CS216029B1 - Způsob fermentační přípravy kyseliny L-asparagové anebo L-glutemové - Google Patents

Abstract

Vynález se týká způsobu fermentační přípravy kyseliny L-asparagové anebo L-glutamové za běžných podmínek, ale s tím rozdílem, že se do živná půdy v průběhu růstová fáze produkčního mikroorganismu přidává antibiotikum peptidováho charakteru typu penicilinu G nebo jeho polosyntetický derivát typu cefalexinu. Kyselina L-asperagová a L-glutamové jsou součástí léčiv a významné výchozí produkty syntézy peptidů.

Description

(⁵⁴) Způsob fermentační přípravy kyseliny L-asparagové anebo L-glutemové

Vynález se týká způsobu fermentační přípravy kyseliny L-asparagové anebo L-glutamové za běžných podmínek, ale s tím rozdílem, že se do živná půdy v průběhu růstová fáze produkčního mikroorganismu přidává antibiotikum peptidováho charakteru typu penicilinu G nebo jeho polosyntetický derivát typu cefalexinu.

Kyselina L-asperagová a L-glutamové jsou součástí léčiv a významné výchozí produkty syntézy peptidů.

216 029

216 C29

Vynález se týká způsobu fermentační přípravy kyseliny L-asparagové anebo L-glutamové produkčními kmeny mikroorganismů Corynebaeterium glutamicum nebo Brevibacterium flavum, standardně produkujícími L-lysin, pokud mají v médiu k dispozici homoserin a leucin, popřípadě dalěí aminokyseliny a které jsou současné rezistentní k některým analogům L-lysinu, například S-aminoethyl-L-cysteinu. Tyto mikroorganismy produkují za standardních podmínek L-3ysin. Působením některých antibiotik, které jsou přidávána v limitovaném množství do média v růstové fázi kultury, dochází k inhibici syntézy L-lysinu. Za takto upravených podmínek kultivace je asimilovatelný zdroj uhlíku konvertován na jiné aminokyseliny, zejména kyselinu L-asparagovou a kyselinu L-glutamovou nebo jejich směs, které jsou uvolňovány z buněk do prostředí. Hromadění kyseliny L-asparagové probíhá zřejmě v důsledku inhibice některé z enzymatických reakcí v biosyntetické dřáze L-lysinu a akumulace kyseliny L-glutamové je vázána na intenzivní transaminaci mezi kyselinou L-asparagovou a alfa-ketoglutarovou. Vznikající kyselina oxaloctová se může dále zapojovat do reakcí Krebsova oyklu.

Na základě uvedených poznatků byl vypracován způsob fermentační přípravy kyseliny L-asparagové nebo L-glutamové produkčními kmeny mikroorganismů Corynebaeterium glutamicum nebo

Brevibacterium flavum, standardně produkujícími L-lysin, kultivací v tekuté živné půdé^, obsahující zdroje asimilovatelného uhlíku a dusíku, minerální živné soli, vitaminy a jiné biofaktory, za aubmerzních podmínek, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se do živné půdy přidává v průběhu růstové fáze mikroorganismu antibiotikum peptidového charaktetypu ru penicilinu G nebo jeho polysyntetický derivát typu cefalexinu, v množství 5 až 50 yg/ml živné půdy, s výhodou 10 yg/ml.

Uvedená antibiotika se mohou jako biotinové regulátory významně uplatňovat při stimulaci produkce L-lysinu u výše uvedených produkčních kmenů Corynebaeterium glutamicum a Brevibacteriuu flavum, jsou-li dávkována do fermentačního média v produkční fázi, t.j. po ukončení růstu mikroorganismů. Podobný efekt peptidových antibiotik na produkci kyseliny L-glutamové u Brevibaoterium lactofermentum je znám, například z japonského pat.spisu č. 7 917 183.

Kyselina L-asparagová je aminokyseliny, která se obvykle připravuje enzymaticky, a to působením enzymu L-aspartázy z mikroorganismu Escheriohia coli nebo z jinýoh mikroorganismů, b|.otransformací kyseliny fumarové v přítomnosti amonných iontů. Tento způsob výroby kyseliny Lfaspsragové je realizovatelný v průmyslovém měřítku, jeho ekonomika je však limitována dostupností výchozí kyseliny fumarové.

Kyselina L-glutamová se připravuje výhradně fermentačním způsobem pomocí kmenů Corynebaeterium nebo Brevibacterium s použitím živných médií obsahujících jako zdroje asimilovatelného uhlíku glukosu, řepnou nebo třtinovou melasu apod. Jednoduchý biosyntetický postup umožňuje ^ž 50% konverzi uhlíkatého zdroje. Dále byly popsány fermentační postupy přípravy kyseliny L-glutamové v živných půdách na bázi náhradních uhlíkatých surovin, jako je kyselina octová, ethanol, lineární uhlovodíky a další uhlíkaté substráty.

I

Způsob fermentační přípravy kyseliny L-asparagové nebo L-glutamové podle vynálezu pomocí mikroorganismů, které produkují za standardních podmínek L-lysin, indukovaný přídavkem limitovaného minimálního množství peptidových antibiotik, nebyl dosud v literatuře popsán. Je vhodný především tím, že nepotřebuje žádnou zvláštní úpravu produkčních kmenů a fermentační technologie.

216 029

Kyselina L-asparagové a L-glutamová slouží jako součást léčiv a výzmané výchozí produkty syntézy peptidů.

Bližší podrobnosti způsobu podle vynálezu jsou uvedeny v následujících příkladech provedení, které tento způsob pouze ilustrují, ale nijak neomezují.

Přiklad 1

Kmenem Corynebacterium glutamicum, který vyžaduje k růstu homoserin a leucin a který je současně rezistentní vůči S-aminoethyl-L-cysteinu, se zaočkuje 50 ml inokulač ního média, umístěného v 500 ml varné baňce, jež má toto složení: sacharosa technická 30 g, octan sodný kryst. 20 g, kukuřičný extrakt (60 % hmot. sušiny) 30 g, destilovaná voda do 1 000 m£, pH média po sterilizaci je 7,0 až 7,2. Po zaočkování se dále kultivu je na rotační třepačce (240 ot) (min) při teplotě A9 °C po dobu 18 h; pH kultury a* do sáhne hodnoty kolem 7,5.

Vyrostlou kulturou se v množství 10 % obj. zaočkuje 20 ml fermentačnťho média, umístěmáho v 500 ml varné baňce, jež mé toto složení: sacharosa technická 18C g, hydrolyzát arašídové mouky 300 ml, kukuřičný extrakt (60 % hmot. sušiny) 10 g, síran amonnkryst. 10 g, fosforečnan draselný sekundární 1 g, síran hořečnatý kryst. 0,1 g, uhličitan vápenatý mletý 30 g, destilovaná voda do 1 000 ml, pH média po sterilizaci je 6,8 až 7,0. Kultivace probíhá za stejných podmínek jako výše. Po 12 hodinách se do média přidá roztok cefalexinu do koncentrace 10 vg/ml. V průběhu kultivace se upravuje pH kultury 10% vodným roztokem čpavku na hodnotu pH 7,0 až 7,2. Po 72 hodinách kultivace se biomasa odstředí a v supernatantu se prokazují kvantitativně jednotlivé aminokyseliny, dále množství L-lysinu, kyseliny L-asparagové a kyseliny L-glutamové.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1:

aminokyselina/g/lltr/	kontrola	eefalěxin
lysin	22,8	8,0
kyselina asparagová	0,7	12,0
glycin	0,5	0,6
kyselina glutamová	3,0	2,4
alanin	3,2	2,7
valin	1,2	0,5
fenylalanin	0,2	0,2
leucin a isoleucin	0,2	0; 2

Jak z této tabulky vyplývá, umožňuje uvedený fermentační postup u kmene Corynebacte· rium glutamicum dosažení produkce kyseliny L-asparagové v množství 12 g/litr fermentač ního média za 72 h kultivace.

Přiklad 2

Stejným kmenem jako v přikladu 1 se ve stejném inokulačním médiu připraví inokulum a získaným inokulem se zaočkuje fermentační půda rovněž stejného složení. Pozdil spočívá v tom, že se po 12 hodinách kultivace přidá do fermentačníctf baněk roztok penicilinu G do koncentrace 10 vg/ml. Po 72 h kultivace se obdobně jako v příkladu 1 stanoví obsah jednotlivých aminokyselin v supernatantu.

216 029

Výsledky jeou uvedeny v tabulce 2:

aminokyselina kontrola /g/litr/	penicilín G
lysin 22,5	5,9
kyselina asparagová 0,8	7,2
glycin 0,8	0,2
kyselina glutamová 0,2	15,5
alanin 3,8	3,0
valin 1,8	1,2
fenylalanin stopy	0,2
leusin a isoleucin 0,2	0,2 '
i Jak z této tabulky vyplývá, umožňuje uvedený fermentační postup u kmene Corynebacte-
rium glutamicum dosažení produkce kyseliny L-asparagové 7 g/litr a kyseliny L-glutamo-
vé kolem 15 g/litr fermentačního média za 72 h kultivace.
Příklad 3
Produkčním kmenem Brevibacterium flavum, který vyžaduje k růstu homoserin a déle
je rezistentní vůči analogu L-lysinu, se stejným postupem jako	v příkladu 1 připraví
inokulum, kterým se zaočkuje fermentační půda stejného složení.	Při dalěím postupu
se po 12 h kultivace přidá do média buď penicilín G nebo cefalexin, a to ve stejném
množství jako v příkladu 1 nebo 2. Po 72 h kultivace se obdobně jako v příkladu 1 stanoví
obsah jednotlivých aminokyselin.
Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3:
aminokyselin? Penicilín G	Cefalexin
/g/litr/
lysin 5,5	2,2
kyselina asparagová 0,2	0,2
glycin 0,2	0,2
kyselina glutamová 13,0	9,0
alanin 1,0	1,6
valin 1,3	0,7
leucin a isoleucin 0,1	0,2
Jak z této tabulky vyplývá, vyznačuje se kmen Brevibacterium	flavum tím,že po apli-

kacl antibiotik produktije pouze kyselinu L-glutaměvou, a to v množství 9 až 13 g/litr fermentačního média za 72 h kultivace.

Claims (1)

1. P ί E D MÍT VY NÁ L E ZU

   Způsob fermentační přípravy kyseliny L-asparagová a nebo kyseliny L-glutamové produkčními kmeny mikroorganismů Corynebacterium glutamicum nebo Brevibacterium flavum, standardně produkujícími L-lysin, kultivací c tekuté živné půdě, obsahující zdroje asimilovatelného uhlíku e dusíku, minerální živné soli,yitaminy a jiné biofaktory, za submerzních podmínek, vyznačující se tím, že se do živné půdy přidává v průběhu růstové fáze mikroorganismu antibiotikum peptidového charakteru typu penicilinu O nebo jeho polosyntetický derivát typu cefalexinu, v množství 5 až 50 yg/,1 živné půdy, s výhod ou 10 yg/ml. .. .