CS203676B1 - Spósob přípravy chromogónneho škrobového substrátu na stanovenie aktivity glukoamylázy - Google Patents
Spósob přípravy chromogónneho škrobového substrátu na stanovenie aktivity glukoamylázy Download PDFInfo
- Publication number
- CS203676B1 CS203676B1 CS21979A CS21979A CS203676B1 CS 203676 B1 CS203676 B1 CS 203676B1 CS 21979 A CS21979 A CS 21979A CS 21979 A CS21979 A CS 21979A CS 203676 B1 CS203676 B1 CS 203676B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- starch
- glucoamylase
- substrate
- determination
- activity
- Prior art date
Links
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims description 15
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 title claims description 14
- 239000000758 substrate Substances 0.000 title claims description 11
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 title claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 29
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 28
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 27
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 18
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N Epichlorohydrin Chemical compound ClCC1CO1 BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 4
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical class [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 claims description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- COFMBBYARPOGBA-UHFFFAOYSA-N 1-phenylethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C(C)C1=CC=CC=C1 COFMBBYARPOGBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000011651 chromium Substances 0.000 claims 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 9
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 9
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 4
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- URPBSRQSVAMQRT-UHFFFAOYSA-N 4-amino-9,10-dioxo-1-[3-(2-sulfoethylsulfonyl)anilino]anthracene-2-sulfonic acid Chemical compound NC=1C=C(C(=C2C(C=3C=CC=CC3C(C12)=O)=O)NC1=CC(=CC=C1)S(=O)(=O)CCS(=O)(=O)O)S(=O)(=O)O URPBSRQSVAMQRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- -1 disodium 8-amino-5- [3- (sulphoethylsulphonyl) anilino] -6-anthraquinone sulphonic acid Chemical compound 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Vynález sa týká sposobu přípravy chromogénného škrobového substrátu na stanovenie glukoamylázovej enzýmovej aktivity.
Rýchle, jednoduché a spolehlivé testy na kvalitativně a kvantitativné stanovenie enzýmovej aktivity stali sa v praktickou životě nepostradatelnými.
K najprogresívnejším metodám stahovenia úrovně ehzýnovej aktivity glukán-giukánohydroláz patři kolorimetrická metoda založená na tom, Že ako testovací substrát sa použije vhodný nerozpustný polysachařid s kovalentne viazaným f.arbivom.
Chromogénny, nerozpustný polysacharidový gel .sa vplyvom prítomnej enzýmovej hydrolázy štiepa na rozpustné štíepne produkty, ktoré spolu s viazaným farbivom prechádzajú do roztoku, pričom intenzita farby roztoku je lineárně úměrná koncentrácii produktov hydrolýzy a tým aj koncentraci! přítomného enzymu.
Tak napr. v případe testovania alfa-amylázovej enzýmovej aktivity možno s výhodou použit ako substrát chromogénny škrob, t. j. farebný polysachařid s vizbami alfa/1—>4/, ktoré sa účinkom enzymu alfa-amylázy štepia £j. Kenedyt Advancee in carbohydrate chemistry and biochemistry, 2 9, / 1 97 4 / , str 350-3.57, L . Kuniak,, J. Zemek /és. AO Č. 1 92 2 1 0 /J ,
Na základe výsledkov výskumu v tejto’oblasti sa zistilo, Že Specificky sietovaný škrob s velmi vysokým napúčacím objemom vo vodě'12 až 20 ml/g po kovalentnom naviazaní farbiva je vynikajúcim substrátom aj pre enzým glukoamy1 ázu , /oiz-1 ,4-glukán glukóhydrolázu , EC 3.2.1.3/ tak, že je ho možné použit výhodné na kolorimetrické stanovenie glukoamylázy.
Podstata vynálezu spočívá v tom, že 2'ě'miákový škrob sa v prvom stupni zosietuje v 0,1 M hydroxide sodnom za použitia 0,1 až 1,0 7» epichlarhydrínu na hmotnost suchého škrobu, po dobu až 24 hodin pri teplote miestnosti za stálého miešania pri požere kvapalnej a pevnej fázy 2:1, v druhora stupni sa nechá zosietený škrob reagovat s dvojsodnou solou kyseliny 8-amino-5-0-/sulfoetýlsulf onyl/ anilinoJ-6-antrachinon.sulfónovej v množstve 4 až 20 Z na hmotnost suchého Škrobu v 0,7 až 1,0% hydroxide sodnom pri pomere kvapalnej a pevnej fázy 10:1 až 10:15 pri teplote miestnosti po dobu 1 až 2 hodiny, nač.o sa reakčná zmes neutralizuje ekvi036 76 valentným množstvom kyseliny octovej a nakoniec sa chromogénny škrob premýva na filtri etanolom o koncentrácii 40 až 50 % do bezfarebnej reakcie filtrátu.
Najvýhodnejší zo škrobov je škrob zemiakový pre jeho vysókú chemickú čistotu, relativné velké rozměry zrna a dobru filtrovatelnost.
Sietovanie s epichlórhydřínom je volené tak, aby napúčací objem hotového chromogénneho Škrobového gélu sa pohyboval v medziach 12 až 18 ml/g, čo je zárukou velmi vysokej citlivosti na glukoaraylázu. Pri nižších hodnotách stupfta napúčania je substrát nedostatočne citlivý pre rychle sériové meranie glukoamylázovej enzýmove.j aktivity. Optimálna doba sietovania pohybuje sa za reakčných podraienok predmetu vynálezu okolo 4 hodin. Po prvom stupni sietovania, přidáváním roztoku farbiva v alkalickora roztoku škrob asi do dvoch minút vytvoří pevný gel, ktorý sa nedá miešat a preto reakcia viazania farbiva prebieha staticky bez miešania, Nie. je to však na překážku rovnoměrnému priebehu reakcie viazania farbiva na škrob, pretože farbivo.sa přidává v rozpustenom stave a reakčná zni es sa dostatočne zhomogenizu je pokial zoželatinuje do takého atupfta, ze sa miešanie musí zastavit.
Po ukončení reakcie naviazania farbiva přidáním kyseliny octovej v zriedenora etanole /1:1/ sa tuhý škrobový gél prevedie na riedku suspenziu, kcorá sa opat može lahko miešat a dobré filtrovat.
Premývanie je najpomalší technologický stupeň přípravy, nakolko volné nezreagované farbívo sa musí kvantitativné z gélu vymyt,až je filtrát úplné číry,. Obyčajne sa na to spotřebuje 70-až 100násobok zriadeného etanolu na hmotnost povodného škrobu.
Red je premývanie ukončené, nakoniec sa gél viacuásobne premýva na filtri koncentrovaným etanolom, aby sa dokonale odstranila voda. Ak sa voda nedostatočne vytěsní etanolom, gél pri sušení vytvára tvrdé hrudky čo je nežiaduce, nakolko by sa musel suchý gél pomlíet.
Nakoniec sa etanol z gélu odstráni sušením volné na vzduchu alebo v sušiarni pri teplotě '80 až 100 °C.
Suchý chromogénny, sletovaný škrob má napúčací objem vo vodě 14 ml/g a je výborným substrátom pre kvantitativné stanovenie glukoamy1ázy.
Pochopitelné, připravený gél je .rovnako dobrým substrátem aj pre alfa-amylázu. Preto vo vzorkácn, kde sa súČasne vyskytuje tak alfa-amylázová ako i glukoamylázová aktivita, najprv sa stanoví alfa-amylázovým testom alfa-ar.iylázová aktivita, v druhom stanovení v novej vzorke sa stanoví alfa-amylázová i glukoamylázová enzymová aktivita pomocou navrhovaného škrobového substrátu v tabletovej formě a ich rozdiel zodpovedá samotnej glukoamylázovej aktivitě. ·
Výhodou navrhovaného sposobu přípravy chromogénneho škrobového substrátu pre stanovenie glukoamylázovej aktivity je, že umožňuje přípravu chromogénneho škrobu vo formě tabletiek, ktoré spíúajú náročné požiadavky klinickej a prevádzkovej praxe prisériovej analýze enzýmovej aktivity, preparát sa móže vyrábat z. domácích lacných surovin poměrně velmi jednoduchým technologickým postupom, výrobna cena připraveného preparátu je mnohonásobné nižšia ako cena obdobných preparátov na svetovom trhu, pri kombinácií s alf a-amylázovým testom umožňuje stanovit vedla seba tak alf a-ů.aylázovú ako i glukoamylázovú enzýraovú aktivitu.
Příklady prevedenia
Přikladl
V '380 ml 0,1 M NaOH sa rozpustí 2 ml epichlórhydrinu pri teplote miestnosti potom sa přidá za stálého miešania 220 g vzduchosuchého zemiakového škrobu a nechá sa reagovat za stálého miešania pri teplote miestnosti *po dobu 4 hodin. V osobitnej kádičke sa rozpustí 14 g pevného NaOH v 1 200 ml vody a v dalšej kádičke osobitne sa rozpustí 8 g dvojsodnej soli kyseliny 8-amino-5-f3-/sulfoetylsulfonyl/anilinoJ-6-antrachinonsulfóuovej /demazol ‘ Brilant Blue R/ v 400 ml vody. Obidva roztoky po vychladení na 20 °C sa zlejú dohromady a přidá sa naraz do reakčnej banky so sletovaným škrobom, reakčná zmes sa dobré zamieša a asi po 2 minutách sa změní na hustý gél, ktorý sa nechá 90 minút bez miešania doreagovat. Potom do reakčhej banky sa vlejé asi 200 ml zriedeného etanolu /til/, do ktorého sa před tým přidalo 20 ml koncentrovanéj kyseliny octovej. Reakčná zmes zr.edne, dobře sa zamieša po dobu 5 minut a filtruje sa cez skleněný filter. Na filtri sa premýva zriedeným etanolom /1:1/ tak dlho až filtrát je úplné, bezfarebný. Nakoniec škrobový gél sa p*remýva na filtri koncentrovaným etanolom, Etanol sa dokonale odsaje a škrobový gél sa suší na vzduchu alebo v sušiarni pri teplote 80 až 100 °C. Suchý Škrobový gél ma napúčací objem 14 ml/g.
Příklad 2
Postup podlá příkladu 1, s tým rozdielom, že doba sietovania sa krátí na 2 hodiny, a ďalej sa pokračuje ako v příklade 1. Škrobový gél má napúčací objem 16 ml/g,
P r í k 1 a d 3
Postup podlá příkladu 1, s tým rozdielom, že sa použije 10 g dvojsodnej soli kyseliny 8-amino~5-[3-/sulfoetylsulfonyl/anilinoj-ó-antrachinonsulfónovej Připravený gél sa dlhšie premýva, ale obsahuje viac víazaného farbiva;t. j. je citlivější pri analytických stanovených enzymových aktivit.
Příklad 4
Postup podlá příkladu 1, s tým rozdielom, že- sa použije 0,2 ml epichlorhydrinu a sletovánie prebieha pri teplote miestnosti po dobu 24 hodin a na farbenie sa použije 40 g dvojsodnej soli kyseliny 8-amÍno-5-L,3-/su1foety1 sulfony1/anilinoj-6-antrachinonsulfoaovej. Výsledný suchý chroraogénny škrobový gél má napúčací objem 18 ml/g.
Vynález má uplatneníe vŠade>kde je potřebné sledovat úroveň glukoamylázovej aktivity či už v priemyslovej praxi ďalej vo výskume pri testovaní raikroorganízraov na glukoamylázovú enzymové aktivitu, a v klinickej praxi pre diagnostické účely niektorých ochorení.
Claims (1)
- PREDMET VYNÁLEZUSposob přípravy chroraogénneho substrátuna stanovenie aktivity glukoamylázy, vyznačený tým, že zemiakový škrob sa v prvom stupni zosieťuje v 0,1 M hydroxide sodnom za použitia 0,1 až 1,0 Z epichlórhydrinu na hmotnost suchého škrobu, po dobu 2 až 24 hodin pri teplote miestnosti za stálého mieŠani.a pri pomere kvapalnej a pevnej fázy 2:1, vdruhom stupni sa nechá zosietený Škrob reagovat s dvojsodnou solou kyseliny S-amíno-S- j_3 -/sul f oe ty Isu 1 f ony 1 /ani 1 inoj -6-antrachinonsulfónovej v množstve 4 až 20 7. na hmotnost suchého škrobu v 0,7 až 1,0* hydroxide sodnom pri pomere kvapalnej a pevnej fázy 10:1 až 10:15 pri teplote miestnosti po dobu 1 až 2 hodiny,, naco sa reakčná zmes neutralizuje ekvivalentnýra množstvom kyseliny octovej a nakoniec. sa chroraogénny škrob premýva na filtri etanolom o koncentrácii 40 až 50 % do bezfarebnej reakcie filtrátu.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS21979A CS203676B1 (sk) | 1979-01-10 | 1979-01-10 | Spósob přípravy chromogónneho škrobového substrátu na stanovenie aktivity glukoamylázy |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS21979A CS203676B1 (sk) | 1979-01-10 | 1979-01-10 | Spósob přípravy chromogónneho škrobového substrátu na stanovenie aktivity glukoamylázy |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS203676B1 true CS203676B1 (sk) | 1981-03-31 |
Family
ID=5333912
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS21979A CS203676B1 (sk) | 1979-01-10 | 1979-01-10 | Spósob přípravy chromogónneho škrobového substrátu na stanovenie aktivity glukoamylázy |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS203676B1 (sk) |
-
1979
- 1979-01-10 CS CS21979A patent/CS203676B1/sk unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Biely et al. | Soluble chromogenic substrates for the assay of endo-1, 4-β-xylanases and endo-1, 4-β-glucanases | |
| Jung | Preparation and application of procion yellow starch for amylase assay | |
| CN111638106B (zh) | 一种尿液干化学分析质控物 | |
| JPH0665987B2 (ja) | 分析要素 | |
| Leisola et al. | Determination of the solubilizing activity of a cellulase complex with dyed substrates | |
| JPH03151397A (ja) | 加水分解酵素基質、加水分解活性を有する物質の検出剤及び検出法並びに分析物を検出するための試験条片 | |
| US4321364A (en) | Preparation of soluble chromogenic substrates | |
| CS203676B1 (sk) | Spósob přípravy chromogónneho škrobového substrátu na stanovenie aktivity glukoamylázy | |
| SU396036A1 (ru) | СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ сс-АМИЛАЗЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ | |
| US3759794A (en) | Method for determination of amylase activity | |
| Foo et al. | Measurement of plasma amylase activity | |
| US3694318A (en) | Substrate and method for alpha-amylase assay | |
| JPH05213944A (ja) | ナフトトリアゾリウム塩 | |
| PL80211B1 (sk) | ||
| Ertingshausen et al. | Single-Reagent Method for Rapid Determination of Total Bilirubin with the" CentrifiChem" Analyzer | |
| JPH0551279B2 (sk) | ||
| JP2001514903A (ja) | 酵素的な共有結合の形成および切断をアッセイする方法 | |
| CA1110620A (en) | SUBSTRATE FOR .alpha.-AMYLASE AND THE PREPARATION THEREOF | |
| CS237101B1 (sk) | Sposob přípravy vodorozpustných chromolytických polysacharidových enzýmových substrátov | |
| CN109061162A (zh) | 一种高通量测定淀粉水解酶抑制活性的方法 | |
| CN108645846A (zh) | 一种基于纸基测定血清α-淀粉酶活性的方法 | |
| US7648839B2 (en) | Metal indicator | |
| CS234607B1 (sk) | SpSsob stanovenia aktivity endo-1,4- β-xylanáz | |
| JP3048672B2 (ja) | 試薬結合ポリマー、該ポリマー膜および該ポリマーを含む担持体 | |
| Kennedy | Some Methods for the Characterisation of Natural and Dyed Amyloses as Potential Substrates for the Assay of α‐Amylase |