CS223812B2 - Method of making the 6-aminopenicillane acid - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu výroby 6-aminopenicillanové kyseliny hydrolýzou penicilinu G, při kterém se vodný roztok penicilinu G o koncentraci 1 až 6 % hmotnost/ /objem hydrolyzuje při pH v oblasti 8 v přítomnosti penicllinacylázy uložené ve vláknech z triacetátu celulózy.

Vynález se týká způsobu výroby kyseliny

6-aminopenicillanové enzymatickým štěpením přírodního penicilinu G.

Způsob podle vynálezu je založen na použití enzymatických přípravků, které jsou uložením ve vlákně učiněny nerozpustnými. Tím se dosáhne značného zlepšení vlastností konečného produktu a významného zjednodušení operací a v důsledku toho i snížení ceny.

Je zn^ámo, že ji^ž několik tet je 6-aminopenici^llanov^{á ky}selina (^dále tá^{ké 6}~APA) cennou výchozí látkou pro výrobu polosyntetického penicilinu.

Příprava 6-APA přímou fermentací pomocí Penicillium chrysogenum v nepřítomnosti prekursoru je po technické stránce velmi složitá a výtěžky jsou velmi nízké.

Nedávno byly navrženy chemické způsoby, které jsou relativně nákladné, vyžadují s^ctálrá technologii v ^důsle^dku nestálosti výchozích a konečných produktů _ a způsobují rozklad produktů, spojený se značnými ztrátami.

!Při používaných enzymatických způsobech se ^pou^žív^{á b}un^ěk v^ho^dnýc^h mi^kroorgamsmů ^kter^é vyráběj ^penicilinac^ylásu. Jeliko^ž se těchto buněk může použít pouze jednou při relativně vysoké koncentraci (pro zkrácení doby hydrolýzy), je třeba čas od času fermentací vyrobit buňky obsahující enzym.

Kromě toho extrakce hydrolytického produktu 6-APA z reakční směsi je velmi složitá a výsledný produkt vyžaduje opakovanou krystalizaci a velmi často obsahuje bílkovinný materiál, který způsobuje, pokud se neodstraní, například rozkladem proteolytickými enzymy, alergie při použití výsledných penicihnů.

To všechno zvyšuje ceny a způsobuje, že je výrobní tec^hnolo^gie zna^čně slo^té.

Způsob podle vynálezu představuje v tomto ohledu značné zlepšení.

Enzymattelte ^přípravy ute^žené do vláknité struktory si udr^žují svou účinnost ^po velmi dlouhou dobu. Vzorky 'tohoto typu si při opakujících se pracovních -cyklech udržely svou účinnost po 12 měsíců takřka nezměněnou.

Prodloužená účinnost struktur podle vynálezu má vedle zřejmých výhod navíc výhodu ve zjednodušení způsobu, přičemž vliv ceny enzymatického katalyzátoru na výslednou cenu produktu je velmi malý nebo takřka zanedbatelný.

Předmětem vynálezu je způsob výroby 6-aminopenicinanové kysehny ^hydro^lýzou penicilinu G, vyznačující se tím, že se vodný roztok pei^i^i^i^^Linu G o koncentraci . 1 až 6 pro^ ^hmo^tnost/objem h^ydro^lyzuje pn pH v oblasti 8 v přítomnosti penicilinacylázy ute^žen^é ve v^láknec^h z ^- triacetátá celutezy.

Vlákno obsahující enzym vyrobené zvlákňováním se před použitím promyje, aby se odstranily z vnějšku adsorbované nečistoty, a ptom se ho použije na katalýzu reakce. Vzhtedem к tom^ ^že protein nemů^že difundovat do- reakčního prostředí, získá se vysoce čistý produkt, který kromě jiného neobsahuje bílkovinné nečistoty tak nebezpečné v důsledku alergekých reakcí. Katalyzátoru, který je úpravou podle vynálezu z^baven roz^pus^tnosti^, se mfe ^pou^žít diskontinuálně. Katalyzátor se uvede do styku s reakční směsí, po skončení jeho půso^ben^{í, t}j. ^hydro^lýz^y se oditelí od rea^kčn^í směsi a uvede do st^yku s novou ^šar^ží ěerst:v^é směsi.

Stejného katalyzátoru se může rovněž pou^ží^t pn ^kontinu^áln^ím způso^bu v ^kotoně. Roztok penicilinu v koloně, vhodně pufrovaný, se vede kolonou obsahující vlákno s enzymem. Vhodným nastavením rychlosti toku a množství vlákna je možno získat vytékající směs s nejvyšším stupněm hydrolýzy.

Enzymatický katalyzátor se připravuje způsobem popsaným v italském patentu č.’

836 462. Podle tohoto patentu se vlákna s uloženým enzymem mohou vyrobit zvlákně-.

rám rozto^ků v^lá^kno^tvornýc^{h p}o^lymerů ve * kterých jsou dispergovány enzymatické přípravky ve velmi malých kapičkách o veli^kosti ř^ádov^ě stejné ja^ko jsou ^kapič^ky emulze.

„^Emu^lze“ se mo^hou zv^lákňova^t za sucha nebo za mokra. Získané vlákno obsahuje uvnitř drobné dutiny, - ve kterých jsou uloženy enzymy. Enzymy jsou odděleny od okolí velmi 'tenkou membránou, která zabraňuje uniknutí enzymů a jejich dispergaci v rea^kčrá směst ate umornuje jejteh ^katalytické působení.

Jako vláknotvorného polymeru se pro uložení enzymu v případě způsobu podle vynálezu používá triacetátu celulózy.

Jako enzymatte^ho matertáhi se může použít surového extraktu získaného z buněk bakterií (E. coli, B. Megaterium, Aerobacter aerogenes, Alcali^gener faecalis atd.).

Při hydrolýze, kterou se má získat 6-APA, se mů^že v^yc^házet z vo^dn^ého rozto^ku ^pou^žité soli penicilinu o koncentraci v rozmezí ¹ a^{ž 6} % (^hmΌ^tnos^t/objem)^, ^ednos^ o ^ncentraci 2 a^ž 3 °/o. Hodnota ^pH rozto^ku se udržuje - okolo 8,0 automatickým přidáváním zásady.

Při ^koztizuá¹mm provozu se m^ůže pou^žít vhodně tlumeného roztoku penicilinu, pro- J tože regulace pH v různé výšce kolony je obtížná.

Hydrolýza penicilinu G (benz^ylpemcШzu) se může ^prov^ádět pn teprntě o^{d 15} d.o ⁶⁰ stupňů Celsia, výhodně od 37 do 40 °C.

Příklad 1

Za míchání se v reaktoru rozpustí 20 g triacetátu celutezy (Fh^a) ve ²⁸⁰ g me^ten^ortou (C. ^Er^ba). ^V jrné nátotě se ^připrav^í rozto^k enz^ymu násleďujteta zp^ůsobem: buňky Es-cherichia Coli (60 g vlhké váhy), získané fermentací na vhodném prostředí v přítomnosti kyseliny fenyloctové, se převedou do fosfátového pufru 0,01 M o pH 7,0. Surový produkt, který se takto získá, se zahřívá tří minuty na 50 °C a, poté se sráží síranem amonným až do dosažení pH 5,5. Frakce získaná v rozmezí hodnoty 25 až 75 %l nasycení se oddělí. Tato frakce se rozpustí v 30 ml fosfátového pufru 0,01 M o pH 8, obsahujícího 30 °/o objemových glycerinu. Získaný enzymatický roztok se přidá к roztoku polymeru. Emulgace obou fází se dosáhne intenzívním třicetiminutovým mícháním při 0 °C.

Emulze se převede do malého zásabníku, udržovaného při teplotě -6 °C, a potom se pod dusíkem zvlákní. Koagulace vlákna se provádí v toluenu při teplotě místnosti.

Toluen se odstraní několikahodinovým vakuovým sušením.

Do skleněné kolony, vybavené termostatovaným pláštěm o výšce 70 cm a průměru 3 cm, se umístí 37 g vláken. Vlákna se promývají vodou a glycerinem až do vymizení bílkovin z promývacích louhů.

Kolonou se nechá cirkulovat 600 ml vodného roztoku 2 % hmotnostních [hmotnost/objem) draselné soli penicilinu G (Squibb), Hodnota pH se udržuje na 8,0 kontinuálním přidáváním 0,5 N NaOH pomocí zařízení к udržování konstantního pH. Kolona se termostatuje na 37 °C. Po 5 hodinách, kdy se rychlost spotře-by sody sníží na 1/20 původní hodnoty, se reakční směs odtáhne, zchladí na 3 °C, okyšelí 2 N HC1 na pH 3,0 (33,5 ml 2 N HClj a extrahuje dvakrát 200 ml butylacetátu.

První extrakt obsahuje 298 mg a druhý extrakt 2 mg penicilinu (stanovení pomocí hydroxylaminu). Vzhledem к tomu, že celkové množství nasazeného penicilinu bylo 12 g, je konverze 97 °/o. Chromatograficky se nezjistí žádné rozkladné produkty. Hodnota pH vodné fáze (800 ml), prosté zbytku nezreagovaného penicilinu a kyseliny fenylootové, se upraví přidáním 33 ml 2 N NaOH na 7,0 a poté se za vakua při 37 °C odpaří na objem 110 ml.

Koncentrovaný roztok 6-APA se ochladí na 0 °C a jeho pH se upraví 3 N HC1 na 4,2. 6-APA se vysráží, odfiltruje a za vakua vysuší při 45 °C do konstantní hmotnosti (6,6 gramu).

Obsah 6-APA ve vodných matečných louzích z krystalizace (130 ml) jo 0,4 °/o hmot.

Obsah 6-APA v krystalickém produktu stanovený pomocí hydroxylaminu je 97,5 °/o. Infračerveným spektrem, chromatografii a měřením optické otáčivostí se potvrdí, že se jedná o prakticky čistý produkt.

V průběhu 6 měsíců se přesně stejným jako shora popsaným způsobem provede 10 příprav 6-APA, vždy za použití stejných vláken obsahujících enzym, aniž dojde к citelnému poklesu produktivity.

Příklad 2

Postupuje se za stejných podmínek jako v příkladu 1 a zvlákňováním se vyrobí vlákno s uloženým enzymatickým přípravkem, z buněk Escherichia Coli, přečištěným stejným způsobem jako v příkladu 1, ale patnáctkrát.

Aktivita stejného množství vláken jako v předcházejícím příkladu je desetkrát vyšší.

Do stejné kolony jako v příkladu 1 (objem 480 ml) se uvede 37 g vláken. Vlákna se promyjí vodou a glycerinem až do vymizení bílkovin z promývacích louhů.

Do zásobníku o objemu 5 1 se na počátku uvedou 3 1 vodného roztoku draselné soli penicilinu G (Squibb) o koncentraci 2 % hmot.

Roztok se kontinuálně čerpá do kolony s vláknem přes zásobník. Aby se snížila doba hydrolýzy, je třeba zajistit naprostou homogenitu reakčního prostředí, směs v zásobníku se proto intenzívně míchá a recirkuluje sé rychlostí 500 ml/min.

Hodnota pH se udržuje na 8,0 přidáváním vodného 0,5 N NaOH pomocí zařízení к automatickému udržování pH. Teplota reakční směsi se automaticky udržuje na 37 °C termostatováním kolony.

Průběh hydrolýzy se může sledovat na základě spotřeby roztoku NaOH, registrované na zapisovači. Po dvou hodinách a 10 minutách klesne rychlost spotřeby hydroxidu sodného na méně než 5 % původní rychlosti. V tomto okamžiku se reakce zastaví a směs se odebere z oběhu. Spotřeba 0,5 N NaOH je 310 ml. Z oběhu se odtáhne celkem 3300 ml volného roztoku, obsahujícího 6-APA, kyselinu fenyloctovou, vzniklé hydrolýzou a zbytek nezreagovaného penicilinu.

Kyselina fenyloctová a penicilín se z reakční směsi odstraní extrakcí butylacetátem. Extrakce se provádí dvakrát vždy 1100 mililitry čerstvého rozpouštědla následujícím způsobem:

Reakční směs se umístí v zásobníku o objemu 6 1, vybavené míchadlem¹. Po ochlazení na 5 °C se hodnota pH nastaví přídavkem vodného 1 N roztoku HC1 na 3. Přidá se 1100 ml butylacetátu a mícháním se provede dobrá dispergace mezi vodnoua organickou fází. V průběhu míchání po dobu 15 minut se kontinuálním přidáváním 1 N HC1 udržuje pH na konstantní hodnotě. Poté se nechá směs 20 minut stát při 5 °C. U dna se vytvoří vodná fáze, která je lehce zakalena přítomností stop rozpouštědla ve formě velmi jemných kapiček, vrchní vrstvu tvoří čirá organická fáze. Fáze se rozdělí v děličce a z emulze butylacetátu ve vodné fázi se čistá vodná fáze získá odstředěním.

Celé množství vodné fáze se zpracuje ještě jednou stejným- způsobem s 1100 ml čerstvého rozpouštědla a vodná fáze se izoluje stejným způsobem. V průběhu obou extrakcí še použije 180 ml vodného 1 N roztoku HC1.

V obou butylacetátových frakcích se zjišťuje za použití hydroxylaminu přítomnost penicilinu. V první frakci, pocházející z první extrakce, je obsah' penicilinu 3 mmol/1, ve druhé frakcí není penicilín' obsažen.

Hodnota. pH vodné fáze, získané při extrakci, se upraví přidáním 165 ml vodného 1 N roztoku NaOH na 6,9 a potom se vodná fáze za vakua odpaří v rotačním odpařováku. Termostatovaná lázeň rotačního' odpařováku se' udržuje při 45 °C, teplota chladicí kapaliny v kondenzátoru je —5 °C, tlak na sací straně vývěvy je 1 torr. V průběhu 5 hodin se objem vodné fáze sníží na 1,8 původního objemu.

Zbytek se převede do jednolitrové baňky, ochladí se na 2 °C a potom se přídavkem 6 N HC1 upraví na 4,2. Během úpravy pH se vysráží v krystalické formě 6-APA. Sraženina se' oddělí vakuovou filtrací a potom se za vakua vysuší (0,5 torru při 45 ^CC) do konstantní hmotnosti. Získá se 32,4 g produktu. Matečné louhy z krystalizace (450 mililitru) se titrují hydroxylaminem a zjistí se, že ' ' obsahují 180 mmolu/1 6-APA, což odpovídá 0,39 % hmot.

Získaná 6-APA se znovu rozpustí ve vodě a titruje hydroxylaminem. Porovnáním se standardním roztokem velmi čisté 6-APA, přečištěné několikanásobným překrystalováním, se zjistí, že obsah čisté 6-APA v produktu ' je 98,5 %. Z původních . 161 mmolů penicilinu se získá

32,4 x 0,985

216 = 147 mmolu 6-APA.

Za předpokladu, že výchozí produkt je čistý, je celkový ' výtěžek 6-APA 91,4 % teorie.

Při ' kontinuálním' provozu se mohou matečné louhy z krystalizace částečně recyklovat ' a ' potom ' vakuově odpařovat. Tím lze celkový výtěžek produktu zvýšit až do mezní hodnoty 95 % teorie.

Claims (3)

1. Způsob výroby 6-amiiU)oenicillanové kyseliny hydrolýzou penicilinu G, vyznačující se tím, že se vodný roztok penicilinu G o koncentraci 1 až 6 % hmotnost/objem· hydrolyzuje při pH v. oblasti 8 v přítomnosti ee.nicilinacylázy uložené ve vláknech z triacetátu celulózy.

2. Způsob podle bodu 1 vyznačující se tím, že na hydrolýzu se používá vodného roztoku ' penicilinu G ' o koncentraci 2 až 3 % hmotnost/objem.

3. Způsob podle bodu 1 vyznačující se tím, že se roztok penicilinu G přivádí ' do hydrolyzační zóny spolu s pufrem.