CS203676B1 - Process for preparing chromogenic amylaceous substrate for the determination of the activity of glucoamylase - Google Patents
Process for preparing chromogenic amylaceous substrate for the determination of the activity of glucoamylase Download PDFInfo
- Publication number
- CS203676B1 CS203676B1 CS21979A CS21979A CS203676B1 CS 203676 B1 CS203676 B1 CS 203676B1 CS 21979 A CS21979 A CS 21979A CS 21979 A CS21979 A CS 21979A CS 203676 B1 CS203676 B1 CS 203676B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- starch
- glucoamylase
- substrate
- determination
- activity
- Prior art date
Links
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims description 15
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 title claims description 14
- 239000000758 substrate Substances 0.000 title claims description 11
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 title claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 29
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 28
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 27
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 18
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N Epichlorohydrin Chemical compound ClCC1CO1 BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 4
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical class [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 claims description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- COFMBBYARPOGBA-UHFFFAOYSA-N 1-phenylethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C(C)C1=CC=CC=C1 COFMBBYARPOGBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000011651 chromium Substances 0.000 claims 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 9
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 9
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 4
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- URPBSRQSVAMQRT-UHFFFAOYSA-N 4-amino-9,10-dioxo-1-[3-(2-sulfoethylsulfonyl)anilino]anthracene-2-sulfonic acid Chemical compound NC=1C=C(C(=C2C(C=3C=CC=CC3C(C12)=O)=O)NC1=CC(=CC=C1)S(=O)(=O)CCS(=O)(=O)O)S(=O)(=O)O URPBSRQSVAMQRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- -1 disodium 8-amino-5- [3- (sulphoethylsulphonyl) anilino] -6-anthraquinone sulphonic acid Chemical compound 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
SOCIALISTICKÁ i POPIS VYNÁLEZU
<”> K AUTORSKÉMU OSVEDČENIU 203676 («) (Bl)
/22/ Přihlášené 10 01 79/21/ /PV 219-79/ (Sl) Int Cl.* 1 2 3C 13 L 1/08//C 12 N 9/34 (40) Zverejnené 30 06 80
ÚŘAD PRO VYNÁLEZY
A OBJEVY (45) Vydané 15 10 8 2 (75)
Autor vynálezu
KUNIAK CUDOVÍT ing. CSc., BRATISLAVA a ZEMEK JURAJ ing. CSc., LEHNICE (54) Spósob přípravy chromogónneho škrobového substrátu na stanovenieaktivity glukoamylázy 1
Vynález sa týká sposobu přípravy chromogénného škrobového substrátu na stanovenie gluko-amylázovej enzýmovej aktivity.
Rychle, jednoduché a spolehlivé testy na kvalitativně a kvantitativné stanovenie enzýmo-vej aktivity stali sa v praktickou životě nepostradatelnými. K najprogresívnejším metodám stahovenia úrovně ehzýnovej aktivity glukán-giukánohydro-láz patři kolorimetrická metoda založená na tom, Že ako testovací substrÚt sa použije vhodnýnerozpustný polysachařid s kovalentne viazaným f.arbivom,
Chromogénny, nerozpustný polysacharidový gel .sa vplyvom prítomnej enzýmovej hydrolázyštiepa na rozpustné štíepne produkty, ktoré spolu 8 viazaným farbivom prechádzajú do roztoku,pričom intenzita farby roztoku je lineárně úměrná koncentrácii produktov hydrolýzy a tým ajkoncentraci! přítomného enzymu. •fak napr. v případe testovania alfa-amylázovej enzýmovej aktivity možno s výhodou použitako substrát chromogénny škrob, t. j. farebný polysachařid s vizbami alfa/1—>4/, ktoré saúčinkom enzymu alfa-amylázy štepia £j. Kenedyt Advances in carbohydrate chemistry and bioche-mistry, 2 9, / 1 97 4 / , str 350-3.57, L . Kuniak,, J. Zemek /és. AO Č. 1 92 2 1 0 /J ,
Na základe výsledkov výskumu v tejto'oblasti sa zistilo, Že Specificky sietovaný škrobs velmi vysokým napúčacím objemom vo vodě'12 až 20 ml/g po kovalentnom naviazaní farbiva jevynikajúcim substrátom aj pre enzym glukoamy1ázu, /oiz-1 ,4-glukán glukohydrolázu, EC 3.2.1.3/tak, že je ho možné použit výhodné na kolorimetrické stanovenie glukoamylázy.
Podstata vynálezu spočívá v tom, že 2'ě'miákový škrob sa v prvom stupni zosietuje v 0,1 iXhydroxide sodnom za použitia 0,1 až 1,0 7» epichlárhydrinu na hmotnost suchého škrobu, po dobu 2 až 24 hodin pri teplote miestnosti za stálého miešania pri pomere kvapalnej a pevnej fázy2:1, v druhora stupni sa nechá zosietený škrob reagovat s dvojsodnou solou kyseliny 8-amino- -5-£3-/sulfoetýlsulfonyl/ anilinoJ-6-antrachinon.sulfónovej v množstve 4 až 20 Z na hmotnostsuchého Škrobu v 0,7 až 1,0% hydroxide sodnom pri pomere kvapalnej a pevnej fázy 10:1 až10:15 pri teplote miestnosti po dobu 1 až 2 hodiny, nač.o sa reakčná zmes neutralizuje ekvi- 036 76 203676 2 valentným množstvom kyseliny octovej a nakoniec sa chromogénny škrob premýva na filtri eta-nolom o koncentrácii 40 až 50 % do bezfarebnej reakcie filtrátu.
Najvýhodnejší zo škrobov je škrob zemiakový pre jeho vysókú chemickú čistotu, relativnévelké rozměry zrna a dobru filtrovatelnost.
Sietovanie s epichlórhydřínom je volené tak, aby napúčací objem hotového chromogénnehoŠkrobového gélu sa pohyboval v medziach 12 až 18 ml/g, čo je zárukou velmi vysokej citlivostina glukoaraylázu. Pri nižších hodnotách stupfta napúčania je substrát nedostatočne citlivý prerychle sériové meranie glukoamylázovej enzýmove.j aktivity. Optimálna doba sietovania pohybujesa za reakčných podraienok predmetu vynálezu okolo 4 hodin. Po prvom stupni sietovania, přidá-váním roztoku farbiva v alkalickora roztoku škrob asi do dvoch rninút vytvoří pevný gel, ktorýsa nedá miešat a preto reakcia viazania farbiva prebieha staticky bez miešania, Nie. je tovšak na překážku rovnoměrnému priebehu reakcie viazania farbiva na škrob, pretože farbivo.sapřidává v rozpustenom stave a reakčná zni es sa dostatočne zhomogenizu je pokial zoželatinujedo takého atupfta, ze sa miešanie musí zastavit.
Po ukončení reakcie naviazania farbiva přidáním kyseliny octovej v zriedenora etanole/1:1/ sa tuhý škrobový gél prevedie na riedku slispenziu, kcorá sa opat móže lahko miešata dobré filtrovat.
Premývanie je najpomalší technologický stupeň přípravy, nakolko volné nezreagované farbí-vo sa musí kvantitativné z gélu vymyt,až je filtrát úplné číry,. Obyčajne sa na to spotřebuje70-až 100násobok zriadeného etanolu na hmotnost povodného škrobu.
Red je premývanie ukončené, nakoniec sa gél viacuásobne premýva na filtri koncentrovanýmetanolom, aby sa dokonale odstranila voda. Ak sa voda nedostatočne vytěsní etanolom, gélpri sušení vytvára tvrdé hrudky čo je nežiaduce, nakolko by sa musel suchý gél pomliet.
Nakoniec sa etanol z gélu odstráni sušením volné na vzduchu alebo v sušiarni pri teplotě'80 až 100 °C.
Suchý chromogénny, sletovaný škrob má napúčací objem vo vodě 14 ml/g a je výbornýmsubstrátom pre kvantitativné stanovenie glukoamy1ázy.
Pochopitelné, připravený gél je .rovnako dobrým substrátem aj pre alfa-amylázu. Pretovo vzorkácn, kde sa súČasne vyskytuje tak alfa-amylázová ako i glukoamylázová aktivita,najprv sa stanoví alfa-amylázovým testom alf a-ar.iy lázová aktivita, v druhom stanovení v novejvzorke sa stanoví alfa-amylázová i glukoamylázová enzymová aktivita pomocou navrhovanéhoškrobového substrátu v tabletovej formě a ich rozdiel zodpovedá samotnej glukoamylázovej akti-vitě. · Výhodou navrhovaného sposobu přípravy chromogénneho škrobového substrátu pre stanovenieglukoamylázovej aktivity je, že umožňuje přípravu chromogénneho škrobu vo formě tabletiek, ktoré spíňajú náročné požiadav-ky klinickej a prevádzkovej praxe prisériovej analýze enzýmovej aktivity, preparát sa móže vyrábat z domácích lacných surovin poměrně velmi jednoduchým technolo-gickým postupom, výrobna cena připraveného preparátu je mnohonásobné nižšia ako cena obdobných preparátovna svetovom trhu, pri kombinácií s alf a-amylázovým testom umožňuje stanovit vedla seba tak alf a-ů.aylázovúako i glukoamylázovú enzýraovú aktivitu. Příklady prevedenia Přikladl V '380 ml 0,1 M NaOH sa rozpustí 2 ml epichlórhydrinu pri teplote miestnosti potom sapřidá za stálého miešania 220 g vzduchosuchého zemiakového škrobu a nechá sa reagovat zastálého miešania pri teplote miestnosti *po dobu 4 hodin. V osobitnej kádičke sa rozpustí14 g pevného NaOH v 1 200 ml vody a v dalSej kádičke osobitne sa rozpustí 8 g dvojsodnejsoli kyseliny 8-amino-5-f3-/sulfoetylsulfonyl/anilinoJ-6-antrachinonsulfóuovej /demazol ‘Brilant Blue R/ v 400 ml vody. Obidva roztoky po vychladení na 20 °C sa zlejú dohromady a při-dá sa naraz do reakčnej banky so sletovaným škrobom, reakčná zmes sa dobré zamieša a asi po2 minutách sa změní na hustý gél, ktorý sa nechá 90 minut bez miešania doreagovat. Potom do
Claims (1)
- 3 203676 reakčhej banky sa vlejé asi 200 ml zriedeného etanolu /til/, do ktořého sa před tým přidalo20 ml koncentrovanéj kyseliny octovej. Reakčná zmes zr.edne, dobře sa zaraieša po dobu 5 minuta filtruje sa cez skleněný filter» Na filtri sa premýva zriedeným etanolom /1:1/ tak dlhoaž filtrát je úplné, bezfarebný. Nakoniec škrobový gél sa p*remýva na filtri koncentrovanýmetanolom. Etanol sa dokonale odsaje a škrobový gél sa suší na vzduchu alebo v sušiarni priteplote 80 až 100 °C. Suchý Škrobový gél ma napúčací objem 14 ml/g. Přiklad 2 Postup podlá příkladu 1, s tým rozdielom, že doba sietovania sa krátí na 2 hodiny, a ďa-lej sa pokračuje ako v příklade 1. Škrobový gél má napúčací objem 16 ml/g. P r i k 1 a d 3 Postup podlá příkladu 1, s tým rozdielom, že sa použije 10 g dvojsodnej soli kyseliny8-amino~5-[3-/sulf oetylsulf onyl/anilinoj-ó-antrachinotisulf ónovej Připravený gél sa dlhšiepremýva, ale obsahuje viac víazaného farbiva;t. j. je citlivější pri analytických stanovenýchenzýmových aktivit. Příklad 4 Postup podlá příkladu 1, s tým rozdielom, že- sa použije 0,2 ml epichlorhydrinu a sieťova-nie prebieha pri teplote miestnosti po dobu 24 hodin a na farbenie sa použije 40 g dvojsodnejsoli kyseliny 8-amÍno-5-L,3-/su1foety1 sulfony1/anilinoj-6-antrachinonsulfoaovej. Výsledný suchýchroraogénny škrobový gél má napúčací objem 18 ml/g. Vynález má uplatnenie vŠade>kde je potřebné sledovat úroveň glukoamylázovej aktivityči už v priemyslovej praxi ďalej vo výskume pri testovaní raikroorganizmov na glukoamylázovúenzýraovú aktivitu, a v klinickej praxi pre diagnostické účely niektorých ochorení. PREDMET VYNÁLEZU Sposob přípravy chroraogénneho substrátuna stanovenie aktivity glukoamylázy, vyznačenýtým, že zemiakový škrob sa v prvom stupni zosieťuje v 0,1 M hydroxide sodnom 2a použitia0,1 až 1,0% epichlórhydrinu na hmotnost suchého škrobu, po dobu 2 až 24 hodin pri teplotemiestnosti za stálého mieŠani.a pri pomere kvapalnej a pevnej fázy 2:1, vdruhom stupni sa necházosietený Škrob reagovat s dvojsodnou solou kyseliny S-amíno-S- j_3 -/sul f oe ty Isu 1 f ony 1 /ani 1 inoj-6-antrachinonsulfónovej v množstve 4 až 20 7. na hmotnost suchého škrobu v 0,7 až 1,0* hydro-xide sodnom pri pomere kvapalnej a pevnej fázy 10:1 až 10:15 pri teplote miestnosti po dobu1 až 2 hodiny,, naco sa reakčná zmes neutralizuje ekvivalentnýra množstvom kyseliny octoveja nakoniec. sa chroraogénny škrob premýva na filtri etanolom o koncentrácii 40 až 50 % do bez-farebnej reakcie filtrátu. f Sevrrografia. η. p·. závod 7. Mott
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS21979A CS203676B1 (en) | 1979-01-10 | 1979-01-10 | Process for preparing chromogenic amylaceous substrate for the determination of the activity of glucoamylase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS21979A CS203676B1 (en) | 1979-01-10 | 1979-01-10 | Process for preparing chromogenic amylaceous substrate for the determination of the activity of glucoamylase |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS203676B1 true CS203676B1 (en) | 1981-03-31 |
Family
ID=5333912
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS21979A CS203676B1 (en) | 1979-01-10 | 1979-01-10 | Process for preparing chromogenic amylaceous substrate for the determination of the activity of glucoamylase |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS203676B1 (cs) |
-
1979
- 1979-01-10 CS CS21979A patent/CS203676B1/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Biely et al. | Soluble chromogenic substrates for the assay of endo-1, 4-β-xylanases and endo-1, 4-β-glucanases | |
| Jung | Preparation and application of procion yellow starch for amylase assay | |
| Klein et al. | New chromogenic substrate for determination of serum amylase activity | |
| CN111638106B (zh) | 一种尿液干化学分析质控物 | |
| McCleary | New chromogenic substrates for the assay of alpha-amylase and (1→ 4)-β-d-glucanase | |
| Leisola et al. | Determination of the solubilizing activity of a cellulase complex with dyed substrates | |
| AU608900B2 (en) | Chromogenic substrates | |
| CS203676B1 (en) | Process for preparing chromogenic amylaceous substrate for the determination of the activity of glucoamylase | |
| SU396036A1 (ru) | СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ сс-АМИЛАЗЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ | |
| US3759794A (en) | Method for determination of amylase activity | |
| US3694318A (en) | Substrate and method for alpha-amylase assay | |
| JPH05213944A (ja) | ナフトトリアゾリウム塩 | |
| PL80211B1 (cs) | ||
| JPH0551279B2 (cs) | ||
| CA1110620A (en) | SUBSTRATE FOR .alpha.-AMYLASE AND THE PREPARATION THEREOF | |
| CS237101B1 (sk) | Sposob přípravy vodorozpustných chromolytických polysacharidových enzýmových substrátov | |
| US7648839B2 (en) | Metal indicator | |
| CS234607B1 (sk) | SpSsob stanovenia aktivity endo-1,4- β-xylanáz | |
| CN109061162A (zh) | 一种高通量测定淀粉水解酶抑制活性的方法 | |
| JP3048672B2 (ja) | 試薬結合ポリマー、該ポリマー膜および該ポリマーを含む担持体 | |
| Kennedy | Some Methods for the Characterisation of Natural and Dyed Amyloses as Potential Substrates for the Assay of α‐Amylase | |
| CN108645846A (zh) | 一种基于纸基测定血清α-淀粉酶活性的方法 | |
| CS224156B1 (cs) | Spósob přípravy chromogénneho škrobu pre detekciu izoenzýmov alfa amylázy | |
| CA2146207C (en) | Assay method and device | |
| JPH0730107B2 (ja) | 加水分解酵素活性を有する物質の検出方法及び二環式化合物 |