CS203676B1 - Process for preparing chromogenic amylaceous substrate for the determination of the activity of glucoamylase - Google Patents

Process for preparing chromogenic amylaceous substrate for the determination of the activity of glucoamylase Download PDF

Info

Publication number
CS203676B1
CS203676B1 CS21979A CS21979A CS203676B1 CS 203676 B1 CS203676 B1 CS 203676B1 CS 21979 A CS21979 A CS 21979A CS 21979 A CS21979 A CS 21979A CS 203676 B1 CS203676 B1 CS 203676B1
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
starch
glucoamylase
substrate
determination
activity
Prior art date
Application number
CS21979A
Other languages
Czech (cs)
Slovak (sk)
Inventor
Ludovit Kuniak
Juraj Zemek
Original Assignee
Ludovit Kuniak
Juraj Zemek
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ludovit Kuniak, Juraj Zemek filed Critical Ludovit Kuniak
Priority to CS21979A priority Critical patent/CS203676B1/en
Publication of CS203676B1 publication Critical patent/CS203676B1/en

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Vynález sa týká sposobu přípravy chromogénného škrobového substrátu na stanovenie glukoamylázovej enzýmovej aktivity.The invention relates to a process for the preparation of a chromogenic starch substrate for the determination of glucoamylase enzyme activity.

Rýchle, jednoduché a spolehlivé testy na kvalitativně a kvantitativné stanovenie enzýmovej aktivity stali sa v praktickou životě nepostradatelnými.Fast, simple and reliable tests for qualitative and quantitative determination of enzyme activity have become indispensable in practical life.

K najprogresívnejším metodám stahovenia úrovně ehzýnovej aktivity glukán-giukánohydroláz patři kolorimetrická metoda založená na tom, Že ako testovací substrát sa použije vhodný nerozpustný polysachařid s kovalentne viazaným f.arbivom.One of the most progressive methods of reducing the level of glucan-gluconic hydrolase enzyme activity is the colorimetric method based on the use of a suitable insoluble polysaccharide with a covalently bonded colorant as the test substrate.

Chromogénny, nerozpustný polysacharidový gel .sa vplyvom prítomnej enzýmovej hydrolázy štiepa na rozpustné štíepne produkty, ktoré spolu s viazaným farbivom prechádzajú do roztoku, pričom intenzita farby roztoku je lineárně úměrná koncentrácii produktov hydrolýzy a tým aj koncentraci! přítomného enzymu.The chromogenic, insoluble polysaccharide gel is cleaved by soluble enzymatic hydrolysis to soluble cleavage products which, together with the bound dye, enter the solution, the color intensity of the solution being linearly proportional to the concentration of the hydrolysis products and thus the concentration. present enzyme.

Tak napr. v případe testovania alfa-amylázovej enzýmovej aktivity možno s výhodou použit ako substrát chromogénny škrob, t. j. farebný polysachařid s vizbami alfa/1—>4/, ktoré sa účinkom enzymu alfa-amylázy štepia £j. Kenedyt Advancee in carbohydrate chemistry and biochemistry, 2 9, / 1 97 4 / , str 350-3.57, L . Kuniak,, J. Zemek /és. AO Č. 1 92 2 1 0 /J ,So eg. in the case of testing for alpha-amylase enzyme activity, preferably chromogenic starch may be used as a substrate, i. j. a colored polysaccharide with alpha (1-> 4) impressions that are cleaved by α-amylase enzyme γ. Kenedyt Advancee in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, 2 9, (1 97 4), pp 350-3.57, L. Kuniak, J. Zemek / és. AO Č. 1 92 2 1 0 / J

Na základe výsledkov výskumu v tejto’oblasti sa zistilo, Že Specificky sietovaný škrob s velmi vysokým napúčacím objemom vo vodě'12 až 20 ml/g po kovalentnom naviazaní farbiva je vynikajúcim substrátom aj pre enzým glukoamy1 ázu , /oiz-1 ,4-glukán glukóhydrolázu , EC 3.2.1.3/ tak, že je ho možné použit výhodné na kolorimetrické stanovenie glukoamylázy.Based on research in this field, it has been found that specifically crosslinked starch with a very high swelling volume in water of 12 to 20 ml / g after covalent binding of the dye is an excellent substrate for the enzyme glucoamylase, oiz-1,4-glucan. glucohydrolase, EC 3.2.1.3/, so that it can be used advantageously for the colorimetric determination of glucoamylase.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že 2'ě'miákový škrob sa v prvom stupni zosietuje v 0,1 M hydroxide sodnom za použitia 0,1 až 1,0 7» epichlarhydrínu na hmotnost suchého škrobu, po dobu až 24 hodin pri teplote miestnosti za stálého miešania pri požere kvapalnej a pevnej fázy 2:1, v druhora stupni sa nechá zosietený škrob reagovat s dvojsodnou solou kyseliny 8-amino-5-0-/sulfoetýlsulf onyl/ anilinoJ-6-antrachinon.sulfónovej v množstve 4 až 20 Z na hmotnost suchého Škrobu v 0,7 až 1,0% hydroxide sodnom pri pomere kvapalnej a pevnej fázy 10:1 až 10:15 pri teplote miestnosti po dobu 1 až 2 hodiny, nač.o sa reakčná zmes neutralizuje ekvi036 76 valentným množstvom kyseliny octovej a nakoniec sa chromogénny škrob premýva na filtri etanolom o koncentrácii 40 až 50 % do bezfarebnej reakcie filtrátu.SUMMARY OF THE INVENTION In a first step, 2-starch starch is crosslinked in 0.1 M sodium hydroxide using 0.1 to 1.0% epichlarhydrin per dry starch, for up to 24 hours at room temperature. while stirring the 2: 1 liquid and solid phase, in the second stage, the cross-linked starch is reacted with 8-amino-5-O- (sulfoethylsulfonyl) anilino-6-anthraquinone sulfonic acid disodium salt in an amount of 4 to 20% to the weight of dry starch in 0.7 to 1.0% sodium hydroxide at a liquid: solid phase ratio of 10: 1 to 10:15 at room temperature for 1 to 2 hours, after which the reaction mixture was neutralized with 76% valent acid acetic acid and finally the chromogenic starch is washed on the filter with 40-50% ethanol until the colorless reaction of the filtrate.

Najvýhodnejší zo škrobov je škrob zemiakový pre jeho vysókú chemickú čistotu, relativné velké rozměry zrna a dobru filtrovatelnost.The most preferred of the starches is potato starch because of its high chemical purity, relatively large grain size and good filterability.

Sietovanie s epichlórhydřínom je volené tak, aby napúčací objem hotového chromogénneho Škrobového gélu sa pohyboval v medziach 12 až 18 ml/g, čo je zárukou velmi vysokej citlivosti na glukoaraylázu. Pri nižších hodnotách stupfta napúčania je substrát nedostatočne citlivý pre rychle sériové meranie glukoamylázovej enzýmove.j aktivity. Optimálna doba sietovania pohybuje sa za reakčných podraienok predmetu vynálezu okolo 4 hodin. Po prvom stupni sietovania, přidáváním roztoku farbiva v alkalickora roztoku škrob asi do dvoch minút vytvoří pevný gel, ktorý sa nedá miešat a preto reakcia viazania farbiva prebieha staticky bez miešania, Nie. je to však na překážku rovnoměrnému priebehu reakcie viazania farbiva na škrob, pretože farbivo.sa přidává v rozpustenom stave a reakčná zni es sa dostatočne zhomogenizu je pokial zoželatinuje do takého atupfta, ze sa miešanie musí zastavit.Crosslinking with epichlorohydrin is selected so that the swelling volume of the finished chromogenic starch gel is between 12 and 18 ml / g, which ensures a very high sensitivity to glucoaraylase. At lower swell rates, the substrate is insufficiently sensitive to rapidly serial measurement of glucoamylase enzyme activity. Under the reaction conditions of the present invention, the optimum crosslinking time is about 4 hours. After the first crosslinking step, adding a dye solution in an alkaline solution of the starch solution for about two minutes creates a solid gel that cannot be mixed and therefore the dye binding reaction proceeds statically without mixing. however, this is an obstacle to the uniform course of the dye-starch binding reaction, since the dye is added in the dissolved state and the reaction is sufficiently homogenized if it gelatinizes to the extent that stirring has to be stopped.

Po ukončení reakcie naviazania farbiva přidáním kyseliny octovej v zriedenora etanole /1:1/ sa tuhý škrobový gél prevedie na riedku suspenziu, kcorá sa opat može lahko miešat a dobré filtrovat.After completion of the dye-binding reaction by adding acetic acid in ethanol diluent (1: 1), the solid starch gel is turned into a thin suspension, which can be easily mixed and well filtered.

Premývanie je najpomalší technologický stupeň přípravy, nakolko volné nezreagované farbívo sa musí kvantitativné z gélu vymyt,až je filtrát úplné číry,. Obyčajne sa na to spotřebuje 70-až 100násobok zriadeného etanolu na hmotnost povodného škrobu.Washing is the slowest technological stage of preparation since the free unreacted dye must be quantitatively eluted from the gel until the filtrate is completely clear. Usually, 70-100 times the amount of ethanol established is consumed for the weight of the flood starch.

Red je premývanie ukončené, nakoniec sa gél viacuásobne premýva na filtri koncentrovaným etanolom, aby sa dokonale odstranila voda. Ak sa voda nedostatočne vytěsní etanolom, gél pri sušení vytvára tvrdé hrudky čo je nežiaduce, nakolko by sa musel suchý gél pomlíet.The red wash is complete, then the gel is washed several times on the filter with concentrated ethanol to completely remove the water. If the water is insufficiently displaced with ethanol, the gel forms hard lumps upon drying which is undesirable as the dry gel would have to be ground.

Nakoniec sa etanol z gélu odstráni sušením volné na vzduchu alebo v sušiarni pri teplotě '80 až 100 °C.Finally, ethanol is removed from the gel by drying in the air or in an oven at a temperature of 80 to 100 ° C.

Suchý chromogénny, sletovaný škrob má napúčací objem vo vodě 14 ml/g a je výborným substrátom pre kvantitativné stanovenie glukoamy1ázy.The dry chromogenic, milled starch has a swelling volume in water of 14 ml / g and is an excellent substrate for the quantitative determination of glucoamylase.

Pochopitelné, připravený gél je .rovnako dobrým substrátem aj pre alfa-amylázu. Preto vo vzorkácn, kde sa súČasne vyskytuje tak alfa-amylázová ako i glukoamylázová aktivita, najprv sa stanoví alfa-amylázovým testom alfa-ar.iylázová aktivita, v druhom stanovení v novej vzorke sa stanoví alfa-amylázová i glukoamylázová enzymová aktivita pomocou navrhovaného škrobového substrátu v tabletovej formě a ich rozdiel zodpovedá samotnej glukoamylázovej aktivitě. ·Of course, the gel prepared is also a good substrate for alpha-amylase. Therefore, in a sample room where both alpha-amylase and glucoamylase activity are present, the alpha-amylase assay is first determined by the alpha-amylase assay, in the second assay in a new sample the alpha-amylase and glucoamylase enzyme activity is determined using the proposed starch substrate in tablet form and their difference corresponds to the glucoamylase activity itself. ·

Výhodou navrhovaného sposobu přípravy chromogénneho škrobového substrátu pre stanovenie glukoamylázovej aktivity je, že umožňuje přípravu chromogénneho škrobu vo formě tabletiek, ktoré spíúajú náročné požiadavky klinickej a prevádzkovej praxe prisériovej analýze enzýmovej aktivity, preparát sa móže vyrábat z. domácích lacných surovin poměrně velmi jednoduchým technologickým postupom, výrobna cena připraveného preparátu je mnohonásobné nižšia ako cena obdobných preparátov na svetovom trhu, pri kombinácií s alf a-amylázovým testom umožňuje stanovit vedla seba tak alf a-ů.aylázovú ako i glukoamylázovú enzýraovú aktivitu.An advantage of the proposed method of preparing a chromogenic starch substrate for the determination of glucoamylase activity is that it allows the preparation of chromogenic starch in the form of tablets that meet the demanding requirements of clinical and operational practice by a series analysis of enzyme activity, the preparation can be produced from. The production price of the prepared preparation is many times lower than the price of similar preparations on the world market, when combined with the alpha-amylase test it is possible to determine side by side both alpha-amylase and glucoamylase enzyme activity.

Příklady prevedeniaExamples of design

PřikladlEXAMPLE

V '380 ml 0,1 M NaOH sa rozpustí 2 ml epichlórhydrinu pri teplote miestnosti potom sa přidá za stálého miešania 220 g vzduchosuchého zemiakového škrobu a nechá sa reagovat za stálého miešania pri teplote miestnosti *po dobu 4 hodin. V osobitnej kádičke sa rozpustí 14 g pevného NaOH v 1 200 ml vody a v dalšej kádičke osobitne sa rozpustí 8 g dvojsodnej soli kyseliny 8-amino-5-f3-/sulfoetylsulfonyl/anilinoJ-6-antrachinonsulfóuovej /demazol ‘ Brilant Blue R/ v 400 ml vody. Obidva roztoky po vychladení na 20 °C sa zlejú dohromady a přidá sa naraz do reakčnej banky so sletovaným škrobom, reakčná zmes sa dobré zamieša a asi po 2 minutách sa změní na hustý gél, ktorý sa nechá 90 minút bez miešania doreagovat. Potom do reakčhej banky sa vlejé asi 200 ml zriedeného etanolu /til/, do ktorého sa před tým přidalo 20 ml koncentrovanéj kyseliny octovej. Reakčná zmes zr.edne, dobře sa zamieša po dobu 5 minut a filtruje sa cez skleněný filter. Na filtri sa premýva zriedeným etanolom /1:1/ tak dlho až filtrát je úplné, bezfarebný. Nakoniec škrobový gél sa p*remýva na filtri koncentrovaným etanolom, Etanol sa dokonale odsaje a škrobový gél sa suší na vzduchu alebo v sušiarni pri teplote 80 až 100 °C. Suchý Škrobový gél ma napúčací objem 14 ml/g.Dissolve 2 ml of epichlorohydrin at room temperature in 380 ml of 0.1 M NaOH, then add 220 g of air-dry potato starch with stirring and allow to react at room temperature with stirring for 4 hours. Dissolve 14 g of solid NaOH in 1200 ml of water in a separate beaker and separately dissolve 8 g of disodium 8-amino-5- [3- (sulphoethylsulphonyl) anilino] -6-anthraquinone sulphonic acid / demazole Brilant Blue R / v 400 in a separate beaker. ml of water. After cooling to 20 [deg.] C., the two solutions are mixed together and added simultaneously to the starch-fed reaction flask, mixed well and after about 2 minutes turned into a thick gel which is allowed to react for 90 minutes without stirring. Then about 200 ml of dilute ethanol (til), to which 20 ml of concentrated acetic acid was added previously, was poured into the reaction flask. The reaction mixture turns gray, stirred well for 5 minutes and filtered through a glass filter. Wash the filter with dilute ethanol (1: 1) until the filtrate is complete, colorless. Finally, the starch gel is washed on the filter with concentrated ethanol, the ethanol is thoroughly aspirated, and the starch gel is dried in an air or oven at 80 to 100 ° C. The dry starch gel has a swelling volume of 14 ml / g.

Příklad 2Example 2

Postup podlá příkladu 1, s tým rozdielom, že doba sietovania sa krátí na 2 hodiny, a ďalej sa pokračuje ako v příklade 1. Škrobový gél má napúčací objem 16 ml/g,The procedure of Example 1, except that the crosslinking time is reduced to 2 hours, and is continued as in Example 1. The starch gel has a swelling volume of 16 ml / g,

P r í k 1 a d 3EXAMPLE 1 a d 3

Postup podlá příkladu 1, s tým rozdielom, že sa použije 10 g dvojsodnej soli kyseliny 8-amino~5-[3-/sulfoetylsulfonyl/anilinoj-ó-antrachinonsulfónovej Připravený gél sa dlhšie premýva, ale obsahuje viac víazaného farbiva;t. j. je citlivější pri analytických stanovených enzymových aktivit.The procedure of Example 1 was followed, except that 10 g of the disodium salt of 8-amino-5- [3- (sulfoethylsulfonyl) anilino] -6-anthraquinone sulfonic acid was used . ie, it is more sensitive to analytical enzyme assays.

Příklad 4Example 4

Postup podlá příkladu 1, s tým rozdielom, že- sa použije 0,2 ml epichlorhydrinu a sletovánie prebieha pri teplote miestnosti po dobu 24 hodin a na farbenie sa použije 40 g dvojsodnej soli kyseliny 8-amÍno-5-L,3-/su1foety1 sulfony1/anilinoj-6-antrachinonsulfoaovej. Výsledný suchý chroraogénny škrobový gél má napúčací objem 18 ml/g.The procedure of Example 1 was followed except that 0.2 ml of epichlorohydrin was used and the blending was carried out at room temperature for 24 hours, and 40 g of disodium 8-amino-5-1,3-sulfonic acid was used for dyeing. sulfony1 / anilinoj-6-antrachinonsulfoaovej. The resulting dry chroraogenic starch gel has a swelling volume of 18 ml / g.

Vynález má uplatneníe vŠade>kde je potřebné sledovat úroveň glukoamylázovej aktivity či už v priemyslovej praxi ďalej vo výskume pri testovaní raikroorganízraov na glukoamylázovú enzymové aktivitu, a v klinickej praxi pre diagnostické účely niektorých ochorení.The invention has application wherever it is desirable to monitor the level of glucoamylase activity, whether in industrial practice further in research in testing microorganisms for glucoamylase enzyme activity, and in clinical practice for the diagnostic purposes of certain diseases.

Claims (1)

PREDMET VYNÁLEZUOBJECT OF THE INVENTION Sposob přípravy chroraogénneho substrátuna stanovenie aktivity glukoamylázy, vyznačený tým, že zemiakový škrob sa v prvom stupni zosieťuje v 0,1 M hydroxide sodnom za použitia 0,1 až 1,0 Z epichlórhydrinu na hmotnost suchého škrobu, po dobu 2 až 24 hodin pri teplote miestnosti za stálého mieŠani.a pri pomere kvapalnej a pevnej fázy 2:1, vdruhom stupni sa nechá zosietený Škrob reagovat s dvojsodnou solou kyseliny S-amíno-S- j_3 -/sul f oe ty Isu 1 f ony 1 /ani 1 inoj -6-antrachinonsulfónovej v množstve 4 až 20 7. na hmotnost suchého škrobu v 0,7 až 1,0* hydroxide sodnom pri pomere kvapalnej a pevnej fázy 10:1 až 10:15 pri teplote miestnosti po dobu 1 až 2 hodiny,, naco sa reakčná zmes neutralizuje ekvivalentnýra množstvom kyseliny octovej a nakoniec. sa chroraogénny škrob premýva na filtri etanolom o koncentrácii 40 až 50 % do bezfarebnej reakcie filtrátu.Process for preparing a chroraogenic substrate for the determination of glucoamylase activity, characterized in that the potato starch is first crosslinked in 0.1 M sodium hydroxide using 0.1 to 1.0 Z epichlorohydrin per dry starch weight for 2 to 24 hours at a temperature In a second stage, the cross-linked starch is reacted with the disodium salt of S-amino-S- [3-] - (1-phenylethylsulfonate) - or 1 - other salt. 6-anthraquinone sulfone in an amount of 4 to 20 7. to the weight of dry starch in 0.7 to 1.0% sodium hydroxide at a liquid: solid phase ratio of 10: 1 to 10:15 at room temperature for 1 to 2 hours, naco The reaction mixture is neutralized with an equivalent amount of acetic acid and finally. The chromium starch is washed on the filter with 40-50% ethanol until the colorless reaction of the filtrate.
CS21979A 1979-01-10 1979-01-10 Process for preparing chromogenic amylaceous substrate for the determination of the activity of glucoamylase CS203676B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS21979A CS203676B1 (en) 1979-01-10 1979-01-10 Process for preparing chromogenic amylaceous substrate for the determination of the activity of glucoamylase

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS21979A CS203676B1 (en) 1979-01-10 1979-01-10 Process for preparing chromogenic amylaceous substrate for the determination of the activity of glucoamylase

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CS203676B1 true CS203676B1 (en) 1981-03-31

Family

ID=5333912

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS21979A CS203676B1 (en) 1979-01-10 1979-01-10 Process for preparing chromogenic amylaceous substrate for the determination of the activity of glucoamylase

Country Status (1)

Country Link
CS (1) CS203676B1 (en)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Biely et al. Soluble chromogenic substrates for the assay of endo-1, 4-β-xylanases and endo-1, 4-β-glucanases
Klein et al. New chromogenic substrate for determination of serum amylase activity
CN111638106B (en) Urine dry chemical analysis quality control object
GB1571265A (en) Amylase determination
JPH0665987B2 (en) Analysis element
Leisola et al. Determination of the solubilizing activity of a cellulase complex with dyed substrates
JPH03151397A (en) Agent and method for detecting novel compound and substance having hydrolase activity and specimen for detecting substance to be analyzed
US4321364A (en) Preparation of soluble chromogenic substrates
CS203676B1 (en) Process for preparing chromogenic amylaceous substrate for the determination of the activity of glucoamylase
SU396036A1 (en) METHOD OF QUANTITATIVE DETERMINATION OF ACTIVITY OF SS-AMYLASE IN BIOLOGICAL LIQUIDS
US3759794A (en) Method for determination of amylase activity
Foo et al. Measurement of plasma amylase activity
US3694318A (en) Substrate and method for alpha-amylase assay
JPH05213944A (en) Naphthotriazolium salt
PL80211B1 (en)
Ertingshausen et al. Single-Reagent Method for Rapid Determination of Total Bilirubin with the" CentrifiChem" Analyzer
JPH0551279B2 (en)
JP2001514903A (en) Methods for assaying for enzymatic covalent bond formation and cleavage
CA1110620A (en) SUBSTRATE FOR .alpha.-AMYLASE AND THE PREPARATION THEREOF
CS237101B1 (en) A method of preparing water-soluble chromolytic polysaccharide enzyme substrates
CN108645846A (en) A method of serum alpha-amylase activity is measured based on paper substrate
US7648839B2 (en) Metal indicator
CS234607B1 (en) A method for determining endo-1,4-β-xylanase activity
JP3048672B2 (en) Reagent-bound polymer, said polymer membrane and carrier containing said polymer
Kennedy Some Methods for the Characterisation of Natural and Dyed Amyloses as Potential Substrates for the Assay of α‐Amylase