CS226190B2 - Method of preparing antigen agents for suppressing tooth decay - Google Patents
Method of preparing antigen agents for suppressing tooth decay Download PDFInfo
- Publication number
- CS226190B2 CS226190B2 CS795761A CS576179A CS226190B2 CS 226190 B2 CS226190 B2 CS 226190B2 CS 795761 A CS795761 A CS 795761A CS 576179 A CS576179 A CS 576179A CS 226190 B2 CS226190 B2 CS 226190B2
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- antigen
- protein solution
- antigenic
- protein
- culture
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 45
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 45
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 45
- 208000002925 dental caries Diseases 0.000 title claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 20
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 title description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 claims abstract description 20
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims abstract description 12
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 10
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 16
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 2
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 claims 1
- DJPVONPSNBLDSU-UHFFFAOYSA-A [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O DJPVONPSNBLDSU-UHFFFAOYSA-A 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 101710098119 Chaperonin GroEL 2 Proteins 0.000 abstract description 27
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 10
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 abstract description 7
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 abstract description 3
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 abstract description 2
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 abstract description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract 1
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 abstract 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 15
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 15
- 101000588258 Taenia solium Paramyosin Proteins 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 9
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 8
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N serine Chemical compound OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000209020 Cornus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- 108010055629 Glucosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000000340 Glucosyltransferases Human genes 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108010065084 Phosphorylase a Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 241001522306 Serinus serinus Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000122143 Streptococcus mutans serotype C Species 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000002324 mouth wash Substances 0.000 description 1
- 229940051866 mouthwash Drugs 0.000 description 1
- 108010050062 mutacin GS-5 Proteins 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000008196 pharmacological composition Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000009979 protective mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 208000004124 rheumatic heart disease Diseases 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229940034610 toothpaste Drugs 0.000 description 1
- 239000000606 toothpaste Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q11/00—Preparations for care of the teeth, of the oral cavity or of dentures; Dentifrices, e.g. toothpastes; Mouth rinses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
- A61K39/092—Streptococcus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
- A61K8/99—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from microorganisms other than algae or fungi, e.g. protozoa or bacteria
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
- Y10S530/825—Bacteria
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Birds (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Dental Preparations (AREA)
Description
(54) Způsob výroby antigenního přípravku pro potlačování zubního kazu tyrniez se týká antigenních proteinových přípravků pro použití ve vakcinách ke snížení výskytu zubního kazu, způsobu výroby uvedených přípravků a směsí obsahujících uvedené přípravky nebo přísluSné'protilátky.
O zubním kazu se Siroce uznává, že je způsobován kyselinou tvořenou bakteriemi sídlícími na povrchu zubů, přičemž hlavní zúčastněný druh bakterie je znám jako Streptococcus mutans. Tento poznatek vedl k četným pokusům zabránit nebo alespoň snížit výskyt zubního kazu imunnzecí celými buňkami nebo složkami buněk S. mutans. Byly popsány pokusy (Bowen se spoo., British Dennal, Journal, sv, 139, 1975, . strany 45 ež 48, Cohen se. sp^o., British Dental Journal, sv. 147, 1979, strany 9 až 41), při kterých byl výskyt zubního kazu u opi-c snížen imunnzací bu3 celými buňkami nebo, maaeriálem obohaceným buněčnými stěnami usazenými při odstředění dnзintegrovaiýcU buněk. (Imuinizace přípravky s enzymem glukozyltransferázou nevedla k ochraně).
Ačkooiv bylo prokázáno, že taková imunizace vyvolává imunntní odezvu vedoucí ke tvorbě protilátek u .S. muuans, cesta, kterou tyto protilátky dosahuj orálních kolonii, je nejistá. Ochrana byla pozorována po imunnzaci submuuosálně do úst nebo subkutánně do.nohy. Alternativní, leč patrně nákladnější přístup zahrnuje místní aplikaci přípravků s protilátkami, například hovězího mléka, obsah^ícího protilátky proti entigenům S. mutans (britský patentový spis č. 1 505 513).
Zatímco se zdá, že imunizace celými buňkami nebo . preparáty z buněčných stěn S. mutans poskytuje ochranu, může toho být dosaženo rovněž s jistým rizkkem, zejména, když se použije živých celých buněk. 0 streptokocích je známo, že se účastní některých chorob, např. reumatkckých srdečních chorob a imunizace celými buňkami nebo dokonce nechaгaOterZsovilýmk buněčnými složkami může zvyšovat nežádoucí vedlejší účinky. Pro maximální bezpečnost, stejně Jako z důvodů maximální účinnosti, by měla vakcina obsahovat jenom specifický antigen nebo antigeny nezbytné к poskytnutí ochrany proti zubnímu kazu.
Identifikovali jsme nyní dva antigenní proteiny (dále označované antigen A a B), které jsou přítomny ve výše uvedených preparátech z buněčných stěn a které, Jak se zdá, spolupůsobí při ochraně-proti zubnímu kazu.
O antigenu В bylo prokázáno, že stimuluje protilátky, které reagují s lidskou srdeční tkání (Hughes, Pathogenic Streptococci, 1979, str. 222 až 223, vydáno Μ. T. Parkerem, Reedbooks, Ghertsey, Anglie). Možnost, že vakcinacet preparáty obsahujícími antigen В by mohla indukovat autoimunitní odezvu poškozující srdce, znamená, že antigen B, Jak Je dosud charakterizován, bude ve vakcině nepřijatelný.
Způsobem podle vynálezu se získává antigenní přípravek obsahující antigen A (definovaný dříve), v zásadě prostý dalších antigenních proteinů odvozených od Streptococcus mutans. Vynález poskytuje dále farmakologický přípravek obsahující takový antigenní přípravek nebo jeho protilátky spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem. Název farmakologický přípravek, Jek se zde užíván, zahrnuje jak profylaktická Činidla, například vakcíny a činidla pro použití po infekci ke zmenšení výsledného poškození.
Antigen A Je antigenní protein zůstávající na buněčných stěnách Streptococcus mutans sérotypu c /Jak je popsáno Bratthallem, Odont. Révy 20., 1969, 231 až 243), Jehož příkladem Je kmen NCTC 10449, po extrakci buněčných stěn vodným roztokem 10 g/litr dodecylsíranu sodného (SDS) po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti nebo po dobu 20 minut za varu, který má molekulární hmotnost asi 29 000 i 3 000 a izoelektrický bod 4,1 až 4,5.
V podstatě stejné proteiny byly nalezeny i v Jiných kmenech S. mutans genetické skupiny I (Coykendall, J. Gen. Microbiol. sv. 83, str. 327 až 338) zahrnující sérotypy e a f, například kmeny popsané Russellem RRB, Microbios Letters, sv. 2/1976), str. 55 až 59. Antigenně příbuzné proteiny se nalézají u kmenů Jiných genetických skupin, například sérotypu b.
Vynález zahrnuje takové antigenně příbuzné proteiny a název antigen AM, používaný v tomto popisu a připojeném předmětu vynálezu, by měl být chápán tak, že Je zahrnuje. Vynález není tedy omezen na některý jednotlivý kmen nebo kmeny.
Antigen A nelze snadno oddělit od buněčných stěn extrahovaných SDS, avšak imunizace králíků extrahovanými buněčnými stěnami poskytuje antiséra proti dvěma proteinům (nazvané antigeny A a B), které mohou být detegovány a odděleny z extraktů celých buněk nebo z filtrátů kultur prostých buněk. Antigen se takto vhodně vyrábí z filtrátů kultury nebo z celkových kultur po rozrušení buněk.
Podle dalšího vyýznaku vynálezu způsob pro přípravu antigenu A (popsaného výše) zahrnuje pěstování bakterií druhu Streptococcus mutans ve vhodném kultivačním médiu, přičemž se odstraňují alespoň buněčné stěny ze získané kultury, aby byl získán roztok proteinu a z uvedenéhď roztoku proteinu se získává antigen A.
Kultivačním médiem může být kterékoliv obvyklé médium pro S. mutans, například Todd-Hewittova Živná půda (Todd E. W. a Hewitt L. F., J. Path. and Bacteriol., 35. 1932, str· 973 ež 974), trypton/kvasničný extrakt nebo chemicky definované médium. Pro snadné následující čištění Je dávána přednost chemicky definovanému médiu. Antigen A se uvolňuje do růstového média ve všech stadiích kultury. Buňky Jsou izolovány výhodně v rané stacionární fázi (typicky 15 až 25 hodin při teplotě 37 °C). Buňky mohou růst rovněž v kontinuální kultuře.
Bílkovinný roztok může obsahovat pouze filtrát kultury získaný odstraněním celých buněk nebo buněčný extrakt prostý buněčných stěn a fragmentů nebo může být jejich směsí získávaných desintegrací buněk celkové kultury a následiým odstraněním buněčných stěn a fragmentů. Buněčné stěny lze oddtranit bu3 jako celé buňky nebo fragmenty po desintegraci obvyklým způsobem, jako například odstředěním nebo filtrací.
Antigen A se odděluje z bílkovirrného roztoku postupem, který zahrnuje afinitní chromaaoorrafi na protilátkách proti entigenu A. Tyto protilátky mají speecfiéitu pro jeden nebo více antigenů, jimiž jsou bu3
I. antigenní bílkoviny o molekulové hmoonosti asi 29 000 a isoelektricéém bodě
4,1 ež 4,5, které zůstávaaí na buněčných stěnách mikroorganismů Streptococcus mutans genetického typu I po extrakci vroucím roztokem 10 g/litr dodaccl-síranu sodného ve vodě po dobu 20 minut, nebo
II. bílkoviny, které dávaaí zkříženou reakci s antigenními bílkovinami skupiny I.
Protil^ítk^í^mL mohou být typicky ^иис^сЬН^ G (IgG-ppooilátky vytvořené u vhodného zvířete, například u králíka, a mohou být imobilizovány na obvyklém n^s^i^<^:is například zesítěné agaróze po aktivaci bromkyanem.
Před chrsmojosgaaií může být do postupu oddělování zahrnuto srážením síronem amonným. Toto srážení síranem amonným lze provádět bu3 v jednom stupni, s výhodou · při 65% nasycení, je vSak výhodné provádět je ve dvou stupních při 45% a 65% nasycení.
Sraženina z prvého stupně obsahuje pouze meeiSzí část antigenu A, zatímco sraženina z druhého stupně obsahuje převážnou · část antigenů A a menší podíl ostatních proteinů, zejména antigenů B. Antigen A lze oddálit chromoaograficky bu3 pouze ze sraženiny z druhého stupně, nebo z obou sraženin, v závislosti na ekonomice procesu.
Ačkkoi výše uvedené srážení je výhodným znakem způsobu podle vynálezu, není však znakem podstatrým, jelikož filtráty kultury, buněčný extrakt nebo jejich směs mohou být použity přímo? do prostředí pro afinitní chrsmoaosг^rjfi♦
Čištěný přípravek antigenů A lze zpracovat ve vakcinu s obvyklými farmaceuticky přijatlnými nosiči včetně pomoc iých látek (například hydroxidu hlinitého), stabilizátorů a iakCeriostatiC. Vakcína může obsahovat protein z jednoho nebo více kmenů S. mutans a lze ji podávat člověku nebo jným savcům subkutánně, intramuskulárně, intravenózně nebo subm^u^koz^l^l^ě, typicky v dávkách 1 až 50, zejména asi 10 /ig na kg tělesné hmoSoosti.
Aby byle vyvolána dostatečná odezva protilátek, může být zapotřebí více injekcí. Ocřhraiyr lze íooíííO im^r^n.zací rovněž orální cestou, například požitím tobolky obsehtufcí antigen.
Podle dalšího význaku vynálezu přípravek ke prevenci nebo kontrole zubního kazu u savců obsahuje protilátky proti antigenů A ve farmaceuticky přijate0n0o vehikulu. Preparát může mít formu injekcí nebo může to být ksInoooict vhodná pro lokální aplikaci, například jako zubní pasta nebo ústní voda. Může obsahovat jenom protilátky proti antigenů A nebo může obsahovat směs protilátek proti jiým antigenům.
Protilátky lze připravit obvyklými způsoby vstřiknutím antigenního přípravku S. mutans, včetně antigenů A, vhodným zvířatům, například kravám nebo králkům. Vhodné antigenní přípravky obsahi-uí zejména SDS prosté buněčné stěny a čištěný antigen A připravený výše popsaným způsobem.
Předpoklásá se, že účinek všech produktů podle vynálezu je způsoben antigenem A obsaženým bučí v podaném produktu nebo vyvolaném imunitní odezvou subjektu. Účinnost těchto protilátek při ochraně před zubním kazem není zcela jasná, avěak takové pochopení není podstatné při provádění způsobu ·podle vynálezu, *
Je možné, že ovlivňují metabolismus buněk bakterií, přičemž inhibují tvorbu glukanu nebo kyseliny. Mělo by však být jasné, že vynález není žádným způsobem omezován specifickou teorií mechanismu účinků makeriálů. Podobně vynález není omezován ne specifické kmeny Streptococcus mutans uvedené vpředu nebo užité v následujících příkladech.
Typické způsoby a produkty podle vynálezu budou nyní popsány pomocí příkladů s odkazem na připojené výkresy, na kterých obr. 1 znázorňuje · IgG odezvy imunizovaných (křivka a) a kontrolních zvířet (křivka b) na antigen A. Obr. 2 znázorňuje IgG odezvy na antigen A u jediného zvířete.
Výroba·antiséra
Bylo použito Streptococcus mutens dobře známého kméne Ingbbitt. Kmen byl popsán B. Krassem; Archs, Oral Bioo.; 11 . str. 429 až 436 a je k^si^kován jako genetický typ 1 systémem СоукепбеЛ (J. Gen. Miirobbol. 83. 1974, 327 až 338) a sérotyp £ podle Bratthalla (Odont. Révy ·.20. 1969, 231 až 243) e uložen· v NCIB, Aberdeen, Scotland jako NCIB..... .
Baakerie rostly v Todd-Hewitově živném prostředí (popsaném E. W. Toddem a L. F. Heni-ttem, J.. P9ht. and Baaceriol. sv. 35, 1932, str. 973 až 974), až bylo dosaženo sta- ♦ cionární fáze (16 hodin).
Buňky byly potom izolovány odstředěním a suspendovány v roztoku sodné soli dodecylsíranu (SDS) jako solublizeačním pufru La^rnmiho (Nátuře 227, 19’70, str. 680 až 685) ve vroucí vodní lázni po dobu 20 minut. Buňky byly potom promyty vodou pomocí odstředění, lyofiizoovány a resuspendovány znovu do vody v koncehnraci 10 m&/ml.
Králík byl imunizován 1 ml těchto SDS extrahovaných buněk a 0,1 ml edjuvans hydroxidu hlinitého intramuskulární injekcí v 0,21. a 48. den. Padesátého pátého dne byl králík vykrvácen po tarSiálií punkci.
Podobných výsledků bylo·dosaženo, když byly buňky extrahovány vodným roztokem 10 g na litr SDS ze varu po dobu 20 minut nebo po dobu 1 hodiny při teplotě místrn^si.
Chearkterizkce antigenů A a B
Antisérum připravené výše popsaným způsobem bylo zkoušeno pomocí imunodSfúzr proti buněčným složaám Ingbbrtt (ve formě extraktu celých buněk zpracovaného ultrazvukem), stejně jako proteinů z filtrátu kultury Ingbbrtt, který byl koncentrován srážením síranem amonným. Byly pozorovány dvě čáry precipitim a ty byly antigenně identické s produktem zpracovaným u^az^nkem e supernkerntem.
Působení nespecifického proteolytického enzymu pronázy (Sigma CHemmial Conmp) na kterýkoliv anti-genní přípravek nevedlo k následnému vzniku . ^^ecipitn^c^i^ých čar, atθzujíeíeh na proteinový charakter anti^ená.
Když bylo kntiséuué zkoušeno proti buňkám zpracovaným ultazvunkem e proti filtrátu kultury citlivější technikou iéunioeθrtrofortzy, . mohly by být detekovány jenom dvě precipitinové reakce mtigein^pro telátka.
Stejné dva antigeny by mohly být detegovány, když byl jiný kmen sérotypu dostupný v Neaional Collection of Type Cultures, CoOindale, Annlie jako NCTC 10449 extrahován a poulit k přípravě antiséra výše popsaným způsobem.
Informace o fyzikálních vlastnostech obou ' antigenů byla získána zkříženou elektronezou, ve které prvým stadiem separace bylo izoelektrické zaostřování v pólyekrylamidovém gelu (oddělení proteinů na základě rozdílů náboje) nebo pomocí elektroforézy na SDS-polyakrylamidovém gelu (oddělení proteinů na.základě jejich mooeku!ární hmotnět!) .
Získané výsledky ukezzuí, že antigen A má izoelektrický bod 4,3 a шоикпЫт! hmotnost 29 000 ± 3 000, zatímco antigen B má izulektr^i^ť^ký bod 5,4 e m^o<^l^i^]^(^rní hmoonoot blízkou 200 000. Přesnější způsob vyuuivající gradientově elektroforózy na SDSspooyakrylamidovém gelu potvrzuje hodnotu 29 000 pro antigen A a poskytl hodnotu 190 000 pro antigen B.
Kontrolní proteiny užité jako standardy m^o<^l^i^]^l^rn:í hmoonooti byly myooin králíka 200 000, beta-galaktosidáza 116 000, fosforyláza A 94 000, hovězí sérový albumin 68 000, avalbumin 43 000, chynoOrypsitoglO A 25 700· Hocdnota pro B je prozatímní, protože diferenční barvicí metody ukazuj, že B obsahuje některé uhlotydráty a glukoproteiny, ό nichž je známo, že vykazuj annašání migraci při gelové elektroforéze·
Antisérum proti SDS-extrahovaným buňkám kmene Inshritt bylo užito k důkazu, že antigeny totožné s A a B byly produkovány dalšími Šesti kmeny sérotypu c /včetně FW293, C67vl GS-5 a OMlTpo, popsané RuseHem RRB, Microbios Seeters, sv· 2 (1976), str. 55 až 59) a rovněž reprezentativní kmeny sérotypů e, (kmen P4) a f (Kmen 151).
Poslední dva sérotypy jsou ve stejné genetické skupině jeko sérotyp c (tj. v genetické skupině I C^o^k^ee^nda]., 1977, Int. J. Syst. Baaceriol. 27. str. 26 až 30) a bylo prokázáno, že jsou antigenně blízce příbuzné (Brrathall se sp., J. dent. Res. 55A, 1976, str. 60 až 64; Perch se spol. Acta path. о1сгоЬГо1, scand. Sec. B32, 1974, str. 357 až 370) a ooCÍ podobné složení proteinů (Ruussll, Microbios Letters 2, 1976, str. 55 až 59).
Kmeny sérotypu b obsahuj antigen zkříženě reagující s antigenem A, zatímco . antigeny reagujcí zkříženě s antigenem B byly pozorovány v sérotypech ja, b a g a kmenech S- san^i^i-S.
Příprava čištěného anti^^^^ A
Po detegování proteinů A a B ve filtrátech kultury ukázaly delší pokusy, že oba antigeny jsou vylučovány během růstového cyklu bu5 v živném prostředí Todd-HHeittově, tr^ypton/kvasničném extraktu nebo chemicky definovaném (CD) mediu Jendy a Kuramitsu (Infect. Immun. 14. 1976, str. 191 až 202). Protože CD medium obsahuje minimum složek interferujících snadno s čistícími operacemi, bylo zvoleno k pioužií*
S. mutans kmene ^gb^tt rostl v CD médiu do raně stacionární fáze a buňky byly odstraněny odstředěním následovaiým filtrací přes skleněné vlákno. Je-li žádoucí příprava čistého anti^g^^^ů A, filtrát by měl projt chroootografic]Qm sloupcem obsahujícím nerozpustný polymer glukózy imnan a oolyakiylaoidlvý gel v kuličkách (BioCel P2), připravený způsobem popsaným McCabem a Smithem (Infe<^t. Immun. 1977, 16: 760 až 765) a cílem odstraní glukossltгθtsferázové enzymy, které maaí jinak sklon čistit se spolu s antigenem B.
Pevný síran amonný byl zvolna přidán do vzniku 45% nasycenooti a sraženina, která se utvořila přes noc při teplotě 4 °C, byla Izolována filtrací. Předběžné pokusy ukázaly, že anti^gen B se srážel maximálně při 45% nasycení síranem amonným, zatímco antigeo A se srážel maximálně 65%· Byl tudíž přidáván další síran amonný, aby filtrát kultury dosáhl 65 % nasycenooti a sraženina byla znovu izolována.
Obě 'frakce byly dlelyzovány proti 50 mta Tris HC1 pufru (hodnota pH,7,5), kteréhožto pufru bylo používáno během čištění, před dalším stupněm, kterým byla chromatogrrfie na DEAE zesítěném dextranu (DEAE Sephsdex A25 - obchodní značka).
Vzorky byly naneseny na oddělené kolony, které byly předem ekvilibrovány Tris-pufrem. Kolony byly eluovány průchodem jednoho objemu Tris-pufru před aplikací lineárního gradientu od 0 do 0,3 M chloridu sodného v Tris-pufru. Po sobě jdoucí frakce byly shromažďovány a analyzovány elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu a pomocí raketové imunnelektroforézy proti, antiséru připravnnému ' proti SDS-extrahovaným buňkám.
Antigen B (z 45% síranu amonného) se eluuje'přibližně 0,8 M chloridem sodným, zatímco antigen A se eluuje přibližně 0,13 M chloridem sodným. V každém případě entigenní proteiny byly hodnoceny,jako z 90 % čisté. Frakce obsahující antigen byly spojeny, dialyzovány proti Tris-pufru a koncentrovány ultrafiltrací. Každý parciálně čištěrý antigen byl potom nanesen ne sloupec agerózového gelu (Sepharose CIL·—óB—obchodiní značka) a eluován' Tris-pufrem. Frakce byly znovu shromážděny a analyzováno jejich složení proteinů a anti-genů.
Výše uvedený způsob vedl k přípravkům proteinů A a B, které byly čisté na základě kritérií elektroforézy na SDSspolytVrylθmidovém gelu a isolektrcekého zostřování ne polyakrylaamidovém gelu.
Když tyto přípravky antigenů A a B byly vstříknuty s adjuvans králkkům a následoval imunizační postup shodný s tím, který je popsán vpředu pro SUSsextrehované buňky, vznikala nespecifická séra, která, když byla zkoušena proti surovým antigerrním příprvvkům pomocí srážení gelové techniky, srážela jenom homooogický antigen.
Neepeeifická antiséra proti antigenům A a B lze pouuít pro imunooorbetní efinitní chromatograficVé čištění antigenů. Při typické přípravě, frakce séra imunoglobulinu G byla kopulována ne ' zesítšnou agarózu (Crn^-aktivovaná Sepharosa, Pharmmaia) způsoby doporučenými výrobcem. Konnentrovaný filtrát kultury S. mutans kmene Ingbbrtt v 0,05 M Tris/ , /HC1 pufru o hodnotě pH 7,5, obsahujícího 1 % Tritonu X-100, byl nanesen na sloupec kolony.
Sloupec byl potom promován několika objemy Tris-pufru před elucí Tris-pufrem obsahujícím buň 3 M rhodanid sodný nebo 0,1 M glycin/HCl pufr o hodnotě pH 2,8 (ačkoliv jiná eluční činidla mohou být rovněž dootečnujcc). Způsob poskytuje čisté přípravky požadovaného anti-genů. Kdyby docházelo k nějakému unikání IgG ze sloupce kolony, může být oddělen snadno od aotigeoů již popsanou iont©měničovou chrommtoglaafí.
Složení aminoOksoeio afinitně čištěného an^enů bylo stanoveno po hydrolýze po dobu 48 hodin při teplotě 105 °C v 6 N kyselině chlorovodíkové a je uvedeno v tabulce 1.
T a b u 1 k a— 1
Složení aminokyselin proteinových hydrolyzátů
Zbytky , nn 1 000 celkových zbytků
| Antigen A | Antigen B | |
| Kyselina aspnregová | 101 | 103 |
| Tlweonin | 56 | 60 |
| Serin | 91 | 61 |
| Kyselina glutamová | 106 | 11 1 |
| Prolin | 65 | 44 |
| Glycin | 190 | 212 |
| Alenin | 89 | 1 17 |
| Cy3tin | - | - |
| Valin | 53 | 58 |
| MeUiionin | - | - |
| Isoleucin | 38 | 38 |
| Leucin | 61 | 53 |
| FenySalanin | 28 | 25 л |
| Tyrosin | - | 10 |
| Histidin | 50 | 18 |
| Lysin | 46 | 64 ‘ |
| Arginin | 27 | 26 ‘ |
| - | 4 |
Hodnocení antigenních a ochranných, vlastností
Antigeny A a B jsou exponovány na povrchu bakterií e působí jako imunogeny. Pokusy zahrnující imunizaci několika tuctů králíků a opic ukázaly, že odezvy protilátek na entigeny ·A a B jsou zřetelně silnější než jiné antigeny. Tento účinek je dokonce ještě ^ζη^αη^!!, když jsou zvířata imunizována přípravky obohacenými buněčnými stěnami. Jak je popsáno vpředu, SDSsextrahovnné stěny uvolňuuí protilátky jenom proti A a B, zatímco stěny podrobené intenzívni extrakci poskytovaly ještě m^o^uur^n^jŽ^:í odezvy na A в B, zatímco u jirých antigenů byly pozorovány slaběí odezvy.
Protilátky lze detegovat ·obvyklými způsoby zkřížené imuuюoleltroforézy nebo reverzní raketové elektroforézy.
Kvannitetivní hodnocení odezvy protilátek bylo prováděno enzymovou imunooorpční zkouěkou (E1ISA), následovanou technikou nn mik:rodlekácU podle VoUem, Bidweein n Bantlettn · (1977, Floeli.ne Piubications). Plastikové mikyoOitračií misky byly potaženy imunoafinitně čiStěrými antigeny A n B v УonceniracícU přibližně 1 /xg/ml.
Zkouška mnnžžtví protilátky opic, která vázala B^igen, byla docílena inkubací s anti-lidkým IgG konjugovaným nn alkalickou fosfatézu (Son Whtley Ltd·). Výsledky byly vyjádřeny jako bod ekvivalence (tj. konečná hranice ředění, která vykazuje konečné zbarvenO, nebo měřením absorbance při 405 nm získané od · vzorku séra příslušného ředění.
^Μοβο^ί vlastnoo ti celých buněk
Někkoik pokusů, při nichž byly úspěšně imunizovány opice celými buňkami S. muuans, bylo popsáno, jak je uvedeno vpředu (Bowen se sp., Brit. Sent. J. 1975 n Cohen se sp. Brit. Sent. J. 1979), přičemž redukce zubního kazu je 50 % nebo více. V rlprezeitatavnm pokuse ' 4 pokusná a 2 kontrolní zvířata byla léčena obdobně usmrcenými celými buňkami (skupina 14 Cohena se spi. British Dental Journal sv. 147, 1979, str. 9 až 14).. Injekce byly podávány O,, 2., 5., 6., 12. e 18. měsíc. Průměrné hladiny protilátek · (Igp) u pokusné a kontrolní skupiny jsou uvedeny na obr. 1 .
Hladina protilátek proti antigenu A po 12 měsících byla nejméně 30x vySSÍ- ve srovnání s kontrolami, ačkoliv tato hladina klesá mezi vrcholy. Misí být zdůrazněno, že je nepravděpodobné, aby pro ochranu byly zásadně nutné tak četné injekce, avšak tento aspekt vynálezu nebyl zkoumán.
Čtyři roky po začátku pokusu měla kontrolní zvířata průměrný počet p£1ti kazových poškození na stálých zubech, zatímco imunizovaná zvířata měla průměrně dvě poškození.
Z těchto výsledků lze vidět zřejmou korelaci mezi hladinami antigenů A a ochranou před zubním kazem. Protilátky proti antigenu A se vya!k^uj pouze zřídka a v nízkých hladinách u neimunizovaných subjektů. Taková přirozená protilátka proti antigenu B byla rovněž pozorována v některých případech.
Není známo, kdy těchto protilátek přibývánebo kdy jsou způsobeny antigenní stimuuací pomoci S. mutans na zubech, systémovou.Infekcí pomocí S. mutans, nebo zkříženou reaktivitou antigenů jirých bakkeeií, vůči nimž má zvíře imun^ní odezvu.
V jiném pokuse byle imunizována skupina osmi opic, celými buňkami a hydroxidem . hlinitým jako adjuvans subkutánní injekcí do nohy (skupina 11, Cohen se sp., ' Brrtish Jednal, uvedený vpředu) a srovnána s osmi kontrolními zvířaty. V této skupině byly hladiny protilátky proti antigenu A u všech kontrolních zvířat zvýšeny, přičemž průměrný titr je 1/520.
Je třeba upozzonnt na to, že v důsledku variací při způsobu není možné srovnávat titrační hodnoty uvedené zde u různých skupin. Průměrné titrační hodnoty u zvířat imunizovaných celými bakteriemi byly však, 6 měsíců po injekci, 1/2830-více než pětinásobek hladiny u korntO!. Protilátky proti antigenu B byly rovněž příoomny u imunizovaných zvířat. 55% snížení kazu bylo pozorováno mezi imunizovanými a kontrolními zvířaty.
Imunogewií vlastnosti porušených buněčných stěn
O imunnzaci porušenými buněčnými stěnami kmene Ingbbrtt popsané Bowenem se sp..(British Dental Journal 1975, str. 45 až 58) bylo prokázáno, že poskkttijí ochranu proti následnému čelenžování tímto kmenem. Imunizace try panno varými buněčnými stěnami neposkytuje ochranu, což dokazuue,že protein se účastní ochranného procesu.
Séra byla shromážděna od čtyř experimeenálních opic imunizovaných příprvvkem z buněčných stěn kmene Ingbbrtt a čelenžovány steným kmenem, který je popsán pro skupinu C Bowenem se sp. Podobně bylo působeno bez imunizace ne pět kontrolních opic.
Kontrolní zvířata měla hodnoty protilátky proti antigenu A <1/20 (3 zvířata),
1/80 (1 zvíře) a '1/1 280 (1 zvvře), zatímco imunizovaná a chráněná zvířata měla titrační hodnoty mezi 1/80 a 1/640 s průměrnou hodnotou 1/220. Tyto hodnoty byly získány ze vzorků séra odebíraných 20 měsíců po poslední injekci. Hladiny by měly být pochooPteltS. vyšší právě po vrcholu.
Pět roků po začátku pokusu byl celkový počet zubních kazů u čtyř pokusných zvířat 4. U pěti kontrolních zvířat bylo 64 poškozeno a toto číslo představovalo opačnou relaci k hladině protilátek v séru, se dvěma kontrolními zvířaty, která nevykazovala jakoukoliv protilátkovou odezvu ukazujcí vyv^ejcí se kaz.
Devět let po začátku pokusu existuje 5 přežívajících zvvřat, dvě zvířata z imunizované skupiny a 2 kontroly uhynuly. Tři přežívájící kontrolní zvířata měla všechna ustupující až pribývvJící kaz, zaujímající 56 , 69 e 93 napadeného povrchu. Jedno m.alé poškození se vyvinulo na zubu jednoho imunizovaného zvířete, zatímco ostatní zůstala bez kazu.
Imunogenní vlastnosti čistého antigenu A
Z výše uvedených výsledků je jasné, že antigeny A a B vstřiknuté jako složky celých bakterií nebo buněčných stěn bakterií jsou schopny vyvvoat imunntní odezvu, v nepřítomnooti adjuvans (skupina G) nebo po přidání hydroxidu hlinitého jako adjuvans (skupina 11). Imunizace čistými antigeny však vyžaduje pro rychlou a trvalou odezvu příoomnost adjuvans. Odezva jedné opice (asi o 5 kg hmoonnosi) imunizované 50 antigenu A (připraveného, jak Je popsáno vpředuýza pouuití srážení sírnnem amonným) s hydroxidem hlinitým je uvedeno na obr. 2.
Claims (3)
- PŘEDMĚT· VYNÁLEZU1. Způsob výroby antigenního přípravku pro potlačování zubního kazu u savců, kultivací druhu Streptococcus mutans v živném prostředí pro získání kultury, přičemž se z kultury odstraňují alespoň buněčné stěny pro získání zbývvaícího bílkovinného roztoku, který je filtrteem kultury, buněčným extraktem nebo kombinaci jich obou, a požadovaný antigenní přípravek se odddlí od bílkovinného roztoku, vyznnaunící se tím, že antigenní přípravek se oddělí od bílkovinného roztoku separačním postupem zahrnujícím afinitni chrsmoanortaii, zahrnuící uvádění bílkovinného roztoku do styku s imobblizovenou protilátkou, vyrvání nežádoucích meaeriálů z imobblizované protilátky e eluování požadovaného antigenního přípravku z imobblizované protilátky, přičemž imobblizované protilátka je charakterizována specificttou pro jeden nebo více entigenů, které jsou bu5 antigenními bílkovinami o mooekulové hmoonnoti asi 29 000 a isselektrCtk0o bodu 4,1 až 4,5 a které zůstávaa! na buněčných stěnách Streptococcus mutans genetického typu I po extrakci vroucím roztokem 10 glitr dodecclsíranu sodného ve vodě po dobu 20 minut, nebo jsou bílkovinami, které dávají zkříženou reakci s uvedenými antigenními bílkovinami.
- 2. Způsob podle bodu 1, vyznnαunící se tím, že před efinitní chгom8t(>bгtaii se provádí oddělování přidáním síranu amonného k bílkovnnéému roztoku do 45 až 65% nasycení, přičemž pevný poddl se shromažSuje a rozpou^í za vzniku druhého bílkovinného roztoku vhodného· pro uvádění do styku s imobilizovanou prstilátksn.
- 3. Způsob podle bodu 2, vyznač^ící se tím, že před afinitní chromatnbrtαií se provádí oddělování přidáním síranu amo orného k roztoku bílkovin až do asi 45% nasycení, odstraní se prvý pevný poddl, k bílkovinnému roztoku se přidá síran amonný pro vysrážení druhého pevného podílu, druhý pevný poddl se shromažďuje a pak se rozpautí pro získání druhého bílkovinného roztoku · vhodného pro uvádění do styku s imobilizovanou bílkovinou.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB7835383 | 1978-09-01 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS226190B2 true CS226190B2 (en) | 1984-03-19 |
Family
ID=10499407
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS795761A CS226190B2 (en) | 1978-09-01 | 1979-08-24 | Method of preparing antigen agents for suppressing tooth decay |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4448768A (cs) |
| EP (1) | EP0009872B1 (cs) |
| JP (1) | JPS5569516A (cs) |
| AU (1) | AU526799B2 (cs) |
| CA (1) | CA1130726A (cs) |
| CS (1) | CS226190B2 (cs) |
| DE (1) | DE2963977D1 (cs) |
| DK (1) | DK363479A (cs) |
| FI (1) | FI67664C (cs) |
| HU (2) | HU181957B (cs) |
| NO (1) | NO152774C (cs) |
| NZ (1) | NZ191390A (cs) |
| ZA (1) | ZA794413B (cs) |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56501364A (cs) * | 1979-10-18 | 1981-09-24 | ||
| DE3263103D1 (en) * | 1981-06-19 | 1985-05-23 | Secr Social Service Brit | Protection against dental caries |
| US4888170A (en) * | 1981-10-22 | 1989-12-19 | Research Corporation | Vaccines obtained from antigenic gene products of recombinant genes |
| JPS58164518A (ja) * | 1982-03-25 | 1983-09-29 | Kitasato Inst:The | 虫歯予防用ワクチン |
| JPS5927833A (ja) * | 1982-08-06 | 1984-02-14 | Advance Res & Dev Co Ltd | コレステロール乃至トリグリセリド低下剤 |
| JPS59128338A (ja) * | 1982-12-08 | 1984-07-24 | Kitasato Inst:The | 歯周炎予防用ワクチン及びその製法 |
| JPS59122428A (ja) * | 1982-12-28 | 1984-07-14 | Advance Res & Dev Co Ltd | コレステロ−ル低下活性蛋白質 |
| GB8303994D0 (en) * | 1983-02-14 | 1983-03-16 | Council Of Governors Of United | Antigenic materials |
| US5135739A (en) * | 1983-02-15 | 1992-08-04 | Kitasato Kenkyusho | Non-cariogenic composition and drink |
| US4659561A (en) * | 1983-02-18 | 1987-04-21 | The University Of Vermont And State Agricultural College | Process for treating the oral cavity |
| US5240704A (en) * | 1983-07-03 | 1993-08-31 | Kitasato Kenkyusho | Vaccine, antibodies & antibody-containing compositions for inhibiting human dental caries induced by streptococcus mutans |
| US4693888A (en) * | 1983-08-11 | 1987-09-15 | Lion Corporation | Caries-preventive composition |
| CA1262442A (en) * | 1984-03-09 | 1989-10-24 | Yasuo Kawai | Anticariogenic or antiperiodontitic agent |
| JPS60190707A (ja) * | 1984-03-09 | 1985-09-28 | Advance Res & Dev Co Ltd | 抗う蝕剤 |
| JPS615022A (ja) * | 1984-06-19 | 1986-01-10 | Advance Res & Dev Co Ltd | 腸内細菌叢改善剤 |
| JPS6112629A (ja) * | 1984-06-28 | 1986-01-21 | Lion Corp | 口腔内組成物 |
| JPS61151128A (ja) * | 1984-12-24 | 1986-07-09 | Advance Res & Dev Co Ltd | コレステロ−ル低下活性ｒｎａ画分 |
| FR2581877B1 (fr) * | 1985-05-14 | 1987-12-18 | Louvain Universite Catholique | Conjugue constitue d'une adhesine de paroi de s. mutans, de nature proteique et d'un polysaccharide de s. mutans, sa preparation et son utilisation notamment dans des vaccins anti-caries |
| JPS625991A (ja) * | 1985-07-03 | 1987-01-12 | Advance Res & Dev Co Ltd | コレステロ−ル乃至トリグリセリド低下活性ｒｎａ画分 |
| US4883754A (en) * | 1986-03-06 | 1989-11-28 | University Of Florida Research Foundation | Bacterial FC receptors |
| US4981685A (en) * | 1986-03-07 | 1991-01-01 | Utah State University Foundation | Bacterial extract vaccines for veterinary application |
| US4945157A (en) * | 1988-05-27 | 1990-07-31 | University Of Florida | Novel Extraction procedure for protein G |
| AU626049B2 (en) * | 1989-05-29 | 1992-07-23 | Lion Corporation | Method for preparing vaccine for dental caries and vaccinal compositions for dental caries used as nasal drop |
| AU613857B3 (en) * | 1990-07-10 | 1991-06-25 | Geoffrey Ernest Smith | Methods for manufacture and use of autogenous anti-tooth decay vaccines |
| US5332096A (en) * | 1993-06-14 | 1994-07-26 | Battaglia Anna D | Mouthwash capsule and package apparatus |
| US6231857B1 (en) | 1998-09-28 | 2001-05-15 | The Regents Of The University Of California | Antibodies to S. mutans and uses thereof |
| US7875598B2 (en) * | 2004-03-04 | 2011-01-25 | The Regents Of The University Of California | Compositions useful for the treatment of microbial infections |
| JP5775260B2 (ja) | 2006-09-06 | 2015-09-09 | シー３ ジアン インコーポレイテッド | 選択的に標的化された抗菌性ペプチドおよびその使用 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2124124B1 (cs) * | 1971-02-08 | 1974-04-12 | Siderurgie Fse Inst Rech | |
| US3879545A (en) * | 1971-03-22 | 1975-04-22 | Abdul Gaffar | Vaccines for the prevention of dental caries |
| GB1375866A (cs) * | 1971-06-11 | 1974-11-27 | ||
| DE2300329A1 (de) * | 1973-01-04 | 1974-07-18 | Patents Int Affiliates Ltd | Vaccine gegen zahnfaeule, verfahren zu deren herstellung und damit durchzufuehrende therapie |
| FR2215202A1 (en) * | 1973-01-15 | 1974-08-23 | Patents Internal Affiliates Lt | Anti-caries vaccine - contg antigenic material derived from buccal streptococcus ssc |
| US3993747A (en) * | 1973-06-20 | 1976-11-23 | Colgate-Palmolive Company | Method for local immunization against dental caries |
| US3931398A (en) * | 1973-06-20 | 1976-01-06 | Colgate-Palmolive Company | Method for local immunization against dental caries |
| JPS5424801A (en) * | 1977-07-28 | 1979-02-24 | Karupisu Shiyokuhin Kougiyou K | Novel antibiotics cc3603 and process for preparing same |
| US4150116A (en) * | 1978-02-21 | 1979-04-17 | Forsyth Dental Infirmary For Children | Immunization against dental caries with glucosyltransferase antigens |
-
1979
- 1979-08-21 ZA ZA00794413A patent/ZA794413B/xx unknown
- 1979-08-23 EP EP79301731A patent/EP0009872B1/en not_active Expired
- 1979-08-23 AU AU50228/79A patent/AU526799B2/en not_active Ceased
- 1979-08-23 DE DE7979301731T patent/DE2963977D1/de not_active Expired
- 1979-08-23 CA CA334,333A patent/CA1130726A/en not_active Expired
- 1979-08-24 CS CS795761A patent/CS226190B2/cs unknown
- 1979-08-24 NZ NZ191390A patent/NZ191390A/xx unknown
- 1979-08-29 FI FI792682A patent/FI67664C/fi not_active IP Right Cessation
- 1979-08-30 HU HU79SE1955A patent/HU181957B/hu not_active IP Right Cessation
- 1979-08-30 DK DK363479A patent/DK363479A/da not_active Application Discontinuation
- 1979-08-30 HU HU831289A patent/HU190893B/hu not_active IP Right Cessation
- 1979-08-30 NO NO792822A patent/NO152774C/no unknown
- 1979-09-01 JP JP11106479A patent/JPS5569516A/ja active Granted
-
1981
- 1981-09-18 US US06/303,539 patent/US4448768A/en not_active Expired - Fee Related
-
1982
- 1982-06-15 US US06/388,624 patent/US4442085A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA794413B (en) | 1980-08-27 |
| NO152774B (no) | 1985-08-12 |
| HU190893B (en) | 1986-12-28 |
| US4448768A (en) | 1984-05-15 |
| EP0009872B1 (en) | 1982-11-03 |
| DE2963977D1 (en) | 1982-12-09 |
| JPH0118056B2 (cs) | 1989-04-03 |
| NO152774C (no) | 1985-11-20 |
| FI67664B (fi) | 1985-01-31 |
| FI792682A7 (fi) | 1980-03-02 |
| DK363479A (da) | 1980-03-02 |
| HU181957B (en) | 1983-11-28 |
| CA1130726A (en) | 1982-08-31 |
| US4442085A (en) | 1984-04-10 |
| FI67664C (fi) | 1985-05-10 |
| AU5022879A (en) | 1980-03-06 |
| NO792822L (no) | 1980-03-04 |
| NZ191390A (en) | 1982-05-25 |
| JPS5569516A (en) | 1980-05-26 |
| AU526799B2 (en) | 1983-02-03 |
| EP0009872A1 (en) | 1980-04-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CS226190B2 (en) | Method of preparing antigen agents for suppressing tooth decay | |
| US4150116A (en) | Immunization against dental caries with glucosyltransferase antigens | |
| Taubman et al. | Effects of local immunization with glucosyltransferase fractions from Streptococcus mutans on dental caries in rats and hamsters | |
| US4521513A (en) | Protection against dental caries | |
| US4789735A (en) | Conjugate constituted from a wall adhesin of S. mutans of proteinic nature and from a polysaccharide of S. mutans, its preparation and its use particularly in anti-caries vaccines | |
| AU649950B2 (en) | A method for isolating and purifying transferrin and lactoferrin receptor proteins from bacteria and the preparation of vaccines containing the same | |
| Verstreate et al. | Outer membrane proteins of Brucella abortus: isolation and characterization | |
| US4250262A (en) | Method of preparing a purified glucosyltransferase | |
| KR19980703099A (ko) | 프로테이나제 ｋ에 대해 내성을 갖는 네이쎄리아 메닝기티디스의 표면 단백질 | |
| US7101562B1 (en) | Conjugate vaccines for the prevention of dental caries | |
| US5439680A (en) | Cell-associated glucosyltransferase, an antibody thereto, and a dental caries prophylactic composition containing said antibody as an effective component | |
| Krasse et al. | An anticaries vaccine: report on the status of research | |
| Challacombe et al. | Natural antibodies in man to a protein antigen from the bacterium Streptococcus mutans related to dental caries experience | |
| GB2033223A (en) | Antigen from Streptococcus Mutans for Protection Against Dental Caries | |
| GB2060647A (en) | Antigens ex. Streptococcus mutans | |
| US5281524A (en) | Cell-associated glucosyltransferase from Streptococcus mutans serotype, c, e or f | |
| FR2633309A1 (fr) | Sequence d'adn codant pour la proteine p30 de toxoplasma gondii, produits d'expression de cette sequence, leurs procedes d'obtention et leurs applications | |
| Johnson et al. | Purification and characterization of group A streptococcal T-1 antigen | |
| WO1981001101A1 (en) | Improvements in or relating to vaccines | |
| Tsang et al. | Antigenic analysis of Barber's protein antigen prepared from Salmonella typhi and demonstration of protein-specific antibodies in sera of typhoid patients | |
| NO161355B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av et antigenpreparat mot dental caries. | |
| in't Veld et al. | Immunogenicity, biochemical and serological characterizations of ribosomal preparations from human oral strains of serotypes c and d of the bacterium Streptococcus mutans |