CS212187B1 - Způsob výroby penicilinů - Google Patents

Abstract

Vynález se týká použití vodného eluótu z rostlinných dusíkatých substrátů, zejména sójové nebo arašídové nebo bavlníkové mouky nebo z globulámího proteinu z bavlníkových semen jako zdroje esimilovatelného dusíku v živné půdě při fermentační výrobě penicilinů.

Description

Vynález se týká způsobu výroby penicilinů, tj. penicilinu G a V, kultivací produkčního mikroorganismu v tekutá živné půdě, obsahující zdroje asimilovatelného uhlíku a dusíku, minerální živné soli a prekursory, za submersních podmínek.

Jak je známo, jedním z hlavních faktorů, který ovlivňuje výtěžnost fermentačního procesu při biosyntetické výrobě penicilinu, je složení živná půdy, jejíž nedílnou součástí je zdroj asimilovatelného dusíku. Na jeho vhodnosti závisí výtěžnost fermentačního postupu a na jeho dostupnosti a ceně pak závisí do značná míry ekonomie výroby.

Zdrojem dusíku, jeho vhodností a použitým množstvím lze ovlivnit fermentační proces. Při velkovýrobě penicilinu jsou jako zdroj dusíku zpravidla používány různé rostlinné substráty, např. rozemletá semena sóji, arašídy, bavlníku nebo s největším úspěchem je používána Pharmamedia, což je prodejní název nehydrolyzovaného glubulérního proteinu získaného z bavlníkových semen. Tuto surovinu však není z ekonomických důvodů možné používat pro výrobu. Byly proto hledány cesty, jak upravit dostupné suroviny, aby svou kvalitou se vyrovná ly Pharmamedii.

Byly provedeny následující úpravy rozemletých semen sóji, arašídy, bavlníku: kyselé hydrolýza, alkalická hydrolýza, enzymatické hydrolýza a eluce.

Kyselá hydrolýza substrátů po úpravě koncentrovanou kyselinou solnou probíhá různou dobu od 10 minut do 120 minut za zvýšeného tlaku.

Alkalické hydrolýza substrátu hydroxidem sodným probíhala 60 až 120 minut za varu.

Při enzymatické hydrolýze substrátu byla měněna koncentrace substrátu (od TO do 30 %), druh enzymu (pankreatin, proteéza, papain), koncentrace enzymu (1000 až 30 000 j./g substrátu), doba hydrolýzy (1 až 48 hodin).

Eluce byla provedena při různé koncentraci substrátu (2 až 9 %), různém pH (2 až 10), byla aplikována různé doba eluce (0 až 3 hodiny), pro eluci byla zvolena různé teplota (laboratorní až 100 °C), eluáty byly různě upravovány (filtrace nebo bez filtrace), získané eluáty pro přípravu fermentačních půd byly ředěny do různých stupňů nebo nebyly ředěny vůbec .

Z uvedených úprav, které byly provedeny s rostlinnými zdroji dusíku, se neosvědčila kyselá ani alkalické hydrolýza, štěpení bílkovin proběhlo až na volné aminokyseliny a takováto forma zdroje dusíku je pro biosyntézu penicilinu nevhodné. Enzymatickou úpravou substrátů byly získány hydrolyzáty, se kterými bylo dosaženo při fermentaci 90% výtěžku ve srovnání s produkcemi dosaženými s Pharmamedii.

Z výsledků hodnocení všech alternativ úprav zdrojů dusíku vyplynulo, že nejvhodnější je postup, při kterém je substrát pouze eluován. S eluáty připravenými nejvhodnějšími postu py byly získány výtěžky ve fermentaci vyšší o 10 až 15 % proti kontrole provedené s Pharmamedií. Bylo zjištěno, že všechny substráty dusíku upravené vhodným elučním postupem skýtají vyšší výtěžky při fermentaci než bez úpravy včetně Pharmamedie. Z dostupných surovin je nejvhodnějším materiálem pro eluci arašídové mouka, absolutně nejlepší je Pharmamedia.

Koncentrace substrátů pro eluci závisí na dalším zpracování eluétu a na fermentačním postupu. Nejvhodnější pH k eluci je 9,0 doba potřebná k eluci se řídí teplotou, je-li zvolena vyšší teplota, je čas potřebný k eluci kratší. Vysvětleni pro zvýhodnění substrátů po eluci při zvýšeném pH pravděpodobně spočívá v docílení dostupnosti důležitých aminokyselin, zejména valinu a methioninu, jak bylo prokázáno celkovou analýzou eluétů.

Příklady provedení:

Přikladl

Fermentace v laboratorním měřítku byla provedena kultivací produkčního mikroorganismu ve varných baňkách obsahu'500 ml se 40 ml fermentační půdy na rotačním třepacím stroji.

Půda obsahovala jako zdroj uhlíku sacharózu, která byla průběžně dávkována, zdrojem dusíku byly látky rostlinného původu jako taková v koncentraci 6 % nebo eluáty z nich připravené. Sluce byla provedena následujícím postupem: 9 % araěidové nebo sojová mouky nebo Pharmamedie (ad) je suspendováno ve vodě, následuje úprava pH 50% roztokem hydroxidu sodného na hodnotu 9,0, takto upravená suspense je zehřéta na teplotu 70 až 80 °C, tato teplota je udržována v průběhu 60 minut.

Takto připravený eluét je zfiltrovén přes gázu e pro přípravu fermentačních půd je zředěn v poměru 75:25 dílům vodou. Tímto způsobem připravený eluát obsahuje rozpustného dusíku 4,0 až 4,5 mg/ml, celkového dusíku 4,5 až 5,0 mg/ml a amoniakálního dusíku kolem 0,5 g/ml. Půda déle obsahovala jako zdroj síry simatan sodný,, kyselinu fenoxyoctovou jako prekursor pro biosyntézu penicilinu V a jako živnou sůl uhličitan- vápenatý . Po sterilizaci byla hodnota pH vyěěí než 7. Inokulace byla provedena 10 % vegetativního inokula produk ního kmene Penicillium chrysogenum, teplota při kultivaci byla 25 °C, doba fermentace 10 dnů. S uvedenými zdroji dusíku bylo dosaženo následujících produkcí.

Zdroj dusíku

Penicilín j./ml sójová mouka arašídová mouka Pharmamedia eluát sójové mouky eluát arašídová mouky eluté Pharmamedie

900 19 500 22 300 24 000

500

000

Přiklad 2

Frementaoe v laboratorním měřítku byla provedena shodným postupem jako u příkladu 1 s tím rozdílem, že zdrojem uhlíku byl sójový olej a laktóza, celkové množství obou látek bylo v půdě od počátku, zdrojem dusíku byly shodné suroviny jako v příkladě 1, navíc bavlníková mouka, v koncentracích sójové nebo arašídové mouka 3,38 %, bavlníkové mouka 4,5 %, Pharmamedia 2,5 %, jejich eluce byla provedena následujícím postupem: 3,38 % arašídové mouky, sójové mouky nebo Pharmamedie, nebo 4,25 % bavlníkové mouky je suspendováno (ad) ve vodě, následuje úprava pH 50% hydroxidem sodným na hodnotu 9,0, takto upravená suspense jsou ponechány při teplotě 25 až 40 °C 60 minut nebo při teplotě 40 až 90 °C 15 minut.

Takto připravené eluáty obsahují 2,5 až 3,0 mg/ml rozpustného dusíku, 3,0 až 3,5 mg/ml celkového dusíku a kolem 0,2 mg/ml amoniakálního dusíku. Půda déle obsahuje jako další zdroj dusíku síran amonný, zdrojem síry je síran sodný. Ostatní složky půdy jsou shodné s půdou uvedenou u příkladu 1. Půdy po sterilizaci mají pH kolem 7,0. Inokulace je provedena 5 % vegetativního inokula produkčního kmene Penicillium chrysogenum, teplota při kultivaci je 25 °C, doba fermentace 9 dnů. S uvedenými zdroji dusíku bylo dosaženo následujících produkci.

Zdroj dusíku

Penicilín j./ml sojové mouka aragídová mouka bavlníkové mouka Pharmamedia eluét sójové mouky eluét arašídové mouky eluét bavlníkové mouky eluét Pharmamedie'

500 27 000

500

000

000 31 500 29 000 33 200

Claims (2)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Způsob výroby penicilinů kultivací produkčního mikroorganismu Penicillium chrysogenum v tekuté živné půdě, obsahující zdroje asimilovatelného uhlíku a dusíku, minerální živné soli a prekursory, za submerzních podmínek, vyznačující se tím, že se jako zdroje asimilovatelného dusíku používá roztoku získaného elucí rostlinných dusíkatých substrátů, zejména sójové nebo arašídové nebo bavlníkové mouky nebo globulémího proteinu z bavlnikových semen, vodou při pH 8 až 10, s výhodou 9, při teplotě 20 °C až k teplotě varu, přičemž hmotnostní množství výchozího substrátu činí 2 až 10 %.
2. 2. Způsob podle bodu 1 vyznačující se tím, že se používá eluétu filtrovaného.

   Severografia. n. p.. závod 7, Most