CS208781B2 - Method of determination of the bonding index in the blood serum - Google Patents
Method of determination of the bonding index in the blood serum Download PDFInfo
- Publication number
- CS208781B2 CS208781B2 CS793505A CS350579A CS208781B2 CS 208781 B2 CS208781 B2 CS 208781B2 CS 793505 A CS793505 A CS 793505A CS 350579 A CS350579 A CS 350579A CS 208781 B2 CS208781 B2 CS 208781B2
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- thyroxine
- serum
- antibodies
- binding
- carrier
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 32
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 title claims description 26
- XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N thyroxine-binding globulin Natural products IC1=CC(CC([NH3+])C([O-])=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 56
- XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N D-thyroxine Chemical compound IC1=CC(C[C@@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N 0.000 claims description 46
- 229940034208 thyroxine Drugs 0.000 claims description 46
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 19
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 19
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims description 13
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 13
- 102000009488 Thyroxine-Binding Proteins Human genes 0.000 claims description 12
- 108010048889 Thyroxine-Binding Proteins Proteins 0.000 claims description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 5
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 5
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 8
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical class IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 6
- 229940035722 triiodothyronine Drugs 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007982 barbital buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- WCDJCWGYYQTMGO-OAHLLOKOSA-N (2S)-2-amino-3-[4-(4-hydroxy-3,5-diiodophenoxy)-3,5-diiodophenyl]-2,3,3-triiodopropanoic acid Chemical compound IC([C@](N)(C(=O)O)I)(C1=CC(I)=C(C(I)=C1)OC1=CC(I)=C(C(I)=C1)O)I WCDJCWGYYQTMGO-OAHLLOKOSA-N 0.000 description 2
- AGNFWIZBEATIAK-UHFFFAOYSA-N 4-phenylbutylamine Chemical compound NCCCCC1=CC=CC=C1 AGNFWIZBEATIAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PKIZUZDCXKXZEW-RSAXXLAASA-N ON1C(=O)CCC1=O.IC1=CC(C[C@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O.IC1=CC(C[C@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 PKIZUZDCXKXZEW-RSAXXLAASA-N 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 102000002248 Thyroxine-Binding Globulin Human genes 0.000 description 2
- 108010000259 Thyroxine-Binding Globulin Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 2
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 2
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000005495 thyroid hormone Substances 0.000 description 2
- 229940036555 thyroid hormone Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PCDWFBFHIIKIPM-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole-2-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2N(CC)C(S(O)(=O)=O)SC2=C1 PCDWFBFHIIKIPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 1
- -1 Schiff base compound Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-RNFDNDRNSA-M iodine-131(1-) Chemical compound [131I-] XMBWDFGMSWQBCA-RNFDNDRNSA-M 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N norethisterone Chemical group O=C1CC[C@@H]2[C@H]3CC[C@](C)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- SCUZVMOVTVSBLE-UHFFFAOYSA-N prop-2-enenitrile;styrene Chemical compound C=CC#N.C=CC1=CC=CC=C1 SCUZVMOVTVSBLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 229960001922 sodium perborate Drugs 0.000 description 1
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- YKLJGMBLPUQQOI-UHFFFAOYSA-M sodium;oxidooxy(oxo)borane Chemical compound [Na+].[O-]OB=O YKLJGMBLPUQQOI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 229920000638 styrene acrylonitrile Polymers 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/78—Thyroid gland hormones, e.g. T3, T4, TBH, TBG or their receptors
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/975—Kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
- Y10S436/81—Tube, bottle, or dipstick
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
(54) Způsob stanovení vazného indexu thyroxinu v krevním séru
Diagnostika funkčního stavu štítné žlázy má v rámci klinické chemie vzhledem к velkému rozšíření poruch této žlázy velký význam. Při základní diagnostice funkce štítné žlázy in vitro se stanoví celkové množství thyroxinu v séru, stanoví se rovněž koncentrace globulinu, vážícího thyroxin. Toto stanovení se provádí pomocí příjmu trijodthyroxinu nebo tak zvaného vazného indexu thyroxinu.
Při testu na příjem trijodthyroxinu se stanoví zbytek vazné kapacity nosných bílkovin pro hormony štítné žlázy v krevním séru. Z těchto bílkovin jde o globu Γη, který váže thynos m, na nějž se váže přibližně 60 procent celkového množství thyroain-u, částečně jde také o prealbum n, a albumin, které jsou rovněž schopny vázat thyroxin. Při stanovení zbytko<vé vazné kapacity jde převážně o stanovení vazby hormonu štítné žlázy na globulin, který váže thyroxin. V případe, že jde o zvýšenou činnost štítné žlázy je obsah thyroxinu zvýšen, při snížené činnosti štítné žlázy je méně vazných míst nosných bílkovin vázáno na thyrox.n a trijodthyronin.
Známý způsob stanovení vazného indexu thyroxinu se provádí tak, že se smísí známé množství radiOaKtlvníhC trijOdthyrOTinu se vzorkem krevního séra a rontoměniče. Raďoaktivní trijodthyrcnin se dělí mezi vazná místa nosné bílkoviny a iontoměniče. V případě, že nosná bílkovina obsahuje větší mncžství neobsazených vazných míst, váže se větší množství radioaktivního' trijodthyromnu na tato místa a zbytek na iontoměn*č. Vyhodnocení se provádí měřením radioaktivity -na tontcmčniči nebo v roztoku.. Poměr radioaktivity roztoku, který odpovídá množství radioaktivního' trijodthyroninu, vázaného na nosné bílkoviny zkoumaného vzcrku séra к radioaktivitě roztoku standardního- vzorku, násobený faktorem, specifickým pro každý standard se nazývá vazný index thyroxinu.
Nevýhoda tohoto· známého způsobu spočívá v nutnosti použití radioaktivních sloučenin. Z toho vyplývá na jedné straně nutnost drahého· a komplikovaného měřicího zařízení, na druhé straně nutnost zcela zvláštního zacházení s radioaktivními reakčními činidly vzhledem к možnému poškození zdravotního stavu pracovníků laboratoře. Tyto nevýhody ztěžují stanovení.
Vynález si klade za úkol navrhnout způsob stanovení vazného indexu thyroxinu, prostý svrchu uvedených nevýhod, proveditelný v každé laboratoři pomocí běžných zařízení a umožňující tak snadné stanovení tohoto indexu ke zjištění fukčního stavu štítné žlázy.
; - Předmětem vynálezu je tedy způsob stanovení vazného indexu thyroxinu v krevním séru, vyznačující se tím, že se ke zkoumanému vzorku séra přidá 100 - až 500 ng thyroxinu ml ia 1 až 200 milí jednotek stanovitelného enzymu ml, kovalentně vázaného na thyroxin, získaný roztok se uvede ve styk s protilátkami proti thyroxinu v pevné fázi, kapalná fáze - se· -oddělí od pevné fáze a v jedné z těchto- fází se měří účinnost použitého' -enzymu..
Vynález vychází z toho, že je možno- užít místo .radioaktivního značení trijodthyroninu - značení enzymem, zvláště v tom případě, že se užije snadno -stanovitelného enzymu. Pokusy však prokázaly, -že - není možno nahraď ‘t radioaktivně značený trijodthyronin (—1125— enzymaticky značeným trijodthyroninem nebo thyroxinem. Ukázalo se totiž, že tyto látky značené enzymem nejsou vázány -na vazná místa bílkovin krevního- séra. Příčinou toho je patrně poměrně velká molekula -enzymu, takže vzniká sférická zábrana.
Nyní bylo- neočekávaně zjištěno, že thýroxin značený enzymem se -může dostat dokonkurence s neznačeným thyroxinem v -případě styku s· protilátkami proti thyroxinu, nacházejícími -se v -pevné fázi. Na této- skutečnosti je založen způsob podle vynálezu, při němž -na jedné straně dochází ke konkurenci vazných· míst -sérových bílkovin a nerozpustné protilátky proti thyroxinu, kde při vazbě - na thyroxin, přičemž v případě, že se naváže větší množství thyroxinu na protilátku, zbývá méně volných vazných míst v -séru. Současně dochází ke konkurenci značeného' a neznačeného- thyroxinu o protilátku. To znamená, že . se váže tím* víceznačného thyroxinu na pevnou fázi, čím vyšší je vazná schopnost séra pro thyroxin a tím i- vazný index thyroxinu. Naměřená enzymatická účinnost v pevné fázi je tedy přímým měřítkem pro velikost vazného indexu. Je však možno stanovit účinnost -enzymu i v kapalné fázi.
Ke značení je nutno užít při provádění způsobu podle vynálezu enzymu, který je možno snadno stanovit a který je možno vázat na thyroxin bez ztráty enzymatické účinnosti. Zvláště vhodné pro- toto značení jsou enzymy, jej - chž účinnost je možno snadno stanovit opticky, - a to- zvláště pomocí barevných zkoušek ve viditelném -světle nebo· změnami jejich NAI^I^-h^kM^^t^i^^iraíe. Typickými příklady vhodných enzymů jsou - peroxidáza, glukózooxidáza, a- -a /-galaktosídáza, glikoamyláza, invertáza a - -alkalická fosfatáza.
Pro všechny -shora uvedené -enzymy jsou známy jednoduché a rychlé metody -stanovení, - které byly popsány například v publikaci H. U. Bergmeyer „Methoden. den enzymatischen Analyse“, Verlag Chemie, 3. vydání 1974j Protilátky proti thyroxinu v pevné fázi -není nutno vázat na -nosič, je možno je učinit nerozpustnými například- zesítěním pomocí polyfunkčních reakčních -složek, jako jsou - - dialdéhydy, - . dloxidy apod. S výhodou je však možno protilátky vázat na pevný nosič. Pevným nosičem pro protilátky pro-ti thyroxinu je jakýkoliv materiál, -který je inertní vzhledem k reakčním složkám a na -nějž je možno protilátky vázat. Bylo zjištěno, že u celé řady materiálů se - - protilátky váží dostatečně -pevně .na povrch -nosiče. Jetaké možno- postupovat tak, že se protilátky váží běžným způsobem pro fixaci - biologicky aktivních bílkovin na pevném nosiči, to znamená kovalentní vazby. Typickým příkladem je aktivace povrchu.nosiče bromkyanem, koklymerací vlíkoviny, povrchovým zesilněním protilátky na nosič působením polyfunkčního zesitňujícího činidla, například glutaraldehyd-u a podobně. Všechny tyto způsoby jsou v oboru známy.
S výhodou se při provádění způsobu podle vynálezu -užije nádobek, jejichž vnitřní stěna je potažena protilátkou. Typickými materiály pro výrobu těchto nádobek jsou polystyren, kopolymery styrenu a aikrylonitrilu, další plastické hmoty a sklo. U - plastických hmot na podkladě -styrenu stačí pro potažení -stěn uložení roztoku protilátky . na určitou dobu do· nádobky.
Způsob podle vynálezu je samozřejmě možno’ provádět také při použití nosičů, které - -nemají tvar -nádobky, tyto nosiče mohou být rozděleny i na jednotlivé částice, mohou například tvořit náplň sloupce.
Protilátky proti thyroxinu je možno· získat běžným způsobem pro výrobu protilátek proti hormonům. Výhodné je použití konjugátu thyroxinu na vhodné nosné bílkovině k vyvolání imunity. Zvláště vhodné - z velkého množství - běžně známých nosných bílkovin jsou -albuminy sko-tu. Tyto -sérové albuminy sko-tu nebo jiné nosné bílkoviny se -váží na thyroxin - chemicky, například působením glutardialdehydu ve slabě alkalickém prostředí s následnou redukcí borohydridem sodíku. Dalším vhodným způsobem je reakce s morfolicyklohexylkarbodiimidem. Vhodnými pokusnými zvířaty pro- aplikaci takto získaných látek, - vyvolávajících imunitu proti thyroxinu jsou například králíci nebo· ovce, je však možno užít i jiných zvířat.
Thyroxin, značený peroxidázou a použití při provádění způsobu podle vynálezu -se získává s výhodou reakcí ter.butyloxykarbony 1thyroxinu-N-hydroxysukcinimidu -s peroxidázou s následným chromatografickým -čištěním získaného produktu. Obdobným způsobem je možno -získat i většinu dalších značených produktů při použití postupů, známých v - chemii bílkovin.
Jak již bylo uvedeno, přidává se ke vzorku séra určité množství thyroxinu. Bylo zjištěno, že toto množství má být 100 až - 500 ng thyroxinu/ml séra. Je však možno užít - i většího -nebo menšího množství. Svrchu uvedené -rozmezí však -stačí pro všechny praktické vzorky séra, to znamená, jak pro -séra s případě snížené činnosti štítné žlázy, tak pro
100 až 400 ng/ml a ž 100 mU/ml
0,1 až 0,2 M, pH 8,6
0,2 % až 0,05 ^g/ml
0,5 až 5 m?M/l séra v případě zvýšené činnosti štítné žlázy. Množství přidaného thyroxinu, značeného enzymem závisí na druhu užitého enzymu, zvláště ina jeho specifické účinnosti, kterou je možno snadno stanovit. V případě, že se užije peroxidázy, užije se s výhodou takové množství, aby ve výsledném vzorku byla účinnost 1 až 200 mU peroxidázy/.ml.
Reakční směs séra, pufru, thyroxinu a enzymaticky značeného thyroxinu se uvede ve styk s protilátkami proti thyroxinu, které jsou nerozpustné a s výhodou vázány na nosič tak dlouho, aby bylo možno dosáhnout stálé vazby značeného thyroxinu na protilátku. Doba styku závisí na podmínkách, zejména pH, teplotě a koncentraci. Obvykle stačí půl hodiny až 2 hodiny. Po skončení inkubace se roztok oddělí od nosiče, například vylitím: roztoku z nádobky, nosič se promyje vodou a pak se stanoví účinnost enzymu, vázaného na nosič. Při výhodném provedení způsobu podle vynálezu při použití nosiče ve formě nádobky a peroxidázy jako enzymu se přidá například peroxid vodíku a 2,2‘-azinodi[3-ethylbenzthiazolinsulfonát (6)] v roztoku v pufru a měří se extinkce při vlnové délce 405 nm.
К provádění způsobu podle vynálezu lze užít různých sestav. Sestava se například skládá z thyroxinu, enzymaticky značeného thyroxinu, protilátky proti thyroxinu ve formě nerozpustné pevné látky, z pufru a reakčního činidla ke stanovení enzymatické účinnosti. Vhodné pufry mají oblast pH v rozmezí 7,5 až 9,3. Výhodné pH tvoří rozmezí 8,0 až 9,0. Typickými příklady použitelných pufrů jsou fosfátový pufr, tris-pufr, boraxový pufr a barbitalový pufr.
Nejvýhodnější je barbitalový pufr v koncentraci 0,05 až 0,5 M.
Sestava může obsahovat ještě stabilizační činidla, například sérový albumin skotu, uhlohydráty nebo, glycerin.
S výhodou obsahuje sestava jako enzymaticky značený thyroxm vázaný na peroxidázu. Reakční činidlo pro stanovení enzymatické účjnnosti může být v tomto výhodném případě tvořeno peroxidem vodíku nebo sloučeninou, která tento peroxid uvolňuje, například perboritanem tento peroxid uvolňuje, například perboritanem sodným nebo perhydritem a 2,2‘-azino-di[ (3-ethylbemzthiazolinsulfonát/6/} J, jakož i vhodným pufrem. Typickým příkladem vhodného pufru je fosforečnanový a citronanový pufr o pH 4,5 až 6,0. Dalším vhodným pufrem pro toto provedení je fosfátový pufr o pH 7,0, guayakol a peroxid vodíku.
Ve výhodném provedení obsahuje sestava následující složky:
thyroxin thyroxinperoxidáza barbitalový pufr sérový albumin skotu protilátky proti thyroxmu (bez nosiče]
H2O2
2,2‘-azino-di- (3-ethylbenzthiazolinsulfonát' (6]i ' pufr s fosfátem a citronanem o pH 5,0 až 50 mM/1
0,1 až 0,2 M
Při výrobě enzymaticky značeného thyroxinu se s. výhodou vychází z terc.butyloxykair bony Ithyroxin-N-.hydroxysukcinimidu a reakce se provádí ve směsi pufru a dimethylformamidu v poměru 1 : 1. Jako pufr se užije kterýkoli ze svrchu uvedených pufrů. К čištění .konjugátu je vhodná fenylbutylaminsepharóza.
Způsobem podle vynálezu je tedy možno snadno, provést stanovení vazného indexu thyroxinu v séru, přičemž přesnost tohoto· stanovení odpovídá přesnosti při použití radioaktivních látek, způsob podle vynálezu je však prostý nevýhod shora uvedeného způsobu.
Způsob podle vynálezu lze využít v diagnostických i průmyslových podmínkách, zejména při výrobě farmaceutických přípravků.
Vynález bude osvětlen následujícími příklady.
Příklad 1
A. Výroba protilátek proti thyroxinu
Thyroxin se váže ve vcdném roztoku o pH 10 přidáním 1,9 hmotnostních % glutardialdehydu na sérový albumin skotu. Pak se redukuje sloučenina Schiffovy báze borohydridem sodným a látky, vyvolávající imunitu proti thyroxinu se čistí chromatograficky. Získaný produkt se podrobí dialýze a pak se podává pokusným zvířatům.
B. Výroba thyroxinperoxidázy
Peroxidáza se uvede v reakci s 10,násobným molárním přebytkem terc.butyloxyk.arbonylthyroxin-N-hydroxysukcinimidu ve směsi dimethylformamidu a fosfátového· pufru o pH 8,5 v poměru 1 : 1. Pak se dimethylformamid odstraní dialýzou a vodný roztok se smísí s fenylbutylaminsepharózou. Sloupec se promyje siměsí trispufru s chloridem sodným a pak směsí ethylenglykolu a vody v poměru 1 : 1 s obsahem 1 M chloridu sodného·. Eluát se míchá 2 hodiny s 0,5 M hydroxylaminu, načež se dialyzuje proti toisfá208781 tavernu pufru. Získaný roztok se smísí se sérovým albuminem skotu a pak se lyofilizuje.
C. Výroba protilátek proti thyroxinu, vázaných na nosič
Z imunizovaných zvířat se známým způsobem získá antisérum proti thyroxinu a vysráží se síranem amonným. Srážení se provádí v 0,04 M fosfátovém pufru 1 : 6000, v němž se také rozpustí sraženina. 1,5 ml takto získaného roztoku se nechá stát pres noc v reakčních nádobkách ze. směsného polymeru styrenu a akrylonitrilu (Lurain), pak se obsah odsaje, nádobky se vymyjí fyziologickým roztokem chloridu sodného s obsahem 1 % sérového albuminu skotu, načež se promyjí a vysuší.
D. Stanovení
Shora získané reakční nádobky s vrstvou protilátek proti thyroxinu se naplní 10 μ1 séra a 1 ml reakčního činidla, které obsahuje 280 ng thyroxinu/ml a 10 mU/ml thyroxin-peroxidázy v 0,12 M bar bita lovem pufru o pH 8,6 s přísadou 0,2 °/o sérového albuminu skotu. Směs se nechá stát 2 hodiny při teplotě místnosti. Pak se obsah nádobek odsaje, nádobky se naplní reakčním činidlem pro stanovení peroxidázy, které sestává z
1,47 m.M/1 H2O2 a 14 rnM/1 ABTS v 0,2 M pufru s fosforečnanem a citronanem o pH 5,0. Změna barvy se měří při 405 nm.
К vyhodnocení se užije cejchovací křivky, získané pomocí dvou standardů s různou vaznou schopností thyroxinu, které se zpracovávají stejným způsobem jako vzorky. Nanášejí se převrácené hodnoty extinkcí, naměřených pro tyto standardy, přičemž je možno stanovit vázané množství thyroxinu nebo přímo hodnoty vazného indexu thyroxinu.
E. Použití metody pro lidské sérum vzorků lidského séra se zkoumá způsobem podle vynálezu a sciu-časně se provádí zkouška při použití trijodthyroninu, značeného radioaktivním jodem. Zkoumaná sera se klasifikují podle získané hodnoty vazného indexu thyroxinu jako normální a jako séra se sníženou nebo zvýšenou vaznou kapacitou thyroxinu. Je zřejmé, že mezi oběma metodami je naprostý souhlas jak je zřejmé z tabulky 1.
| Tabulka 1 | ||
| A/B | 1 2 | 3 |
| 1 | 28 1 | |
| 2 | 1 28 | |
| 3 1) snížená | 3 | 22 |
2) normální l vazná schopnost thyroxinu
3) zvýšeni I
A — způsob podle vynálezu
В —- způsob s použitím radioaktivního značení
Claims (6)
- PŘEDMĚT VYNALEZU1. Způsob stanovení vazného indexu thyroxinu v krevním séru, vyznačující se tím, že se ke zkoumanému vzorku séra přidá 100 až 500 ng thyroxinu/ml a 1 až 200 milijednotek stanovitelného enzymu/ml, kovalentně vázaného na thyroxin, získaný roztok se uvede ve styk s protilátkami proti thyroxinu v pevné fázi, kapalná fáze se oddělí od pevné fáze a v jedné z těchto fází se měří účinnost použitého enzymu.
- 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako stanovitelného enzymu užije peroxidázy.
- 3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se protilátky proti thyroxinu užijí ve formě, vázané na nosič.
- 4. Způsob podle bodu 3, vyznačující se tím, že se jako pevného nosiče užije nádobky, jejíž vnitrní stěna je povlečena protilátkou.
- 5. Způsob podle bodů 1 až 4, vyznačující se tím, že se užije 100 až 500 ng thyroxinu/ml séra.
- 6. Způsob podle bodů 1 až 5, vyznačující se tím, že se užije 1 až 10 mU/ml peroxidázy vázané na thyroxin.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2825650A DE2825650C3 (de) | 1978-06-12 | 1978-06-12 | Verfahren zur Bestimmung des Thyroxin-bindungsindex im Serum |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS208781B2 true CS208781B2 (en) | 1981-09-15 |
Family
ID=6041575
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS793505A CS208781B2 (en) | 1978-06-12 | 1979-05-21 | Method of determination of the bonding index in the blood serum |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4467030A (cs) |
| EP (1) | EP0006998B1 (cs) |
| JP (1) | JPS551590A (cs) |
| AT (1) | AT361134B (cs) |
| CA (1) | CA1122119A (cs) |
| CS (1) | CS208781B2 (cs) |
| DE (2) | DE2825650C3 (cs) |
| ES (1) | ES481490A1 (cs) |
| FI (1) | FI68653C (cs) |
| HU (1) | HU182464B (cs) |
| YU (1) | YU136479A (cs) |
| ZA (1) | ZA792871B (cs) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4410633A (en) * | 1980-09-25 | 1983-10-18 | Corning Glass Works | Method for the measurement of free thyroxine or 3,5,3'-triiodothyronine in a liquid sample |
| DE3122019C2 (de) * | 1981-06-03 | 1983-11-10 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung eines automatisierten kontinuierlichen Enzymimmunotestes |
| DE3504406A1 (de) * | 1985-02-08 | 1986-08-14 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur bestimmung der bindungskapazitaet des thyroxin bindenden globulins |
| DE3546014A1 (de) * | 1985-12-24 | 1987-06-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung der bindungskapazitaet des thyroxin bindenden tbg |
| DE3812610A1 (de) * | 1988-04-15 | 1989-10-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung der thyroxinbindekapazitaet und dazu geeignete standardloesung |
| JP5997446B2 (ja) * | 2011-02-03 | 2016-09-28 | アークレイ株式会社 | 甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬およびその用途 |
| CN115808519A (zh) * | 2022-07-15 | 2023-03-17 | 桂林电子科技大学 | 一种用于甲状腺素检测的化学发光试剂盒及其制备方法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL154598B (nl) * | 1970-11-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking. |
| US4040907A (en) * | 1974-06-20 | 1977-08-09 | Syva Company | Iodothyronine enzyme conjugates |
| US3962039A (en) * | 1974-08-08 | 1976-06-08 | Center For Laboratory Medicine | Analytical procedure for thyroid hormones |
| US4043872A (en) * | 1975-02-20 | 1977-08-23 | Syva Company | Polyiodothyronine immunoassay |
| US4081245A (en) * | 1976-05-03 | 1978-03-28 | Beckman Instruments, Inc. | Immunoassay procedure employing novel immunochemical composites |
| US4052504A (en) * | 1976-06-30 | 1977-10-04 | Corning Glass Works | Assay for thyroxine binding globulin |
| US4032626A (en) * | 1976-06-30 | 1977-06-28 | Corning Glass Works | Reagent and method for tbg assay |
| GB1573627A (en) * | 1976-09-18 | 1980-08-28 | Ismail A A A | Process and device for the determination and detection of a reaction component |
| US4168207A (en) * | 1977-08-03 | 1979-09-18 | Syva Company | TBG assay |
-
1978
- 1978-06-12 DE DE2825650A patent/DE2825650C3/de not_active Expired
-
1979
- 1979-05-02 CA CA000326897A patent/CA1122119A/en not_active Expired
- 1979-05-21 CS CS793505A patent/CS208781B2/cs unknown
- 1979-05-28 AT AT386979A patent/AT361134B/de not_active IP Right Cessation
- 1979-05-29 FI FI791720A patent/FI68653C/fi not_active IP Right Cessation
- 1979-06-06 EP EP79101785A patent/EP0006998B1/de not_active Expired
- 1979-06-06 DE DE7979101785T patent/DE2961673D1/de not_active Expired
- 1979-06-11 HU HU79BO1790A patent/HU182464B/hu not_active IP Right Cessation
- 1979-06-11 ZA ZA792871A patent/ZA792871B/xx unknown
- 1979-06-11 YU YU01364/79A patent/YU136479A/xx unknown
- 1979-06-12 ES ES481490A patent/ES481490A1/es not_active Expired
- 1979-06-12 JP JP7311379A patent/JPS551590A/ja active Granted
-
1981
- 1981-05-15 US US06/263,948 patent/US4467030A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HU182464B (en) | 1984-01-30 |
| EP0006998A1 (de) | 1980-01-23 |
| JPS551590A (en) | 1980-01-08 |
| ES481490A1 (es) | 1980-01-16 |
| DE2825650B2 (de) | 1980-05-29 |
| DE2961673D1 (en) | 1982-02-18 |
| ZA792871B (en) | 1980-07-30 |
| CA1122119A (en) | 1982-04-20 |
| DE2825650A1 (de) | 1979-12-13 |
| JPH0146828B2 (cs) | 1989-10-11 |
| US4467030A (en) | 1984-08-21 |
| FI68653C (fi) | 1985-10-10 |
| EP0006998B1 (de) | 1981-12-30 |
| DE2825650C3 (de) | 1981-02-05 |
| ATA386979A (de) | 1980-07-15 |
| AT361134B (de) | 1981-02-25 |
| FI791720A7 (fi) | 1979-12-13 |
| YU136479A (en) | 1984-04-30 |
| FI68653B (fi) | 1985-06-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0594772B1 (en) | Water-soluble, polymer-based reagents and conjugates comprising moieties derived from divinyl sulfone | |
| US5543332A (en) | Water-soluble, polymer-based reagents and conjugates comprising moieties derived from divinyl sulfone | |
| US4931385A (en) | Enzyme immunoassays and immunologic reagents | |
| CA1098824A (en) | Stabilized peroxidase reagent for enzyme immunoassay | |
| US5051356A (en) | Specific binding composition comprising a low pI protein or carbohydrate and a diagnostic test kit and method of use | |
| CS257757B2 (en) | Method of reaction determination between antigen and antibody and reaction agent for realization of this process | |
| CA1168580A (en) | Immunological reagent for the detection of tubes of the rheumatoid factor in a biological specimen and process for preparing this novel reagent | |
| CS208781B2 (en) | Method of determination of the bonding index in the blood serum | |
| GB2102946A (en) | Enzyme immunoassay | |
| EP0095089B1 (en) | Improved homogeneous binding assay method and reagent system, test kit and test device therefor | |
| JPH0215827B2 (cs) | ||
| EP0152847A1 (en) | Stabilized enzyme conjugate composition | |
| Másson et al. | Chemical activation of nitrocellulose membranes for peptide antigen‐antibody binding studies: direct substitution of the nitrate group with diaminoalkane | |
| US4288538A (en) | Test method and composition therefor | |
| JP2749104B2 (ja) | アミンオキシドを含有する免疫化学的アツセイ用の試薬 | |
| JPH032662A (ja) | 免疫測定システム、免疫測定方法、洗浄溶液試薬および酵素基質有機化学コンパウンド | |
| EP0210863A1 (en) | Immunoassay | |
| EP0040728A1 (en) | An improvement in and relating to assaying methods involving biospecific affinity reactions | |
| JPS61241665A (ja) | 安定化された固相試薬 | |
| JP3655657B2 (ja) | アッセイ試薬及びそれを使用した測定方法 | |
| CA1336163C (en) | Enzyme quantitation wicking assay | |
| JPH01316660A (ja) | 物質の免疫学的検出方法及びこれに使用する組成物及びテストキット | |
| US20040121416A1 (en) | Assay | |
| JPS58201067A (ja) | ラクトフエリンの定量法 | |
| JPS61133862A (ja) | 免疫測定用材料の不動化方法 |