NO152774B - Fremgangsmaate for fremstilling av et antigenpreparat med virkning mot dental-karies - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for rensing

og isolering av et antigen-preparat fra bakterier av arten Streptococcus mutans ved dyrking av bakterier i et dyrkingsmedium for å frembringe en cellekultur, fjerne i det minste celleveggene fra den nevnte cellekultur for å fremstille en proteinoppløsning og separere antigenpreparatet fra protein-oppløsningen, hvor antigenpreparatet inneholder bare antigene proteiner som har følgende egenskaper: 1) de er tilstede på celleveggene av Streptococcus mutans genetisk gruppe i,

2) de kan ikke ekstraheres fra de nevnte cellevegger ved kok-

ing med 10 g/liter natriumdodecylsulfat i 20 minutter,

3) de har en molekylvekt på omtrent 29.000,

4) de har et isoelektrisk punkt på mellom 4,1 og 4,5,

5) ved behandling med proteolytisk enzym vil de ikke danne noen precipitinlinjer ved testing ved immunodiffusjon mot antiserum til natriumdodecylsulfat-ekstraherte celler av S. mutans, og

6) de stimulerer ikke dannelse av antistoffer som kryssrea-

gerer med humant hjertevev, og

det særegne ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er at antigenpreparatet separeres fra proteinoppløsningen ved hjelp av en separeringsmetode som omfatter at proteinoppløs-ningen bringes i kontakt med et immobilisert antistoff, uøns-

kede materialer vaskes bort fra det immobiliserte antistoff og antigenpreparatet elueres fra det immobiliserte antistoff,

hvor det immobiliserte antistoff har en spesifisitet for ett eller flere antigene proteiner som har de ovennevnte egenskap-

er .

Disse og andre trekk ved oppfinnelsen fremgår av patentkrav-

ene.

Dental-karies ansees vanligvis å bevirkes av syre som utvikles

av bakterier som koloniserer overflaten av tennene idet den vesentlige bakterieart som er involvert er kjent som Streptococcus mutans. Denne erkjennelse har ført til tallrike forsøk på å forhindre eller i det minste å redusere forekomsten av dental-karies ved immunisering med hele celler eller cellekomponenter av nevnte S. mutans. Det er således beskrevet forsøk (Bowen et al, British Dental Jouranl, bind 139, 1975, sidene 45-48; Cohen et al, British Dental Journal, bind 147, 1979, sidene 9-14) hvori forekomsten av dental-karies i aper reduseres ved immunisering med enten hele celler eller cellevegg-rikt material avsatt fra knuste celler ved sentrifugering (immunisering med glukosyltransferaseenzym-preparater frem-bragte ingen beskyttelse). Selv om immunisering er blitt vist å utvikle en immunreaksjon som frembringer antistoffer til S. mutans-bakterier er den rute hvorved de nevnte antistoffer kommer frem til de orale kolonier usikker. Det er iakttatt beskyttelse etter submukos immunisering i munnen eller subkutant i benet. Et alternativt, men antatt dyrere forsøk medførte utvortes påføring av antistoff-preparater, f.eks. storfe-melk inneholdende antistoffer til S. mutans-antigener (U.K. patentskrift 1.505.513).

Mens immunisering med hele celler eller cellevegg-preparater av S. mutans synes å medføre beskyttelse,.kan denne følges av visse farer, spesielt når levende hele celler anvendes. Streptococci er-kjent å medvirke i visse sykdommer, f.eks. reumatiske hjertesykdommer og immunisering med hele celler ■ eller endog ukarakteriserte cellekomponenter kan gi anledning til uønskede bivirkninger. For maksimal sikkerhet såvel som maksimal effektivitet bør vaksiner inneholde bare det eller de spesifikke antigener nødvendige for å medføre beskyttelse mot dental-karies.

U.K. patentskrift nr. 1.375.866 (Smith) beskriver en vaksine for dental-karies basert på antigener avledet fra gjæring av stammer av S. mutans. Vaksinene i henhold til dette patentskrift er avledet fra hele celler eller deler av hele celler av S. mutans men bare et spesifikt enzym, nemlig dekstran-sukrase, med et isoelektrisk punkt på 4.2, læres.

Det er identifiseringen og isoleringen av en hittil udentifi-sert uisolert gruppe av komponenter fra den omfattende samling av komponenter som er tilstede på celleveggene av S. mutans som gir den foreliggende oppfinnelse nyhet og oppfinnelses-høyde fremfor de fremgangsmåter for isolering av cellevegger som beskrives av Smith.

Det er nå identifisert to antigen-proteiner (i det følgende benevnt antigener A og B) som er tilstede i de ovenfor be-skrevne cellevegg-preparater og som synes å være involvert i beskyttelsen mot dental-karies.

Antigen B er vist å stimulere dannelsen av antistoffer som reagerer med menneskelig hjertevev (Hughes, Pathogenic Streptococci, 1979, sidene 222-223, utgitt av M.T. Parker, Reed-books, Chertsey, England). Muligheten for at vaksinering med preparater inneholdende antigen B skulle indusere en hjerte-skadende autoimmunreaksjon betyr at antigen B som hittil karakterisert vil være uakseptabelt i en vaksine.

Følgelig tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av et antigen-preparat inneholdende antigen A (som definert i det følgende) som er i det vesentlige fritt for andre antigen-proteiner avledet fra Streptococcus mutans. Preparatet kan anvendes for videre fremstilling av farmakolog-iske preparater omfattende det nevnte antigenpreparat eller antistoffer dertil i en farmasøytisk tålbar bærer. Betegnelsen farmakologisk preparat som anvendt heri dekker både profylaktiske midler, f.eks. vaksiner, og midler for bruk

etter infeksjon for å redusere resulterende skade.

Antigen A er det antigen-protein som er tilbake på celleveggene av Streptococcus mutans serotype c (som beskrevet av Bratthall, Odont Revy 20, 1969, sidene 231-243) hvorav stammen NCTC 10449 er et eksempel, etter ekstraksjon av cellene med 10 gram/liter natriumdodecylsulfat (SDS) i vann i 1 time ved romtemperatur eller 20 minutter med koking og som har en molekylvekt på omtrent 29 000 - 3 000 og et isoelektrisk punkt på 4,1 til 4,5. I det vesentlige identiske proteiner finnes i andre stammer av S. mutans genetisk gruppe I

(Coykendall. J. Gen. Microbiol, bind 83, sidene 327-338)

inkluderende serotypene e og f, f.eks. de stammer som er beskrevet av Russell RRB, Microbiol. Letters, bind 2 (1976) sidene 55-59. Antigenisk beslektede proteiner finnes i stammene fra andre genetiske grupper, f.eks. serotype b. Den foreliggende oppfinnelse omfatter fremstilling av slike antigenisk beslektede proteiner og betegnelsen "antigen A" som anvendt heri skal omfatte disse og oppfinnelsen er således ikke begrenset til anvendelse av en spesiell stamme av denne type, selvom anvendelse av en stamme av S. mutans serotype c er fordelaktig.

Antigen A kan ikke lett separeres fra celleveggene ekstrahert med SDS, men immunisering av kaniner med de ekstraherte cellevegger gir antisera til to proteiner (benevnte antigener A og B) som derved kan oppdages i og separeres fra hele celle-ekstrakter eller cellefrie dyrkingsfiltrater. Antigenet fremstilles således fordelaktig fra dyrkingsfiltrater eller fra hele kulturer etter celleødeleggelse.

Dyrkingsmediet kan være et hvilket som helst konvensjonelt medium for S. mutans som f.eks. Todd-Hewitt-buljong (Todd E. W. & Hewitt L.F., J. Path & Bacteriol, 35, 1932, sidene 973-974), videre trypton/gjærekstrakt'eller et kjemisk definert medium.

For å lette etterfølgende rensing foretrekkes et kjemisk

definert medium. Antigen A frigis til dyrkingsmediet ved alle trinn av dyrkingen. Fordelaktig høstes cellene ved tidlig stasjonær fase (typisk 15 - 25 timer ved 37°C). Cellene kan også dyrkes i kontinuerlig kultur.

Proteinløsningen kan omfatte bare dyrkingsfiltrat oppnådd ved

å fjerne hele celler eller en celleekstrakt befridd for cellevegger og avfall eller kan være en blanding av disse fremstilt ved å knuse cellene i en hel kultur og deretter fjerne celleveggene og avfall. Celleveggene kan fjernes enten som hele celler eller som fragmenter etter desintegrering, ved konvensjonelle metoder som f.eks. sentrifugering eller filtrering.

Antigen A kan separeres fra proteinløsningen ved konvensjonelle metoder, foretrukket ved felling med ammoniumsulfat etterfulgt av kromatografering. Utfellingen med ammoniumsulfat kan gjennom-føres i et eneste trinn foretrukket til 65% metning, men gjennom-føres fordelaktig i to trinn til 45% og 65% metning. Bunnfallet fra det første trinn inneholder bare en mindre andel antigen A

mens bunnfallet fra annet trinn inneholder hovedmengden av antigenet A og en mindre andel av andre proteiner, særlig antigen B. Antigenet A kan separeres kromatografisk fra enten bunnfallet i annet trinn eller fra begge bunnfall avhengig av lønnsomhets-betraktninger for prosessen.

Den kromatografiske separering kan gjennomføres med hvilke som helst konvensjonelle media som f.eks. fornettet dekstran eller agarosegel eller dekstran-substituert triazin-fargestoff immobilisert på agarosegel. Et spesielt egnet material er dietylamino-etyl-fornettet dekstran. Proteinene kan elueres med konvensjonelle pH eller ioniske gradienter, foretrukket en natrium-klorid-ionisk gradient når antigen A elueres med 0,1 - 0,2 molar NaCl. Alternativt kan affinitets-kromatografering eller immuno-adsorbsjonsmiddel-kromatografering anvendes enten med ammoniumsulfat- bunnfallet eller den rå celleekstrakt og/eller supernatant-oppløsningen.

Foretrukket separeres antigenet A fra proteinløsningen ved affinitets-kromatografering på immobiliserte anti-antigen A antistoffer. Antistoffene kan typisk være immunoglobulin G

(IgG) antistoffer dyrket i•et passende dyr som f.eks. kaniner

og kan immobiliseres på en konvensjonell bærer som f.eks. fornettede agarosekuler etterfulgt av cyanbromidaktivering.

Det rensede antigen A-preparat kan benyttes ved fremstilling av en vaksine med konvensjonelle farmasøytisk tålbare bærere inkluderende tilsetningsmidler (f.eks. aluminiumhydroksyd), stabiliserende midler og bakteriostatiske midler. Vaksinen kan inneholde proteiner fra en eller flere stammer av S.mutans og kan tilføres til mennesker eller pattedyr enten subkutant, intramuskulært, intravenøst eller submukøst, typisk i doser på 1 - 50, spesielt omtrent 10 mikrogram pr. kg kroppsvekt. Flere injeksjoner kan kreves for å utvikle tilstrekkelig antistoff-reaksjon. Beskyttelsen kan også utløses ved immunisering via en oral rute, f.eks. ved å svelge en kapsel inneholdende antigenet.

Et preparat for forhindring eller kontroll av dental-karies i pattedyr omfatter antistoffer til antigen A i en farmasøytisk tålbar bærersubstans og preparatet kan være et injiserbart preparat eller kan være en sammensetning egnet for lokal påførsel, f.eks. en tannpasta eller et munnvaskemiddel. Preparatet kan inneholde antistoffer til antigen A eller kan omfatte en blanding av antistoffer til andre S.mutans-antigener. Antistoffene kan fremstilles ved konvensjonelle metoder ved injisering av et S. mutans-antigen-preparat, omfattende antigen A, i passende dyr som f.eks. kuer eller kaniner. Passende antigen-preparater omfatter spesielt SDS-vaskede cellevegger og i renset antigen A fremstilt som beskrevet ovenfor.

Det vil være klart at virkningen av produktene fremstilt i henhold til oppfinnelsen skyldes antistoffer til antigen A, uansett om de er inkludert i produktet eller tilføres eller utvikles ved immun-reaksjonen av den som tilføres produktet, men virkningen av disse antistoffer til å forhindre dental-karies er ikke fullt ut for-stått.

Det er mulig at de påvirker metabolismen i bakteriecellene og forhindrer dannelse av enten glukan eller syre. Det er godt mulig at det kan utvikles en mer spesifikk teori for virkemåten av materialene.

Oppfinnelsen skal nå beskrives ved hjelp av eksempelvise ut-førelsesformer med henvisning til de vedføyde tegninger hvori

Fig. 1 viser IgG-reaksjoner mot antigen A i immunisert (kurve

a) og kontroll (kurve b) dyr,

Fig. 2 viser IgG-reaksjoner mot antigen A i et eneste dyr.

Fremstilling av antiserum til SDS- ekstraherte cellevegger.

Streptococcus mutans, av den velkjente stamme Ingbritt ble anvendt. Denne stamme er blitt beskrevet av Krasse/ B; Archs.

Oral Biol, 11, sidene 429 - 436 og er klassifisert som genetisk type 1 ved systemet til Coykendal (J. Gen. Microbiol.83, 1974, 3 27 - 3 38) og serotype c i henhold til Bratthall (Odont. Revy 20, 1969, 231 - 243) og deponert i NCIB, Aberdeen, Skottland som NCIB 11516.

Bakteriene ble dyrket i Todd-Hewitt-buljong (som beskrevet av

Todd E.W. og Hewitt L.F., J. Path.og BacterioL, bind 35, 1932, sidene 973 - 974) inntil den stasjonære fase ble nådd (16 timer). Cellene ble så høstet ved sentrifugering og suspendert i natrium-dodecylsulf at (SDS) oppløseliggjørende buffer i henhold til Laemmli (Nature 227, 1970, sidene 680 - 685) i et kokende vann-

bad i 20 minutter. Cellene ble så vasket grundig i vann ved sentrifugering, frysetørket og suspendert på nytt i vann med en konsentrasjon på 10 mg/ml. En kanin ble immunisert med disse SDS-ekstraherte celler, 1 ml pluss 0,1 ml aluminiumhydroksyd-tilsetningsmiddel injisert intramuskulært ved døgn 0, 21 og 48.

Etter døgn 55 ble kaninen tømt for blod ved hjelp av hjerte-punktering.

Lignende resultater ble oppnådd når cellene ble ekstrahert med

en 10 gram pr. liter vandig løsning av SDS med koking i 20 minutter eller i 1 time ved romtemperatur.

Karakterisering av antigener A og B.

Antiserum fremstilt som ovenfor ble testet ved immunodiffusjon

mot cellekomponenter av Ingbritt (i form av en ultralydekstrakt av hele celler) såvel som proteiner fra et dyrkingsfiltrat av Ingbritt som var blitt konsentrert ved hjelp av ammoniumsulfat-utfelling. To precipitin-linjer ble iakttatt, og disse var antigenisk identiske mellom sonikat og supernatant. Behandling av enten antigen-preparatet med et ikke-spesifikt proteolytisk enzym "Pronase"resulterte i at det deretter ikke ble dannet noen precipitin-linjer, som viste proteinnaturen av antigenene.

Når antiserumet ble testet mot celle-sonikatet og kulturfiltratet ved hjelp av den mer sensitive teknikk med kryss-immunoelektroforese, kunne fremdeles bare to antigen-antistoffprecipitin-reaksjoner oppdages.

De samme to antigener kunne påvises når en annen serotype c-stamme, tilgjengelig fra National Collection of Type Cultures, Colindale, England som NCTC 10449, ble ekstrahert og anvendt for ■ fremstilling av antiserum som beskrevet ovenfor.

Informasjon om de fysikalske egenskaper av de to antigener ble oppnådd ved kryss-immunoelektroforese hvori den første dimensjons-separasjon foregikk ved isoelektrisk fokusering i polyakrylamid-gel (for separering av proteiner i henhold til deres ladnings-forskjeller) eller ved hjelp av SDS-polyakrylamidgel-elektroforese (for å separere proteiner i henhold til deres molekylvekt). De oppnådde resultater viste at antigen A hadde et isoelektrisk punkt på 4,3 og en molekylvekt på 29 000 + 3 000 mens antigen B hadde et isoelektrisk punkt på 5,4 og en molekylvekt på nær 200 000.

Den mer nøyaktige teknikk med SDS-polyakrylamid-gradientgel-elektroforese bekreftet verdien på 29 000 for A og ga en verdi på 190 000 for B. De markeringsproteiner som ble anvendt som molekylvekt-standarder var kaninmyosin 200 000; 8-galaktosidase,

116 000; fosforylase A, 94 000; storfe-serumalbumin, .68 000; ovalbumen, 43 00 0;efcymotrypsinogen A, 25 700. Verdien for B er bare foreløbig, ettersom differensial-fargemetoder viste at B inneholdt noe karbohydrat og glykoproteiner er kjent å vise anomalier ved vandringen i gel-elektroforesen.

Det antiserum som ble dannet mot SDS-ekstraherte celler av

Ingbritt ble anvendt for å vise at antigener identisk med A og B ble fremstilt av 6 andre stammer av serotype c (inkluderende FW293, C67-1, GS-5 og OMZ-70 som beskrevet av Russell RRB, Microbios Letters, bind 2 (1976), sidene 55 - 59) og også av representative stammer av serotyper e (stammen P4) og f (stammen 151). Disse to siste serotyper er i den samme genetiske type som serotype c (dvs. genetisk gruppe I i henhold til Coykendall,

for hvilke navnet S.mutans Clarke er foreslått (Coykendall, 1977, Int. J. Syst. Bacteriol.27, sidene 26 - 30) og er blitt vist å

være nær beslektet antigenisk (Bratthall et al J. Dent.Res.55A, 1976, sidene 60 - 64; Perch et al, Acta Path. Microbiol. Scand.Sec B82, 1974, sidene 3 57 - 370) og har lignende proteinsammensetning (Russell, Microbios Letters 2, 1976, sidene 55 - 59). Serotype b-stammer inneholder et antigen som kryssreagerer med antigen A, mens antigener som kryssreagerer med antigen B er blitt iakttatt i serotyper a, d og g og stammer av S.sanguis.

Fremstilling av renset antigen A.

Etter påvisning av proteinene A og B i dyrkingsfiltrater, viste ytterligere forsøk at begge antigener utskilles ved vekstsyklusen i enten Todd-Hewitt-buljong, trypton/gjær/ekstrakt, eller det kjemisk definerte (CD) medium til Janda og Kuramitsu (Infect. Immun.14, 1976, sidene 191 - 202). Da CD-mediet inneholder de færreste komponenter som vil ha tendens til å forstyrre rense-metodene ble det valgt for anvendelse. S.mutans-stammen Ingbritt ble dyrket i CD-medium til tidlig stasjonær fase, og cellene ble fjernet ved sentrifugering•etterfulgt av filtrering gjennom glass-fibre. Hvis det er ønskelig å fremstille rent antigen B bør filtratet føres gjennom en kromatograferingskolonne inneholdende den uoppløselige glukosepolymer mutan og polyakrylamid-gelkuler (BioGel P2) fremstilt som beskrevet av McCabe og Smith (Infect. Immun. 1977, 16, sidene 760 - 765) for å fjerne glukosyl-transferase-enzymene som ellers ville ha tendens til samrensing med antigen B. Fast ammoniumsulfat ble tilsatt sakte til å gi en 4 5% mettet løsning og bunnfallet som ble dannet over natten ved 4°c ble samlet ved sentrifugering. Foreløbige forsøk har vist at antigen B ble maksimalt utfelt med 45% mettet ammonium-sulf at, mens antigen A ble maksimalt utfelt ved 65%. Ytterligere ammoniumsulfat ble derfor tilsatt for å bringe dyrkningsfiltratet til 65% metning og bunnfallet ble samlet på nytt. Begge fraksjoner ble dialysert mot 50 mM Tris HC1 buffer (pH 7,5) ..i bufferen ble anvendt ved rensingen, før det neste trinn som var kromato-graf ering på DEAE fornettet dekstran (DEAE "Sephadex" A25).

Prøver ble tilført separate kolonner som på forhånd var blitt ekvilibrert med Tris-buffer. Kolonnene ble eluert ved med-føring av ett volum av Tris-buffer før det ble tilført en lineær gradient av 0 - 0,3 M NaCl i Tris. Sekvensfraksjoner ble samlet og analysert ved hjelp av SDS-polyakrylamid-klumpgelelektroforese og ved hjelp av smeltet påskyndet immunoelektroforese mot antiserumet fremstilt mot SDS-ekstraherte celler.

Antigen B (fra 4 5% ammoniumsulfat) eluerte ved omtrent 0,8 M

NaCl mens antigen A eluerte ved omtrent 0,13 M NaCl. I hvert tilfelle ble antigen-proteinene bedømt til å være omtrent 90%

rene. AntigenhoIdige fraksjoner ble samlet, dialysert mot Tris-buffer og konsentrert ved ultrafiltrering. Hvert spesielt renset antigen ble så tilført til en kolonne av agarosegel ("Sepharose" CL-6B) og eluert med Tris-buffer. Fraksjoner ble på nytt samlet

og analysert med hensyn til antigener og proteinsammensetning.

Den ovennevnte metode ga preparater av proteiner A og B som var tilsynelatende rene ved kriteriene i henhold til SDS-polyakrylamid-gelelektroforese og isoelektrisk fokusering i polyakrylamid-gel.

Når disse preparater av antigener A og B ble injisert i kaniner med tilsetningsmidler, etter en immuniseringsplan identisk med den som er beskrevet ovenfor for SDS-ekstraherte celler, ble det fremstilt monospesifikke antisera som når de ble testet mot rå antigen-preparater ved hjelp av utfelling-i-gelteknikk ut-felte bare det homologe antigen.

De monospesifikke antisera dannet mot antigener A og B kan anvendes for immunoadsorps jon smidde! 4^af f ini te tskr ornat ograf er ing s-rensing av antigenene. Ved en typisk preparering ble immunoglobulin G-fraksjonen av serumet koblet til fornettede agarosekuler (CnBr-aktivert "Sepharose") ved hjelp av fabrikant-anbefalte metoder. Konsentrert dyrkingsfiltrat fra S.mutans-stammen Ingbritt i 0,05 M Tris/HCl buffer pH 7,5 inneholdende 1% "Triton X-100" ble ført ned gjennom kolonnen.

Kolonnen ble så vasket med flere volum av Tris-bufferen før den ble eluert med enten Tris-buffer inneholdende 3M natriumtiocyanat eller 0,1 M glycin/HCl-buffer pH 2,8 (selv om andre eluerings-midler kan vise seg like tilfredsstillende). Metoden gir rene preparater av det ønskede antigen. Hvis det skulle opptre noen lekkasje av IgG fra kolonnen kan dette lett separeres fra antigenet ved ionevekslingskromatografering som allerede beskrevet.

Aminosyre-sammensetningen av det affinitetsrensede antigen.ble bestemt etter hydrolyse i 48 timer ved 105°C i 6 N HCl og er vist i den etterfølgende tabell 1.

Bedømmelse av antigeniske og beskyttende egenskaper.

Antigener A og B ble eksponert på overflaten av bakterien og virker som immunogener. Forsøk vedrørende immunisering av flere dusin kaniner og aper har således vist at antistoff-reaksjoner mot antigener A og B er markert sterkere enn mot andre antigener. Denne effekt er endog mer markert når dyrene er immunisert med cellevegg-anrikede preparater. Som beskrevet ovenfor vil SDS-ekstraherte vegger trekke ut antistoffer til bare A og B, mens vegger underkastet mindre rigorøs ekstraksjon gir fremdeles deres mest kraftige reaksjoner til A og B mens svakere reaksjoner til ikke mer enn to andre antigener er blitt iakttatt.

Antistoffer kan påvises ved konvensjonell teknikk med kryss-immunoelektroforese eller reversert påskyndet linje-elektroforese.

Kvantifisering av antis.tof f-reaksjoner er blitt gjennomført ved enzym-forbundet immunoadsorpsjonsmiddel-forsøk (ELISA) etterfulgt, av mikroplate-teknikk i henhold til Voller, Bidwell og Bartlett (1977, Flowline Publications). Plast-mikrotiterskåler ble be-lagt med immunoaffinitetsrensede antigener A eller B ved kon-sentrasjoner på omtrent 1 mikrogram/ml.

Bedømmelse av mengden av ape-antistoff som binder til antigenet ble oppnådd ved inkubering med anti-human IgG konjugert til alkalisk fosfatase. Resultater er blitt ut-

trykt enten som en endepunktbestemmelse (dvs. endepunktet for en fortynningsserie som viser en tydelig farge), eller ved å

måle absorpsjonen ved 405 nm av en serumprøve ved en spesiell fortynning.

Immunogenisitet av hele celler.

Flere forsøk hvor aper med hell er blitt immunisert med hele celler av S.mutans er beskrevet som angitt ovenfor (Bowen et al, Brit. Dent. J. 1975 og Cohen et al Brit. Dent. J. 1979) med reduksjon i karies på 50% eller mer. Med et representativt forsøk ble 4 forsøksdyr og 2 kontrolldyr behandlet tilsvarende med drepte hele celler (gruppe 14 i henhold til Cohen et al, British Dental Journal, bind 147, 1979, sidene 9 - 14). Injeksjoner ble gitt ved månedene 0, 2, 5, 6, 12 og 18. Midlere antistoff (IgG) nivåer i forsøksgrupper og kontrollgruppene er vist i fig. 1. Nivået for antistoffer etter 12 måneder overfor antigen A var minst 30 ganger så stort som i kontrolldyrene, selv om dette nivå falt mellom tilførslene. Det må nevnes at det er usannsynlig at så mange injeksjoner er nødvendig for beskyttelse, men dette aspekt er ikke ytterligere undersøkt.

Fire år etter begynnelsen av forsøket hadde kontrolldyrene et middeltall på 5 karies-skader i deres permanente tenner, mens de immuniserte dyr hadde et midlere tall på 2 skader.

Fra disse resultater kan det sees at det er en tydelig sammen-

heng mellom nivåene av antistoffer til antigen A og beskyttelse mot dental-karies. Antistoffer til antigen A forekommer bare sjelden og med lave nivåer i ikke-immuniserte tilfeller. Slike "naturlige antistoffer" overfor antigen B er også blitt iakttatt i mange tilfeller. Det er ikke kjent når disse antistoffer frem-kom eller om de skyldes antigenisk stimulering av S. mutans på tennene, systemisk infeksjon av S.mutans, eller kryss-reaktivitet av antigener eller andre bakterier hvortil dyrene har en immunreaksjon.

Ved et annet forsøk ble en gruppe på 8 aper immunisert med hele celler pluss aluminiumhydroksyd-tilsetningsmiddel ved subkutan injeksjon i benet (gruppe 11 i henhold til Cohen et al, British Dental Journal, som ovenfor) og sammenlignet med 8 kontrolldyr.

I denne gruppe ble nivåene for antistoff til antigen A forhøyet

i alle kontrolldyr idet den midlere bestemmelse var 1/520 (merk at på grunn av variasjoner i fremgangsmåten er det ikke mulig å sammenligne de bestemmelser som her er fremlagt for forskjellige grupper). Den midlere bestemmelse i dyr immunisert med hele bakterier var imidlertid 6 måneder etter en kraftig injeksjon

1/2830 - mer enn 5 ganger nivået i kontrollene. Antistoffer til antigen B var også tilstede i immuniserte dyr. En 55% nedsettelse av karies ble iakttatt for immuniserte i forhold til kontrolldyrene.

Immunogenisitet av brutte cellevegger.

Immunisering med brutte cellevegger av stammen Ingbritt som beskrevet av Bowen et al (British Dental Journal, 1975, sidene 45 - 58) er blitt vist og medfører beskyttelse mot etterfølgende an-grep av denne stamme. Immunisering med trypsiniserte cellevegger medfører ikke beskyttelse og dette viser at et protein er involvert i beskyttelsesprosessen.

Sera ble samlet fra 4 forsøksaper immunisert med et cellevegg-preparat av Ingbritt-stammen og angrepet med den samme stamme

som beskrevet for gruppe C av Bowen et al. 5 kontrollaper ble lignende angrepet uten immunisering.

Kontrolldyr hadde innhold av antistoff til antigen A på < 1/20

(3 dyr), 1/80 (1 dyr) og 1/1280 (1 dyr) mens de immuniserte og beskyttede dyr hadde bestemmelser mellom 1/80 og 1/640 med en middelverdi på 1/220. Disse verdier ble oppnådd fra serumprøver tatt 20 måneder etter den siste kraftige injeksjon. Nivåene

ville selvfølgelig vært høyere umiddelbart etter en kraftig til-førsel . 5 år etter begynnelsen av forsøket var det totale antall av karies-skader i de 4 forsøksdyr 4. I de 5 kontrolldyr var det totale antallet skader 64 og antallet hadde et inverst forhold til nivået for antistoffer i serumet, idet de to kontrolldyr som ikke viste noen antistoff-reaksjon viste kraftig karies.

9 år etter begynnelsen av forsøket er det 5 overlevende dyr, 2

av den immuniserte gruppe og 2 kontrolldyr har dødd. De tre overlevende kontrolldyr er alle utsatt for kraftig karies med hen-holdsvis 56, 69 og 93 ødelagte overflater. En eneste liten skade har utviklet seg i en tann på ett immunisert dyr, mens de andre forblir karies-fri.

Immunogenisitet av rent antigen A.

Det fra de ovennevnte resultater klårt at antigener A og B injisert som komponenter av hele bakterier eller bakterie-cellevegger er istand til å medføre en immunreaksjon når ikke noe tilsetningsmiddel er tilstede (gruppe C) eller når aluminiumhydroksyd-tilsetningsmiddel tilsettes (gruppe 11). Immunisering med de rene antigener krever imidlertid nærvær av tilsetningsmiddel for eh hurtig og vedvarende reaksjon. Reaksjoner for en enkelt ape (omtrent 5 kg kroppsvekt) immunisert med 50 mikrogram antigen A (fremstilt som beskrevet ovenfor under anvendelse av ammoniumsulfat-utfelling) med aluminiumhydroksyd er illustrert i fig. 2.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte for rensing og isolering av et antigenpreparat fra bakterier av arten Streptococcus mutans ved dyrking av bakterier i et dyrkingsmedium for å frembringe en cellekultur, fjerne i det minste celleveggene fra den nevnte cellekultur for å fremstille en proteinoppløsning og separere antigenpreparatet fra proteinoppløsningen, hvor antigenpreparatet inneholder bare antigene proteiner som har følgende egenskaper: 1) de er tilstede på celleveggen av Streptococcus mutans genetisk gruppe I, 2) de kan ikke ekstraheres fra de nevnte cellevegger ved koking med 10 g/liter natriumdodecylsulfat i 20 minutter, 3) de har en molekylvekt på omtrent 29.000, 4) de har et"isoelektrisk punkt på mellom 4,1 og 4,5, 5) ved behandling av proteolytisk enzym vil de ikke danne noen precipitinlinjer ved testing av immunodiffusjon mot antiserum til natriumdodecylsulfat-ekstraherte celler av S. mutans, og 6) de stimulerer ikke dannelse av antistoffer som kryssreage

rer med humant hjertevev,

karakterisert ved at antigenpreparatet separeres fra proteinoppløsningen ved hjelp av en separeringsmetode som omfatter at proteinoppløsningen bringes i kontakt med et immobilisert antistoff, uønskede materialer vaskes bort fra det immobiliserte antistoff og antigenpreparatet elueres fra det immobiliserte antistoff, hvor det immobiliserte antistoff har en spesifisitet for ett eller flere antigene proteiner som har de ovennevnte egenskaper.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at bakterien er en stamme av S. mutans serotype c.