CS220319B2 - Agent for detecting the presence of ascorbic acid - Google Patents

Description

^Vyn^ález se ^tý^{ká d}etekce přítomnosti kyseliny askorbové v testovaných vzorcích. Přesněji se týká analytického prostředku a ' směsi jpoužitekm ^pro stanovení ^temnosti kyseliny askorbové v kapalném vzorku.

Anatyza různých tyz&álně cliemickýcli s^ystémů na přítomnost redukujících činidel je ^během ^le^t prov^ádjna ímznými metodami - za použití ^-různýc^h ctemiltólií. ^Některé tyto metody zahrnují chemické techniky prováděné za mokra, zaHmco jrné napřMad ^C~^STI^X © reak^čn^í papír^ky do^dávan^é firmou Ames Compan^y Divismn o^f Mles ^La^boratories^, lne. v^yužívají vý^ho^dy meto^dy nazývané „ponoř a ^čti“.

Z cliemickýcli meM ^pro analýzu pritomnosti redukčního činidla prováděných za mok^ mají n^ěkter^é záhadní ^ležttost. Ta^k se jedná o redukci kyseliny jodisté, fosfomolyMenovou ^kyselⁱnu^{, F}ehlrng^ův roztok Tollensovo činidlo, Nesslerovo činidlo, o-dinitrobenzen, p-nitrosodimethylanilin, kyselinu seleničitou a met^hyle.novou modř. Veškeré tyto metody jsou diskutovány v knize Fritz Feigl: Spot Tests in Organic Analysis, Elsevier Publishing Company (1966) a H. R. Rosen^berg^, Chemistr^y an^d Ph^ysiolo^gy o^f the ^- foterscwnce

Publishers (¹⁹⁴⁵).

Dosavadní -metody Icliniclcého stanov.em kyseliny askorbové zahrnují titrace jodem, ²,6-dichlor^fenolmdofenoiem^, met^hytenovo^u modří a reakci s Folinovým činidlem, molybden-fosfowolframovou kyselinou, směsí ^kyan^idu železitého a mo^lybdenanu amonného, fosfomolybdenovou kyselinou, uranylacetátem, vanadiem, diazoniovou solí sulfanilové kyseliny, suifanilamidem, kyselinou ‘seleničitou, chloridem zla^titým^, cMoridem rtufnatým, - směsí síranu měďnatého a thiokyanátu amonn^ého^, síranu železna^tého^, k^yanidu železitého, kyselinou chlorovodíkovou (furfuralový test), kakothelinem, manganistanem a kyanidem železítým (metoda pruské modře). Veškeré tyto metody jsou po^psán^y v H. R. Rosei^er^ Chemistr^y an^d Physiology of the Vitamins, Interscience PuMis^^ New Yor^k (194⁵).

USA - patent č. 3 771 964 popisuje prostře^dek pro testoval a směs pro stanovení přítomnosti ^kyselm^y askor^bové v ^kapahn^ác^h jako je moč. Směs zahrnuje alespoň jednu sůl fosfomol^ybdenové k^yselrn^y a s^ů kyselin^{y d}usicm^é. ^Prost^ře^de^{k ty}pu „pono^ř a čti“ se připraví nanesením směsi na suchý nosič, jako je papír. Přítomnost kyseliny askorbové v testovaném vzorku způsobuje, že ^prostředek se zabarvil mo^dře^{, př}i^čem^ž rn tenzita v^ybarvení je ^přímo z^ávis^lá na ^kon- centraci kyseliny askorbové ve vzorku.

Vynález 'byl nalezen při výzkumném programu, který měl za účel nalezení nového reakčního činidla ve formě reakčních ' pa^pír^ků ^pro stanovem ^kyselrn^y as^kort)ov^é v moči. Zejména byla žádána kontinuální odpověď v rozmezí koncentrace kyseliny as^kor^bov^é o^d asi 40 do 200 m^g %, což zahrnuje rozmezí kyseliny askorbové, jaké se obvykle nalézá v lidské · moči.

Předmětem vynálezu je tedy prostředek pro stanovení přítomnosti kyseliny askorbové v testovaném vzorku, který se vyznačuje tím, že sestává z nosiče, který obsahuje na kyselinu askorbovou citlivý indikátor obecného vzorce I

kde

R, ^R1 a R² jsou substiteenty stejn^é ne^bo různé a to atom vodíku nebo alkyl s 1 až 6 atomy uhlíku,

Q je aminoskupina nebo dialkylaminoskupina s 1 až 6 atomy uhlíku v každém z al^kylů a

G je atom vodíku, nitroskupina nebo hydroxyskupina, s tím, že neznamenají současně Q dimethylaminoskupinu, R methyl a G, ^R1 a ^r2 atomy vodíku.

Význam výrazu alkyl, jak je použit ve vynálezu, zahrnuje alkyly s 1 až 6 atomy uhlíku. Tak alk^yl zahrnuje metoyL ethy^l a ·veškeré isomery propylu, butylu, pentylu a hexylu. Prostředek obsahuje nosič napojený sm^ěsí a metoda zahrnuje uvedern testovaného vzorku, který má obsahovat kyselinu as^korbovou^, ve st^yk s ^prost^řed^kem pocUe vynálezu a odečtení detekovatelné odpovědi vyvolané na nosiči.

In^^tory; ^které tvoří jádro vyn^álezu jsou známé ja^ko thmzmová barvwa. Strulktur^y použité ve v^yn^álezu u^kazuj^{í ty}to slou^čenin^y v oxteovatetoém stavu ve toerém v^ykazuj^í tmav^ší barv^y. ^po uve^dem ve sty^k s ^kyselinou askoréovou ve vo^dn^ém roztoku převedou se tato oxidovatelná barviva na bezbarvý re^du^kovaný stav. ^Ta^k jesthže sloučenina tohoto typu se uvede ve styk s testovaným vzor^kem oteahujteím ^kyselrnu as^kor^bovou^, potom je^ho ^barva zesvětlá a je závislá na množství přítomné kyseliny askorbové. Pozorováním stupně vybarvení indikátoru se může přesně stanovit koncentrace kyseliny askorbové přítomné ve vzorku.

Colour · Index, třetí vydání publikovaném Society of Dyers an^d Colourists spolu s Američan Association of Textile Chemists and Colorists (1971) je standardní, průmyslem uznávaným indexem barviv, který zahrnuje mnohé indikátory podle vynálezu. Tyto sloučeniny jsou uvedeny pod C. I. čisty a tato notace je zde uve^dena s o^dkazem na Colour Index.

Ně^kter^é případy t^hiázmovýc^h barvw ^pou^žívanýc^{h p}o^dle vynátezu jsou Lautoova violeť (C. I. 52 000), azur A (C. I. 52 005), methylenová zeleň (c. I. 52 020) a toluidinová modř (C. I. 52 040).

I když fenomen blednutí barvy, který je vtastoí rndtaátoirnm ^po^dle vynátezu je sám o sobě dostačující pro kvalitativní a semikvantitativní základ analýzy, bylo nalezeno, že &^tále te^pší detelkovatetaou o^dpov^ěď je možno dosáhnout, jestliže se indikátor mů^že použtí ve s^pojem s pobo^čným- barvivém nebo barvivém použitým jako pozadí. Ta^kovýmto tarvivém jsou neutrálm červe^ň (C. L ⁵⁰ O⁴⁰). ^Ta^k na^prí^kla^d noste napojený neutrální červení a methylenovou zelern je p^ůvodn^ě temn^ě mo^drý, m^ění svou barvu na purpurovou, světle purpurovou a nakonec červenou, a to v závislosti na přítomnosti redukujícího činidla a jeho koncentraci. Tak barvivo použité jako pozadí umožňuje pozorovateli snadnějⁱ di^ferenciovat odpověď prostředku podle vynálezu tím, že dochází ke změně jedné barvy na dru^hou místo zm^ěny intenzity jedn^é barv^y. Místo pozorování blednutí methylenové zeleně ze zelenomodré ’ na světle modrou dochází za použití červeného barviva tvořícího pozadí spolu s methylenovou zelení k tomu, ze z ^po^čátečm modr^{é př}es ^pur^purovou a světle purpurovou dojde ke změně na červenou.

^Nosič podívaný v souvislosti s v^ynálezem m^ůže mh různé ^form^y. S ^výhodo^u se p^ouží^vá nasákhvý nosič^, do šerého se indtaátor m^ůže vpravit tak že se nosič uvede ve ^sty^k s rozto^kem ve v^hodn^ém roz^pou^ště^u ja^ko je voda^, etoanol ne^bo chloro^form. ^Tak nasákhvý noste se m^ůže ponořit do roztoku rndtoátoru, vysušit a získá se tak testovací prostředek.

Mternatívně se může noste potístovat buď ^k°ntⁱnuá^ln^ím ^povta^kem nebo v podstatě ^oddělenýmⁱ skvrnami ja^ko jsou pru^hy apocty přteemž tís^k se ^prová^dí kom^ponentou indikátoru ve vhodném nosiči.

Příklady vhodných nosičů jsou četné. Na^př^íkla^{d USA p}atent c. 3 ^{846 247} n^árokuje použití plsti, porézních keramických pás^ků a t^kanýc^h nebo matovanýc^h skteněnýc^h vtaken. Ja]ko n^áhraž^{ky p}ro ^pa^pír ^USA ^patent č. ^{3 552} 9²8 n^áro^kuje ^použití ^dřevěných tyčinek tafek houbovitých materiálů a hhmtých matertate. Použití s^yntetíc^kých ^pr^ys^kyřtených roun a s^klen^ěnýc^h vtaknitých plstí místo papíru je uvedeno v britském patente c. ¹-³6^{9 139}. Jiný brits^ký ^patent čís. 1 349 623 nárokuje použití světlo propouštějícího ten^kého povla^ku ^pokrývajíc^ího s^po^dm ^pa^pír. Jako referenční materiál ta^ké na vrhuje impregnovat papír částí reakčního systému a impregnovat síťovinu jiným neslučitelným reakčním činidlem. Konečně francouzský patent č. 2 170 397 nárokuje použití nosiče, který obsahuje více než 50 % polyamidových vláken.

Ve výhodném provedení testovacího prostředku se jako nosič používá porézní filtrační papír. Prostředek se muže připravit ponořením filtračního papíru do vodného roztoku indikátoru, jako je methylenová zeleň. Indikátorový roztok může dále obsahovat pufry, jako je kyselina citrónová, kyselina fosforečná, kyselina uhličitá nebo její soli, aniontové, kationtové a neiontové povrchově aktivní látky a ostatní vedlejší složky známé odborníkům připravujícím reakční pásky používané v technice ,,ponoř a čti“.

Po namočení do indikátorového roztoku se takto impregnovaný filtrační papír vysuší ve vzdušné sušárně. Vysušený nosič se potom může fixovat na podkladovou složku, jako je pruh polystyrenu, který slouží jako podkladový materiál pro nosič napojený reakční složkou. Nosič může být chráněn jakýmkoliv způsobem, jako je dvojitá adhezívní páska nebo porézní povlak.

Pří provedení podle vynálezu se může jako barvivo pro pozadí použít jakékoli vhodné barvivo, ale s výhodou takové, které je chemicky snášenlivé se sloučeninou používanou jako indikátor, a které nemění barvu v přítomnosti kyseliny askorbové, která se má stanovit. Neutrální červeň vyhovuje těmto kritériím a bylo nalezeno, že je zejména vhodná pro provedení podle vynálezu, jestliže se analyzuje kyselina askorbová v močí.

Metoda pro použití testujícího prostředku spočívá v ponoření prostředku do testovaného vzorku, který má obsahovat kyselinu askorbovou, a to na dobu 1 až 30 sekund nebo více a pozoruje se změna v množství absorbovaného světla nebo odraženého světla. Semikvantitativní stanovení koncentrace kyseliny askorbové se může provádět srovnáváním prostředku se sérií standardních barev. Tyto standardní barvy se mohou kalibrovat na známé koncentrace kyseliny askorbové.

Následující příklady popisují výhodné provedení vynálezu a uvádí srovnávací data ukazující relativní účinnost indikátorových sloučenin. Příklady jsou pouze popisující a vynález žádným způsobem neomezují.

Příklad 1

Prostředek pro testování

Prostředek pro testování podle vynálezu se připraví pro použití při testování vzorků moči na přítomnost kyseliny askorbové a pro stanovení její Koncentrace.

Nosič se připraví z filtračního papíru.

Kus tohoto papíru velikosti 13 x 3 cm se ponoří do roztoku obsahujícího indikátor, barvivo používané jako pozadí a různé vedlejší složky. Jmenovitě roztok obsahuje následující složky, rozpuštěné v 10 litrech destilované vody.

1,5 g methylenová zeleň

0,5 g neutrální červeň

126,95 g NaHzPOd. №0

11,35 g NasHPCH.

Změřená hodnota pH tohoto roztoku byla 5,8. V případě potřeby pH se může upravit na 5,8 použitím 5M roztoků NaOH nebo HC1.

Takto impregnovaný filtrační papír se potom vysuší ve vzduchové sušárně při 50 ^CC po dobu 20 minut.

Vysušený filtrační papír, který je zbarven temně modře, se rozstříhá na kousky velikosti 1 x 0,5 cm a tyto se potom individuálně umístí na držadla velikosti 8 x 0,5 centimetru. Tato držadla jsou vyrobena z čirého bezbarvého, flexibilního polystyrénového proužku s hladkým povrchem. Polystyrénový proužek je 0,02 mm silný. Matrice impregnovaného filtračního papíru byly připojeny na polystyrénová držadla pomocí dvojité adhesivní lepicí pásky.

Příklad 2

Hodnocení testovacího prostředku podle příkladu 1.

Pro stanovení účinnosti testovacího prostředku připraveného' podle příkladu 1 pro stanovení koncentrací kyseliny askorbové v moči na semikvantitativní bázi se provede následující pokus. Jednotlivé vzorky moči se připraví tak, že obsahují 0,25, 50, 100 a 200 mg % (mg na 100 ml) kyseliny askorbové. Připraví se proužky reakčních papírků postupem podle příkladu 1. Jednotlivé reakční proužky se potom ponoří do odpovídajících vzorků po dobu 1 až 2 sekund a poté se odstraní. Každý nosič se po ponoření nechá vyvíjet po dobu 60 sekund a potom se hodnotí vybarvení.

Bylo nalezeno, že v závislosti na koncentraci kyseliny askorbové v moči původní temně modré zbarvení vybledne pozorovatelným způsobem závisejícím na koncentraci kyseliny askorbové v moči, a tak se mohou odlišit jednotlivé vzorky v rozmezj 0 až 200 mg % podle typu změny barvy. Žádná změna barvy nebyla pozorována při 0 mg %. Při koncentraci 25 mg % kyseliny askorbové se vybarvení mění z temně modré na modrou s odstínem do purpurové, při 50 mg % je vybarvení purpurové, při 100 mg % je světle purpurové a při 200 mg % je červené, to je barva barviva používaného jako pozadí. Tak pro koncentrace 200 mg % se proužek změní z temně modrého vybarvení na červené.

Příklady 3 až 10

Hodnocení různých thiazinových barviv pro použití jako indikátorů

Byla provedena série pokusů, aby byla stanovena použitelnost reprezentativního počtu thiazinových barviv, jakožto indikátorů. S překvapením bylo nalezeno a výsledky pokusů to dokazují, že pouze sloučeniny obecného vzorce I jsou dostatečně vhodné pro použití jako činidla pro detekci kyseliny askorbové v moči.

Vzorky filtračního papíru velikosti 7,5 x x 10 cm se impregnují roztoky indikátorů uvedených v tabulce. Každá sloučenina použitá jako indikátor se upraví na roztok obsahující asi 50 mg indikátoru v asi 5 ml pufru kyseliny citrónové a citrátu sodného pH 4. Filtrační papír se impregnuje odděleně 25 μ\ každého pufrovaného roztoku. Tak filtrační pa/pír obsahuje celkem 25 skvrn, z nichž každá odpovídá jednomu indikátoru. Takto se připraví 4 proužky filtračního papíru velikosti 10 x 7 cm.

Pro stanovení relativní použitelností každého indikátoru pro detekci kyseliny askorbové se 25 μΐ vzorku kyseliny askorbové v moči nanese na každou indikátorovou skvrnu. Tento roztok obsahuje 1 g kyseliny askorbové na 100 ml moči (1000 mg %]. Indikátory se hodnotí nanesením vzorku kyseliny askorbové na příslušnou skvrnu indikátoru a po 60 sekundách se hodnotí změna vybarvení. Relativní použitelnost každého indikátoru se stanoví hodnotou rychlosti změny blednutí indikátoru.

Ten indikátor, který bledne rychle, má přiřazenou hodnotu 5, zatímco indikátor, který bledne pomalu nebo vůbec, má přiřazenou hodnotu 1 nebo 0. Vysoká koncentrace kyseliny askorbové 1000 mg % byla vybrána tak, aby se minimalizovalo nebezpečí experimentální chyby. Tak indikátor s rychlostí blednutí 1 při 1000 mg % kyseliny askorbové by nebyl funkční u prostředků, které jsou potřeba pro detekci hladiny kyseliny askorbové do 200 mg %. Výsledky tohoto pokusu jsou shrnuty v dále uvedené tabulce.

η CQ < Η

о о о	СМ О о	ш о о
СМ	см	см
Ю	ю	ш

О гЧ о

О1 ю

Claims (3)

1. Prostředek pro stanovení přítomnosti kyseliny askorbové v testovaném vzorku, vyznačený tím, že sestává z nosiče, který obsahuje na kyselinu askorbovou citlivý indikátor obecného vzorce I různé a to atom vodíku nebo alkyl s 1 až 6 atomy uhlíku,

Q je aminoskupina nebo dialkylaminoskupina s 1 až 6 atomy uhlíku v každém z alkylů a

G je atom vodíku, nitroskupina nebo hydroxyskupina s tím, že neznamenají současně Q dimethylaminoskupinu, R methyl a G, R¹ a R² atomy vodíku.

2. Prostředek podle bodu 1 vyznačený tím, že jako indikátor obsahuje Lauthovu violeť nebo azur A nebo methylenovou zeleň nebo toluidinovou modr.

3. Prostředek podle bodu 1 vyznačený tím, že jako indikátor obsahuje methylenovou zeleň.

kde

R, R¹ a R² jsou substituenty stejné nebo