CS204368B1 - Process for preparing immobilised enzymes with high specific activity - Google Patents

Description

ČESKOSLOVENSKÁ SOCIALISTICKÁ REPUBLIKA (19) POPIS VYNÁLEZU K AUTORSKÉMU OSVEDČENIU 204368 (11) (Bl) (22) Přihlášené 13 11 78 (51) Int. Cl.3 C 12 N 11/14 (21) (PV 7361-78) (40) Zverejnené 31 07 80 ÚŘAD PRO VYNÁLEZY A OBJEVY (45) Vydané 30 03 82 (75)

Autor vynálezu ZEMEK JURAJ ing. CSc. LEHNICA, KUNIAK LUDOVfT ing. CSc. a KU-CÁR STEFAN RNDr. CSc., BRATISLAVA (54) Spósob přípravy imobilizovaných enzýmov o vysokej špecifickej akti-vitě

Vynález sa týká spósobu přípravy •imobili-zovaných enzýmov o vysokej špecifickej ak-tivitě.

Imobilizácia enzýmov na vodonerozpust-iných nosičoch, látkách organického aleboanorganického povodu pomocou funkčnýchskupin schopných reagovat s aminokyselina-mi a bielkovinami enzýmu za vzniku kovalent-nej vazby je dókladne opísaný (napr. Methodsin Enzymology Vol. XLIV, Immobilized En-zymes, Ed. Klaus Morbach, Academie Press,New York, San Francisko, London, 1976). Or-ganické látky napr. celulóza, polyamidy, poly-akrylamid a pod. majú ako nosiče isté nevý-hody, nakolko nemajú dostatočnú mechanickústabilitu, sú citlivé voči rozpúštadlám, vočizměnám pH a iontovej sily a sú častonapadané mikroorganizmami. Z tohto dó-vodu sú častokrát upřednostňované anor-ganické látky s enzýmami viazanými ko-valentnou vazbou pomocou specifickýchfunkčných skupin. Nakolko nosič anorganic-kého povodu tieto funkčně skupiny pováčšinenemá, je nutná jeho předběžná úprava, napr.pomocou aminoalkylsilánov, čím povrch získáorganické funkčně skupiny, napr. alkylamí-ny, ktoré vytvárajú s anorganickou látkou ko-valentnú vazbu. Dalšia úprava takto získané-ho materiálu móže byť převedená napr.pomocou tiofosgénu, fosgénu, anhydridu di- karbónových kyselin, připadne dalšími spó-sobmi. Z anorganických materiálov, ako vhodnéenzýmové nosiče sú kysličníky hliníka, železa,kysličník nikelnatý, titaničitý, zirkoničitý,hydroxylapatit, kremičitany a porézně sklo.Velkost pórov u porézneho skla umožňuje pří-stupnost enzýmov v procese imobilizácie akoaj substrátov v priebehu reakcie s imobilizo-vaným enzýmom do vnútomého priestoru no-siča. Účinnost reakcie imobilizácie enzýmu,specifická aktivita imobilizovaného enzýmua jeho stabilita pri skladovaní na povrchu no-siča však závisí na dlžke a substituentoch zlú-čeniny (spacera) obsahujúceho funkčnú sku-pinu vhodnú k zakotveniu enzýmu. Přípravaimobilizovaných enzýmov o vysokej špecific-kej aktivitě, vysokej účinnosti reakcie s biel-kovinou enzýmu a dlhej stabilitě imobilizova-ného enzýmu počas skladovania je zahrnutáv riešení tejto přihlášky vynálezu.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že povrchskla sa nechá reagovat s χ-aminopropyltrieto-xysilánom pri teplote 100 až 120 °C po dobu4 až 10 hodin, pri-čom získaný produkt obsa-hujúci aminoalkylskupiny sa nechá v druhomstupni reagovat s tiofosgénom pri 70 až 90 °Cpo dobu 2 až 8 hodin a získaný polyizotiokya-nát sa nechá reagovat v tretom stupni s 1,6diamino-2,5-dihydroxyhexánom po dobu 2 až 204368 2 6 hodin pri 80 až 100 °C a získaný derivát ob-sahu júci vól’né primárné aminoskupiny sa mo-difikuje v reakcii s vhodným činidloňi, napr.tiofosgénom v štvrtom stupni pri 70 až 90 °Cpo dobu 2 až 6 hodin, alebo anhydridom ky-seliny jantárovej a v poslednom stupni sa na.takto uipravenom nosiči imobilizuje enzým zamiešania po dobu 1 až 20 hodin pri teplote 0až 40 °C, pri pH 4 až 6. Výhoda uvedeného spósobu imobilizáciespočívá v tom, že pomocou bifunkčnej šesť-uhlíkatej látky obsahujúcej hydroxylové sku-piny v sústave k reaktívnym skupinám (napr.— NH2) sa zvyšuje účinný povrch umožňujúcizískat až 96% emzýmu naneseného na nosičv aktívnej formě (podlá údajov D. L. Latigue,Immobilized Enzymes for Industrial Reac-tors, London 1975, str. 127) zostáva aj za naj-lepších podmienok len asi 80 % enzýmu poimobilizácii na nosiči v aktívnej formě. Poklesaktivity imobilizovaného enzýmu zakotvenéhona skle modifikovaným vyššie uvedeným spó-sobom počas skladovania je o 10 až 30 % niž-ší ako u nosičov bez tejto modifdkácie alebo sozavedením bifunkčnej látky dlhšej alebo krat-šej ako 6 uhlíkovej. Přístupnost aktívnehocentra imobilizovaného enzýmu pre reakciuso substrátom alebo inhibítorom je lepšia akou nosičov nemodifikovaných týmto spóso-bom. Příklady preyedenia Příklad 1

Sklo o kontrolovanej velkosti pórov (10 g),CPG-10, 1400 o zrnitosti 120/200, strednýpriemer pórov 1200 A, specifický - povrch. 12,5 m2/g (fa Electronucleonics, USA) sa: za-,Ihrievalo v zriedenej (1:1) kyselině dusičnéjpri teplote 120 °C po dobu 5 hodin. Partikuleskla sa potom premyli nadbytkem (500 ml) vo-dy, destilovanej vody a acetónom a vysušili.Vysušené sklo sa reaktivovalo v prúde kys-líka pri teplote 400 °C po dobu 12-hod. Akti-vované sklo (10 g) sa použilo k silanizácii,ktorá.sa prevádzala v 10 % roztoku χ-amino-propyltrietoxysilánu v toluéne (160 ml) priteplote i20 °C po dobu 4 hodin. Produkt re-akcie silinizácie sa premýval nadbytkom to-luénu (400 ml) za účelom odstránenia nezře-.agovaného χ-aminopropyltrietoxysilánu. Pre-rnyté sklo sa sušilo pri teplote 100 °C cez noc.Získané sklo obsahujúce primárné aminosku-piny sa charakterizovalo na ioh obsah pomo-cou metody využívajúcej 2,4,6 — trinitroben-:zénsulfónovou kyselinou (H. Wand, M; Rudela H. Dantzemberg, Z. Chemie, 18, 224 (1978).Porézně sklo s primárnými aminoskupinami(10 g) sa nechalo reagovat s tiofosgénom(10 %-ný roztok) tiofosgénu v chloroforme(200 ml) pri teplote 80 °C cez noc. Získanésklo obsahujúce izotiokyanátové funkčně sku-piny sa charakterizovalo na ich obsah pomo- cou reakcii s (U — 41C) valínom (U — 14G) cys-teínom a merkaptoetanolom.

Reakciá sá prevádzala tak, že porézně sklo(10 g) obsahujúce izotiokyanátové skupiny sanechalo reagovat s 2,5 %-ným 1,6 diamino— 2,5-dihydroxyhexánom (v 400 ml chloroformu)pri teplote 80 °C po dobu 5 hodin. Nezreagova-ný diaminohexán sa vymyl nadbytkom (0,6 1)chloroformu, (0,5 1) vody a (0,5 1) acetonu.Reakcia takto modifikovaného porézneho sklas tiofosgénom prebehla v 10 %-nom roztokutiofosgénu v 200 ml chloroformu pri teplote80 °C po dobu 5 hodin.

Takto připravený nosič (10 g) sa použil k i-mobilizácii pseudocholínesterázy (acylcholínacylhydroláza EC 3.1.1.8). Pseudocholínesterá-za z konskej plazmy (0,5 g, 120 U/mg) sa roz-pustila v 200 ml 0,02 M borátového pufru (pH8,5) a přidalo sa 10 g porézneho skla so zave-deným 1,6-diamino—2,5 dihydroxyhexánom aizotiokyanátovými funkčnými skupinami.Imobilizácia prebiehala za miešania po dobu2 hodin. Nezreagovaný rozpustný enzým savymyl 2 M ehloridom sodným vo vodě (500ml). Imobilizovaný enzým sa udržiaval vozvlhčenom stave pri 4°C a aktivita pokleslaza 1 rok o 15%. Získaná špecifická aktivitaenzýmu 2300 U/g, účinnost imobilizácie 95 %.Příklad 2

Tak ako uvedené v příklade 1 s tým rozdie-lom, že po zavedení 1,6-diamino—2,5-dihydro-xyhexánu derivatizované sklo (10 g) s volný-mi aminoskupinami sa nechá reagovat s an-hydridom kyseliny jantárovej (4 g) v 200 mlchloroformu pri teplote 80 °C po dobu 2 hodin.Reakóný produkt sa premyl vo vodě (500 ml)a acetone (300 ml) a Vysušil. Ďalšia modifiká-cia skla (10 g) obsahujúceho vol’né karboxy-lové skupiny sa previedla v 2 %-nom vodnomroztoku l~cyklohexyl-3-(2-rhorfolinoetyl) kar-bódiimidu o pH 4,8 za miešania pri izbovejteplote po dobu 1 hodiny. Získané derivatizo-vané sklo sa premylo 4 rázy vodou (500 ml)před imoibilizáciou enzýmu. Imobilizácia en-zýmu sa prevádzala rovnako ako uvedenév příklade 1, s tým rozdielom, že teplota prireakcii imobilizácie sa udržiavala v rozmedzí0 až 2 °C. Špecifická aktivita imóbilizovanéhoenzýmu 2050 U/g. Účinnost.imobilizácie 85 %.Příklad 3

Tak ako uvedené v příklade 1 s tým rozdie-lom, že sa namiesto pseudocholínesterázy pou-žije glukoamyláza (a-l,4-glukán glukohydro-láza EC 3.2.1.3) s Endomycopsis bispora. Spe-cifická aktivita zmobilizovaného enzýmu 1200U/g, účinnost imobilizácie 92 %.

Snobilizované enzýmy na nosičoch za vyu- žitia 1,6 diamino-2,5—dihydroxyhexánu sú vhodné pre priemyselnú aplikáciu a pre použi- tie v analytickej ohémii.

Claims (1)

1. 3 PREDMET VYNÁLEZU Spósob přípravy imobilizovaných enzýmovo vysokéj specifickéj aktivitě vyznačuj úci satým, že sa povrch skla nechá reagovat s r-anii-nopropyltirietoxysilánom pri teplote 100 až120 °C po dobu 4 až 10 hodin, priěorn získanýprodukt obsahujúci aminoalkylové skupiny sanechá v druhom stupni reagovat s tiofosgénompri teplote 70 až 90 °C po dobu 4 až 8 hodina získaný izotiokyanát alkylderivát sa necháreaogavť v treťom stupni, s 1,6-diamino—2,5- dihydroxyhexánom po dobu 4 až 8 hodin priteplote 80 až 100 °C a získaný derivát obsahu-júci volné primárné- aminoskupiny sa modi-fikuje v reakcii s tiofosgénom v štvrtom stupnipri teplote 70 až 90 °C po dobu 2 až 8 hodinalebo s anhydridom. kyseliny jantárovej av poslednom stupni ňa takto upravenom skle.sa imobilizuje enzým za miešania po dobu 1až 20 -hodin pri teplote 0 až 40 °C a pH 4 až 6.