CS228510B2

CS228510B2 - Method for producing a packing prod for quick liquid chromatography

Info

Publication number: CS228510B2
Application number: CS484781A
Authority: CS
Inventors: Yuzo Yanagihara; Kohji Noguchi; Makoto Honda
Original assignee: Asahi Chemical Ind
Priority date: 1980-06-25
Filing date: 1981-06-25
Publication date: 1984-05-14
Also published as: JPH0115822B2; JPS5730945A

Description

Vynález se týká nového granulovaného zesilovaného kopolymeru, náplně pro vysoce citlivou rychlou kapalinovou chromatografii obsahující tento zesilovaný kopolymer a zpUsobu jeho výroby. Vynález se zvláště týká náplně pro ' kapalinovou chromatografii vhodné pro vysoce citlivé a do vysokého stupně prováděné dělení nebo analýzu sloučenin, rozpuštěných ve vodném roztoku, separačním mechanismem na základě gelové permeační chromatografie, která obsahuje kopolymer sestávající alespoň z jedné jednotky vinylalkoholu, alespoň jedné jednotky vinylesteru karboxylové kyseliny a alespoň jedné jednotky zesilovaného monomeru, obsahujícího isokyanurátový kruh a zpUsobu její výroby.

Kapalinová chromatografie představuje zpUsob dělení nebo analýzy, využívající rozdíl v rychlosti vymývání v dUsledku určitých interakcí mezi pevnou fází, tj. náplní a ' složkami určenými k oddělení, které jsou rozpuštěné v pohybující se kapalné fázi. ZpUsob, ve kterém se použije náplň o malé velikosti částic a vysoké mechanické pevnosti a dosahuje se vysoce citlivé dělení nebo analýzy vedením rozpouštědla při vysoké rychlosti po krátkou dobu, se obecně označuje jako vysoce citlivá rychlá kapali2 nová chromatografie a používá se v různých oborech.

Gelová permeační chromatografie je jednou z forem kapalinové chromatografie, využívající princip, že složka s menší velikostí molekuly, než je velikost pórU v náplni (označované jako „gel“) proniká do gelu v závislosti na své velikosti molekuly, zatímco složka s větší velikostí molekul prochází vně gelu. Tímto zpUsobem mohou být složky postupně vymývány rozpouštědlem v pořadí od složky s větší velikostí molekuly.

Gelová permeační chromatografie se mUže roztřídit podle rozpouštědel použitých pro dělení nebo analýzu na systémy používající organické prostředí a na systémy s ’ vodným prostředím. Z těchto dvou systémU je možné gelovou permeační chromatografií založenou na systému s vodným prostředím použít k oddělení nebo pro analýzu ve vodě rozpustných syntetických polymerU, sacharidU, aminokyselin a proteinU. Tento zpUsob je zvláště vhodný v biochemii a lékařství jako jednoduchý analytický postup, který se mUže s úspěchem použít pro analýzu séra bez předchozího zpracování vzorku nebo beze změny rozpouštědla během analýzy, jak se požaduje v běžné kapalinové chromatografii při použití adsorpce a distribu ce, - a rovněž při zisku většího množství informací. Zvláště složky krve a moči jsou v úzkém vztahu s chorobami ledvin nebo jater nebo symptomy, jakož i karcinomem. Z toho důvodu existuje značná potřeba objevit gel pro vysoce citlivou rychlou - kapalinovou chromatografií, zvláště gely pro systém založený na vodním prostředí pro gelovou permeační chromatografií, které jsou vhodné pro dělení nebo analýzu zmíněných složek.

Pro systém založený na vodném prostředí u gelové permeační chromatografie, se běžně používá gel, připravený zesíťováním dextranu s epichlorhydrinem (Sephadex). Tento gel je však tak zvaný měkký gel, jeho póry využité k separaci jsou tvořeny zesíťovanou strukturou, avšak mechanická pevnost gelu je malá. Z toho důvodu nemůže být tento gel použit pro rychlou gelovou permeační chromatografií.

Dále je také známa příprava gelu pro typ vodného prostředí tím, že se zmýdelní částice kopolymeru vinylacetátu a 1,4-butandiol divinyletheru, jak je uvedeno v americkém patentu č. 3 586 626. Avšak jak připouští W. Heitz, autor tohoto amerického patentu, kopolymerovatelnost monomerů použitých pro tento gel je nízká (viz W. Heitz, J. Chromato.gr. - - 53,. 37, 1970), a proto vytvářený gel nemá dostatečnou pevnost a prakticky nemůže být použit pro vysoce citlivou rychlou kapalinovou ' chromatografií.

Dále se uvádí, že gel pro typ vodného prostředí o vyšší mechanické pevnosti se dá připravit zmýdelněním částic kopolymeru, například diethylenglykoldimetakrylátu nebo - diglycidylmetakrylátu s vinylacetátem, a potom - zesíťováním zmýdelněného- kopolymeru, jak je popsáno v americkém - patentu č. 4 104 208. Tento způsob je však složitý a je obtížné- získat gel ' - s konstantní kvalitou a dobrou reprodukovatelností. - Kromě toho je známo, že je - možné - získat tvrdý gel polývinylalkoholu zmýdelněním kopolymeru vinylacetátu a zesnujícího činidla se - strukturou - triazinového kruhu v takovém rozsahu, že infračervené absorpční spektrum esteru při 1730 cm¹ zcela zmizí, jak je popsáno v britském patentu č. 2 034 328 A. Výzkumy prováděné autory - tohoto vynálezu však ukázaly, že gel získaný tímto způsobem má malou mechanickou pevnost - a v této souvislosti není gel vhodný pro rychlou gelovou permeační chromatografii, při které se používá gelu - s menší velikostí částic, například se středním průměrem částic menším než asi 20 μΐη. Uvedený gel může být použit při průmyslovém dělení, kdy se může použít gelu o větší velikosti částic, bez zvláštního požadavku na mechanickou pevnost, jako je tomu například při odsolování vodného roztoku polymeru.

Aby bylo možné použít tento gel pro systém založený na vodném prostředí pro rychlou gelovou permeační - chromatografii, musí mít pórovitou strukturu o přísně regulova telné velikosti odpovídající velikosti molekul složek určených k separaci, stejně jako musí mít malou velikost částic s dostatečnou mechanickou pevností. Dále je nutné, aby gel byl hydrofilní s nízkou adsorpční schopností vzhledem ke složkám, určeným k separaci ve vodném roztoku.

Na tyto požadavky se zaměřili autoři tohoto vynálezu při vyvinutí gelů pro systém založený na vodném prostředí pro gelovou permeační chromatografii. Výsledkem je gel, obsahující převážně hydroxyskupiny, esterové skupiny a jednotky zesíťujícího monomeru v polymerní kostře, mající póry vhodné pro separaci nebo analýzu předmětných látek ve vodném roztoku a vykazující mechanickou pevnost dostatečnou k použití při vysokých rychlostech nebo vysokých tlacích a způsob výroby tohoto gelu.

Předmětem tohoto vynálezu je způsob výroby náplně pro rychlou kapalinovou chromatografii, který spočívá v tom, že se monomerní směs alespoň jedné jednotky vinylesteru karboxylové kyseliny se 2 až 5 atomy uhlíku a alespoň jedné jednotky zesíťujícího monomeru obecného vzorce ve- kterém

Rl, R2 a R3 jsou stejné nebo - rozdílné - a náleží do skupiny tvořené —CH2—CH = CH2, —CH2-C = CH a —CH2—C = CH2,

....... CH3 z

při -molárním poměru vinylesteru karboxylové kyseliny k - zesíťujícímu monomeru 1:

: 0,88 až 1: 0,22, s výhodou 1: 0,11 až 1: 0,18 · nechá zpolymerovat v suspenzi a získaný granulovaný kopolymer se podrobí reesterlfikaci nebo zmýdelnění v rozsahu, při kterém reesterifikační poměr nebo poměr zmýdelnění činí 0,4 až 0,8, s výhodou 0,45 až 0,75.

Příkladné provedení vynálezu je znázorněno na připojených výkresech, kde obr. 1 představuje kalibrační křivku pro gel pro gelovou permeační chromatografii podle vynálezu a uvádí definici vyloučené molekulové hmotnosti (označeno jako М_Нт), obr. 2 je infračervené absorpční spektrum gelu podle příkladu 1 a obr. 3 až 5 jsou chromatogramy, získané při použití gelů podle příkladů 1, 2 a 5.

Gel pro použití v systému s vodným prostředím pro rychlou gelovou permeační chromatografií musí vykazovat mechanickou pevnost, odolávající vysokým rychlostem nebo vysokým tlakům, stejné jako musí být hydrofilní. Hydrofilnost gelu podle vynálezu je docílena obsahem hydroxyskupin v kostře polymeru. Tyto hydroxyskupiny se mohou tvořit reesterifikací nebo zmýdelněním esterových skupin v kopolymeru alespoň jednoho vinylesteru karboxylové kyseliny s alespoň jednoho zesíťujícího monomeru, obsahujícího isokyanurátový kruh. Ukázalo se však, že se mechanická pevnost gelu sníží v případě, když jsou všechny esterové skupiny reesterifikovány nebo zmýdelněny. Pokud je nezměněných esterových skupin příliš mnoho, sníží ae hydrofilnost gelu a složky rozpuštěné ve vodném roztoku se snadno adsorbují. Nyní bylo zjištěno, že je vhodné provádět reesterifikací nebo zmýdelnční do takové míry, aby bylo asi 40 až asi ' 80 % esterových skupin převedeno na hydroxyskupiny. Poměr reesterifikace nebo poměr zmýdelnění Y (0 < Y š 1) je vyjádřen rovnicí 1:

a + b (1) kde a a b jsou molární poměry alespoň jedné jednotky -alespoň vinylalkoholu a alespoň jedné jednotky vinylesteru karboxylové kyseliny v kopolymeru.

Y tedy - ukazuje poměr uvedených jednotek v kopolymeru.

Veličiny a a b se mohou vypočítat z hustoty hydroxyskupin (označované dále symbolem ,,4θη“ ) ^v gelu a množství alespoň jedné jednotky zesíťujícího monomeru obsahujícího isokyanurátový kruh. - qoH značí ekvivalent alespoň jedné jednotky vinylalkoholu na -hmotnostní jednotku gelu a může být stanovena reakcí gelu s anhydridem kyseliny octové v pyridinu, jako -rozpouštědle, přičemž se zjišťuje množství spotřebovaného anhydridu kyseliny octové při reakci s hydroxyskupinami nebo změna hmotnosti gelu a koncentrace hydroxyskupin se vypočte z této naměřené hodnoty. Například, pokud se spotřebuje 1 milimol anhydridu kyseliny octové v reakci s 1 g suchého gelu, činí q_QH tohoto gelu 1 mmol/g.

Druhy jednotek zesíťujícího monomeru, obsahujícího -isokyanurátový kruh, mohou být identifikovány jejich infračerveným absorpčním spektrem a jejich -počet může -být stanoven z obsahu dusíku, získaného elementární analýzou gelu. Jinými slovy veličina a může být zjištěna z hodnoty qoH a veličina b z hodnoty získané odečtením celkového množství alespoň jedné jednotky vinylalkoholu a alespoň jedné jednotky zesíťujícího monomeru od celkového množství alespoň jedné jednotky vinylalkoholu, alespoň jedné jednotky vinylesteru karboxylové kyseliny a alespoň jedné jednotky zesíťujícího monomeru v gelu. Chemická struktura vinylkarboxylá.tových skupin může být potvrzena identifikací karboxylové kyseliny vzniklé úplnou reesterifikací nebo zmýdelněním gelu. Pokud jsou podmínky pro výrobu gelu známy, je rovněž možno vypočítat Y - ze složení výchozích látek a qoH vytvořeného gelu. Je výhodné, aby se poměr reesterifikace nebo poměr zmýdelnění pohyboval - v rozmezí od 0,45 do asi 0,75. -Zatímco se hodnota qoH mění v závislosti na vinylesteru karboxylové kyseliny, použité jako- výchozí látka, stupeň zasíťování -a poměr reesterifikace -nebo poměr zmýdelnění činí podle předkládaného vynálezu 3 až 11 milimol -na g suchého gelu.

Tak - má gel podle vynálezu, obsahující současně odpovídající jednotky vinylalkoholu, vinylesteru karboxylové -kyseliny a zesíťující monomer s obsahem isokyanurátového kruhu, vynikající vlastnosti pro použití při rychlé gelové permeační chromatografii. Tato skutečnost je podložena faktem, že jednotky residuálních esterových skupin v -gelu ovlivňují -uchování mechanické pevnosti gelu a také faktem, že tyto jednotky mají vyšší hydrofilnost ve srovnání s jednotkami - zesíťujícího monomeru, - čímž se snižuje adsorpční schopnost gelu ve srovnání s případem, kdy je mechanická pevnost udržována pouze zesíťujícím monomerem.

Mezi -gely připravenými reesterifikací nebo zmýdelněním - kopolymeru vinylesteru karboxylové kyseliny a zesíťujícího monomeru s obsahem isokyanurátového kruhu, má gel připravený -při použití většího množství zesíťujícího monomeru větší mechanickou pevnost. Vzhledem k tomu, že zesilující monomer neobsahuje žádné hydroxyskupiny, a nemohou tedy hydroxyskupiny vzniknout hydrolýzou, má gel kopolymeru, -obsahujícího větší množství jednotek zesíťujícího monomeru v - polymerní kostře, - sníženou hydrofilnost. -K použití - gelu pro rychlou gelovou permeační chromatografií musí gel obsahovat optimální množství -isokyanurátových jednotek. Je výhodné, aby -se stupeň zesíťování (označený jako „X“] -pohyboval v rozmezí 0,2 s X < asi 0,4.

X je vyjádřeno rovnicí 2:

v ^3c a + b + 3c (2) kde a - a b mají shora uvedený význam a c značí molární poměr alespoň jedné jednotky zesíťujícího monomeru obsahujícího isokyanurátový kruh v celkovém množství alespoň jedné jednotky vinylalkoholu, alespoň jedné jednotky vinylesteru karboxylové kyseliny a alespoň jedné jednotky zesíťuj’ícího monomeru kopolymeru.

Ve vzorci mohou být veličiny a a b stanoveny popsanými postupy . a veličina c může být stanovena z hodnot elementární analýzy gelu nebo esterifikačního gelu. Pokud jsou známy podmínky pro přípravu gelu, může být X snadno stanoveno výpočtem z molů vinylesteru karboxylové kyseliny a zesíťujícího monomeru, použitého v polymerizaci, náhradou za (a + b] a c v popsaném vzorci.

S veličinou X ve shora uvedeném rozmezí má gel s malou velikostí částic dostatečnou pevnost k tomu, aby se dal použít při vysokém tlaku a podmínkách vysoké rychlosti. . Takový gel je rovněž dostatečně hydrofilní a obtížně adsorbuje složky ve vodném roztoku, zvláště proteiny a aminokyseliny a tudíž je zvláště vhodný k použití pro gelovou permeační chromatografii o vysoké rychlosti. Dále je vhodné, že gel podle vynálezu zabezpečuje současně shora uvedené rozmezí hodnot X a Y.

U běžného^ měkkého gelu musí být za účelem zvýšení vyloučené molekulové hmotnosti [označované jako M_limj, tj. minimální molekulové hmotnosti látky, která nemůže pronikat do pórů gelu, snížen stupeň zesilováni k rozšíření sítě, což musí nezbytně vést ke zvýšení opětného přijímání vody (označovaného jako W_R), s výsledkem způsobujícím nevýhodné zmenšení mechanické pevnosti. Zvláště v případě, kdy je velikost částic malá, dá se předpokládat vznik nepříznivých účinků, jako tlakové ztráty v naplněné koloně v důsledku snížené mechanické pevnosti. Proto se používají gely, které mají průměr částic alespoň 50 μΐη.

Gel podle vynálezu má naproti tomu hodnotu W_R asi 0,5 až 2,0 g vody/g suchého gelu bez ohledu na M_Hra, a může být tedy i v případě, kdy je hodnota M_Hm vysoká, použit pro gelovou permeační chromatografií pro vysoké rychlosti. Toto je pozoruhodné u gelů typu pro vodné prostředí pro rychlou gelovou permeační chromatografii, kde se mohou použít gely s průměrem částic nejvýše 20 μΐη, které mají požadovanou dostatečnou mechanickou pevnost, Wr je definováno jako množství (g) vody, kterou může obsahovat jeden gram suchého gelu, když je gel udržován v rovnováze s vodou, a je měřítkem množství pórů v gelu použitém při gelové permeační chromatografií.

Při zvýšeném Wr se hmotnost podílu polymerního skeletu na jednotku objemu gelu ve vodě, to znamená hmotnost samotného gelu, relativně sníží. Pokud je tedy Wr příliš velké, sníží se mechanická pevnost gelu ve vodě a je nemožné zvýšit rychlost proudění, což má za následek ztráty tlaku v koloně. Naproti tomu, pokud je Wr příliš malé, množství pórů v gelu, které fungují při gelové permeační chromatografií se sníží, čímž se zmenší schopnost separace na gelu. Proto je rozhodující pro gel typu pro vodné prostředí pro rychlou gelovou permeační chro^^tt^o^i?^fii mít hodnotu Wr v příslušném rozmezí.

Je vhodné, aby gel pro rychlou gelovou permeační chromatografií se strukturou podle tohoto vynálezu, vykazoval Wr v rozmezí asi od 0,5 asi do 2,0 g vody/g suchého gelu, zvláště asi 0,8 až asi 2,0 g vody/g suchého gelu. Gel podle tohoto vynálezu může mít Wr v takovém rozsahu. Wr se stanoví takto:

Gel, ponořený ve vodě ve zcela vyváženém stavu, se odstředí za účelem odstranění vody, lpící na povrchu gelu, a stanoví se jeho hmotnost Wí. Gel se vysuší a stanoví se jeho suchá hmotnost W2. Wr se vypočte z této rovnice:

Mim gelu . podle vynálezu se může pohybovat v širokém rozmezí. Jak bylo uvedeno, Mim značí minimální molekulovou hmotnost sloučeniny, která nemůže pronikat do pórů gelu. Sloučeniny a látky mající molekulovou hmotnost nižší, než je tato kritická hodnota, mohou být oddělovány gelovou permeační chromatografií, avšak sloučeniny, mající molekulovou hmotnost vyšší, než je tato kritická hodnota, nepronikají do pórů gelu, nýbrž procházejí přímo mezerami mezi gely. Tyto sloučeniny vykazuj! v podstatě stejný eluční objem bez ohledu na molekulovou hmotnost a nemohou být oddělovány gelovou permeační chromatografií.

M_nm může být získána z kalibrační křivky gelové permeační chromatografie. Tato kalibrační křivka se získá nanesením logaritmu molekulových hmotností jednotlivých vzorků, jejichž molekulové hmotnosti jsou známy na ordinátu a eluční objem- každého vzorku nanesením na abscissu ve vztahu ke koloně, vyplněné gelem, jak je znázorněno na obr. 1. To představuje vztah mezi elučním objemem a molekulovou hmotností látky, určené k oddělení na chromatogramu. Šikmá čára a čára rovnoběžná s ordinátou jsou na tomto grafu v podstatě přímky a část, ve které se tyto přímky stýkají, je křivka. Mum v předkládaném vynálezu je vyjádřeno jako hodnota na ordinátě v bodě, ve kterém prodloužení šikmé přímky prochází prodloužením čáry, paralelní k ose y. Μ,™ je jednou z vlastností gelu a značí vyloučenou molekulovou hmotnost, při které může gel sloužit separačním účinkem založeném na rozdílech ' ve velikosti molekul. Sloučeniny s molekulou větší než odpovídá ' vyloučené molekulové hmotnosti jsou vymývány, aniž by došlo k oddělení.

Podle vynálezu je hodnota M_Hm stanovena při použití standardní sloučeniny o známé molekulové hmotnosti, ve formě póly228510 ethylenglykolů nebo dextranů a destilované vody jako rozpouštědla. Vzhledem к tomu, že obchodně dostupné, ve vodě rozpustné standardní polymery mají molekulovou hmotnost nižší než 2 000 000, nemůže být úplná kalibrační křivka získána u gelu, jehož hodnota M_lim převyšuje 2 000 000. M_Jimtakového gelu nemůže být přesně stanoveno a je -odhadováno z průsečíku prodloužené kalibrační křivky, stanovené pro molekulové hmotnosti nižší než 2 000 000 a čáry rovnoběžné s ordinátou y, která je stanovena za stejných podmínek, odpovídajících gelu o nižší hodnotě М_Нт.

Pro získání mechanické pevnosti gelu, vhodné pro rychlou gelovou permeační chromatografii a současné nízké adsorpční schopnosti, pohybuje se stupeň zesíťování X výhodně v rozmezí od 0,24 do 0,32, pokud M_Urn odpovídá 10³ až 10⁵, a stupeň zesíťování X se pohybuje v rozmezí od 0,27 do 0,35 v případě, že М_Ит náleží do rozmezí od 10⁵do 10».

Gel podle vynálezu může být definován jako zcela porézní tvrdý gel, který má v suchém stavu velkou specifickou plochu povrchu. Zcela porézní struktura značí strukturu, mající jemné póry rovnoměrně rozdělené ve vnitřních částech částic. Obecně řečeno, organické syntetické polymery, mající zesíťovanou strukturu se nechají nabobtnat v rozpouštědle, vykazujícím afinitu к polymerům a následně se vysuší. V případě měkkého gelu, kde jsou póry, vyplněné rozpouštědlem při bobtnání, udržovány pouze sítí zesíťování, nemůže tato síť udržovat stav při nabobtnání i po vysušení a póry z větší části zmizí. V takovém případě je specifická plocha povrchu omezena v podstatě na vnější povrch částic, vykazuje obecně velmi nízké hodnoty, menší než 1 m²/g. Na druhé straně, v případě tvrdého gelu s pevnou porézní strukturou, zůstává struktura pórů v podstatě zachována, i když v porovnání se stavem po nabobtnání dojde к určitému smrštění po vysušení. Jinými slovy, povaha pórů je permanentní. Tvrdý gel tedy vykazuje mnohem větší plochu povrchu než měkký gel.

Gel podle tohoto vynálezu má specifickou plochu povrchu asi 5 až asi 1000 m²/g. U gelu, který má specifickou plochu povrchu menší, než je spodní hranice rozmezí se rozumí, že jde o gel se strukturou homogenního typu (měkký gel), který převážně neobsahuje jemné póry a není tedy vhodný pro rychlou gelovou permeační chromatografii.

Specifická plocha povrchu se může měřit různými známými postupy, ale u tohoto vynálezu se stanovuje nejužívanějším postupem, metodou, kterou publikovali S. Brunauer, P. Emmet a E. Teller v J. Am. Chem. Soc., 60, 309 — 316 (1928). Při této metodě, zkráceně označované BET, se pracuje za použití plynného dusíku. Pro měření specifické plochy povrchu je nezbytné dostatečně vysušit vzorky. Vzhledem к tomu, že gel podle vynálezu obtížně schne v důsledku vysoké hydrofilnosti, je vhodnější vlhký gel nejprve uvést do rovnováhy s acetonem a gel teprve potom vysušit za sníženého tlaku při teplotách nižších než asi 60 °C.

Gel podle vynálezu vykazuje střední průměr částic, označený jako D_w, asi 4 až asi 200 дт. Zvláště výhodné vlastnosti pro vysoce citlivou rychlou kapalinovou chromatografii vykazuje gel v případě, že Ď_w je malý, například v rozmezí od asi 5 do asi 20 μπι. Pokud je požadována zvláště vysoká schopnost separace, je výhodné, aby hodnota D_w gelu činila asi 5 až asi 12 ^m. D_w se měří speciálním počitadlem a vypočte podle následující rovnice:

— Σ (ni. di⁴) ^{Dw =} F(bi7ďPl ve které di značí průměr částice, a ni je četnost výskytu průměru částic di.

V oboru kapalinové chromatografie je dobře známo, že je možno zlepšit separační schopnost zmenšením částic náplně. Když však prochází rozpouštědlo kolonou, vyplněnou gelem o malém rozměru částic, zvyšuje se nebezpečí ztráty tlaku ve srovnání s případem, kdy se použije gel o větší velikosti částic. Pokud je mechanická pevnost gelu malá, dochází к deformaci gelu, což má za následek abnormálně velkou ztrátu tlaku. Gel s malou velikostí částic je nepoužitelný pro vysoce citlivou rychlou kapalinovou chromatografií.

Vzhledem к tomu, že mechanická pevnost gelu podle vynálezu může být úspěšně zlepšena regulací různých vlastností, včetně poměru reesterifikace nebo poměru zmýdelnění a stupně zesítění, odolává gel vysokým rychlostem a vysokým tlakům přes malou velikost jeho částic.

Gel podle vynálezu, vykazující uvedené vlastnosti, může být vyroben suspenzní polymerací monomerní směsi alespoň jednoho vinylesteru karboxylové kyseliny a alespoň jednoho zesilujícího monomeru, obsahujícího isokyanurátový kruh v přítomnosti rozpouštědla, které může rozpouštět směs monomerů, avšak je obtížně rozpustné ve vodě a reesterifikací nebo zmýdelněním částic výsledného kopolymeru do takové míry, aby poměr reesterifikace nebo poměr zmýdelnění činil asi 0,4 až 0,8.

Vinylester karboxylové kyseliny, který může být použit v tomto vynálezu, je sloučenina, mající alespoň jednu polymerovatelnou vinylkarboxylovou skupinu a náleží do skupiny, tvořené vinylestery karboxylové kyseliny se 2 až 5 atomy uhlíku. Příkladem takových vinylesterů karboxylové kyseliny je vinylacetát, vinylpropionát, vinylbutyrát, vinylvalerát a vinylpivalát, které mohou být použity jednotlivě nebo v kombinaci dvou nebo více druhů. Z těchto vinylesterů karboxylové kyseliny jsou zvláště výhodné vinylacetát a vinylpropionát, vzhledem ke snadnosti polymerace, reesterifikace, zmýdelnění i dostupnosti.

Zesíťující monomer, mající isokyanurátový kruh a použitelný ve způsobu podle vynálezu, je reprezentován vzorcem:

ve kterém

Ri, Rz a R3 mohou být stejné nebo rozdílné a náleží do skupiny, tvořené

-CHz-CH = CH2, —CH2— C - CH— a —CH2—C = CH₂.

СНз

Z těchto zesíťujících monomerů má triallylisokyanurát (Ri=Ra=R3 = —CH2—CH = = CH2) dobrou schopnost kopolymerace s vinylacetátem a dobrou stabilitu při reesterifikaci nebo zmýdelnění a v této souvislosti je mu dávána přednost pro použití jako zesíťující monomer.

Molární poměr vinylesterů karboxylové kyseliny к zesíťujícímu monomeru, který se může použít, je obvykle 1 к asi 0,08 až asi 0,22. Podle použití získaného gelu je molární poměr vinylesterů karboxylové kyseliny к použitému zesíťujícímu monomeru s výhodou 1 к asi 0,11 až asi 0,16 nebo zvláště výhodně 1 к asi 0,12 až asi 0,18.

Jiné monomery, jako je například 2-ethylhexylmethakrylát a akrylamid, které jsou kopolymerovatelné s vinylesterem karboxylové kyseliny a zesíťujícím monomerem, se mohou použít v množství například až do asi 3 °/o hmotnostních, vztaženo na hmotnost vinylesterů karboxylové kyseliny, co v podstatě nemá nepříznivý účinek na vlastnosti a separační výkon gelu.

К vytvoření permanentních pórů v částicích kopolymeru а к současné kontrole množství pórů, velikosti pórů a distribuce velikosti pórů, se к systému pro polymeraci v suspenzi přidá alespoň jedno ředidlo, které může rozpouštět směs monomerů, která je ale obtížně rozpustná ve vodě.

Příkladem takových ředidel, které se mohou použít při způsobu podle vynálezu, jsou aromatické uhlovodíky, jako je toluen, xy len a dekalin, alifatické uhlovodíky, jako je heptan, oktan a děkan, esterové sloučeniny, jako je n-butylacetát, isobutylacetát a n-hexylacetát, methylethylketon, a n-heptanol, které mohou být použity samotné nebo v kombinaci dvou nebo více druhů. Vhodné množství ředidla, které může být použito podle vynálezu, se pohybuje v rozmezí od asi 20 do asi 200 dílů hmotnostních na 100 dílů hmotnostních směsi monomerů. Pokud je množství ředidla nižší, než je uvedená spodní hranice tohoto rozmezí, množství pórů v gelu se příliš sníží a současně se zmenší separační schopnost gelu. Pokud je toto množství vyšší než udaná horní hranice shora uvedeného rozmezí, zmenší se mechanická pevnost gelu a gel ztrácí schopnost к použití při vysokých rychlostech a vysokých tlacích. Výhodné množství ředidla je v rozmezí od asi 20 do asi 100 dílů hmotnostních na 100 dílů hmotnostních směsi monomerů.

Za účelem kontroly velikosti pórů a distribuce velikosti pórů gelu může se použít lineárního polymeru rozpustného ve směsi monomerů v kombinaci s ředidlem shora popsaným.

Lineární polymer, který může být použit podle tohoto vynálezu, je lineární polymer, který se může rozpustit ve směsi monomerů v koncentraci alespoň 1 % hmotnostního. Příkladem takových lineárních polymerů jsou polyvinylacetát a polystyren. Množství použitého lineárního polymeru činí až do asi 10 dílů hmotnostních, výhodně asi 0,3 až asi 10 dílů hmotnostních na 100 dílů hmotnostních monomerní směsi. Použitím lineárního polymeru v kombinaci s ředidlem se může snadno vyrobit gel, který má větší průměr pórů, tj. má vysoké Мц_т.

Iniciátor, který se může použít pro polymeraci v suspenzi podle tohoto vynálezu, může být libovolný upotřebitelný iniciátor radikálové polymerace. Vhodným příkladem mohou být iniciátory typu azosloučeniny, jako 2,2-azobisisobutyronitril a 2,2‘-azobis(2,4-dimethylvaleronitrilj a iniciátory peroxidového typu, jako je benzoylperoxid, lauroylperoxid, di-terc.butylperoxid a kumenhydroperoxid. Množství iniciátoru radikálové polymerace je obecně v rozmezí od asi 0,1 do asi 5 dílů hmotnostních na 100 dílů hmotnostních monomerní směsi.

Při provádění polymerace v suspenzi je výhodné přidat к vodné fázi stabilizátor suspenze zvolený ze skupiny tvořené o sobě známými organickými polymerními stabilizátory, jako je polyvinylalkohol a methylcelulóza. Množství použitého stabilizátoru suspenze je v rozmezí od asi 0,1 do asi 3 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost vody, jako prostředí pro polymeraci v suspenzi. Je-li nutné nebo v případě potřeby je možné použít kombinace s prostředkem pro úpravu pH, jako fosforečnanem sodným. Je výhodné udržovat přibližně neutrální hod228510 notu pH suspenze. Velikost částic granulovaného polymeru získaného polymerací je možné měnit změnou druhu a množství stabilizátoru suspenze nebo rychlost míchání.

Objemový nebo hmotnostní poměr mezi organickou fází a vodnou fází při polymeraci v suspenzi není podstatný a může být takový, jaký se obvykle volí při provádění polymerace v suspenzi.

•Polymerační teplota se pohybuje obecně v rozmezí · od asi 50 do· asi 90 °C, výhodně od asi 60 do asi 80 °C.

Doba polymerace je obvykle asi 10 až 50 hodin.

Po ukončení polymerace se částice - výsledného kopolymeru odfiltrují, dostatečně promyjí vodou, horkou vodou, acetonem a podobně, aby se odstranil lineární polymer, stabilizátor suspenze, zbývající monomery, ředidla atd., ulpívající na částicích a kopolymer se potom suší.

Takto získané částice kopolymeru se reesterifikují nebo zmýdelní. Reesterifikace může být prováděna v alkoholu, jako- methanolu, ethanolu a podobně jako v rozpouštědle. Zmýdelnění se může provádět ve vodě nebo· ve směsi vody a alkoholu, jako methanolu, ethanolu a podobně, jako v rozpouštědle, vždy za použití kyseliny, například kyseliny sírové, kyseliny chlorovodíkové a podobně, nebo zásady, jako hydroxidu sodného, hydroxidu draselného a podobně.

Teplota pro reesterifikaci nebo zmýdelnění je obvykle asi 0 až asi 60 °C, výhodně asi 0 až asi 40 °C. Doba reesterifikace nebo zmýdelnění se pohybuje v rozmezí od asi 5 do asi 50 hodin.

K výrobě gelů, jejichž velikost částic je malá, a které odolávají vysokým tlakům a vysokým rychlostem, je nutné podle tohoto vynálezu, aby poměr reesterifikace nebo poměr zmýdelnění byl v rozmezí od asi 0,4 do asi 0,8. Pokud jsou · všechny esterové skupiny v gelu reesterifikovány nebo zmýdelněny, to znamená pokud činí poměr reesterifikace nebo zmýdelnění 1,0, může se získat vysoce hydrofilní gel, jehož mechanická pevnost nutně není dostatečná. Výhodný poměr reesterifikace nebo poměr zmýdelnění je asi 0,45 až asi 0,75. Podmínky pro reesterifikaci nebo zmýdelnění se mohou příslušně volit změnou druhu reakčního rozpouštědla, reakční teploty, reakční doby a podobně.

Po reesterifikaci nebo zmýdelnění se získané částice odfiltrují a dostatečně promyjí studenou nebo horkou vodou. Podle potřeby se částice roztřídí, aby se získaly částice použitelné jako náplň pro vysoce citlivou rychlou kapalinovou chromatografií, například tím, že se částice dispergují ve vodě, aby se tím umožnilo jejich jednoduché roztřídění využitím rozdílu v rychlosti sedimentace.

Gel podle tohoto vynálezu obsahuje v polymerním skeletu převážně hydroxyskupiny, esterové skupiny a jednotky zesilujícího monomeru, které mají isokyanurátový kruh · a · jsou dostatečně hydrofilní při takovém obsahu hydroxylů, jako spadá do shora uvedeného rozsahu. Gel nemá schopnost adsorbovat řadu sloučenin rozpuštěných ve · vodě. Proto při separaci nebo analýze ve vodě rozpustných syntetických polymerů, sacharidů nebo proteinů, má gel kalibrační křivky, ve kterých je vztah mezi elučním objemem a logaritmem molekulové hmotnosti materiálu určeného k oddělení, vyjádřen v podstatě přímými čarami nebo mírnými křivkami. To znamená, že je gel podle tohoto vynálezu vhodný pro použití v gelové permeační chromatografií typu s vodným prostředím. Při analýze vzorků, sestávajících z různých složek, jako například v případě séra nebo moči, jsou však při použití gelu podle tohoto vynálezu některé· složky slabě adsorbovány na gelu, na co ukazuje větší eluční objem, než by se dal předpokládat z jejich molekulové hmotnosti. Výsledkem tohoto může být zjištění řady píků. Kromě toho gel nemá téměř žádnou · adsorbční schopnost pro proteiny, jako · je albumin a eluuje proteiny v objemu, odpovídajícímu jejich molekulové hmotnosti. Proto při použití gelu podle vynálezu při analýze séra nebo moči není tedy nutné odstranit proteiny. Vzhledem k tomu, že gel · podle vynálezu obsahuje hydroxyskupiny, esterové skupiny a jednotky zesifujícího monomeru, majícího isokyanurátový kruh, ve vhodných poměrech, dá se předpokládat, · že malá adsorpční schopnost gelu kromě separačního účinku, založeného na rozdílech · ve velikosti molekul, poskytuje gel s dobrou separační schopností.

Gel podle předkládaného vynálezu vykazuje dále velmi dobrou mechanickou pevnost · s hodnotou Wr udržovanou uvnitř uvedeného rozmezí. Proto bez ohledu na malou velikost částic odolává gel podle vynálezu vysokým tlakům a vysokým rychlostem.

Gel pro rychlou gelovou permeační chromatografii ve vodném médiu musí splňovat · následující požadavky:

obsahovat póry v gelu, vykazovat malou adsorpční schopnost a míti dostatečnou mechanickou pevnost, aby obstály při vysokých tlacích nebo vysokých rychlostech i při malých rozměrech částic. Gel podle vynálezu splňuje všechny tyto· požadavky, přičemž tyto vlastnosti vyplývají z hodnot X, pohybujících se v uvedených rozmezích, poměru reesterifikace nebo poměru zmýdelnění a hodnot Wr.

Takovéto vynikající separační vlastnosti a mechanické pevnosti, jako vykazuje gel podle vynálezu, nemohou být například u gelu tvořeného kopolymerem vinylalkoholu a triallylisokyanurátu, u něhož je hodnota X nízká a absorpce infračerveného absorpčního spektra při 1730 cm^_1 zcela vymizela, jak je uvedeno v britském patentu číslo

034 328 A. Z toho důvodu není takový gel vhodný pro použití jako náplň pro vysoce citlivou rychlou kapalinovou chromatografii.

Velikost pórů gelu podle vynálezu může být volena v širokém rozmezí. Gel podle vynálezu není tudíž vhodný pouze pro separaci nebo analýzu ve vodě rozpustných syntetických. polymerů, sacharidů nebo proteinů, ale rovněž pro analýzu složek s molekulovou hmotností od několika set tisíc do několika miliónů, obsažených v krvi a moči a které se zdají mít úzkou souvislost s chorobami jater nebo ledvin nebo symptomů, jakož' i karcinomu. Kromě toho, vzhledem k tomu, že je gel podle vynálezu určen pro své vynikající vlastnosti k použití pro rychlou gelovou permeační chromatografii, mohou být tyto analýzy provedeny v krátkém časovém úseku a poskytnout větší množství informací.

Gel podle vynálezu může být použit jako náplň kolony. Použitá kolona je obvykle válec vyrobený z nerezavějící oceli, přičemž je ovšem možno volit v závislosti na použití jiný typ kolony.

Vynález bude dále podrobněji objasněn příklady praktického použití, které však rozsah vynálezu nijak neomezují.

Příklad 1

Homogenní kapalná směs sestávající ze 100 g vinylacetátu, 32,2 g (X = 0,25) triallylisokyanurátu, 100 g n-butylacetátu, 3,3 g 2,2‘-azObisisooiityronitrilu a 800 ml vodného roztoku, obsahujícího 1 % hmot, polyvinylalkoholu se stupněm polymerace asi 2400 a poměrem zmýdelnění 88 % mol., 0,05 % hmot, dihydrátu dihydrogenfosforečnanu sodného a 1,5 % hmot, dodekahydrátu hydrogenfosforečnanu sodného, byla vpravena do dvoulitrové baňky. Po důkladném promíchání za míchání se provedla při zahřívání na 65 °C po dobu 18 hodin a dále při zahřívání na 75 °C po dobu 5 hodin polymerace v suspenzi. Částice výsledného polymeru byly odděleny filtrací, promyty vodou a potom acetonem, vysušeny a podrobeny ^esse^nkací v roztoku obsahujícím 47 g hydroxidu sodného a 2 1 methanolu při 15 °C po dobu 20 hodin. Výsledné částice polymeru byly odfiltrovány, promyty vodou a dispergovány ve vodě za účelem roztřídění na základě rozdílné rychlosti-sedimentace.

Průměr částic D_w takto získaného gelu zesilovaného polyvlnylalkoholu byl změřen, přičemž byl stanoven průměr 10,0 μπι. Hustota hydroxylových skupin q₀H byla stanovena popsaným postupem a byla zjištěna hodnota 7,3 mmol/g, což ukazuje na poměr reesterifikace 0,64. Rovněž bylo potvrzeno infračervenou adsorpcí spektra gelu po reesterifikaci, jak je znázorněno na obr. 2, že ye skeletu polymeru zbyly esterové skupiny. Infračervené spektrum bylo měřeno po vytvarování gelu do KBr tablet při použití in fračerveného spektrofotometru. Gel vykazoval nasákavost vody 1,58 g vody/g suchého gelu a specifickou plochu povrchu 95 m²/g.

Tento gel byl vpraven do kolony z nerezavějící oceli o průměru 7,5 mm a délce 50 cm a za použití diferenčního' refraktometru byly měřeny vodné roztoky dextranů a polyethylenglykolů, o různé molekulové hmotnosti. Sloučeniny z každé skupiny byly eluovány postupně v závislosti na vzrůstu molekulové hmotnosti a bylo potvrzeno, že separace byla provedena pomocí gelové permeační chromatografle. Vyloučená molekulová hmotnost Mum dextranů činila 3 χ 1Ó¹. Při analýze χ-globulinu, albuminu hovězího séra, ovalbuminu a myo^lubilinu, při použití vodného roztoku 'obsahujícího 0,3 M chloridu sodného a 0,1 M fosforečnanu sodného, jako rozpouštědla v detektoru ultrafialové absorpce byly proteiny eluovány v pořadí proteinů od vyšší molekulové hmotnosti, se stupněm opětného získání v podstatě 100 °/o. Všechny vzorky byly měřeny při rychlosti toku 1 ml/min.

Vzorek roztoku sublimačně sušeného lidského séra byl kromě toho analyzován při použití naplněné kolony podle obr. 3, kde vrchol A indikuje převážně albumin, vrchol B kreatinin a vrchol C kyselinu močovou. Některé složky byly eluovány v množství větším než odpovídá prázdnému objemu kolony v důsledku jejich slabé absorpční schopnosti ke gelu, avšak počet složek byl zjištěn a oddělen po eluci χ-globulinu a albuminu.

Příklad 2

Gel byl připraven postupem, popsaným v příkladu 1 s tím rozdílem, že místo kapalné směsi, použité v příkladu 1 byla použita kapalná směs, sestávající ze 100 g vinylacetátu, 32,2 g (X = 0,25) triallyMsokyanurátu, 40 g toluenu a 3,3 g 2,2‘-azobisisobutyronitrilu, a že reesterifikace byla prováděna při 40 °C po dobu 20 hodin. _

Výsledný gel vykazoval hodnotu D_w 9,5 ^m, q0H 9,0 mmol/g, poměr reesterifikace 0,74, Wr 1,0 g vody/g suchého gelu a specifickou plochu povrchu 38 m⁵/g.

Gel byl vpraven do stejné kolony jako v příkladu 1 a byla prováděna analýza polyethylenglykolů s různou molekulovou hmotností. Bylo prokázáno, že eluční pořadí odpovídalo polyethylenglykolu s vyšší molekulovou hmotností a M_Hm odpovídal 1,9 x x 1Ο³. Všechny vzorky byly měřeny při průtokové rychlosti 1 ml/min a každá z analýz byla ukončena v průběhu 20 minut. Dále byl analyzován vzorek roztoku lyofíiizovaného lidského séra, při použití naplněné kolony, poskytující záznam, odpovídající obr. 4, kde vrchol D představuje převážně albumin, vrchol E kreatin a vrchol F kyselinu močovou. Ačkoliv je počet vrcholů zdánlivě menší než na obr. 3 v ' důsledku menší citlivosti měření, odpovídá základní model eluční křivky téměř ' zcela křivce podle obr. 3. To potvrzuje, že pomocí gelu podle tohoto příkladu je možno , provádět stanovení a oddělení složek, uvedených v příkladu.

Příklad 3

Gel byl připraven postupem, uvedeným v příkladu 1 s tím rozdílem, že bylo použito kapalné směsi, sestávající ze 100 g vinylacetátu, 37,5 g (X = 0,28) triallyiisokyanurátu, 100 · g n-butylacetátu a 4,1 g polyvinylácetátu, ' se stupněm polymerace asi 500 a

3,4 g 2,2‘-azobisisobntyronitrilu a reesterifikace byla prováděna při 15 °C po dobu 15 hodin.

Výslpdný gel měl Ě)_w 9,1 μη, qoH 5,1 mmol/ /g (poměr reesterifikace 0,50), Wr 1,46 g vody/g suchého gelu a specifickou plochou povrchu 86 ra²/g.

Tento gel byl vpraven do kolony, popsané v příkladu · 1 a byly prováděny analýzy polyethylenglykolů a dextranů, majících různou molekulovou hmotnost, a proteinů včetně χ-globulinu. Analýzami bylo potvrzeno, že sloučeniny každé skupiny byly eluovány v pořadí od sloučeniny mající vyšší molekulovou hmotnost a že proteiny byly eluovány se stupněm opětného získání v podstatě ' 100 %. Mii_m pro dextran odpovídala 8 x χ 104. Všechny vzorky byly měřeny při průtokové rychlosti 1 ml/min a každá z analýz byla ukončena během 20 minut.

Příklad 4

Gel byl připraven postupem podle příkladu 1 při použití kapalné směsi, obsahující 116 g vinylpropionátu, 39,4 g (X = 0,29) triallylisokyanurátu, 62 g n-butylacetátu a

3,9 g 2,2‘-azobisisobutyronitrilu. ReesSerřfikace byla prováděna při 40 °C po dobu 20 hodin. _

ZíSkaný gel vykazoval D_w 10,8 pm, q₀H

7,7 mmol/g (poměr rrerierrfikace 0,72), W_R

1,30 g vody/g suchého gelu a specifickou plochu povrchu 52 m2/g.

Tento gel byl umístěn v koloně, popsané v příkladu 1 a byly prováděny analýzy polyrthylrnglykolů a dextranů, majících různou molekulovou hmotnost a proteinů, včetně χ-globulinu. Bylo potvrzeno, že sloučeniny každé ze skupin byly eluovány v pořadí se vzrůstající molekulovou hmotností a že proteiny byly eluovány se stupněm opětného získání v podstatě 100 %. M_Hmpro dextran byla 2 x 10⁴. Všechny vzorky byly měřeny při průtokové rychlosti 2 ml/ /min a každá z analýz byla ukončena během 10 minut.

P ř í k 1 a d 5 .

Gel byl připraven postupem podle příkladu 1 při použití kapalné směsi, obsahující

100 g · vinrlacrtátu, 41 g (X = 0,3) triallylisokyanurátu, 141 · g methylisobi^itylketonu a

2.8 g 2,2‘-azobisisobntyronilrilu a rrrsierifikace byla prováděna při 40 °C po dobu 20 hodin.

Výsledný , gel vykazoval D_w 12,1 pm, q0H 7.8· meq/g (poměr reesterifikace 0,62), Wr

1,78 g vody/g suchého. geko a specifickou plochu povrchu 87 m²/g.

Tento gel byl umístěn v koloně podle příkladu 1 a byla prováděna série analýz standardních vzorků polrrthylrnglykolů a dextranů s různou molekulovou hmotností. Sloučeniny každé skupiny byly eli-iovány v pořadí od sloučenin s vyšší molekulovou hmotností a Mli_m pro dextran odpovídalo · 5 x 10⁴. Rovněž analýza standardních vzorků albuminu hovězího séra, ovalbuminu a myoglobinu byla prováděna při použití naplněné kolony. Rovněž v tomto případě bylo, potvrzeno, že tyto proteiny byly eluovány v pořadí od proteinů s vyšší molekulovou hmotností a se stupněm opětného získání v podstatě 100 %. Získaný diagram je uveden na obr. 5, kde křivka G představuje eluční křivku albuminu, křivka H eluční křivku ova^uminu a křivka I eluční křivku myoglobinu. Jak je patrné z těchto výsledků, gel podle tohoto · příkladu je velmi účinný pro separaci · proteinů. Všechny vzorky byly měřeny při průtokové rychlosti 1 ml za minutu a každá z analýz byla ukončena během 20 minut.

Příklad 6

Gel byl připraven postupem podle příkladu 1 při použití kapalné směsi, sestávající ze 100 g vinylacrtáto, 48 g (X = 0,33) triallylisokranoráto, 104 g n-h^anolu a

3,7 g 2,2‘-azobisisobutyronitrilu.

Výsledný gel měl D_w 9,7 μΐη, q0H 4,4 mmol/g (poměr reesterifiкacr 0,4'7), Wr 1,5 g vcdy/g suchého gelu a specifickou plochu povrchu 60 m²/g.

Tento gel byl umístěn v koloně podle příkladu 1 a při použití naplněné kolony byly prováděny analýzy polyrthrlrnglrkкlů a dextranů, majících různé molekulové hmotnosti. Všechny sloučeniny byly eluovány v pořadí od nejvyšší molekulové hmotnosti. MHm pro dextran bylo 5 x 10⁵. Všechny vzorky byly měřeny při průtokové rychlosti 1 ml/min a každá z analýz byla ukončena během 20 minut.

Poklad 7

Gel byl připraven postupem podle příkladu 1 při použití kapalné směsi, sestávající ze 100 g vinyl^acetátu, 52 g (X = 0,35) triallrliskCranuráto, 122 g n-butylacetátu, 6 g polyvinylacrtáto o stupni polymerace , asi 500 a 3,8 g 2,2‘-azobisiss0utyronitrilu, přičemž byla reesterinkace prováděna při 40° Celsia po dobu 20 hodin.

Výsledný gel měl D_w 11,4 pm, q0H 7,6 mmol/g (poměr esterové výměny 0,75), Wr

1,65 g suchého gelu a specifickou plochu povrchu 95 m²/g.

Tento gel byl umístěn v koloně, popsané v příkladu 1 a pomocí naplněné kolony byly prováděny analýzy polyethylenglykolů a dextranů s různými molekulovými hmotnostmi a proteinů, jako je albumin hovězího séra, ovalbumin a myoglobin ve formě standardních vzorků. Bylo potvrzeno, že sloučeniny každé skupiny byly eluovány v pořadí od nejvyšší molekulové hmotnosti a regenerace proteinů odpovídala v podstatě 100 %. MHm pro dextran bylo odhadnuto na 2 χ 10⁶.

Všechny vzorky byly měřeny při průtokové rychlosti 1 ml/min a každá z analýz byla ukončena během 20 minut.

Příklad 8

Gel byl připraven postupem, popsaným v příkladu 1 při použití kapalné směsi, obsahující 100 g vinylacetátu, 64 g (X = ' 0,4) triallylisokyanurátu, 164 g n-butylacetátu, ''8,2 g polyvinylacetátu se stupněm polymerace asi 500 a 4,1 g 2,2‘-azoblsisobutyronitrilu a reesterifikace byla prováděna při 40 °C po dobu 20 hodin. .__.

Výsledný gel vykazoval Dw 11,8 μτη, q0H

5,2 mmol/g (poměr reesterifikace 0,6), W_R

1,85 g vodly/g suchého gehi a specifickou plochu povrchu 120 m²/g.

Tento gel byl vpraven do kolony podle příkladu 1 a byly prováděny analýzy polyethylenglykolů a dextranů, majících různou molekulovou hmotnost, a proteinů, jako je albumin, ovalbumin a myoglobin. Analýzy potvrdily, že sloučeniny každé skupiny byly eluovány v pořadí od sloučeniny s nejvyšší molekulovou hmotností a regenerace proteinů odpovídala v podstatě 100 %. Mnm pro dextran činila 1 χ 10⁷. Všechny vzorky byly měřeny při průtokové rychlosti 1 ml/min a všechny analýzy byly ukončeny během 20 minut.

Příklad 9

Gel byl připraven postupem podle příkladu 1 pří použití kapalné směsi obsahující 100 g vinylacetátu, 37,5 g (X = 0,28) triallylisokyanurátu, 69 g n-butylacetátu, 69 g dekalinu (směs cis- a trans-isomerů), 4 g polyvinylacetátu se stupněm polymerace asi 500 a 3,4 g 2,2‘-azobisisobutyronitrilu. Reesterifikace byla prováděna při 40 °C po dobu 20 hodin. __

Výsledný gel měl D_w 14,5 g, q0H 8,5 mmol/ /g (poměr reesterifikace 0,74), Wr 1,98 g vody/g suchého gelu a specifickou plochu povrchu 80 m²/g.

Tento gel byl vpraven do . kolony, popsané v příkladu 1 a pomocí naplněné kolony byly prováděny analýzy polyethylenglykolů a dextranů s různými molekulovými hmotnostmi a proteinů včetně y-globulinu, ovalbuminu a myoglobinu ve formě standardních vzorků proteinu.

Analýzy potvrdily, že sloučeniny každé skupiny jsou eluovány v pořadí od sloučeniny s nejvyšší molekulovou hmotností ' a regenerace proteinů odpovídá v podstatě· 100 (,. Miim pro dextran byla 1 χ 106. Všechny vzorky byly měřeny při průtokové rychlosti 1 ml/min a každá z analýz byla ukončena během 20 minut.

Porovnávací příklad 1

Gel byl připraven postupem podle příkladu 1 s tím rozdílem,· že zmýdelnění ' bylo prováděno při 60 °C po dobu 20 hodin v roztoku, obsahujícím 60 g hydroxidu sodného, 100 g vody a 500 ml methanolu. Toto zmýdelnění nahradilo reesterifikaci, popsanou v příkladu 1. __

Výsledný gel měl D_w 9,7 μΐη, q0H 13,5 mmol/g (poměr reesterifikace 0,98) a Wr

1,95 g vody/g suchého gelu.

Podle infračerveného absorpčního spektra gelu zcela vymizela absorpce odpovídající esterové skupině při 1730 cm'¹..

Tento gel byl vpraven do kolony podle příkladu 1 a analýzy byly prováděny za stejných chromatografických podmínek jako v příkladu 1, avšak vzhledem k nedostatečné mechanické · vlastnosti gelu byla .. ztráta tlaku v koloně tak vysoká, že nebylo možno · provádět měření.

Porovnávací příklad 2

Gel byl připraven postupem podle příkladu 1 s tím rozdílem, že reesterifikace byla prováděna při 0 °C po dobu 5 hodin.

Výsledný gel měl D_w 9,0 μΐη, q₀H 3,2 meq/ /g (poměr reesterifikace 0,33) a Wr 1,24 g vody/g suchého gelu.

Gel vykazoval vysokou mechanickou pevnost a rozpouštědlo mohlo procházet kolonou podle příkladu 1, naplněnou tímto gelem při průtokové rychlosti 1 ml/min nebo vyšší, avšak analýza y-globulinu byla neúspěšná v důsledku abnormálně · velkého elučního objemu a rovněž stupeň opětného získání byl nízký.

Porovnávací příklad 3

Homogenní kapalná směs, obsahující 90 gramů vinylacetátu, 4,5 g (X = 0,017) triallylisokyanurátu, 60 g toluenu a 0,9 g· benzoylperoxidu, a 210 g vodného roztoku, obsahujícího 2 % polyvinylalkoholu, s polymeračním stupněm 500 a poměrem zmýdelnění 89 °/o, byla vpravena do llitrové baňky a po dobu 16 hodin byla při 60 °C prováděna polymerace v suspenzi. Výsledné částice polymeru byly odděleny filtrací, promyty vodou a acetonem, vysušeny a potom vystaveny zmýdelnění v kapalné směsi 50 g hydroxidu sodného, 100 g methanolu a 100 g vody při 60 °C po' dobu 30 hodin.

Výsledný gel měl D_w 14,8 μη, q0H 18,2 mmol/g (poměr zmýdelnění 0,90), W_R 3,31 g vody/g suchého gelu a specifickou plochu povrchu 0,1 m²/g. Uvedené výsledky naznačují, že gel v suchém stavu neobsahoval v podstatě žádné póry.

Tento gel byl vpraven do kolony, popsané v příkladu 1 a analýzy byly prováděny za stejných chromatografických podmínek jako v příkladu 1, avšak ztráty tlaku v koloně byly příliš vysoké v důsledku nedostatečné mechanické pevnosti gelu, takže nebylo možno provádět měření.

Porovnávací příklad 4

Gel byl připraven postupem podle příkladu 1 s tím rozdílem, že bylo použito kapalné směsi, obsahující 50 g vinylacetátu, 73 g (X = 0,6) triallylisokyanurátu, 123 g n-butylacetátu a 3 g 2,2‘-azobisiso0ι.ltyronitrilu, místo kapalné směsi podle příkladu 1 a reesterifikace byla prováděna při 40 °C po dobu 20 hodin. __

Výsledný gel měl D_w 9,2 ^m, q0H 3,3 mmol/ /g (poměr reesteriflkace 0,61) a Wr 1,4 g vody/g suchého gelu.

Tento gel byl vpraven do kolony, popsa né v příkladu 1 a byly prováděny analýzy albuminu hovězího séra, ovalbuminu a myoglobinu ve formě standardních vzorků, přičemž tyto látky byly vesměs adsorbovány na gelu při zanedbatelné eluci, takže nebylo možno stanovit vrcholy.

Porovnávací příklad 5

Gel byl připraven postupem podle příkladu 1 při použití kapalné ' směsi, obsahující 100 g vinylacetátu, 11 g (X = 0,1) triallylisokyanurátu, 44 g toluenu a 2,8 g 2,2‘-azobisisobutyroniirilu. __

Výsledný gel měl D_w 10,1 /tm, q0H 12,5' mmol/g (poměr reesterifikace 0,78) a Wr

1,97 g vody/g suchého gelu.

Tento gel byl umístěn v koloně podle příkladu 1 a za stejných chromatografických podmínek jako v příkladu 1 byly prováděny analýzy. Ztráta tlaku v koloně v důsledku nedostatečné mechanické pevnosti gelu však znemožnila měření.

Přestože byl vynález popsán v závislosti na specifickém provedení, bude odborníkovi zřejmé, že je možno aplikovat různé modifikace, aniž by se přesáhl rozsah vynálezu.

Claims

pRedmet vynalezu

Způsob výroby náplně pro rychlou kapalinovou chromatografii 'vyznačující se tím, že se monomerní směs alespoň jedné jednotky vinylesteru karboxylové kyseliny se 2 až 5 atomy uhlíku a alespoň jedné jednotky zesilujícího· monomeru obecného' vzorce ve kterém

Ri, Rz a R3 jsou stejné nebo rozdílné a náleží do skupiny tvořené —CH2—CH = CH2 , —CHz—C=CH a CHz—C=CHž , ........

I

CH3 při molárním poměru vinylesteru karboxylové kyseliny k zesilujícímu monomeru 1: : 0,08 až 1 : 0,22, s výhodou 1: 0,11 až 1: 0,18 nechá zpolymerovat v suspenzi a získaný granulovaný kopolymer se podrobí , reesteriíikaci nebo' zmýdelnění v rozsahu, při kterém reesterifikační poměr nebo poměr zmýdelnění činí 0,4 až 0,8, s výhodou 0,45 až 0,75.