溶于去离子水的3,4-二羟苯基丙酸(DHPA)溶液，并调整溶液pH至5.5。再称量碳二亚胺(EDC)溶于去离子水与无水乙醇(1:1，v/v)的混合溶液中，加入反应溶液中，调整pH至5.5，室温下剧烈搅拌4h，期间每间隔1h调整一次pH，保持其在5.5左右；反应结束后使用分子量为3500规格的透析袋在pH＝5.5的去离子水溶液中透析48h，冷冻干燥，得到邻苯二酚化季铵盐壳聚糖(CQCS)。

在优选的实施例中，所述步骤S1中，壳聚糖溶液浓度为30g/L，冰醋酸溶液浓度为0.2％。

所述步骤S1中，反应的第一温度区间为60-75℃，缩水甘油基三甲基氯化铵与壳聚糖的质量比为1.2:1,。

所述步骤S1中，纯化过程的离心速度为5000rpm，离心时间为10min。

在另一个优选的实施例中，所述步骤S2中，季铵化壳聚糖溶液浓度为20g/L，3,4-二羟苯基丙酸溶液浓度为100g/L，碳二亚胺溶液浓度为50g/L，且三种材料的摩尔比依次为5：2.5：1。

在另一个优选的实施例中，提供一种前述医用敷料在快速止血和高效抗菌领域的应用，使敷料既具有良好的吸水扩散能力，能快速吸收血液水分，促进红细胞和血小板的聚集活化，加速血凝块的形成，实现止血；也能基于明胶凝胶层适宜的微孔结构，保证季铵盐抗菌剂的有效暴露，从而表现高效的抗菌效果。

在另一个优选的实施例中，还提供一种前述医用敷料在伤口修复领域的应用，使敷料能通过吸水膨胀保留水分，进而维持伤口愈合所需的湿润环境，有效降低伤口感染机会并促进愈合。

下面将结合具体的示例和试验，对前述医用敷料的制备及其效果进行示例性试验和对比。当然本发明的实施例并不以此为限。

下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施方式中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

【实施例1】

GCNF的制备

步骤1，使用无水乙醇超声清洗棉无纺布(NF)20min，去除表面杂质，随后置于60℃烘箱干燥备用。

步骤2，将预处理的NF按1:30的浴比浸入Tris-HCl缓冲液(10.0mM,pH8.5)溶解的季铵盐抗菌剂溶液(30g/L)中，37℃下振荡沉积24h，之后取出无纺布用乙醇和去离子水清洗3次，60℃下干燥2h，获得CQCS改性的NF样品CQCS@NF(CNF)。

步骤3，将制得的CNF按1:30的浴比浸入PBS(60℃，pH6.8)溶解的明胶(Gel)溶液中(1％，5％，10％(w/v))，50℃水浴条件下震荡12h沉积均匀，之后取出样品挤压至相同湿重，并置于4℃的冰箱中5h以形成CQCS/Gel水凝胶层，最后在去离子水中浸泡10s，去除无纺布上未附着的水凝胶。冷冻干燥后得到不同浓度Gel凝胶包覆CQCS修饰的棉无纺布复合敷料1％Ge-CQCS@NF,5％Ge-CQCS@NF,10％Ge-CQCS@NF(GCNF-1,GCNF-5,GCNF-10)。

以下所用测试样品为实施例1中得到的CNF、GCNF-1、GCNF-5和GCNF-10。

【实施例2】

CQCS的合成及表征

步骤1，将1g壳聚糖置于36mL的0.2％冰醋酸中配成悬浮液，60℃下连续搅拌30min后将2mL缩水甘油基三甲基氯化铵(GTMAC)溶液(0.6g/mL)缓慢加入其中，75℃下继续反应18h，之后取出混合物，室温下将混合物以5000rpm离心10min来除去不溶的聚合物，将上清液通过布氏漏斗在减压下过滤，并将滤液在预冷的无水乙醇中沉淀，过滤，洗涤三次，之后置于真空烘箱中干燥3天得到淡黄色的季铵盐壳聚糖(QCS)固体，研磨装袋备用。

步骤2，首先将QCS(3.25mmol,500mg)溶于25mL去离子水配成溶液，随后加入溶于3mL去离子水的3,4-二羟苯基丙酸(DHPA，1.62mmol，294mg)溶液，并调整溶液pH至5.5。再称量碳二亚胺(EDC，0.65mmol，124.6mg)溶于4mL去离子水与无水乙醇(1:1，v/v)的混合溶液中，加入反应溶液中，调整pH至5.5，室温下剧烈搅拌4h，期间每间隔1h调整一次pH，保持其在5.5左右。反应结束后使用分子量为3500规格的透析袋在pH＝5.5的去离子水溶液中透析48h，冷冻干燥，得到邻苯二酚化季铵盐壳聚糖(CQCS)，并将其置于4℃真空干燥器中避光保存。

为了验证CQCS的成功合成，使用傅里叶红外光谱仪、紫外分光光度计和核磁共振波谱仪记录了CS、QCS和CQCS的化学组成及结构特征。

表征结果如图3所示，首先通过FT-IR和UV-vis对各样品的化学组成分析(图3a，b)可以看出，相较于CS仅在1595cm^-1出现归属于未脱乙酰部分的C＝O伸缩振动峰，QCS在1483cm^-1和1651cm^-1及2920cm^-1处出现了3个新的吸收峰，分别为季铵基团上-CH₃的变形振动和伸缩振动峰，该结果证明了QCS的成功合成；对于CQCS，其在1558cm^-1处出现了归属于芳香族上C＝C的伸缩振动峰，表明邻苯二酚基团已被成功接枝到QCS上。此外，如图3b所示，CQCS在280nm处也出现了归属于邻苯二酚基团的特征吸收峰，进一步表明邻苯二酚基团被成功接枝到QCS上，且吸收峰并未发生蓝移，说明邻苯二酚基团尚未被氧化。另外，图3c的¹HNMR显示，CQCS除在δ2.65处出出现归属于主链糖环上C-2位的质子峰外，还在δ7.4左右出现归属于苯环的质子峰，进一步表明邻苯二酚基团的成功引入，即成功合成CQCS。

【实施例3】

FT-IR、XPS及SEM形貌表征

为了验证功能化棉无纺布被成功制备，使用傅里叶红外光谱仪记录了各改性无纺布的表面信息，用x射线光电子能谱(XPS)分析了各纱布样品的表面元素组成，并拍摄记录实物图，并通过荧光标记法(FITC标记CQCS，Cy5.5-NHS标记Gel)直观显示试样的沉积情况，最后用扫描电子显微镜观察了各试样的表面形貌。

表征结果如图4所示，首先通过FT-IR谱图的变化，初步确定了CPCG的成功合成。如图4a所示，CNF与GCNF均在1528cm^-1附近出现归属于苯环骨架C＝C的伸缩振动峰，且CNF在1652cm^-1附近出现归属于C＝O的伸缩振动峰，相较于NF明显减小，再进一步沉积Gel后减少为1644cm^-1，这种拉伸振动峰减小的结果归因于氢键的存在，而GCNF中各峰的透过强度增大，且在2500～3500cm^-1出现宽而强的吸收带，这归属于GCNF中显著增强的O-H氢键相互作用，这一结果表明CQCS和Gel成功以物理方式沉积到NF表面。

XPS分析结果如图4b所示，其中结合能为284eV、397eV和531eV时的波峰分别对应于C1s、N 1s和O1s光电子。GCNF和CNF相较于NF均在397eV处有明显的N1s光电子峰，而且随着Ge浓度的增大，C 1s、N 1s和O1s光电子峰都逐渐增大，这归因于CQCS和Gel上的大量氨基，表明CQCS和不同浓度的Ge都成功沉积到NF表面。

各试样的实物图像如图4c所示，NF的颜色在沉积CQCS后略有变黄，这也进一步证明了CQCS在NF表面发生了氧化作用。另外，在CNF表面进一步沉积Gel后，可明显地观察到随明胶沉积浓度增加而愈加致密的明胶海绵层。在分别对CQCS和Gel进行FITC和Cy5.5标记后，我们进一步利用激光共聚焦记录了CQCS和Gel在NF表面的沉积情况。如图4d所示，CNF表面因为沉积了FITC标记的CQCS而显示出强烈的绿色荧光，GCNF表面则因为沉积了Cy5.5标记的Gel，且由于FITC和Cy5.5荧光颜色叠加的原因，而显示强烈的黄色荧光，且随着Gel沉积浓度的增加，GCNF的颜色也由黄色逐渐变为橙色，这也表明GCNF表面沉积了越来越多的Cy5.5标记的Gel。接下来，我们利用SEM-EDX对GCNF进行了表面形貌和表面元素组成分析。如图4e，f所示，NF表面均匀光滑，CNF表面则因沉积了CQCS而在部分纤维表面及缝隙间形成了较薄的壳聚糖薄膜。GCNF表面则因沉积了Gel而形成了独特的凝胶微孔结构，且凝胶海绵的致密程度随Gel浓度的增加而越加致密，如GCNF-1表面存在大量孔隙且结构较为松散，而GCNF-10表面几乎没有孔隙且结构致密，该结果与各敷料的实物情况一致。综上所述，这些结果进一步清楚地表明PHMG和CS在CG表面的成功共轭和吸附，以及医用敷料CPCG的成功制备。

【实施例4】

液体吸收性能检测

液体吸收率是评价止血材料的重要指标，高的液体吸收性有利于浓缩红细胞、血小板和凝血因子，从而改善止血反应。以去离子水、生理盐水(NS),PBS(pH6.8)及全血(Whole Blood,WB)为测试液，以商用止血海绵(MHS)为对照组，对NF,CNF,GCNF-1,GCNF-5和GCNF-10进行了液体吸收性测试。具体方法为：首先取干净样品(1cm x 1cm)于60℃烘箱中干燥完全，取出预称重(W₁)，随后加入等体积的待测液，37℃下浸泡30min，之后取出样品，用垂直滴液法在滤纸上小心地吸收表面残留液体，以确定湿重(W₂)。对每种类型的样品重复上述过程3次。液体吸收率(Lar)计算如下：

由图5可知，1)CNF和GCNF对所有液体的吸收率都要明显高于NF，这是由于沉积CQCS和Gel后虽然降低NF的润湿性，但增强了其亲水性，利于水分子的吸收和保留；2)GCNF的液体吸收率要明显优于CNF，这主要归结于Gel出色的吸水膨胀性，能大限度地吸收并扩散水分子；3)在所有棉纱敷料中，GCNF-5具有最佳的液体吸收率，对四种测试液体的吸收率都维持在900-1000％，略微优于GCNF-10(820-865％)，这主要归结于GCNF-5表面有大量的微小孔隙，后者可以吸收和保留更多的水分子；而GCNF-10表面具有较为致密的明胶层、且孔隙率较低，故在一定程度上阻止了液体的渗入和吸收。值得注意的是，得益于其疏松的多孔结构，MHS在所有测试敷料中对所有测试液体都具有最高的吸收率，比GCNF-5还高了约200％，但高的液体吸收率也并不意味着具有最好的止血效果，因为血液的过多流失往往会显著增加致残和致死几率。

【实施例5】

体外止血性能评价

通过测定凝血指数(BCI)评价GCNF复合敷料的体外凝血效果。首先从小鼠眼球收集新鲜血液，然后将GCNF裁切成方块(1cm x 1cm)，置于培养皿中37℃预热5min。然后在每个样品中滴加活化的柠檬酸全血100μL(含10μL浓度为0.2M的CaCl₂)静置不同的时间(1,3,5,10,20min)，再加入5mL去离子水静置10min以冲洗未结合的血细胞，最后移取200μL冲洗水到96孔板中，并用酶标仪记录540nm各样品的吸光度值(Is)。采用无样品培养板(TCP)添加100μL血液作为Control组(Ic)，并利用下式计算BCI值：

此外，为了探索红细胞/血小板与纱布之间的界面相互作用，将从小鼠眼球收集的新鲜血液离心(2500rpm,10min)处理，并将其分层溶于PBS中，得到红细胞/血小板悬液。然后将两种悬液分别滴加200μL到纱布(1cm x 1cm)表面，之后在室温下将处理的纱布浸入含有2.5wt％戊二醛的PBS中2h，以固定红细胞/血小板，最后使用一系列分级的乙醇-PBS溶液(30,40,50,60,70,80,90,100％,v/v)将红细胞/血小板脱水15min，并于常温下真空烘箱干燥24h，再使用SEM观察红细胞/血小板粘附情况。

表征结果如图6所示，从BCI测定结果(图6a)可以看出，NF的BCI高达83％，与TCP组相当，说明纯棉纱敷料几乎不能止血。沉积CQCS后，NF的BCI值降低到了55％，说明止血性能有所提高，这主要归结于CQCS自身的亲水吸水性以及表面季铵阳离子与红细胞之间的静电相互作用，能吸收血液并促进红细胞、血小板的聚集，加速血凝块的形成，达到止血目的；有意思的是，在沉积适宜浓度的明胶后进一步显著提高了NF的止血效果，尤其GCNF-5的BCI值已降低至34％，略高于MHS的32.6％，表明GCNF-5具有出色的止血潜力。此外，沉积了较高明胶浓度的GCNF-10的BCI值为55％，这可能是因为GCNF-10的表面具有较为致密的明胶层，后者在一定程度上阻止了血液的渗入和吸收，故其止血效果明显不如表面既有适宜浓度的明胶又有多孔结构的GCNF-5。图6b所示的是各试样的血液凝固动力学行为。总体来说，所有改性棉纱敷料及MHS的BCI值都能随止血材料与全血静置时间的延长而不断降低，且GCNF-5的BCI值是降低的最快的，在10分钟时已降低至21％，与MHS的22％相当。另外，比较有意思的是，GCNF-5和GCNF-1在1分钟时的BCI值已分别降低至51％和57％，远低于MHS的72％，该结果表明GCNF-5和GCNF-1能够较MHS更快地启动凝血，这主要归结于GCNF-5和GCNF-1的良好湿润性和动态吸水性，可以在血滴接触后缓慢吸收血液水分，促进红细胞/血小板的聚集粘附，加速凝血过程，但由于GCNF-1孔隙率较大，血细胞易随水分一起扩散渗透，聚集粘附数量减少，导致其BCI值略小于GCNF-5。

图6c所示的是GCNF在体外的止血效果。TCP组在缓慢滴加去离子水后，由于血液未凝固而被快速稀释成红色溶液并扩散至整个培养皿。NF组的清洗液也比较红，说明仅有少量血液发生了凝固。CNF组的清洗液比NF组略淡，说明CQCS赋予了CNF一定的凝血性能，但还不足以完全止血。相较于NF和CNF组，GCNF组的最终清洗液仅有略微的红色，尤其GCNF-5组几乎无色，与MHS组差不多，这一结果表明GCNF-5确实能够通过快速凝固血液来发挥止血作用。在证实GCNF-5可通过快速凝固血液来发挥止血作用后，我们进一步通过扫描电镜考察了红细胞和血小板在GCNF-5表面的粘附行为。如图6d所示，各敷料表面均能聚集粘附红细胞，且形态正常，其中NF和CNF由于表面较为光滑、孔隙较大，粘附数量较少；GCNF-1由于Gel沉积较少，粘附数量变化不明显；GCNF-5由于表面润湿性良好，孔隙率合适，血液水分扩散完全，大量红细胞粘附于微小纤维及孔洞内，利于激活凝血系统；GCNF-10的表面虽然也聚集了大量红细胞，但这些红细胞大多相互堆叠聚集(与GCNF-10的相互作用较弱)，极易被冲洗脱落；而MHS得益于独特的海绵结构，大量红细胞聚集粘附于内部空腔，同样利于凝血系统的激活。各敷料表面的血小板粘附情况与红细胞粘附情况相似，NF和CNF表面同样只能粘附很少的血小板，GCNF-1由于沉积明胶降低了孔隙率而使血小板粘附量提高，GCNF-10则由于表面过于致密而粘附量降低，不过GCNF-5仍然由于合适的润湿性和孔隙率，而具有最多的血小板粘附，其数量甚至优于MHS，这或许是由于GCNF-5的内部纤维结构相较于MHS的内部海绵空腔结构，更有利于血小板的交缠粘附，进而有效活化血小板，促进止血。总的来说，GCNF-5与MHS都具有良好的液体吸收性，较低的BCI值和快速的止血能力，并能有效聚集红细胞/血小板，促进止血。

【实施例6】

体外抗菌性能检测

由于伤口敷料需要具有高效抗菌活性，以有效避免伤口感染；因此采用抑菌圈法、吸光度法和点板计数法评价了功能化棉无纺布的体外抗菌性能。

抑菌圈法：在倒有15ml固体LB培养基的培养皿表面接种100μL PBS洗涤过的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌(10⁸CFU/ml)，并用一次性无菌涂布棒涂抹均匀，待菌液干燥后，用无菌镊子将已灭菌处理的片状试样(0.5cm x 0.5cm)置于培养皿表面，并小心压紧，再滴加10μL无菌PBS于试样上，以促进抗菌组分的扩散。然后将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中孵育24h，观察试样周围抑菌圈的大小。试样的抑菌性能即可由其周围的抑菌圈面积大小来决定，面积越大则抗菌性能越好，反之则抗菌性能越差。

吸光度法：将试样(1cm x 1cm)浸泡在含有1ml稀释后的细菌溶液的EP管中，在37℃,180rpm的恒温摇床中培养24h。每隔一段时间(0,3,6,9,12,24h)移取100μl细菌液于96孔板中，通过酶标仪测定细菌液在600nm处的OD值。

点板计数法：将上述样品经过紫外辐照杀菌处理后，置于含有S.aureus或E.coli(10⁸CFU/mL)的PBS(pH7.4)中，37℃下培养，并在不同的时间间隔(1,10,20,30min,1,3,6,9,12,24h)移取100μl培养的细菌悬浮液至96孔板中，依次梯度稀释至10CFU/ml，再在LB培养板上按浓度递增点板，置于37℃恒温培养箱中培养24h，统计各试样培养板上的细菌数目，其中未添加试样的PBS菌液为对照组。

体外抗菌评价结果如图7所示，抑菌圈结果(图7a)显示，GCNF-5与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌共孵育24h后形成的抑菌圈(分别为21和19mm)与CNF和金黄色葡萄球菌和大肠杆菌共孵育24h后形成的抑菌圈(分别为21和19mm)几乎完全一致，说明在CNF表面沉积一定浓度的明胶后并未影响其抗菌活性，该结果也意味着GCNF-5在完成快速止血的同时还可高效抗菌。值得注意的是，GCNF-5和CNF所形成的抑菌圈都要明显大于棉纱敷料自身与细菌的接触区域，说明GCNF-5和CNF不仅可通过直接与细菌接触来发挥抗菌作用，还可通过扩散作用来形成更广泛的抑制区。二者的接触抗菌作用主要来自于CQCS上的季铵盐基团和壳聚糖自身的抗菌作用，而扩散抑制作用应该是由于脱落的CQCS向四周扩散后引起的。

为了深入探究GCNF-5的抗菌潜力，我们进一步通过OD₆₀₀测定法和平板计数法系统评价了GCNF-5的抑菌和抗菌活性。如图7b,c所示，NF确实无法抑制细菌的生长，因为OD₆₀₀的值随孵育时间延长而不断增加。但GCNF-5和CNF均能高效抑制S.aureus和E.coli的生长，二者的OD₆₀₀值在与细菌仅接触1分钟后便开始缓慢降低，说明细菌的生长已被高效抑制。图7d所示的是GCNF-5和CNF在与细菌接触不同时间后的平板计数结果。同7b,c的结果一致，GCNF-5和CNF均能在仅与细菌接触1分钟后便发挥出色的抗菌注意，如GCNF-5在与S.aureus和E.coli接触1分钟后可分别杀死99.998％和99.993％的细菌，甚至在20分钟后清除99.999％的细菌(图7e，f)，以及在30分钟后清除所有细菌(菌落数已降低至0CFU/mL，如图7e)。总之，上述结果表明GCNF-5具有出色的抑菌和抗菌活性，且其抑菌和抗菌活性还具有极佳的持久性，即其抗菌活性在随后的24h内始终能保持在100％(图7f)。

综上所述，CQCS确实可以显著提高NF的抗菌活性，其抗菌机制主要归结于以下几点：1)CQCS上带正电荷的季铵盐基团和氨基与细菌细胞膜的静电相互作用引起了细菌细胞膜的严重破裂；2)伴随细菌细胞膜的严重破裂，CQCS与细菌胞膜之间的静电相互作用进一步引起了细胞内蛋白质的大量泄露，且同时显著抑制了细胞内ATP的合成。此外，值得注意的是，在CNF表面进一步沉积适宜浓度的明胶后，并未显著降低CQCS的抗菌活性，该特性使得GCNF-5在完成快速止血的同时还能发挥高效抗菌作用。

【实施例7】

沉积吸附牢度及性能检测

虽然上述结果已证实GCNF-5具有快速止血和高效抗菌的重要潜力，但由于GCNF-5主要依靠物理方式沉积制备，而伤口周围变化复杂的微环境要求伤口敷料在拥有优异性能的同时，能够保持性质稳定，不影响伤口愈合。因此我们选用不同pH的PBS缓冲液模拟体内伤口微环境，通过称重法测定CQCS及Ge在NF表面的沉积稳定性，及其对应的抗菌和止血性能变化。简言之，首先记录CNF在CQCS沉积前后的质量分别为m₀,m₁，然后37℃下将CNF分别置于pH＝6.8和pH＝7.4的PBS溶液中浸泡不同时间(3,6,12,24,48,72,96,120,144,168h)，之后取出CNF清洗干燥并称重(m₂)，最后通过计算CQCS在这些条件下的洗脱量来定量(ΔE)反应涂层的稳定性，计算公式如下：

取浸泡处理后的CNF，按前述点板计数法，测定其与细菌作用6h之后的抗菌效果变化。对于Ge沉积的CNF，选用Cy5.5-NHS标记的GCNF-5为测试样，同样预先称重并浸泡干燥，记录明胶洗脱量(Δw)，并使用激光共聚焦显微镜拍摄记录荧光变化。

如图8a所示，CNF在不同pH值的PBS溶液中浸泡7天后，CQCS洗脱率都仅为3.5％左右，且在酸性环境(pH＝6.8)下洗脱率更大，这是由于酸性环境会导致CQCS与NF之间的氢键作用减弱，使CQCS部分脱落，但随着时间延长，酸性条件下的CQCS脱落趋于平衡，这是由于酸性条件下已经氧化的邻苯二酚基团并不易变性，可以依靠沉积的CQCS之间的氢键、共价键及π-π相互作用和CQCS与NF之间剩余大量的氢键作用，继续保持较强黏附性。而GCNF-5在pH＝6.8和7.4的PBS溶液中浸泡7天后(图8b)，洗脱率分别为54.4和60.2％，说明在37℃生理环境的长时间处理下，Gel凝胶层会由于Gel的逐渐降解而脱落，但碱性环境下降解速度相对较慢，这是由于Gel凝胶在碱性环境下，分子间羧基与氨基的相互作用更强，凝胶结构相对稳定一些，且在酸性条件下，Gel与CNF之间的氢键作用也会因-NH₂质子化而减弱。使用激光共聚焦显微镜拍摄记录了荧光标记GCNF-5在浸泡处理后的整体荧光变化情况(图8c)。可以看出，两种PBS处理的GCNF-5在整个过程中都一直存在明显的归因于FITC标记CQCS的绿色荧光，而归因于Cy5.5-NHS标记Gel的红色荧光则随着浸泡时间的延长逐渐减弱，且在pH6.8的缓冲溶液中减弱得更为明显，这是由于Gel本身在37℃下易溶化降解，且氢键作用在酸性条件下易因为质子化而减弱。这一结果表明GCNF-5在长时间作用于类伤口微环境时，基于邻苯二酚超强黏附性的CQCS可以稳定附着于GCNF-5表面，提供高效持久的抗菌活性，但仍会有大量Ge凝胶因温度、时间等问题发生明显脱落，这可能会对伤口的后续保湿愈合有所影响。

通过点板计数法和BCI值进一步评价了PBS浸泡处理的GCNF-5的抗菌及止血性能变化。抗菌率曲线如图9a，b所示，可以看出，由于CQCS的微量脱落，两种PBS处理的CNF对S.aureus和E.coli的抗菌率在浸泡7天后都从最初的99.999％和99.998％降至最后的99.992％和99.92％。说明虽然CNF在浸泡处理后会有微量CQCS的脱落，但仍然具有较高的抗菌效果。BCI值的变化情况(图9c)显示，GCNF-5的BCI值也基本随浸泡时间延长而增大，且前24h的增速大于24h后，这是由于前期表层Gel的脱落归因于溶液中氢键质子化引起的断裂，且酸性条件下的脱落率明显大于碱性条件下，因此酸性条件下BCI值的变化更明显，而后期则主要归因于Gel的降解，且降解速度逐渐减缓，对应BCI值的变化趋势放缓，但都为36％和40％，仍具有一定的凝血潜力。

【实施例8】

血液和细胞相容性检测

尽管GCNF-5具有出色的止血能力和体外抗菌活性，但其应用于临床的前提是具备优异的生物相容性。因此，利用小鼠全血、小鼠成纤维细胞(L929)和人脐静脉细胞融合细胞(EA.hy926)评价了GCNF-5的溶血和细胞毒性。

首先从小鼠眼球中收集1mL新鲜血液，离心(2500rpm,4℃,10min)收集红细胞(RBCs)，并溶于PBS(pH＝6.8)制备RBC悬液(4％,v/v)。然后取一片样品(0.5cm x 0.5cm)于离心管中，加入900μL的PBS和100μL的RBC悬液，37℃下孵育1h。随后在3000rpm下离心5min，然后使用酶标仪在560nm处测量上清液的观密度，并用光学拍照记录溶血情况。使用下式计算溶血率，分别用超纯水和生理盐水(NS)处理的RBC悬液作为阳性对照和阴性对照。NF、CNF和GCNF-5作为材料对照组

其次在37℃下将10片样品(0.5cm×0.5cm/片)浸泡在10mLPBS中24h，然后取出样品，获得浸提液待用。然后将L929细胞铺于含有DMEM培养基的96孔板中，再置于加湿培养箱(37℃,5％CO₂)中孵育24h，随后添加浸提液再共同孵育24h，然后用AM和PI染色处理，并在倒置荧光显微镜下观察。另外在细胞用PBS冲洗三次后，加入10μL CCK-8试剂处理，并于37℃下避光孵育1h，最后使用酶标仪记录450nm下各孔的OD值。EA.hy 926细胞的处理方法亦一致。其中未处理的细胞用作阴性对照，不含细胞但含培养基的孔用作空白对照。细胞存活率由下式计算得到：

实验结果如图10所示，溶血结果(图10a，b)显示，各敷料在与红细胞悬液共孵育1h后，仅有CNF引起了轻微的溶血，溶血率约4.3％，GCNF-5和NF并未造成溶血(溶血率分别为2.4％和2.2％)。CNF引起溶血的主要原因是因为其纤维表面带有大量季铵盐基团和氨基，后者可能在一定程度上破坏了红细胞膜的完整性，进而引起了溶血。但在沉积明胶后，可能是由于削弱了季铵盐基团以及氨基和红细胞膜的相互作用，故进一步提高了其血液相容性。活\死细胞染色和CCK-8检测进一步证实了GCNF-5具有良好的细胞相容性，如图10c所示，无论是L929还是EA.hy 926细胞在与GCNF-5共孵育24h后，都能维持正常的细胞形态，且并未检测到PI标记的死细胞(红色荧光信号)，说明GCNF-5具有良好的细胞相容性。CCK-8的检测结果与活死细胞染色结果一致，如图10d,e所示，GCNF-5处理的L929和EA.hy 926细胞的存活率分别高达99％和97％，与PBS组的细胞存活率几乎完全一致。总之，溶血和细胞毒性实验结果均表明GCNF-5具有良好的生物相容性，具有作为止血材料的重要的应用潜力。

【实施例9】

体内止血效果检测

虽然GCNF-5具有优异快速的体外止血能力，但其体内止血效果尚不明确，因此，通过建立小鼠肝损伤模型和断尾出血模型，检测了GCNF-5的体内止血能力。

小鼠肝损伤模型：首先剃去腹部毛发，切开皮肤组织，剖开腹腔暴露肝脏。然后小心地取出肝脏周围的血清，并在肝脏下放置预称重的滤纸，以准确估计失血量。选择20G的无菌针头引发肝出血，待自然出血10s后将各样品(1cm x 1cm)放置于出血部位，记录止血时间及失血量。

小鼠断尾出血模型：先用手术剪刀剪去尾巴长度的三分之二，然后将切割伤口暴露15s以保证正常失血。随后用各样品止血，记录止血时间和失血量。每个模型均检测3次，以未处理的损伤模型为对照组。

检测结果如图11所示，GCNF-5对小鼠肝损伤模型的实时止血效果(图11a)显示，NF确实几乎无止血效果，其在与出血的肝脏接触后，并不能快速阻止肝脏出血，且血液流失严重并四处扩散。相较于NF，CNF有了一定的止血效果，血液流失量相对较少，该结果与体外止血结果相似。值得注意的是，GCNF-5确实具有极其出色的体内止血效果，其在接触到出血的肝脏后，便能迅速发挥止血作用，进而有效减少了血液流失和扩散。图11b,c的结果进一步证实了GCNF-5的出色止血效果，其仅需52.50±3.67s便能快速止血，远快于control组的178±6.5s、NF组的167.5±2s、以及CNF组的117.5±3.7s，甚至略快于MHS组的69±4.9s；除止血时间快外，GCNF-5组的失血量也远远少于control、NF和CNF组，前者的失血量仅为58.4±1.8mg，而后者的失血量则依次高达125.5±3.7mg、112±7.5mg和103.9±8.2mg，GCNF-5的失血量同样略少于MHS，后者的失血量为71.5±4.4mg。

小鼠断尾模型的实验结果(图11d)表明，GCNF-5在接触出血的小鼠尾巴后便能快速止血，且血液流失量显著少于Control、NF和CNF组。如图11e,f的计算结果可以得知，GCNF-5的止血时间仅为67.7±2.2s，略快于MHS组的70.7±5.3s，但显著快于Control组的199±13.5s，NF组的158.3±10.8s，CNF组的124.3±10.4s；另外，GCNF-5的失血量为70.7±3.6mg，同样略少于MHS的71±2.6mg，但显著少于Control组的246.3±10mg，NF组的195.00±5.7mg，以及CNF组的106.00±12.4mg。

综上，上述两种出血模型实验的实验结果均证实了GCNF-5具有出色的止血效果，其止血效果显著优于NF，甚至在止血时间和血液流失量方面略优于MHS。GCNF-5出色的止血性能与NF表面依次沉积的CQCS和Gel有关。在接触出血伤口后，GCNF-5可首先利用独特凝胶微孔结构的强吸水性和表面氨基、羟基等基团的亲水性，快速吸收血液，并垂直扩散水分，促进红细胞和血小板的聚集与活化；随后，GCNF-5可进一步通过表面的正电荷基团与血细胞的静电作用，有效粘附红细胞和血小板，激活凝血系统，产生凝血因子和凝血酶，诱导原纤维蛋白转化成纤维蛋白，并促进纤维蛋白单体聚集形成稳定的纤维蛋白多聚体，促进血凝块的形成，从而减少失血。此外，值得特别强调的是，基于棉质无纺布构建的GCNF-5，不仅柔软度和舒适度优于MHS，且能在接触血液时更快地吸收血液、聚集红细胞和血小板，并发挥止血作用。因此，我们认为GCNF-5是一种极具潜力的新型止血敷料，具有与MHS相当的，甚至略占优势的止血潜力。

【实施例10】

体内抗菌和动物伤口愈合性能评价

本发明采用简单的逐层沉积工艺制备可快速止血和高效抗菌的功能化棉无纺布敷料，并通过构建金黄色葡萄球菌感染的小鼠全皮伤口来评价新型棉无纺布敷料的体内抗菌和伤口愈合情况。

具体实施方法为：将小鼠麻醉并剃毛，然后在每只小鼠的背部创建一个圆形的全层皮肤伤口(8mm x 8mm)，紧接着在伤口上接种10μL金黄色葡萄球菌溶液(10⁸CFU/mL)。10min后，将所有小鼠随机分为5组(n＝5)，创面分别用NF,MHS,CNF,GCNF-5覆盖作为对照组，未覆盖任何敷料的作为空白组。在整个治疗期间，各种敷料每2天更换一次保持伤口整洁。同时拍照记录创面面积，创面闭合率(WCR)按下式计算：

其中S₀是创面当天的伤口面积，S是拍照记录当天的伤口面积。

为了评估GCNF-5用于伤口治疗的抗菌活性，在第2天和第14天处死小鼠，然后收集感染组织，称重，置于无菌PBS中，用超声细胞破碎仪(UP-250，浙江明德仪器，中国)进行破碎、匀浆处理。在4℃下以2500rpm离心5分钟后，将100μL上清液接种到LB琼脂平板上进行CFU计数。

动物实验的结果如图12所示，用不同纱布处理的伤口组织随时间的宏观愈合情况(图12a)及对应的伤口闭合率(图12b)显示，GCNF-5和CNF处理伤口的愈合速度明显快于MHS、NF及对照组，在第6天时便已修复68％的伤口区域。MHS和NF组的伤口愈合速度比较缓慢，直到治疗10天后，仍分别有35％和28％的伤口区域未修复，且都还存在伤口结痂。此外，CNF组虽然具有与GCNF-5相近的伤口愈合速度，但其前期愈合效果较差，这是由于CNF表面没有明胶凝胶层，只靠CQCS不足以迅速止血并吸收伤口渗液，营造适宜的伤口愈合环境。因此CNF治疗的伤口在2天时的情况仅略优于NF及MHS组，伤口表面仍有部分渗液堆积，容易滋养细菌，诱导伤口脓肿感染。而GCNF-5敷料可以在治疗的2天内迅速杀菌，吸收渗液，促进细胞增殖，修复28％的伤口区域，且6天内即可修复68％的伤口区域，并在第14天时使伤口愈合面积达到99.99％，从而表现出色的促伤口愈合性能。

伤口组织菌落计数情况(图12c，d)表明，与体外抗菌结果一样，MHS和NF在体内同样无法高效抗菌，伤口部位的细菌数量在处理48h后依然高达10⁶CFU/mg，几乎没有抗菌效果。但是在经GCNF-5处理6h后，其抗菌率便达99％，进一步处理24h后，伤口部位的细菌数量已急剧地降至10^2.8CFU/mg，抗菌率高达99.9％。除可以高效抗菌后，GCNF-5还能有效抑菌，这可以从伤口部位的细菌数量在随后的14天内，逐渐降低至2CFU/mg得到证实。总之，上述结果清楚地证实了GCNF-5在体内同样具有出色的抗感染性能，其抗菌效果与CNF并无显著差异，说明在CNF表面沉积适宜浓度的明胶并未显著影响CQCS的抗菌活性。

虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。因此，本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。

Claims (8)

1.一种医用敷料的制备方法，所述医用敷料包括基材，其特征在于，所述医用敷料还包括：

季铵盐抗菌剂，其通过贻贝仿生化学策略稳定吸附在基材表面；

明胶凝胶层，其通过物理吸附将明胶凝胶沉积在附有抗菌剂的基材上；

其中，所述抗菌剂分别与明胶凝胶层和基材通过氢键、共价键及π-π相互作用连接，在所述基材表面形成有凝胶微孔结构；

所述制备方法包括以下步骤：

S1、使用无水乙醇超声清洗棉无纺布NF，去除表面杂质，随后烘干备用；

S2、将S1处理得到的棉无纺布浸入Tris-HCl缓冲液溶解的季铵盐抗菌剂溶液中，37℃下沉积24h，之后取出无纺布用乙醇和去离子水清洗3次，60℃下干燥2h，获得CQCS改性的NF样品CQCS@NF，即CNF；

S3、将S2制得的CNF浸入PBS溶解的明胶Gel溶液中，40-60℃的水浴条件下震荡1.5-24h沉积均匀，之后取出样品挤压至相同湿重，并置于4℃的冰箱中5 h以形成CQCS /Gel水凝胶层，最后在去离子水中浸泡10s，去除无纺布上未附着的水凝胶，冷冻干燥后得到Gel凝胶包覆CQCS修饰的棉无纺布复合敷料Gel-CQCS@NF，即GCNF；

所述步骤S1中，无水乙醇清洗时间为20min，干燥温度为60℃；

所述步骤S2中，Tris-HCI缓冲液的pH为8.5，溶液浓度为10mMol；

所述步骤S2中，季铵盐抗菌剂溶液为邻苯二酚化季铵盐壳聚糖溶液，其浓度为10-40g/L，NF与邻苯二酚化季铵盐壳聚糖溶液的浴比为1：30-50；

所述步骤S3中，明胶溶液的溶解温度为60℃，溶解浓度为10-100g/L，CNF与明胶溶液的浴比为1：30-50。

2.根据权利要求1所述的一种医用敷料的制备方法，其特征在于：所述明胶与季铵盐抗菌剂的质量比为5:3。

3.根据权利要求1所述的一种医用敷料的制备方法，其特征在于：所述基材为棉无纺布。

4.根据权利要求1所述的一种医用敷料的制备方法，其特征在于，所述邻苯二酚化季铵盐壳聚糖由壳聚糖经季铵化和邻苯二酚化改性处理得到，其制备方法包括以下步骤：

X1、将壳聚糖溶于冰醋酸配成悬浮液，在60-75℃下连续搅拌并将缩水甘油基三甲基氯化铵GTMAC溶液缓慢加入其中，继续反应18-24h，之后取出混合物，室温下离心除去不溶的聚合物，将上清液通过漏斗在减压下过滤，并将滤液在预冷的无水乙醇中沉淀，过滤，洗涤三次，之后置于真空烘箱中干燥3天得到淡黄色的季铵盐壳聚糖QCS固体；

X2、首先将QCS溶于去离子水配成溶液，随后加入溶于去离子水的3,4-二羟苯基丙酸DHPA溶液，并调整溶液pH至5.5；再称量碳二亚胺EDC溶于去离子水与无水乙醇1：1，v/v的混合溶液中，加入反应溶液中，调整pH至5.5，室温下剧烈搅拌4h，期间每间隔1h调整一次pH，保持其在5.5；反应结束后使用分子量为3500规格的透析袋在pH=5.5的去离子水溶液中透析48 h，冷冻干燥，得到邻苯二酚化季铵盐壳聚糖CQCS。

5.根据权利要求4所述的一种医用敷料的制备方法，其特征在于：所述步骤X1中，壳聚糖溶液浓度为30g/L，冰醋酸溶液浓度为0.2%。

6.根据权利要求4所述的一种医用敷料的制备方法，其特征在于：所述步骤X1中，缩水甘油基三甲基氯化铵与壳聚糖的质量比为1.2：1。

7.根据权利要求4所述的一种医用敷料的制备方法，其特征在于：所述步骤X1中，纯化过程的离心速度为5000rpm，离心时间为10min。

8.根据权利要求4所述的一种医用敷料的制备方法，其特征在于：所述步骤X2中，季铵化壳聚糖溶液浓度为20g/L，3,4-二羟苯基丙酸溶液浓度为100g/L，碳二亚胺溶液浓度为50g/L，且三种材料的摩尔比依次为5：2.5：1。

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