CS226190B2

CS226190B2 - Method of preparing antigen agents for suppressing tooth decay

Info

Publication number: CS226190B2
Application number: CS795761A
Authority: CS
Inventors: Geoffrey Colman; Roy R B Russell
Original assignee: Secr Social Service Brit
Priority date: 1978-09-01
Filing date: 1979-08-24
Publication date: 1984-03-19
Also published as: JPH0118056B2; NO152774C; JPS5569516A; HU181957B; HU190893B; NZ191390A; CA1130726A; NO152774B; NO792822L; EP0009872A1; EP0009872B1; AU5022879A; ZA794413B; DE2963977D1; FI67664C; FI67664B; FI792682A7; US4448768A; US4442085A; AU526799B2

Description

(54) Způsob výroby antigenního přípravku pro potlačování zubního kazu tyrniez se týká antigenních proteinových přípravků pro použití ve vakcinách ke snížení výskytu zubního kazu, způsobu výroby uvedených přípravků a směsí obsahujících uvedené přípravky nebo přísluSné'protilátky.

O zubním kazu se Siroce uznává, že je způsobován kyselinou tvořenou bakteriemi sídlícími na povrchu zubů, přičemž hlavní zúčastněný druh bakterie je znám jako Streptococcus mutans. Tento poznatek vedl k četným pokusům zabránit nebo alespoň snížit výskyt zubního kazu imunnzecí celými buňkami nebo složkami buněk S. mutans. Byly popsány pokusy (Bowen se spoo., British Dennal, Journal, sv, 139, 1975, . strany 45 ež 48, Cohen se. sp^o., British Dental Journal, sv. 147, 1979, strany 9 až 41), při kterých byl výskyt zubního kazu u opi-c snížen imunnzací bu3 celými buňkami nebo, maaeriálem obohaceným buněčnými stěnami usazenými při odstředění dnзintegrovaiýcU buněk. (Imuinizace přípravky s enzymem glukozyltransferázou nevedla k ochraně).

Ačkooiv bylo prokázáno, že taková imunizace vyvolává imunntní odezvu vedoucí ke tvorbě protilátek u .S. muuans, cesta, kterou tyto protilátky dosahuj orálních kolonii, je nejistá. Ochrana byla pozorována po imunnzaci submuuosálně do úst nebo subkutánně do.nohy. Alternativní, leč patrně nákladnější přístup zahrnuje místní aplikaci přípravků s protilátkami, například hovězího mléka, obsah^ícího protilátky proti entigenům S. mutans (britský patentový spis č. 1 505 513).

Zatímco se zdá, že imunizace celými buňkami nebo . preparáty z buněčných stěn S. mutans poskytuje ochranu, může toho být dosaženo rovněž s jistým rizkkem, zejména, když se použije živých celých buněk. 0 streptokocích je známo, že se účastní některých chorob, např. reumatkckých srdečních chorob a imunizace celými buňkami nebo dokonce nechaгaOterZsovilýmk buněčnými složkami může zvyšovat nežádoucí vedlejší účinky. Pro maximální bezpečnost, stejně Jako z důvodů maximální účinnosti, by měla vakcina obsahovat jenom specifický antigen nebo antigeny nezbytné к poskytnutí ochrany proti zubnímu kazu.

Identifikovali jsme nyní dva antigenní proteiny (dále označované antigen A a B), které jsou přítomny ve výše uvedených preparátech z buněčných stěn a které, Jak se zdá, spolupůsobí při ochraně-proti zubnímu kazu.

O antigenu В bylo prokázáno, že stimuluje protilátky, které reagují s lidskou srdeční tkání (Hughes, Pathogenic Streptococci, 1979, str. 222 až 223, vydáno Μ. T. Parkerem, Reedbooks, Ghertsey, Anglie). Možnost, že vakcinace_t preparáty obsahujícími antigen В by mohla indukovat autoimunitní odezvu poškozující srdce, znamená, že antigen B, Jak Je dosud charakterizován, bude ve vakcině nepřijatelný.

Způsobem podle vynálezu se získává antigenní přípravek obsahující antigen A (definovaný dříve), v zásadě prostý dalších antigenních proteinů odvozených od Streptococcus mutans. Vynález poskytuje dále farmakologický přípravek obsahující takový antigenní přípravek nebo jeho protilátky spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem. Název farmakologický přípravek, Jek se zde užíván, zahrnuje jak profylaktická Činidla, například vakcíny a činidla pro použití po infekci ke zmenšení výsledného poškození.

Antigen A Je antigenní protein zůstávající na buněčných stěnách Streptococcus mutans sérotypu c /Jak je popsáno Bratthallem, Odont. Révy 20., 1969, 231 až 243), Jehož příkladem Je kmen NCTC 10449, po extrakci buněčných stěn vodným roztokem 10 g/litr dodecylsíranu sodného (SDS) po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti nebo po dobu 20 minut za varu, který má molekulární hmotnost asi 29 000 i 3 000 a izoelektrický bod 4,1 až 4,5.

V podstatě stejné proteiny byly nalezeny i v Jiných kmenech S. mutans genetické skupiny I (Coykendall, J. Gen. Microbiol. sv. 83, str. 327 až 338) zahrnující sérotypy e a f, například kmeny popsané Russellem RRB, Microbios Letters, sv. 2/1976), str. 55 až 59. Antigenně příbuzné proteiny se nalézají u kmenů Jiných genetických skupin, například sérotypu b.

Vynález zahrnuje takové antigenně příbuzné proteiny a název antigen A^M, používaný v tomto popisu a připojeném předmětu vynálezu, by měl být chápán tak, že Je zahrnuje. Vynález není tedy omezen na některý jednotlivý kmen nebo kmeny.

Antigen A nelze snadno oddělit od buněčných stěn extrahovaných SDS, avšak imunizace králíků extrahovanými buněčnými stěnami poskytuje antiséra proti dvěma proteinům (nazvané antigeny A a B), které mohou být detegovány a odděleny z extraktů celých buněk nebo z filtrátů kultur prostých buněk. Antigen se takto vhodně vyrábí z filtrátů kultury nebo z celkových kultur po rozrušení buněk.

Podle dalšího vyýznaku vynálezu způsob pro přípravu antigenu A (popsaného výše) zahrnuje pěstování bakterií druhu Streptococcus mutans ve vhodném kultivačním médiu, přičemž se odstraňují alespoň buněčné stěny ze získané kultury, aby byl získán roztok proteinu a z uvedenéhď roztoku proteinu se získává antigen A.

Kultivačním médiem může být kterékoliv obvyklé médium pro S. mutans, například Todd-Hewittova Živná půda (Todd E. W. a Hewitt L. F., J. Path. and Bacteriol., 35. 1932, str· 973 ež 974), trypton/kvasničný extrakt nebo chemicky definované médium. Pro snadné následující čištění Je dávána přednost chemicky definovanému médiu. Antigen A se uvolňuje do růstového média ve všech stadiích kultury. Buňky Jsou izolovány výhodně v rané stacionární fázi (typicky 15 až 25 hodin při teplotě 37 °C). Buňky mohou růst rovněž v kontinuální kultuře.

Bílkovinný roztok může obsahovat pouze filtrát kultury získaný odstraněním celých buněk nebo buněčný extrakt prostý buněčných stěn a fragmentů nebo může být jejich směsí získávaných desintegrací buněk celkové kultury a následiým odstraněním buněčných stěn a fragmentů. Buněčné stěny lze oddtranit bu3 jako celé buňky nebo fragmenty po desintegraci obvyklým způsobem, jako například odstředěním nebo filtrací.

Antigen A se odděluje z bílkovirrného roztoku postupem, který zahrnuje afinitní chromaaoorrafi na protilátkách proti entigenu A. Tyto protilátky mají speecfiéitu pro jeden nebo více antigenů, jimiž jsou bu3

I. antigenní bílkoviny o molekulové hmoonosti asi 29 000 a isoelektricéém bodě

4,1 ež 4,5, které zůstávaaí na buněčných stěnách mikroorganismů Streptococcus mutans genetického typu I po extrakci vroucím roztokem 10 g/litr dodaccl-síranu sodného ve vodě po dobu 20 minut, nebo

II. bílkoviny, které dávaaí zkříženou reakci s antigenními bílkovinami skupiny I.

Protil^ítk^í^mL mohou být typicky ^иис^сЬН^ G (IgG-ppooilátky vytvořené u vhodného zvířete, například u králíka, a mohou být imobilizovány na obvyklém n^s^i^<^:i_s například zesítěné agaróze po aktivaci bromkyanem.

Před chrsmojosgaaií může být do postupu oddělování zahrnuto srážením síronem amonným. Toto srážení síranem amonným lze provádět bu3 v jednom stupni, s výhodou · při 65% nasycení, je vSak výhodné provádět je ve dvou stupních při 45% a 65% nasycení.

Sraženina z prvého stupně obsahuje pouze meeiSzí část antigenu A, zatímco sraženina z druhého stupně obsahuje převážnou · část antigenů A a menší podíl ostatních proteinů, zejména antigenů B. Antigen A lze oddálit chromoaograficky bu3 pouze ze sraženiny z druhého stupně, nebo z obou sraženin, v závislosti na ekonomice procesu.

Ačkkoi výše uvedené srážení je výhodným znakem způsobu podle vynálezu, není však znakem podstatrým, jelikož filtráty kultury, buněčný extrakt nebo jejich směs mohou být použity přímo? do prostředí pro afinitní chrsmoaosг^rjfi♦

Čištěný přípravek antigenů A lze zpracovat ve vakcinu s obvyklými farmaceuticky přijatlnými nosiči včetně pomoc iých látek (například hydroxidu hlinitého), stabilizátorů a iakCeriostatiC. Vakcína může obsahovat protein z jednoho nebo více kmenů S. mutans a lze ji podávat člověku nebo jným savcům subkutánně, intramuskulárně, intravenózně nebo subm^u^koz^l^l^ě, typicky v dávkách 1 až 50, zejména asi 10 /ig na kg tělesné hmoSoosti.

Aby byle vyvolána dostatečná odezva protilátek, může být zapotřebí více injekcí. Ocřhraiyr lze íooíííO im^r^n.zací rovněž orální cestou, například požitím tobolky obsehtufcí antigen.

Podle dalšího význaku vynálezu přípravek ke prevenci nebo kontrole zubního kazu u savců obsahuje protilátky proti antigenů A ve farmaceuticky přijate0n0o vehikulu. Preparát může mít formu injekcí nebo může to být ksInoooict vhodná pro lokální aplikaci, například jako zubní pasta nebo ústní voda. Může obsahovat jenom protilátky proti antigenů A nebo může obsahovat směs protilátek proti jiým antigenům.

Protilátky lze připravit obvyklými způsoby vstřiknutím antigenního přípravku S. mutans, včetně antigenů A, vhodným zvířatům, například kravám nebo králkům. Vhodné antigenní přípravky obsahi-uí zejména SDS prosté buněčné stěny a čištěný antigen A připravený výše popsaným způsobem.

Předpoklásá se, že účinek všech produktů podle vynálezu je způsoben antigenem A obsaženým bučí v podaném produktu nebo vyvolaném imunitní odezvou subjektu. Účinnost těchto protilátek při ochraně před zubním kazem není zcela jasná, avěak takové pochopení není podstatné při provádění způsobu ·podle vynálezu, *

Je možné, že ovlivňují metabolismus buněk bakterií, přičemž inhibují tvorbu glukanu nebo kyseliny. Mělo by však být jasné, že vynález není žádným způsobem omezován specifickou teorií mechanismu účinků makeriálů. Podobně vynález není omezován ne specifické kmeny Streptococcus mutans uvedené vpředu nebo užité v následujících příkladech.

Typické způsoby a produkty podle vynálezu budou nyní popsány pomocí příkladů s odkazem na připojené výkresy, na kterých obr. 1 znázorňuje · IgG odezvy imunizovaných (křivka a) a kontrolních zvířet (křivka b) na antigen A. Obr. 2 znázorňuje IgG odezvy na antigen A u jediného zvířete.

Výroba·antiséra

Bylo použito Streptococcus mutens dobře známého kméne Ingbbitt. Kmen byl popsán B. Krassem; Archs, Oral Bioo.; 11 . str. 429 až 436 a je k^si^kován jako genetický typ 1 systémem СоукепбеЛ (J. Gen. Miirobbol. 83. 1974, 327 až 338) a sérotyp £ podle Bratthalla (Odont. Révy ·.20. 1969, 231 až 243) e uložen· v NCIB, Aberdeen, Scotland jako NCIB..... .

Baakerie rostly v Todd-Hewitově živném prostředí (popsaném E. W. Toddem a L. F. Heni-ttem, J.. P9ht. and Baaceriol. sv. 35, 1932, str. 973 až 974), až bylo dosaženo sta- ♦ cionární fáze (16 hodin).

Buňky byly potom izolovány odstředěním a suspendovány v roztoku sodné soli dodecylsíranu (SDS) jako solublizeačním pufru La^rnmiho (Nátuře 227, 19’70, str. 680 až 685) ve vroucí vodní lázni po dobu 20 minut. Buňky byly potom promyty vodou pomocí odstředění, lyofiizoovány a resuspendovány znovu do vody v koncehnraci 10 m&/ml.

Králík byl imunizován 1 ml těchto SDS extrahovaných buněk a 0,1 ml edjuvans hydroxidu hlinitého intramuskulární injekcí v 0,21. a 48. den. Padesátého pátého dne byl králík vykrvácen po tarSiálií punkci.

Podobných výsledků bylo·dosaženo, když byly buňky extrahovány vodným roztokem 10 g na litr SDS ze varu po dobu 20 minut nebo po dobu 1 hodiny při teplotě místrn^si.

Chearkterizkce antigenů A a B

Antisérum připravené výše popsaným způsobem bylo zkoušeno pomocí imunodSfúzr proti buněčným složaám Ingbbrtt (ve formě extraktu celých buněk zpracovaného ultrazvukem), stejně jako proteinů z filtrátu kultury Ingbbrtt, který byl koncentrován srážením síranem amonným. Byly pozorovány dvě čáry precipitim a ty byly antigenně identické s produktem zpracovaným u^az^nkem e supernkerntem.

Působení nespecifického proteolytického enzymu pronázy (Sigma CHemmial Conmp) na kterýkoliv anti-genní přípravek nevedlo k následnému vzniku . ^^ecipitn^c^i^ých čar, atθzujíeíeh na proteinový charakter anti^ená.

Když bylo kntiséuué zkoušeno proti buňkám zpracovaným ultazvunkem e proti filtrátu kultury citlivější technikou iéunioeθrtrofortzy, . mohly by být detekovány jenom dvě precipitinové reakce mtigein^pro telátka.

Stejné dva antigeny by mohly být detegovány, když byl jiný kmen sérotypu dostupný v Neaional Collection of Type Cultures, CoOindale, Annlie jako NCTC 10449 extrahován a poulit k přípravě antiséra výše popsaným způsobem.

Informace o fyzikálních vlastnostech obou ' antigenů byla získána zkříženou elektronezou, ve které prvým stadiem separace bylo izoelektrické zaostřování v pólyekrylamidovém gelu (oddělení proteinů na základě rozdílů náboje) nebo pomocí elektroforézy na SDS-polyakrylamidovém gelu (oddělení proteinů na.základě jejich mooeku!ární hmotnět!) .

Získané výsledky ukezzuí, že antigen A má izoelektrický bod 4,3 a шоикпЫт! hmotnost 29 000 ± 3 000, zatímco antigen B má izulektr^i^ť^ký bod 5,4 e m^o<^l^i^]^(^rní hmoonoot blízkou 200 000. Přesnější způsob vyuuivající gradientově elektroforózy na SDSspooyakrylamidovém gelu potvrzuje hodnotu 29 000 pro antigen A a poskytl hodnotu 190 000 pro antigen B.

Kontrolní proteiny užité jako standardy m^o<^l^i^]^l^rn:í hmoonooti byly myooin králíka 200 000, beta-galaktosidáza 116 000, fosforyláza A 94 000, hovězí sérový albumin 68 000, avalbumin 43 000, chynoOrypsitoglO A 25 700· Hocdnota pro B je prozatímní, protože diferenční barvicí metody ukazuj, že B obsahuje některé uhlotydráty a glukoproteiny, ό nichž je známo, že vykazuj annašání migraci při gelové elektroforéze·

Antisérum proti SDS-extrahovaným buňkám kmene Inshritt bylo užito k důkazu, že antigeny totožné s A a B byly produkovány dalšími Šesti kmeny sérotypu c /včetně FW293, C67vl GS-5 a OMlTpo, popsané RuseHem RRB, Microbios Seeters, sv· 2 (1976), str. 55 až 59) a rovněž reprezentativní kmeny sérotypů e, (kmen P4) a f (Kmen 151).

Poslední dva sérotypy jsou ve stejné genetické skupině jeko sérotyp c (tj. v genetické skupině I C^o^k^ee^nda]., 1977, Int. J. Syst. Baaceriol. 27. str. 26 až 30) a bylo prokázáno, že jsou antigenně blízce příbuzné (Brrathall se sp., J. dent. Res. 55A, 1976, str. 60 až 64; Perch se spol. Acta path. о1сгоЬГо1, scand. Sec. B32, 1974, str. 357 až 370) a ooCÍ podobné složení proteinů (Ruussll, Microbios Letters 2, 1976, str. 55 až 59).

Kmeny sérotypu b obsahuj antigen zkříženě reagující s antigenem A, zatímco . antigeny reagujcí zkříženě s antigenem B byly pozorovány v sérotypech ja, b a g a kmenech S- san^i^i-S.

Příprava čištěného anti^^^^ A

Po detegování proteinů A a B ve filtrátech kultury ukázaly delší pokusy, že oba antigeny jsou vylučovány během růstového cyklu bu5 v živném prostředí Todd-HHeittově, tr^ypton/kvasničném extraktu nebo chemicky definovaném (CD) mediu Jendy a Kuramitsu (Infect. Immun. 14. 1976, str. 191 až 202). Protože CD medium obsahuje minimum složek interferujících snadno s čistícími operacemi, bylo zvoleno k pioužií*

S. mutans kmene ^gb^tt rostl v CD médiu do raně stacionární fáze a buňky byly odstraněny odstředěním následovaiým filtrací přes skleněné vlákno. Je-li žádoucí příprava čistého anti^g^^^ů A, filtrát by měl projt chroootografic]Qm sloupcem obsahujícím nerozpustný polymer glukózy imnan a oolyakiylaoidlvý gel v kuličkách (BioCel P2), připravený způsobem popsaným McCabem a Smithem (Infe<^t. Immun. 1977, 16: 760 až 765) a cílem odstraní glukossltгθtsferázové enzymy, které maaí jinak sklon čistit se spolu s antigenem B.

Pevný síran amonný byl zvolna přidán do vzniku 45% nasycenooti a sraženina, která se utvořila přes noc při teplotě 4 °C, byla Izolována filtrací. Předběžné pokusy ukázaly, že anti^gen B se srážel maximálně při 45% nasycení síranem amonným, zatímco antigeo A se srážel maximálně 65%· Byl tudíž přidáván další síran amonný, aby filtrát kultury dosáhl 65 % nasycenooti a sraženina byla znovu izolována.

Obě 'frakce byly dlelyzovány proti 50 mta Tris HC1 pufru (hodnota pH,7,5), kteréhožto pufru bylo používáno během čištění, před dalším stupněm, kterým byla chromatogrrfie na DEAE zesítěném dextranu (DEAE Sephsdex A25 - obchodní značka).

Vzorky byly naneseny na oddělené kolony, které byly předem ekvilibrovány Tris-pufrem. Kolony byly eluovány průchodem jednoho objemu Tris-pufru před aplikací lineárního gradientu od 0 do 0,3 M chloridu sodného v Tris-pufru. Po sobě jdoucí frakce byly shromažďovány a analyzovány elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu a pomocí raketové imunnelektroforézy proti, antiséru připravnnému ' proti SDS-extrahovaným buňkám.

Antigen B (z 45% síranu amonného) se eluuje'přibližně 0,8 M chloridem sodným, zatímco antigen A se eluuje přibližně 0,13 M chloridem sodným. V každém případě entigenní proteiny byly hodnoceny,jako z 90 % čisté. Frakce obsahující antigen byly spojeny, dialyzovány proti Tris-pufru a koncentrovány ultrafiltrací. Každý parciálně čištěrý antigen byl potom nanesen ne sloupec agerózového gelu (Sepharose CIL·—óB—obchodiní značka) a eluován' Tris-pufrem. Frakce byly znovu shromážděny a analyzováno jejich složení proteinů a anti-genů.

Výše uvedený způsob vedl k přípravkům proteinů A a B, které byly čisté na základě kritérií elektroforézy na SDSspolytVrylθmidovém gelu a isolektrcekého zostřování ne polyakrylaamidovém gelu.

Když tyto přípravky antigenů A a B byly vstříknuty s adjuvans králkkům a následoval imunizační postup shodný s tím, který je popsán vpředu pro SUSsextrehované buňky, vznikala nespecifická séra, která, když byla zkoušena proti surovým antigerrním příprvvkům pomocí srážení gelové techniky, srážela jenom homooogický antigen.

Neepeeifická antiséra proti antigenům A a B lze pouuít pro imunooorbetní efinitní chromatograficVé čištění antigenů. Při typické přípravě, frakce séra imunoglobulinu G byla kopulována ne ' zesítšnou agarózu (Crn^-aktivovaná Sepharosa, Pharmmaia) způsoby doporučenými výrobcem. Konnentrovaný filtrát kultury S. mutans kmene Ingbbrtt v 0,05 M Tris/ , /HC1 pufru o hodnotě pH 7,5, obsahujícího 1 % Tritonu X-100, byl nanesen na sloupec kolony.

Sloupec byl potom promován několika objemy Tris-pufru před elucí Tris-pufrem obsahujícím buň 3 M rhodanid sodný nebo 0,1 M glycin/HCl pufr o hodnotě pH 2,8 (ačkoliv jiná eluční činidla mohou být rovněž dootečnujcc). Způsob poskytuje čisté přípravky požadovaného anti-genů. Kdyby docházelo k nějakému unikání IgG ze sloupce kolony, může být oddělen snadno od aotigeoů již popsanou iont©měničovou chrommtoglaafí.

Složení aminoOksoeio afinitně čištěného an^enů bylo stanoveno po hydrolýze po dobu 48 hodin při teplotě 105 °C v 6 N kyselině chlorovodíkové a je uvedeno v tabulce 1.

T a b u 1 k a— 1

Složení aminokyselin proteinových hydrolyzátů

Zbytky , nn 1 000 celkových zbytků

	Antigen A	Antigen B
Kyselina aspnregová	101	103
Tlweonin	56	60
Serin	91	61
Kyselina glutamová	106	11 1
Prolin	65	44
Glycin	190	212
Alenin	89	1 17
Cy3tin	-	-
Valin	53	58
MeUiionin	-	-
Isoleucin	38	38
Leucin	61	53
FenySalanin	28	25 л
Tyrosin	-	10
Histidin	50	18
Lysin	46	64 ‘
Arginin	27	26 ‘
	-	4

Hodnocení antigenních a ochranných, vlastností

Antigeny A a B jsou exponovány na povrchu bakterií e působí jako imunogeny. Pokusy zahrnující imunizaci několika tuctů králíků a opic ukázaly, že odezvy protilátek na entigeny ·A a B jsou zřetelně silnější než jiné antigeny. Tento účinek je dokonce ještě ^ζη^αη^!!, když jsou zvířata imunizována přípravky obohacenými buněčnými stěnami. Jak je popsáno vpředu, SDSsextrahovnné stěny uvolňuuí protilátky jenom proti A a B, zatímco stěny podrobené intenzívni extrakci poskytovaly ještě m^o^uur^n^jŽ^:í odezvy na A в B, zatímco u jirých antigenů byly pozorovány slaběí odezvy.

Protilátky lze detegovat ·obvyklými způsoby zkřížené imuuюoleltroforézy nebo reverzní raketové elektroforézy.

Kvannitetivní hodnocení odezvy protilátek bylo prováděno enzymovou imunooorpční zkouěkou (E1ISA), následovanou technikou nn mik:rodlekácU podle VoUem, Bidweein n Bantlettn · (1977, Floeli.ne Piubications). Plastikové mikyoOitračií misky byly potaženy imunoafinitně čiStěrými antigeny A n B v УonceniracícU přibližně 1 /xg/ml.

Zkouška mnnžžtví protilátky opic, která vázala B^igen, byla docílena inkubací s anti-lidkým IgG konjugovaným nn alkalickou fosfatézu (Son Whtley Ltd·). Výsledky byly vyjádřeny jako bod ekvivalence (tj. konečná hranice ředění, která vykazuje konečné zbarvenO, nebo měřením absorbance při 405 nm získané od · vzorku séra příslušného ředění.

^Μοβο^ί vlastnoo ti celých buněk

Někkoik pokusů, při nichž byly úspěšně imunizovány opice celými buňkami S. muuans, bylo popsáno, jak je uvedeno vpředu (Bowen se sp., Brit. Sent. J. 1975 n Cohen se sp. Brit. Sent. J. 1979), přičemž redukce zubního kazu je 50 % nebo více. V rlprezeitatavnm pokuse ' 4 pokusná a 2 kontrolní zvířata byla léčena obdobně usmrcenými celými buňkami (skupina 14 Cohena se spi. British Dental Journal sv. 147, 1979, str. 9 až 14).. Injekce byly podávány O,, 2., 5., 6., 12. e 18. měsíc. Průměrné hladiny protilátek · (Igp) u pokusné a kontrolní skupiny jsou uvedeny na obr. 1 .

Hladina protilátek proti antigenu A po 12 měsících byla nejméně 30x vySSÍ- ve srovnání s kontrolami, ačkoliv tato hladina klesá mezi vrcholy. Misí být zdůrazněno, že je nepravděpodobné, aby pro ochranu byly zásadně nutné tak četné injekce, avšak tento aspekt vynálezu nebyl zkoumán.

Čtyři roky po začátku pokusu měla kontrolní zvířata průměrný počet p£1ti kazových poškození na stálých zubech, zatímco imunizovaná zvířata měla průměrně dvě poškození.

Z těchto výsledků lze vidět zřejmou korelaci mezi hladinami antigenů A a ochranou před zubním kazem. Protilátky proti antigenu A se vya!k^^uj pouze zřídka a v nízkých hladinách u neimunizovaných subjektů. Taková přirozená protilátka proti antigenu B byla rovněž pozorována v některých případech.

Není známo, kdy těchto protilátek přibývánebo kdy jsou způsobeny antigenní stimuuací pomoci S. mutans na zubech, systémovou.Infekcí pomocí S. mutans, nebo zkříženou reaktivitou antigenů jirých bakkeeií, vůči nimž má zvíře imun^ní odezvu.

V jiném pokuse byle imunizována skupina osmi opic, celými buňkami a hydroxidem . hlinitým jako adjuvans subkutánní injekcí do nohy (skupina 11, Cohen se sp., ' Brrtish Jednal, uvedený vpředu) a srovnána s osmi kontrolními zvířaty. V této skupině byly hladiny protilátky proti antigenu A u všech kontrolních zvířat zvýšeny, přičemž průměrný titr je 1/520.

Je třeba upozzonnt na to, že v důsledku variací při způsobu není možné srovnávat titrační hodnoty uvedené zde u různých skupin. Průměrné titrační hodnoty u zvířat imunizovaných celými bakteriemi byly však, 6 měsíců po injekci, 1/2830-více než pětinásobek hladiny u korntO!. Protilátky proti antigenu B byly rovněž příoomny u imunizovaných zvířat. 55% snížení kazu bylo pozorováno mezi imunizovanými a kontrolními zvířaty.

Imunogewií vlastnosti porušených buněčných stěn

O imunnzaci porušenými buněčnými stěnami kmene Ingbbrtt popsané Bowenem se sp..(British Dental Journal 1975, str. 45 až 58) bylo prokázáno, že poskkttijí ochranu proti následnému čelenžování tímto kmenem. Imunizace try panno varými buněčnými stěnami neposkytuje ochranu, což dokazuue,že protein se účastní ochranného procesu.

Séra byla shromážděna od čtyř experimeenálních opic imunizovaných příprvvkem z buněčných stěn kmene Ingbbrtt a čelenžovány steným kmenem, který je popsán pro skupinu C Bowenem se sp. Podobně bylo působeno bez imunizace ne pět kontrolních opic.

Kontrolní zvířata měla hodnoty protilátky proti antigenu A <1/20 (3 zvířata),

1/80 (1 zvíře) a '1/1 280 (1 zvvře), zatímco imunizovaná a chráněná zvířata měla titrační hodnoty mezi 1/80 a 1/640 s průměrnou hodnotou 1/220. Tyto hodnoty byly získány ze vzorků séra odebíraných 20 měsíců po poslední injekci. Hladiny by měly být pochooPteltS. vyšší právě po vrcholu.

Pět roků po začátku pokusu byl celkový počet zubních kazů u čtyř pokusných zvířat 4. U pěti kontrolních zvířat bylo 64 poškozeno a toto číslo představovalo opačnou relaci k hladině protilátek v séru, se dvěma kontrolními zvířaty, která nevykazovala jakoukoliv protilátkovou odezvu ukazujcí vyv^ejcí se kaz.

Devět let po začátku pokusu existuje 5 přežívajících zvvřat, dvě zvířata z imunizované skupiny a 2 kontroly uhynuly. Tři přežívájící kontrolní zvířata měla všechna ustupující až pribývvJící kaz, zaujímající 56 , 69 e 93 napadeného povrchu. Jedno m.alé poškození se vyvinulo na zubu jednoho imunizovaného zvířete, zatímco ostatní zůstala bez kazu.

Imunogenní vlastnosti čistého antigenu A

Z výše uvedených výsledků je jasné, že antigeny A a B vstřiknuté jako složky celých bakterií nebo buněčných stěn bakterií jsou schopny vyvvoat imunntní odezvu, v nepřítomnooti adjuvans (skupina G) nebo po přidání hydroxidu hlinitého jako adjuvans (skupina 11). Imunizace čistými antigeny však vyžaduje pro rychlou a trvalou odezvu příoomnost adjuvans. Odezva jedné opice (asi o 5 kg hmoonnosi) imunizované 50 antigenu A (připraveného, jak Je popsáno vpředu_ýza pouuití srážení sírnnem amonným) s hydroxidem hlinitým je uvedeno na obr. 2.

Claims

PŘEDMĚT· VYNÁLEZU

1. Způsob výroby antigenního přípravku pro potlačování zubního kazu u savců, kultivací druhu Streptococcus mutans v živném prostředí pro získání kultury, přičemž se z kultury odstraňují alespoň buněčné stěny pro získání zbývvaícího bílkovinného roztoku, který je filtrteem kultury, buněčným extraktem nebo kombinaci jich obou, a požadovaný antigenní přípravek se odddlí od bílkovinného roztoku, vyznnaunící se tím, že antigenní přípravek se oddělí od bílkovinného roztoku separačním postupem zahrnujícím afinitni chrsmoanortaii, zahrnuící uvádění bílkovinného roztoku do styku s imobblizovenou protilátkou, vyrvání nežádoucích meaeriálů z imobblizované protilátky e eluování požadovaného antigenního přípravku z imobblizované protilátky, přičemž imobblizované protilátka je charakterizována specificttou pro jeden nebo více entigenů, které jsou bu5 antigenními bílkovinami o mooekulové hmoonnoti asi 29 000 a isselektrCtk0o bodu 4,1 až 4,5 a které zůstávaa! na buněčných stěnách Streptococcus mutans genetického typu I po extrakci vroucím roztokem 10 glitr dodecclsíranu sodného ve vodě po dobu 20 minut, nebo jsou bílkovinami, které dávají zkříženou reakci s uvedenými antigenními bílkovinami.
2. Způsob podle bodu 1, vyznnαunící se tím, že před efinitní chгom8t(>bгtaii se provádí oddělování přidáním síranu amonného k bílkovnnéému roztoku do 45 až 65% nasycení, přičemž pevný poddl se shromažSuje a rozpou^í za vzniku druhého bílkovinného roztoku vhodného· pro uvádění do styku s imobilizovanou prstilátksn.
3. Způsob podle bodu 2, vyznač^ící se tím, že před afinitní chromatnbrtαií se provádí oddělování přidáním síranu amo orného k roztoku bílkovin až do asi 45% nasycení, odstraní se prvý pevný poddl, k bílkovinnému roztoku se přidá síran amonný pro vysrážení druhého pevného podílu, druhý pevný poddl se shromažďuje a pak se rozpautí pro získání druhého bílkovinného roztoku · vhodného pro uvádění do styku s imobilizovanou bílkovinou.