CN109061162A - 一种高通量测定淀粉水解酶抑制活性的方法 - Google Patents

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Abstract

一种高通量测定淀粉水解酶抑制活性的方法属于抑制淀粉水解酶活性领域，该方法包括以下步骤：将磷酸缓冲液稀释，随后与淀粉按照比例混合进行一定程度的搅拌，稀释制备好的淀粉酶溶液与磷酸缓冲液混合于96孔版，放入酶标仪在660nm波长下进行检测。通过本发明测定α‑淀粉酶的活力，与传统检测α‑淀粉酶活性应用分光光度计法相比，使用96孔酶标板测定是一种高通量测定的新型方法，它具有微量高效，简便迅速，稳定灵敏，减少人为读数误差等优点。

Description

一种高通量测定淀粉水解酶抑制活性的方法
技术领域
本发明属于测定淀粉水解酶抑制活性技术领域，主要涉及一种高通量测定淀粉水解酶抑制活性的方法。
背景技术
α-淀粉酶称α-1,4-D-葡聚糖水解酶，广泛分布于动物、植物和微生物中,是一种重要的淀粉水解酶。它可以随机的切断淀粉、糖原等分子内的α-1，4葡萄糖苷键,生成α-糊精和葡萄糖等还原糖,是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。抑制α-淀粉酶可以有效抑制肠道内唾液淀粉酶及胰淀粉酶的活性，阻碍食物中碳水化合物的水解和消化，降低人体对糖分吸收及脂肪合成降低，从而减轻体质量，对其他哺乳动物、昆虫以及微生物的α-淀粉酶也有很强的特异性抑制作用。因此研究抑制淀粉酶活性的方法，既可以为抗病虫新品种的培育提供理论依据，为设计新型无毒无污染的抗虫、抗菌药物，减少环境污染等提供良好的试验材料，又可为其应用产品的开发(如糖尿病人专用食品，减肥药等)提供研究基础。
关于α-淀粉酶的活力测定方法很多，实验室常用的淀粉酶活力测定方法是紫外分光光度法，通过检测还原糖数量的增加、与碘液显色反应的下降或水解色原底物释放的发色基团所引起的光密度变化来进行的。利用色原底物的测定方法目前主要应用于临床测定。另外还有通过测定淀粉粘度的降低、旋光度的变化等来反映α-淀粉酶的活力，利用高效液相色谱测定淀粉酶活力也是一种快速的方法。本发明采用96孔酶标板法测定α-淀粉酶的活力。
96孔板具有以下优点：第一，节约试剂。以前检测α-淀粉酶活性采用紫外分光光度计法，反应液是96孔酶标板法的数倍；第二，简单快速。分光光度计法每次只能检测1个样品，而96孔酶标板法1次可以同时检测多个样品；第三，稳定灵敏。分光光度计法每次检测需要人工调试，获得的重复数据间误差较大，96孔酶标板法只需将每个样品定容，完全自动检测，数据稳定；第四，减少误差。用酶标仪读取所测α-淀粉酶活性的数据，可减少了不同试验者人为读数时的误差。总之，采用96孔酶标板法测定酚氧化酶活性，更加方便快捷，完全克服了前人所用方法的弊端。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种高通量测定淀粉水解酶抑制活性的方法，达到快速高效测定的目的。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
1、一种高通量测定淀粉水解酶抑制活性的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)准备磷酸缓冲液1L，将CaCl2加入磷酸缓冲液进行10倍稀释，在准备好的溶剂中加入HCl/NaOH，将pH调节为6.9；
(2)将淀粉与磷酸缓冲液按照一定比例进行混合，加至磁力搅拌器中进行搅拌，直至淀粉变成半透明状态；
(3)随后将其转移至室温下搅拌，直至冷却到室温，保存于-4℃；
(4)制备淀粉酶母液，称取适量的淀粉酶粉末，加入一定体积的磷酸缓冲液混匀，于-20℃保存；
(5)取出少许制备母液，加入磷酸缓冲液进行稀释；
(6)将系列稀释的样品与磷酸缓冲液混合于96微孔板中，用酶标仪在660nm的波长下淀粉水解酶抑制性进行检测，具有全自动、高通量、灵敏高效的特点。
2、根据权利要求1所述的一种高通量测定淀粉水解酶抑制活性的方法，其特征在于，步骤(1)所述的加入缓冲液的CaCl2含量为35-40ppm。
3、根据权利要求1所述的一种高通量测定淀粉水解酶抑制活性的方法，其特征在于，步骤(2)所述的磁力搅拌器控制温度为280-320℃，转速为300-400rpm，磁力搅拌时间为1-2min。
4、根据权利要求1所述的一种高通量测定淀粉水解酶抑制活性的方法，其特征在于，步骤(4)所述的称取淀粉酶粉末为70-80mg，加入磷酸缓冲液体积为20-30mL。
5、根据权利要求1所述的一种高通量测定淀粉水解酶抑制活性的方法，其特征在于，步骤(5)所述的稀释倍数为18-20倍。
6、根据权利要求1所述的一种高通量测定淀粉水解酶抑制活性的方法，其特征在于，步骤(6)所述的加入96微孔板中的样品体积为10-20μL，磷酸缓冲液体积为180-190μL。
本方法先将磷酸缓冲液稀释，随后与淀粉按照比例混合进行一定程度的搅拌，控制好搅拌的时间与温度，防止搅拌过度；稀释制备好的淀粉酶溶液，随后与磷酸缓冲液混合于96孔版，放入酶标仪中高通量测定淀粉水解酶对α-淀粉酶活性的抑制。该方法采用96孔酶标板法测定α-淀粉酶的活力，与传统检测α-淀粉酶活性应用分光光度计法相比，此方法具有微量高效，简便迅速，稳定灵敏，减少人为读数误差的优点。
附图说明
附图为本工艺技术路线图。
具体实施方式
实施例1：
将准备磷酸缓冲液1L，将含量为35-40ppm的CaCl2加入磷酸缓冲液进行10倍稀释，在准备好的溶剂中加入HCl/NaOH，将pH调节为6.9。(2)将淀粉与磷酸缓冲液按照一定比例进行混合，加至磁力搅拌器中进行搅拌，直至淀粉变成半透明状态。(3)随后将其转移至室温下搅拌，温度为280-320℃，转速为300-400rpm，磁力搅拌时间为1-2min，直至冷却到室温，保存于-4℃。(4)制备淀粉酶母液，称取70-80mg淀粉酶粉末，加入体积为20-30mL磷酸缓冲液混匀，于-20℃保存。(5)取出少许制备母液，加入磷酸缓冲液进行稀释18倍。(6)将系列稀释的10-20μL样品与180-190μL磷酸缓冲液混合于96微孔板中，用酶标仪在660nm的波长下淀粉水解酶抑制性进行检测，具有全自动、高通量、灵敏高效的特点。
实施例2：
将准备磷酸缓冲液1L，将含量为35-40ppm的CaCl2加入磷酸缓冲液进行10倍稀释，在准备好的溶剂中加入HCl/NaOH，将pH调节为6.9。(2)将淀粉与磷酸缓冲液按照一定比例进行混合，加至磁力搅拌器中进行搅拌，直至淀粉变成半透明状态。(3)随后将其转移至室温下搅拌，温度为280-320℃，转速为300-400rpm，磁力搅拌时间为1-2min，直至冷却到室温，保存于-4℃。(4)制备淀粉酶母液，称取70-80mg淀粉酶粉末，加入20-30mL磷酸缓冲液混匀，于-20℃保存。(5)取出少许制备母液，加入磷酸缓冲液进行稀释19倍。(6)将系列稀释的10-20μl样品与180-190μl磷酸缓冲液混合于96微孔板中，用酶标仪在660nm的波长下淀粉水解酶抑制性进行检测，具有全自动、高通量、灵敏高效的特点。
实施例3：
将准备磷酸缓冲液1L，将含量为35-40ppm的CaCl2加入磷酸缓冲液进行10倍稀释，在准备好的溶剂中加入HCl/NaOH，将pH调节为6.9。(2)将淀粉与磷酸缓冲液按照一定比例进行混合，加至磁力搅拌器中进行搅拌，直至淀粉变成半透明状态。(3)随后将其转移至室温下搅拌，温度为280-320℃，转速为300-400rpm，磁力搅拌时间为1-2min，直至冷却到室温，保存于-4℃。(4)制备淀粉酶母液，称取70-80mg淀粉酶粉末，加入20-30mL磷酸缓冲液混匀，于-20℃保存。(5)取出少许制备母液，加入磷酸缓冲液进行稀释20倍。(6)将系列稀释的10-20μL样品与180-190μL磷酸缓冲液混合于96微孔板中，用酶标仪在660nm的波长下淀粉水解酶抑制性进行检测，具有全自动、高通量、灵敏高效的特点。

Claims (6)

1.一种高通量测定淀粉水解酶抑制活性的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)准备磷酸缓冲液1L，将CaCl2加入磷酸缓冲液进行10倍稀释，在准备好的溶剂中加入HCl/NaOH，将pH调节为6.9；
(2)将淀粉与磷酸缓冲液按照一定比例进行混合，加至磁力搅拌器中进行搅拌，直至淀粉变成半透明状态；
(3)随后将其转移至室温下搅拌，直至冷却到室温，保存于-4℃；
(4)制备淀粉酶母液，称取适量的淀粉酶粉末，加入一定体积的磷酸缓冲液混匀，于-20℃保存；
(5)取出少许制备母液，加入磷酸缓冲液进行稀释；
(6)将系列稀释的样品与磷酸缓冲液混合于96微孔板中，用酶标仪在660nm的波长下对淀粉水解酶抑制性进行检测，具有全自动、高通量、灵敏高效的特点。
2.根据权利要求1所述的一种高通量测定淀粉水解酶抑制活性的方法，其特征在于，步骤(1)所述的加入缓冲液的CaCl2含量为35-40ppm。
3.根据权利要求1所述的一种高通量测定淀粉水解酶抑制活性的方法，其特征在于，步骤(2)所述的磁力搅拌器控制温度为280-320℃，转速为300-400rpm，磁力搅拌时间为1-2min。
4.根据权利要求1所述的一种高通量测定淀粉水解酶抑制活性的方法，其特征在于，步骤(4)所述的称取淀粉酶粉末为70-80mg，加入磷酸缓冲液体积为20-30mL。
5.根据权利要求1所述的一种高通量测定淀粉水解酶抑制活性的方法，其特征在于，步骤(5)所述的稀释倍数为18-20倍。
6.根据权利要求1所述的一种高通量测定淀粉水解酶抑制活性的方法，其特征在于，步骤(6)所述的加入96微孔板中的样品体积为10-20μL，磷酸缓冲液体积为180-190μL。
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CN104886437A (zh) * 2014-03-06 2015-09-09 苏州工业园新国大研究院 高粱麸提取物及其制备方法和应用

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