CS216029B1

CS216029B1 - Process for the preparation of L-aspartic acid or L-glutamic acid

Info

Publication number: CS216029B1
Application number: CS90381A
Authority: CS
Inventors: Frantisek Smekal; Jaromir Pirko; Ludvik Novak
Original assignee: Frantisek Smekal; Jaromir Pirko; Ludvik Novak
Priority date: 1981-02-06
Filing date: 1981-02-06
Publication date: 1982-10-29

Abstract

Vynález se týká způsobu fermentační přípravy kyseliny L-asparagové anebo L-glutamové za běžných podmínek, ale s tím rozdílem, že se do živná půdy v průběhu růstová fáze produkčního mikroorganismu přidává antibiotikum peptidováho charakteru typu penicilinu G nebo jeho polosyntetický derivát typu cefalexinu. Kyselina L-asperagová a L-glutamové jsou součástí léčiv a významné výchozí produkty syntézy peptidů.The invention relates to a method for the fermentation preparation of L-aspartic acid or L-glutamic acid under conventional conditions, but with the difference that a peptide antibiotic of the penicillin G type or its semi-synthetic derivative of the cephalexin type is added to the nutrient medium during the growth phase of the production microorganism. L-aspartic acid and L-glutamic acid are components of drugs and important starting products of peptide synthesis.

Description

(⁵⁴) Způsob fermentační přípravy kyseliny L-asparagové anebo L-glutemové( ⁵⁴ ) Method for the fermentation preparation of L-aspartic acid or L-glutamic acid

Vynález se týká způsobu fermentační přípravy kyseliny L-asparagové anebo L-glutamové za běžných podmínek, ale s tím rozdílem, že se do živná půdy v průběhu růstová fáze produkčního mikroorganismu přidává antibiotikum peptidováho charakteru typu penicilinu G nebo jeho polosyntetický derivát typu cefalexinu.The invention relates to a method for the fermentation preparation of L-aspartic acid or L-glutamic acid under conventional conditions, but with the difference that a peptide antibiotic of the penicillin G type or its semi-synthetic derivative of the cephalexin type is added to the nutrient medium during the growth phase of the production microorganism.

Kyselina L-asperagová a L-glutamové jsou součástí léčiv a významné výchozí produkty syntézy peptidů.L-aspartic acid and L-glutamic acid are components of pharmaceuticals and important starting products of peptide synthesis.

216 029216,029

216 C29216 C29

Vynález se týká způsobu fermentační přípravy kyseliny L-asparagové anebo L-glutamové produkčními kmeny mikroorganismů Corynebaeterium glutamicum nebo Brevibacterium flavum, standardně produkujícími L-lysin, pokud mají v médiu k dispozici homoserin a leucin, popřípadě dalěí aminokyseliny a které jsou současné rezistentní k některým analogům L-lysinu, například S-aminoethyl-L-cysteinu. Tyto mikroorganismy produkují za standardních podmínek L-3ysin. Působením některých antibiotik, které jsou přidávána v limitovaném množství do média v růstové fázi kultury, dochází k inhibici syntézy L-lysinu. Za takto upravených podmínek kultivace je asimilovatelný zdroj uhlíku konvertován na jiné aminokyseliny, zejména kyselinu L-asparagovou a kyselinu L-glutamovou nebo jejich směs, které jsou uvolňovány z buněk do prostředí. Hromadění kyseliny L-asparagové probíhá zřejmě v důsledku inhibice některé z enzymatických reakcí v biosyntetické dřáze L-lysinu a akumulace kyseliny L-glutamové je vázána na intenzivní transaminaci mezi kyselinou L-asparagovou a alfa-ketoglutarovou. Vznikající kyselina oxaloctová se může dále zapojovat do reakcí Krebsova oyklu.The invention relates to a method for the fermentation preparation of L-aspartic acid and/or L-glutamic acid by production strains of microorganisms Corynebaeterium glutamicum or Brevibacterium flavum, which normally produce L-lysine, if they have homoserine and leucine, or other amino acids, available in the medium and which are simultaneously resistant to some L-lysine analogues, for example S-aminoethyl-L-cysteine. These microorganisms produce L-lysine under standard conditions. The action of some antibiotics, which are added in limited amounts to the medium in the growth phase of the culture, inhibits the synthesis of L-lysine. Under such adjusted cultivation conditions, the assimilable carbon source is converted to other amino acids, in particular L-aspartic acid and L-glutamic acid or a mixture thereof, which are released from the cells into the environment. The accumulation of L-aspartic acid is probably due to the inhibition of some of the enzymatic reactions in the L-lysine biosynthetic pathway, and the accumulation of L-glutamic acid is linked to the intensive transamination between L-aspartic acid and alpha-ketoglutarate. The resulting oxaloacetic acid may further participate in the Krebs cycle reactions.

Na základě uvedených poznatků byl vypracován způsob fermentační přípravy kyseliny L-asparagové nebo L-glutamové produkčními kmeny mikroorganismů Corynebaeterium glutamicum neboBased on the above findings, a method for the fermentation preparation of L-aspartic or L-glutamic acid by production strains of microorganisms Corynebaeterium glutamicum or

Brevibacterium flavum, standardně produkujícími L-lysin, kultivací v tekuté živné půdé^, obsahující zdroje asimilovatelného uhlíku a dusíku, minerální živné soli, vitaminy a jiné biofaktory, za aubmerzních podmínek, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se do živné půdy přidává v průběhu růstové fáze mikroorganismu antibiotikum peptidového charaktetypu ru penicilinu G nebo jeho polysyntetický derivát typu cefalexinu, v množství 5 až 50 yg/ml živné půdy, s výhodou 10 yg/ml.Brevibacterium flavum, which normally produce L-lysine, by cultivation in a liquid nutrient medium containing sources of assimilable carbon and nitrogen, mineral nutrient salts, vitamins and other biofactors, under submerged conditions, according to the invention, the essence of which consists in adding to the nutrient medium during the growth phase of the microorganism an antibiotic of the peptide character type penicillin G or its polysynthetic derivative of the cephalexin type, in an amount of 5 to 50 μg/ml of nutrient medium, preferably 10 μg/ml.

Uvedená antibiotika se mohou jako biotinové regulátory významně uplatňovat při stimulaci produkce L-lysinu u výše uvedených produkčních kmenů Corynebaeterium glutamicum a Brevibacteriuu flavum, jsou-li dávkována do fermentačního média v produkční fázi, t.j. po ukončení růstu mikroorganismů. Podobný efekt peptidových antibiotik na produkci kyseliny L-glutamové u Brevibaoterium lactofermentum je znám, například z japonského pat.spisu č. 7 917 183.The mentioned antibiotics can be significantly used as biotin regulators in stimulating the production of L-lysine in the above-mentioned production strains Corynebaeterium glutamicum and Brevibacterium flavum, if they are dosed into the fermentation medium in the production phase, i.e. after the end of the growth of microorganisms. A similar effect of peptide antibiotics on the production of L-glutamic acid in Brevibaeterium lactofermentum is known, for example, from Japanese patent No. 7,917,183.

Kyselina L-asparagová je aminokyseliny, která se obvykle připravuje enzymaticky, a to působením enzymu L-aspartázy z mikroorganismu Escheriohia coli nebo z jinýoh mikroorganismů, b|.otransformací kyseliny fumarové v přítomnosti amonných iontů. Tento způsob výroby kyseliny Lfaspsragové je realizovatelný v průmyslovém měřítku, jeho ekonomika je však limitována dostupností výchozí kyseliny fumarové.L-aspartic acid is an amino acid that is usually prepared enzymatically, namely by the action of the enzyme L-aspartase from the microorganism Escherichia coli or from other microorganisms, by the biotransformation of fumaric acid in the presence of ammonium ions. This method of producing L-aspartic acid is feasible on an industrial scale, but its economics are limited by the availability of the starting fumaric acid.

Kyselina L-glutamová se připravuje výhradně fermentačním způsobem pomocí kmenů Corynebaeterium nebo Brevibacterium s použitím živných médií obsahujících jako zdroje asimilovatelného uhlíku glukosu, řepnou nebo třtinovou melasu apod. Jednoduchý biosyntetický postup umožňuje ^ž 50% konverzi uhlíkatého zdroje. Dále byly popsány fermentační postupy přípravy kyseliny L-glutamové v živných půdách na bázi náhradních uhlíkatých surovin, jako je kyselina octová, ethanol, lineární uhlovodíky a další uhlíkaté substráty.L-glutamic acid is prepared exclusively by fermentation using Corynebaeterium or Brevibacterium strains using nutrient media containing glucose, beet or cane molasses, etc. as sources of assimilable carbon. A simple biosynthetic process allows for up to 50% conversion of the carbon source. Fermentation processes for the preparation of L-glutamic acid in nutrient media based on alternative carbon raw materials, such as acetic acid, ethanol, linear hydrocarbons and other carbon substrates, have also been described.

IAND

Způsob fermentační přípravy kyseliny L-asparagové nebo L-glutamové podle vynálezu pomocí mikroorganismů, které produkují za standardních podmínek L-lysin, indukovaný přídavkem limitovaného minimálního množství peptidových antibiotik, nebyl dosud v literatuře popsán. Je vhodný především tím, že nepotřebuje žádnou zvláštní úpravu produkčních kmenů a fermentační technologie.The method of fermentation preparation of L-aspartic or L-glutamic acid according to the invention using microorganisms that produce L-lysine under standard conditions, induced by the addition of a limited minimum amount of peptide antibiotics, has not yet been described in the literature. It is suitable primarily because it does not require any special treatment of the production strains and fermentation technology.

216 029216,029

Kyselina L-asparagové a L-glutamová slouží jako součást léčiv a výzmané výchozí produkty syntézy peptidů.L-aspartic and L-glutamic acids serve as components of drugs and as important starting products for peptide synthesis.

Bližší podrobnosti způsobu podle vynálezu jsou uvedeny v následujících příkladech provedení, které tento způsob pouze ilustrují, ale nijak neomezují.Further details of the method according to the invention are given in the following examples, which only illustrate the method but do not limit it in any way.

Přiklad 1Example 1

Kmenem Corynebacterium glutamicum, který vyžaduje k růstu homoserin a leucin a který je současně rezistentní vůči S-aminoethyl-L-cysteinu, se zaočkuje 50 ml inokulač ního média, umístěného v 500 ml varné baňce, jež má toto složení: sacharosa technická 30 g, octan sodný kryst. 20 g, kukuřičný extrakt (60 % hmot. sušiny) 30 g, destilovaná voda do 1 000 m£, pH média po sterilizaci je 7,0 až 7,2. Po zaočkování se dále kultivu je na rotační třepačce (240 ot) (min) při teplotě A9 °C po dobu 18 h; pH kultury a* do sáhne hodnoty kolem 7,5.The strain Corynebacterium glutamicum, which requires homoserine and leucine for growth and is also resistant to S-aminoethyl-L-cysteine, is inoculated into 50 ml of inoculation medium placed in a 500 ml boiling flask, which has the following composition: technical sucrose 30 g, sodium acetate crystal. 20 g, corn extract (60% by weight of dry matter) 30 g, distilled water to 1,000 ml, pH of the medium after sterilization is 7.0 to 7.2. After inoculation, the culture is further cultured on a rotary shaker (240 rpm) at a temperature of A9 °C for 18 h; the pH of the culture a* reaches a value of around 7.5.

Vyrostlou kulturou se v množství 10 % obj. zaočkuje 20 ml fermentačnťho média, umístěmáho v 500 ml varné baňce, jež mé toto složení: sacharosa technická 18C g, hydrolyzát arašídové mouky 300 ml, kukuřičný extrakt (60 % hmot. sušiny) 10 g, síran amonnkryst. 10 g, fosforečnan draselný sekundární 1 g, síran hořečnatý kryst. 0,1 g, uhličitan vápenatý mletý 30 g, destilovaná voda do 1 000 ml, pH média po sterilizaci je 6,8 až 7,0. Kultivace probíhá za stejných podmínek jako výše. Po 12 hodinách se do média přidá roztok cefalexinu do koncentrace 10 vg/ml. V průběhu kultivace se upravuje pH kultury 10% vodným roztokem čpavku na hodnotu pH 7,0 až 7,2. Po 72 hodinách kultivace se biomasa odstředí a v supernatantu se prokazují kvantitativně jednotlivé aminokyseliny, dále množství L-lysinu, kyseliny L-asparagové a kyseliny L-glutamové.The grown culture is inoculated with 10% vol. of 20 ml of fermentation medium, placed in a 500 ml boiling flask, which has the following composition: technical sucrose 18C g, peanut flour hydrolysate 300 ml, corn extract (60% wt. dry matter) 10 g, ammonium sulfate crystal. 10 g, secondary potassium phosphate 1 g, magnesium sulfate crystal. 0.1 g, ground calcium carbonate 30 g, distilled water to 1,000 ml, pH of the medium after sterilization is 6.8 to 7.0. Cultivation is carried out under the same conditions as above. After 12 hours, a solution of cephalexin is added to the medium to a concentration of 10 vg/ml. During cultivation, the pH of the culture is adjusted with a 10% aqueous ammonia solution to a pH value of 7.0 to 7.2. After 72 hours of cultivation, the biomass is centrifuged and the individual amino acids, as well as the amounts of L-lysine, L-aspartic acid and L-glutamic acid, are quantitatively determined in the supernatant.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1:The results are shown in Table 1:

aminokyselina_/g/_lltr/ amino acid _/g / _lltr / kontrola control eefalěxin ephalexin lysin lysine 22,8 22.8 8,0 8.0 kyselina asparagová aspartic acid 0,7 0.7 12,0 12.0 glycin glycine 0,5 0.5 0,6 0.6 kyselina glutamová glutamic acid 3,0 3.0 2,4 2.4 alanin alanine 3,2 3.2 2,7 2.7 valin valine 1,2 1.2 0,5 0.5 fenylalanin phenylalanine 0,2 0.2 0,2 0.2 leucin a isoleucin leucine and isoleucine 0,2 0.2 0; 2 0; 2

Jak z této tabulky vyplývá, umožňuje uvedený fermentační postup u kmene Corynebacte· rium glutamicum dosažení produkce kyseliny L-asparagové v množství 12 g/litr fermentač ního média za 72 h kultivace.As can be seen from this table, the above fermentation procedure allows the Corynebacterium glutamicum strain to achieve the production of L-aspartic acid in an amount of 12 g/liter of fermentation medium in 72 h of cultivation.

Přiklad 2Example 2

Stejným kmenem jako v přikladu 1 se ve stejném inokulačním médiu připraví inokulum a získaným inokulem se zaočkuje fermentační půda rovněž stejného složení. Pozdil spočívá v tom, že se po 12 hodinách kultivace přidá do fermentačníctf baněk roztok penicilinu G do koncentrace 10 vg/ml. Po 72 h kultivace se obdobně jako v příkladu 1 stanoví obsah jednotlivých aminokyselin v supernatantu.The same strain as in Example 1 is used to prepare an inoculum in the same inoculation medium and the obtained inoculum is inoculated into a fermentation medium of the same composition. The procedure consists in adding a solution of penicillin G to the fermentation flasks after 12 hours of cultivation to a concentration of 10 vg/ml. After 72 hours of cultivation, the content of individual amino acids in the supernatant is determined similarly to Example 1.

216 029216,029

Výsledky jeou uvedeny v tabulce 2:The results are shown in Table 2:

aminokyselina kontrola /g/litr/ amino acid control /g/liter/ penicilín G penicillin G lysin 22,5 lysine 22.5 5,9 5.9 kyselina asparagová 0,8 aspartic acid 0.8 7,2 7.2 glycin 0,8 glycine 0.8 0,2 0.2 kyselina glutamová 0,2 glutamic acid 0.2 15,5 15.5 alanin 3,8 alanine 3.8 3,0 3.0 valin 1,8 valine 1.8 1,2 1.2 fenylalanin stopy Phenylalanine traces 0,2 0.2 leusin a isoleucin 0,2 leucine and isoleucine 0.2 0,2 ' 0.2 ' i Jak z této tabulky vyplývá, umožňuje uvedený fermentační postup u kmene Corynebacte- i As can be seen from this table, the fermentation process described above allows the Corynebacterium strain to rium glutamicum dosažení produkce kyseliny L-asparagové 7 g/litr a kyseliny L-glutamo- rium glutamicum achieving production of L-aspartic acid 7 g/liter and L-glutamic acid vé kolem 15 g/litr fermentačního média za 72 h kultivace. about 15 g/liter of fermentation medium for 72 h of cultivation. Příklad 3 Example 3 Produkčním kmenem Brevibacterium flavum, který vyžaduje k růstu homoserin a déle A production strain of Brevibacterium flavum that requires homoserine for growth and longer je rezistentní vůči analogu L-lysinu, se stejným postupem jako is resistant to the L-lysine analogue, with the same procedure as v příkladu 1 připraví in example 1 prepares inokulum, kterým se zaočkuje fermentační půda stejného složení. inoculum, which is used to inoculate a fermentation broth of the same composition. Při dalěím postupu As you proceed se po 12 h kultivace přidá do média buď penicilín G nebo cefalexin, a to ve stejném after 12 h of cultivation, either penicillin G or cephalexin is added to the medium, in the same množství jako v příkladu 1 nebo 2. Po 72 h kultivace se obdobně jako v příkladu 1 stanoví amount as in example 1 or 2. After 72 h of cultivation, similarly to example 1, the obsah jednotlivých aminokyselin. content of individual amino acids. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3: The results are shown in Table 3: aminokyselin? Penicilín G amino acids? Penicillin G Cefalexin Cephalexin /g/litr/ /g/liter/ lysin 5,5 lysine 5.5 2,2 2.2 kyselina asparagová 0,2 aspartic acid 0.2 0,2 0.2 glycin 0,2 glycine 0.2 0,2 0.2 kyselina glutamová 13,0 glutamic acid 13.0 9,0 9.0 alanin 1,0 alanine 1.0 1,6 1.6 valin 1,3 valine 1.3 0,7 0.7 leucin a isoleucin 0,1 leucine and isoleucine 0.1 0,2 0.2 Jak z této tabulky vyplývá, vyznačuje se kmen Brevibacterium As this table shows, the Brevibacterium strain is characterized by flavum tím,že po apli- flavum by the fact that after application

kacl antibiotik produktije pouze kyselinu L-glutaměvou, a to v množství 9 až 13 g/litr fermentačního média za 72 h kultivace.The antibiotic produces only L-glutamic acid, in an amount of 9 to 13 g/liter of fermentation medium in 72 hours of cultivation.

Claims

WHEN YOU HAVE TO FIND YOU

Process for the fermentative preparation of L-aspartic acid and / or L-glutamic acid by production strains of microorganisms Corynebacterium glutamicum or Brevibacterium flavum, normally producing L-lysine, by cultivation in liquid culture medium containing sources of assimilable carbon e nitrogen, under submerged conditions, characterized in that, during the growth phase of the microorganism, an antibiotic of the penicillin O type peptide or its semi-synthetic derivative of the cephalexin type is added to the culture medium in an amount of 5 to 50 µg / l, preferably 10 µg / ml. ...