CS199365B1 - Adjuvantní iaaktivevaná tkáňová vakcina proti Aujeszkyho chorobě a způsob její výroby - Google Patents

Description

Předmětem vynálezu je adjuvantní inaktivované tkáňová vakcina proti Aujeezkyho chorobě (AL), která navozuje rezistenci imunizovaných zvířat, nebo jejich potomstva pasivně předanou protilátkou a způsob výroby této vakciny·

Virus Aujeezkyho choroby (AD), vyvolává u postižených vnímavých zvířat onemocněni centrálního noervového systému a dýchacího traktu se smrtelnými důsledky především u mladých jedinců· Výskyt tohoto onemocněni, hlavně ve velkochovech zvířat vede ke hromadným ztrátám a způsobuje znaěuá ekonomické ztráty, zejména u selat a norků·

Hesistenoe proti virovým infekcím, kromě faktorů podmiňujících přirozenou rezistenoi, je dána přítomnosti protilátek neutralizujících chorobnost viru vyvolávat infekční proces a imunitou‘zprostředkovanou buňkami· Jednotlivé faktory rezistence proti danému infekčnímu činiteli se uplatňuji u různých živočišných druhů, v různém rozsahu v závislosti na genetických vlastnoateoh hostitele obrážejících se ve složeni buněčných povrchů a způsobu metabolismu, přítomnosti nespecifických inhibitorů a jiných nespecificky působících mechanismů a patogenese příslušného infekčního onemocněni·

Virové infekce předpokládající činnost viru k cílovému orgánu krvi jsou úspěšně ovlivnitelné cirkulujícími protilátkami, v ostatních případech se předpokládá účast imunitních

199 365

199 385 mechanismů shrnovaných pod pojmem buňkami zprostředkováimunita·

V aktivní imunizaoi proti virovým infekoía jo zásadní podmínkou aplikaoe určité minimální antlgenni many vhodnou cestou, které by vyvolala dostačující protilátkovou odpověň, přičemž virové antigeny musí mít zaohovány složku podminujíoí Indukci syntézy protilátek, schopných neutralizovat rozvoj infekčního oaemoenéai· Předpokládá se, žo podmínkou pro vyvoláni infekce je přilnuti viru na buňka v místě odpovídajícího reoeptoru (BORLAND J. J.» Enterovirus enhanoe lato speoifio host cella, and subsequent alterations of coli protein and nukleio acid synthesla· Bact. Sov· 1964, 28*3), tedy protilátka neutralizující virus musí blokovat determinanty povrohu virové čéstloo odpovídající tgmto reoeptorům. V ojedinělých případech lze účinně zasáhnout do rozvoje infekčního procesu neutralizací složek uplatňujioíoh se i v jiném stupni replikačnlho oyklu viru, jako např· imunizaoi proti neuraminidaze mixovirů.

V aktivní imunizaci je možno využít tzv·' adjovantnlhe účinku některých látek, které jednak umožni produkci protilátek do vyěěloh titrů, jednak stimulujíol tzv· buňkami zprostředkovatelnou imunitu·

V procesech o prevenci Aujeazkyho choroby (AD) byla publikována řada výsledků hledajících mocnost prevence AD účinnou imunizaoi*

Omezení úmrtnosti prasat ve atádeoh zamořených virem Aujeazkyho choroby (AV) pasivně podanou protilátkou ve formě imunního séra (ΚΟΥΝΌΚ J., GRECZI E.i Sérum Ajezaky s diseaso in sucklng pigs. Acta vet· hug· 1957» 7*423 až 427)» nebo gamaglobulinem (LUEASHEV I.I·, NIKIZIKA V.S., Prophylaotio and theropatttis peepertios of gamma globulln in Aujezsky β dioeace Veterinaria (Moskva) 1958, 35/9 » 48 až 50), ukázalo v terénních podmínkách na možnost ovlivněni průběhu nemoci imunizaci· Nicméně v tuto dobu nebyla k dispozici účinné očkovací látka ani iaaktlvovaná ani živá n platil názor, formulovaný (MANNINGER R·, MOCZY J. * Traite dos maladies interaes den animals domestiquee. Paris* Vigot Přeros 1959» EP· 457 až 464) , že aktivní imunizace proti AD není možná·

Pokusy o přípravu vakoiay proti AD byly zaměřeny několika směry*

a) , vypracování účinné iaaktlvované vakoiny, popřípadě s adjuvanoieůi,

b) vypracováni živé avlrulentni vakoiny solekol avirulentnioh mutant,

o) získání přirozeného, málo virulentního kmene z přirozených ohnisek infekce AD,

d) vypracováni vakoiny za použiti virulentního viru, který by se v organismu imunizovaného jedinoe nešířil, nevedl k onemocněni.

Byla učiněna řada pokusů k přípravě iaaktlvované vakoiny. Pormalizovaná vakoina bez velké účinnosti pro prasata byla připravena (KOCH A·, abraham E·'* Immunizationsversuohe mlt dem Aujezakysohem Virus. Acta vet. Hung. 1952, 2*270 až 279), (ŽUPFA A·*

Versuoh zur Immunisierung von Laborateriumstioren und Sohweinen mlttels Pormaldehyd - und - UV Strahlen - iaaktivierten Aujezsky-virus. Arch.exp. Vet. met.1963, 17*595 až 613)· Ochrana prasat před fatálními důsledky infekce navodila formalizovaná vakoina

199 385 adsorbovaná aa aluminiumhydroxyd (AIRAEETIAN V.G., JHACHATRYAN A.B. , CHBANYAN M.S.,

ABELYAM K.E·'» Iaaunologic peopertles of inactivalted vacínes against Aujezsky 's disease. Veterinaria (Moskva) 1969, 46:34 až 36), (SOLOMEIN P.S. : Rieview of the use of aluminiím hydroxid· formolized vadne against Aujezsky 's disaase Veterinaria (Moskva)

1955» 32/12:11 až 14) a formulovakoina adsorbovaná na aluminium hydroxyd a po adsorbci upravená saponinem (RRESCIRA T., PIOSRINI A·: Gontrollo dl officiada di un vaccine onotro la pseudsrabia (Malattla di Aujezsky) Veterinaria Italiana 1971, 22/7-8:374 až 393)·' Tato vakcina podle údajů autorů vadla již po jednorázovém i.m. podáním k serokonverzl, zabránila výskytu viru ve farlngu a v krvi a infekci po i.m· challengy virulentním virem AD·

V praoeoh (AIRAPETYAN V.G., KCHATRYAN A.B., CHBANYAN M.S., ABELYAN K.E.: Immunologlo properties of inaotivated vaodnos against Aujezsky 's diseaoe. Veterinaria t (Moskva) 1969, 46:34 až 36) a (ERESCHRA T., ERIORINI A·: Controllo di effio-ada di » un vacclaa oontro la pseudorábia (Malattla Aujezsky) Veterinaria Italiana 1971, 22/7-8 : 374až 393) jsou táž uvedeny dávky virového antigenu vyjádřené v TCID^q· (ATRAPETYAN V.G., KHACHATRYAN A.B., CHBANYAN M.S., ABELYAN K.E. : Immuuologio properties of iaaotlvatted vaelnes against Aujezsky 's diseaoe* Veterinaria (Moskva) 1969, 46:34 až 36) použili virus ve formě infekčního media z prlmskultur ledvin 3 až 13 denních králíků, ve 224 pasáži (tltr 10⁶’^ τοίΕ^θ/πιΐ)· Imunizačni dávka aplikovaná v objemu 3 ml subouttáně pro prase obsahovala minimálně 10?*² ΤΟΙΒ^θ viru.

(PRESGBRA T., EIORINI A·: Controllo di effioaoia di un vaccine oontro la pseudorabia (Malattla di Aujezsky) Veterinaria Italiana 1971, 22/7-8 : 374 až 393) použili čerstvé Izolovaný virus v 6. pasáži na stabilní linii vepřových ledvinnýoh buněk (IK - 15) mající titr 10?*-* tcID^q/biI infekčního media· Autory vypracovaná formolem inaktlvovaná na hydroxid hlinitý adsorbovaná vakcina byla aplikovaná s.c. v odstupňovaných dávkách 10, 5, 2,5) 1,25 , ml (maximum 10⁸’-? TCID^q viru pro dávku).

I když v práci (AIRAPETYAN V.G., KHACHATRYAN A.B., CHBANYAN M.S., ABELYAN K.E.: Immunologio properties of inaotivated vaocines against Aujeszky 's diseaoe· Veterinaria (Moskva) 1969» 46:34 až 36) dále není uvedeno vyhodnoceni titrů protilátek zvířat po vakoiuaol z obou praoí lze vyvodit, že inaktivaoe viru formolem nemění antigennl strukturu AV a hydroxyd hlinitý se uplatňuje jako účinné adjuvans·

Na aluminium hydroxyd adsorbovaný virus ovlivněný saponinem (BERBINSCHI C., PAPADOPOL Maria: Valaur immunogéne d 'un vacoin inaetivo confere la, aůadoe ďAujeszky chez la beuf, le monfeoa, lv póre efe pe chien. Archiva vet. 1967» 3*59 až 69) sa neukázal vakcinou dostatečně bezpečnou· Použiti tohoto typu vakclny vedlo u imunizovaných prasnic k potratům, poškozeni plodu, jejich munifikaci a hynuti mladých selat (POPOV A·, TCHENTCHEV I· : Utilisation dos vaecina vivants contre les maladies & virus das animaux en Bulgarle Bull. Off.· int. Epizoot, 1965, 64:195-202), (TONEVA 7·: Les vaocins vlvant utiliaés en Bulgarle contre la maladie d 'Aujezsky, Bull· Off.int.Epizoot.

199 385

1965, 64»203 až 207). Nicméně z prací publikovaných (B3S8BIBSCHI C., PAPADOPOL Maria i Vale ur immunogéne ďun vaccin inactivé contre la maladle d 'Aujeszky ohez la houf, le monton, le póre et le ohien. Archive vet. 1967, 5*59 až 69) vydává možnost eliminace AT ze zamořených chovů prasat soustavnou imunizaoi a je navrhováno v takovýchto chovech po plošném proočkovánl dále imunizovat jen chovné prasnice pro přerušeni možnosti přenosu vjru z praš nice na sele pasivně přenesenou protilátkou (BSRBINSCHI 0·, PAPADOPOL Maria, MARTA M·» t Untersuohung Uber der psrophylatisohen ffert der inaktlvierten Aujeszky-vakalne in Sohweinesuchtbetriebeu. Archive vet· 1968, 5»1θ7 až 114)·

Za neinaktivovanou je pokládána i vakoina vypracovaná (LTSBNKD I.P., TSUÍBAL A.N., KDLBACHNAJA M.Z., Preparation and laboratory trilas of UHlEk Aujeszky ^fa dissass virus vaccine, alone qnd ooabined with awine fever vaocin·. Veterinářija (Kijerv) 1965, » 38 až 43), ve které byl virus podroben inaktlvacl krystalovou violeti a účinnost vakoiay byla potenoována aluminiem hydroxydsm· (BASKSSVILLE A·, MoPERRAN JIBI, DOW O·» Aujeszky *s dieease in piga· The Teterinary Bulletin 1975, 45/9*465 *Ž 480) nepokládá inaktlvacl AT krystalvioleti za pravděpodobnou, neboť (UaSiC M«, PETROVlC M.t Kanu durch Kristalvioletvakzlne gegeh Sobveinepest dis Aujeszkysohe Krankenheit Hbertragen werdea 7 Zbl.Bakt.Parasitkde. 1962, I.Orig. 185»145 až 254) ukázali na resistenoi Ať k účinku krystalové violeti·

Krystalvioleťová adaorbátová vakoina byla připravena a ověřena (NBJDALKOT S., STOITSCHBV S·, RIBAROV B., STIWVA N. t Tersuche zur Herstelluttg von Takzine gegen die Aujeszky sche Krankheit aus inaktlvierten Virus.· I.Mitteilung Arqh. exp· Tater, med· 1968, 22J.499 až 507), (NBJDALKOV S·, STOILOVA B., RIBAROT B·, TABAKOV B. i Z Ur Imunnitžt von Sangřerkelu nach Impfung mit Adsorbatkristallviolettvakzifie gegen die Aujeszkysohe Krankheit Arch· f· Exper. Vet.med. 1972, 2^/2*257 až 262)· Vakcinou iOdukované protilátky U selat 10 až 20 dnů stáří paradoxně dosahovaly vyšších titrů u jedinců e již existujícími Titry, zatímco u jedinců bez prokazatelných protilátek nedooházl k jejích produkci· Podle zkušeností (ARNADDOV H.: Immunity and antibody dynamice lu pigs inooulnted with Aujeszky 's ethanol vaccine. I.Influence of naturrally aoquired antlbodies. Veterinarnomeditains ki Nauki 1975, 10/5*85 až 87) presxistujl kolostrálni protilátky zabráni uplatněni as virovému antigenu a k prolátkové odpovědi zpravidla nedochází.

t

ÁV inaktivovaný HHOg se ukázal schopný po dvou až třeoh revakoinaoíoh i.v. osetou dávkou kolem 10® TCZD 50 AT vyvolat u králíka tvorbu protilátek v titrech 52-128, které ochránily zvířata před challengii 500 TGID 50 homologního viru (ITASlSOTÁ S., SKODA R., MATES T., SOKOL Ρ.» Inactivacion of Aujeszky s dieease (pseudorabies) virus by nitrous acld. Acta Tirologica 1965, 7»7 až 15)· Podkožní podáni viru králíkům bylo až na výjimku bez efektu na protilátkovou tvorbu· Účinnost na praeateeh ověřovaná nebyla a lzte těžko předpokládat, že imunizačni schéma vyžadující četné revakoinaoe by byly praktioky použitelné.

199 395

Bas účinku se ukázala vakoina připravené ÚT inaktivací AV (BELÁDÍ I·, IVÁNOVIGS G·’ XBuuuniaiexrung tou Laborateriiuestioren mit dam Virus der Aujeszkyschen Krankheit nach deseen Inaktiviernng nit UT Strahlen· Acta Microbiol.Hung.1954, 2«151 ažl60)·

V laboratorním pokusu na morčateoh a králících a třech prasnicích byla ověřena vakoina proti AB připravená fotoinaktivaoi AT pomnoženého na primokultúrách vepřových ledvinných buněk methylénovou modří s následnou expozicí evětlu (BORGEN H.C., ESEENSEN 1.1 Immunising efeot of photoinaktlvated pseudorabieo virus. Zbl.· Bakt.· Par as i t kde I.Orig.

I97O, 214«lj až 16)· Inaktivovaný virus byl aplikován s.c. v dávoe 50 ml pro dosi s obsaQ hen viru 5x10 TOID 50. Erimovakcinaoe vedla k vzestupu protilátek z 0,5-1 og₂ ΝΒ^θ na 0,9, resp· 1,2 u dvou imunizovaných prasnic, 14 dnů po revakoinaci na 4,9 a 6,2-log.g ΝΒ^θ (oož odpovídá zhruba titrům 32 a 64)· Ohallenge dávkou LD 10 LD50 králičích (200 TOID 50) virulentního viru vedla k anamneetické reakci se stoupnutím titrů protilátek na 9,9 a 6,2 -log·2» ®>ijq (00a 1024 a 64) bez známek klinického onemocnění· Kolostrálni protilátky ochránily před stejnou ohallengovaoí látkou AT 1 selata imunizovaných prasnic, zatimoo jak kontrolní prasnice tak i její selata měly klinicky manifestni známky onemocněni, kterému selata podlehla·

Týrazný účinek fotoinaktivováného AT projevující se titry protilátek a prasat ukazuje v porovnáni s jinými anaktivovanými v akci námi současně alespoň dvě skutečnosti t 1). Potoinaktivaoe je velice šetrná inaktivačni procedura ponechávající virový povrch beze změn· 2) Užitková dávka viru pětkrát deset na osmou pro dosi subkutánnim podáni představuje dostatečně účinný antlgenni stimulus·

Nedostatkem této vakoiny je dávkováni (50 ml e.o· pro dosi a určitá obtížnost přípravy vakoiny ve velkoprovoznioh podmínkách (1000 dávek s 50 tis.ml·)·

Etanulen inaktivovaný virus AB ve směsi s parafinovým olejem (HARALAMBIET H., MERMERSKI K., STOET I., SIMEONOT S.j IOTOT M.: Investigatiag the immunegenicity of aloohol-inaktivated Aujeszky *a virus on sheep· C.r. Aoed· bulg. Sol· 1966, 19’441 až 444) byl použit pro imunizaci ovcí, hovězího dobytka i prasat· Zkušenosti s touto vakcinou byly shrnuty po tříletém období pokusů (HARALAMBIET H., MERMERSKI K., SIEMONOT S., IOTOT M., STOET I·, DIMITROTK·, NIKOLOT 1* * Untersusohungen Ober die Immunogenitfit der mit fithanol inaktivierten Takzino gegen dle Aujazkysche Krankheit· Arcg. exp· Tet· med· 1967, 21 ’ 501 až 507)· Vakoina byla podkládána za účinnější než formalizovaná vakoina podle (SOLOMKIN P.S.: Review of the use of aluminium hydroxide formolized vaooine against Aujeszky *s disease· Teteriaarija (Moskva) 1955» 32/12’U až 14)., (BOIADZHIET S., GENET Kh., GEHOT I., TAOHET B. STOIANOT V., KALCHEV I· i Studios on Aujeszky 'b desease· I· Comparison of vaccines. Tet· med· Nauki (Sofia) 1967» 4/9*19 až 26) z porovnaných tří typů inaktivovaných vakcin - alkoholem inaktivované, formol-adsorbátové a saponinadsorbátové pokládá alkoholem inaktivovanou vakolnu proti AB za nejlepší.’ (SIMEONOT S., TASILET V., IOTOT M., MERMERSKI K. * Improvement of ethanol vaooine against Aujeszky *s disease I.Eroduction of an athanol199 395

-saúpnin vaocine· Veterinanemeditsinsku Naukl 1971, 8/7*23 až 29), se pokusili v ethanolem inaktlvované vakeině nahradit parafinované adjuvans saponinem. Titry neutralizačních protilátek u prasat imunizovaných touto vakcinou ve dvou dávkách dosahuji 20« den po revákcinaoi hodnot 8 s přetrváním po 4 měsíce, po 6 měsících 4 nebo 2 (SIMEONOV S., YOTOV 11«, VASILEV V., MERMBRSEI K. i Attemps to lmprove the ethanol vacolne against Aujeszky 'a disease· II· Storage llfe and duration of immuuity Veterinarskomeditsinski naukl (Sofia) 1972, 9/5*69 až 73)·

Účinnost ethanolové vakciny s parafinovým olejem jako adjuvans (HARAIAMBIEV H., MERMERSKI K·, SIMEONOV S., YOTOV M., STOEV I., DIMITROV K·, NIKOMV I. t Untersuohung Uber die immunogeaitfit der mít ethanol Inaktivlerten Vakzine gagan dle Aujeszkysohe Krankheit. Arch· exp· Vet· med· 1967, 21*501 až 507), ověřováaná na selatech s přítomnými potilátkamí v nízkých titreoh je těžko hodnotitelná, neboť nelze vyloučit, že vakcinace se uplatňovala jako sekundární podnět* Tomuto názoru by odpovídala i úvaha autorů a odlišné protilátkové odpovědí selat různého stáři s nízkým titrem protilátek·¹ (GENOV I·, RBZASHKA A·, GENOVÁ A·* Produktion of propiolaotone - lnaotlvated vaccine against Aujezsky *s disease from the Russe vaocinal strain. Vet.med.'nauki (Sofia) 1967 , 4/10*35až 40) učinili pokus o přípravu absorbátové vakciny s šetrně Inaktivovaným virem AD beta - propiolaktonem. Byl kladen důraz na vhodnou minimální účinnou dávku inaktivačního činidla (0,05 %)·’ Účinnost vakciny byla hodnocena na ovcích a prasatech·

I když množství virovéhe antigenu ve vakeině bylo malé (maximum 10-⁵ TCID 50 pro dávku), autoři prokazovali po primovakcinaoi ovcí i prasat shodné titry 16, po revkacinaoi 32·

Význam dostatečně velkého antigenniho impulsu a potenciální účinek adjuvana je naznačen v práci (SKODA R., WITTMANN G., Die immunísierung von Schwlaen mít Vakzinen aUs inaktivlerten Aujeszky-Vírus· Zbl.Vet.med.1973, Heft 2>127 až 138)· Autoři konstatovali slabou účinnost doposud vypracovaných inaktivovanýoh vakcin. Pokusili se koncentrovat virus, získaný z tkáňových kultur buněk BHK 21, takže konečné množství virového angigenu ve vakeině odpovídalo dávce 5 z Ιθθ TCID^q v objemu kompetnl vakciny. Byly porovnány v účinnosti 2 dávky viru, a to 5x10^ a 10^ TOID^q, které byly aplikovány i.a. nebo s.e· s diethylamlnoethyldextransm (DBAE'- D) a dále býly srovnány oo do účinnosti s virem inaktivovanýoh stejnou procedurou aplikovaným bez adjuvancii a s Preudovým ikompletním adjuvans. Z pokusů vyplynulo, že ΞΕΙ inaktivovaný virus indikuje protilátky, které po 4 týdnech dosahuji neutralizační titry 2 a 4. Inkompletnl adjuvans nepotenoovalo ant i gen ní vlastnosti užitého viru. DEAE -Ev porovnání proti samotnému víru a viru v ikom pletních adjuvanciíoh vedl k dřívější a vyšší protilátkové odpovědi (8 až 32)· Po primovakcinaoi se udržují titry 1 až 4 po dobu až 15 týdnů, revákcinaoe vede ke zvýšení titrú na 9 až 32, ale protilátky poklesávají stejně rychle jako po primární odpovědi, takže 80 až 105· den resistenoe na infekční zátěž byla prokazatelná u 13· vakoinovanýoh selat z 20.

189 368

Autoři uzavírají, že revkacinace nevedla ke stupňováni imunity. Současně je pozoruhodné i sděleni, že u zvířat očkovaných timte typem vakciny kontaktní infekce virulentním virem vylučovaným horním respir^čnía traktem artoflviálaě infikovaných zvířat nevedl k typické sekundární odpovědi (aoamnestické reakoi), a že titry protilátek začínají stoupat po 4 až 7 dnech (SKODA R., JAKUBÍK J.« Immumleslerung ven Schweinwn mit AujeszkyvirusVakzinen, hergestelit aze zvol Plawttenvariantea Des Virus. Zhl.Vet.laed. 1974, B 21,

234 až 241) autoři uvádějí v diskusi do vztahu časový odstup revakcinace od primodávky v k přetrváni protilátek.

Z uvedénáho přehledu literatury o možnosti použití inaktivované vakciny k prevenci a tlumeni AD je možno se pokusit o některé zobecnění.

1. Předpokladem účinnosti virového antigenu je šetrná inaktivaňnl procedura, ponechávající povrchové atruktury virionu bez poškozeni (BGRGEN H.H.,ESPENSEN L. t Immunizing effeot of photoinaotivated pseudorabies virus. Zbl. Bact. Parasitkde 1. Orig. 1970,

214*13 až 16).

2. Vakcina musí představovat dostatečný antigennl impulz, který je dán koncentrací viru.

3· 0 výsledku imunizace rozhoduje i zvolené imunizačni schéma (SKODA R., JAKUBÍK J. t Immunlaierung von Schweinen mit Aujeszkyvirus-Vakzinen, hergestellt aus zwei Plaquenvarianten der Virus. Zbl.vet.med. 1974, B* 21, 234 až 241).

Inaktivované vakcina vypracovaná s ohledem na uvedené předpoklady se ve své účinnosti může vyrovnat, měřeno titrem neutralizačních protilátek, vakcinám attenuováným (BORGEN H. 0., ESPBNSEN L. t Immunizing effect of ohotoinactivated pseudorabies virus. Zbl.baot. Parasitkde I. Orig. 1970, 214-12-16) bez rizika novorozených selat vysokobřezích prasnic (BOYADZHIEV S., GENEV Kh., GENOV I·, VACHEV B., STOYANOV V·, KALCHEV I·, : StUdies on Aujeszky 'a disease. I. Comparison of vaccines. Vet.med.nauki (Sofia) 1967, 4/9*19 až 26), (HASIČ M., PETROVIČ M.* Kann durch Kristalvioletvakzine gegen Schweinepe st dle Aujeszkysohe Krankheit Hbertragen werden, Zbl. Bact. Parasitasche · 1962, I. Orig... 185 * t 145 až 154) a bez omezeni jejich aplikace na ohniska infekce. V žádném případš není možno souhlasit dnes již s tvrzením (Meanlnger R., Moczyj * Traité des maladies internes des animavx domestigques. Papis » Vigot fréves 1959, ΡΡ· 457 až 464)» ře aktivní imunizace proti AD není možná. Nelze souhlasit ani s názorem (Kretzschmar 0., Unter suchvagen zur Eplzotologie der Aujeszkyschen Krankheit heim Schweinund daraus sich ergebende Schluss forgerungeu fflr Prophylaxie und Bekamptung Mh.Vet.med. 1964, 19 * 248 až 257), Zuffa A. Versuoh zur Immunisierung von Laboratoriumstieren und Schweinwn mittels Pormaldehyd - und - UV straohen inaktivierten Aujeszky - virus. Arch. exp. Vet.med.1963, 17*595 až 613), že inaktivovaná vakcina proti AD je neúčinná. Z uvedeného přehledu světového písemnictví vyplývá, že aktivní imunizace inaktivovanou vakcinou dokonale chránící imunizované zvíře, neni vyřešena.

199 3BS

Uvedené nedostatky jsou odstraněny adjuvantoí inaktivovanou tkáňovou vakoinou proti Aujestkyho chorobě podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že je tvořena iaaktivevauou mutaaetou viru Aujeszkyho choroby ONOZO Ae 5/78 - dosahující v živném roztoku tkáňových kultur titry nejméně ΙΟθ'^ΤΟΙΒ^θ^Ι), ve směsi se vstřebatelným adjuvane v koncentraci 6 až 8 procent. Způsob výroby této vakoiny spočívá v tom, že infekční médium vnímavých buněk tkáňových kultur, infikovaných nejméně multiplicltou 1 mutanty viru Aujeszkyho choroby - CNOTO Ao 5/78 - na buňku a po infekci uchovávaných při teplotě 26 až 37 ®O, se odehrává v době rozvinutého virem vyvolaného poškozeni tkáně, s výhodou 20 hodin po infekci, tkáňová drž a virové aglomeráty se odstraní, ověří se množství - tltru viru, infekční medium se inaktivuje přidáním 10 procent hetapropielaktoru do konečné konoentraoe 0,05 až 0,025 procent za kontroly pH, podle výsledků titraoe se upraví koncentrace virového antigenu, nejméně však do hodnoty 10⁸’^ TOH^tml), přidají se antibiotika, adjuvans do koncentrace 6 až 8 %, směs se promíchá, čímž vznikne viskoznl očkovací látka. Selektovaná mutanta viru Aujeszkyho choroby - ONCTO Ao 5/78 dosahuje titry přesahující 9/1θβ^θ TCID^q (ml) na kulturách vepřových ledvinných buněk ve formě primokultury nebo nejvhodněji stabilní linie PK. Inaktivaoe probíhá při 30 až 37 °C po dobu 15 až 30 minut.

Jednou z výhod je použiti mutanty Herpes virus suis AV podle vynálezu, kmenu CNOTC Ao 5/78 čs. státní sbírky typovaných kultur v Praze 10 - Vinohrady, árobárova 48. Tato mutanta viru Aujezskyho choroby byla získána AU 1 z SVÚ Praha - Iysólaje, selekci platů morfologicky distinktních po proběhnutí dvou replikačulch cyklů na buňkách linie PK kultivovaných pod agarovou pokrývkou za teploty 36* °0. Získaný klonus je charakterizován»

a) zachovanou autigenni strukturou,

b) zachovanou virulencí pro prase, králíka, morče a myš,

c) schopnosti rychlé tvorby nekrotlckých ložisek v buňkách linie PK s charakteristickou morfologii,

d) schopností dosáhnout v infikačním médiu tkáňových kultur vnímavých buněk titry přesahující 10θ TCID^q v mí.

Mutanta AV dosahuje na buňkách vepřové ledviny titrů vyšších než 10,9 TOID^q/biI, je možnost případného zředěni infekčního média až do minimální hodnoty 10⁸’^ TCED^/ml, zabezpečující v použitém adjuvans dostatečný autigenni impuls, vedoucí k rezistenci očkovaných jedinců, podtrženém imunizač nim--schématem. Účinný antigenní podnět je zajištěn velice Šetrnou inaktivačni procedurou, představovanou použitím betapropiolaktonu v konečných koncentracích 0,05 až 0,25 %· Imunizačnl účinek je podstatně zvýšen přidáním vstřebatelného lipoidního adjuvans, které kromě potsnciaoe účinku vakoiny má výhodu v tom, že nevyžaduje nucený výsek partií jatečnýoh zvířat, kde byla vakoina aplikována a která svou konzistencí odpovídá požadavku technických možnosti pro nosovou aplikaci. Kromě stimulace humurálníoh protilátek adjuvans kladně ovlivňuje i buňkami zprostředkovanou imunitu. Výsledek imunizace je ovlivněn vhodně zvolenou pozologil, dávkováním a revakcinací. Ověřené imunizačnl schéma prokázalo výhody vnitrosvalového podáni očkovací látky proti podáni strktně podkožnímu a do podkožního tuku, předevěim při anamaestleké odpovědi. Pro hladinu

199 39S protilátek je vhodnější revakcinaoe v období tří až pěti týdnů po primovakoinaci v porovnání a revakoinaoí po 14 dnech po vakcinaei· Revakcinaoe oplodněných samic např· prasnic 7 až 14 dmi před porodem, vede k ochraně selat kolostrem po dobu alespoň 50 dnů po porodu, tedý v době, největší vnímavosti zvířete· Zásadní výhodou aplikace účinné inaktivované vekolny proti vakclnám živým, je možnost jejího použiti v prevenci AD, především v oblastech e jejím výskytem bez rizika vneseni živého viru do stáda· Aplikace inaktivované vakeiny vodo k zastaveni projevu infekoe 3 až 5 dnů po imuaizačnim zákroku· Tento rychlý účinek je vysvětlitelný boosterovaelm efektem** vakeiny v promořenóm chovu. Jedinci nereagující na aplikaci vakeiny jsou vzácnou výjimkou· Takciaa nevyvolává místní ani osikovou reakci a lse ji bez rizika použit i u vysokobřezleh zvířat·

Výroba vakeiny předpokládá použiti běžných ingrediencí a samotný výrobní postup so obejde bes náročnějšího přístrojového vybaveni· 7 podstatě zahrnuje vybaveni laboratoře tkáňových kultur a při velkovýrobě možnost sterilního rozplnění výrobku·

Účinnost vakeiny je zaručena alespoň šest měsíců při skladováni při teplotě 3 až °0.

Takcina co do imunity byla ověřena na prasatech, morčatech, králících a myších s výsledky, která ukazují, na obecnou schopnost této vakeiny indukovat tvorbu protilátek a chránit imunizované jedince před infekci virulentním AT.

Přiklad:

vakciaa podle vynálezu má toto složeni infekční médium tkáňových kultur 95 díly aquasorb hydrofilni bezvodý 7 dílů penicilín a streptomycin cca 500/j/gema/ml

Kuagizone 5/ug/ml

Přiklad způsobu výroby 1000 ml vakeiny podle vynálezu:

Karlovým roztokem s 0,5 % laktalbuminhydrolysátu upraveným 7,5% roztokem AnHCO^ na ph 7,6 propláchnuté rozrostlé kultury buněk RK - stabilní linie vepřových ledvin v Roux lahvích objemu 1200 ml se infikuji objemem 1,0 ml virového kmene - mutanty viru Aujeszkyho choroby - ONCTC Ao 5/78·

Infikované kultury se uloží na 20 min do ttermostatu pro adsorpci viru na buňky a pak ee převrství 100 ml udržovacího média - složeného z Karlova roztoku s 0,5 % lektal— buminhydrolysátu, pH 7,6 po úpravě 7,5% roztokem NaHCO^.

Infikované kultury se inkubuji při teplotě 36 aí y? °C v termostatu do doby, kdy cytophické změny jsou ve formě úplné destrukce tkáně· Zpravidla inkubace nepřekročí 48 hod·

Infekční médium je slito, takže tvoři jednu výchozí suspenzi a centrifiguje se při 5000 až 6000 rpm po 10 min· za použití úhlové hlavy centrifugy Jantzkl T 23 Supernatant1G

199 39S nl tekutiny se odsaji a iuaktivuji přidáním desetlproentního přeohlazeného vodného roztoku betapropiolaktonu do konečné koncentrace 0,05 až 0,25 %t nejvhodněji 0,15 %» aa 1000 ml virové eentrifugované suspenze 15 ml 10% vodného roztoku betapropiolaktonu za neustálého mícháni· Nádoba s virovou suspenzi po přidáni betapropiolaktonu so uloží do vodni lázně 30 až 36 °C aa dobu 50 minut, e úpravou pH po 10 minutáoh na hodnotu

7,6 přidáním Bikarbonátu· Po dobu inaktivace so virová suspenze 2 x po desetiminutovýeh intervalech promíohá· Po ukončeni inaktivace po 50 minutách so opakované kontroluje, popřípadě upraví pHt přidají so antibiotika penicilín a streptomyoin do konoeutraoe 500 j,, resp· gamma a Fungs 120 N/ml* Za neustálého miohánl nejvhodněji v mixeru nebo na vyeokoobrátkové míchačce, so přidá 85 ml rozehřátého Aquasorbu k objemu 250 al virové suspenze, vyčká se vazby suspenze na adjuvans, což ae projeví zhoustnutím hmoty přibližně do 1 minuty od přidáni adjuvans a dále so za neustálého mícháni pozvolna přidává zbytek virové suspenze· Celková doba míšeni dostačující k dokonalé homogenizaci nepřekračuje 5 minijt, obvykle dostačující 4 minuty·

Adjuvantní vakoina se sterilně plni dc lékcvek a uzavírá gumovými zátkami a kovovými objímkami· Až do té doby použiti se uchovává při chladničkové teplotě 4 až 6 °C·

Účinnost vakciny byla ověřována v pokusech.na selatech, králících a morčateoh za použití subkutánnlho a iatramuskulárnlho podáni· Nejvyšší účinnost byla prokázána na morčatech, u kterých docházelo při dodrženi stejné dávky na váhovou jednotka k vysoké protilátkové odpovědi po primární vakoiaaoi (.256 tit), nižěi titry byly dosaženy na selatech (64 až 128), králíci po orimovakoinaci odpovídali jen pc zvýšení dávky· Revakcinace ve všech případeoh vedla k protilátkové odpovědi do vysokých titrú (256 ai 512 proti 1000 TOID^q v neutralizačním testu na tkáňových kulturách) a současně zvířata byla resistentni na infekci 10^ TCID^q infekčního viru aplikovaného i.m. Aplikace vakciny králíkům byla současně testem bezpečnosti, neboť králík odpovídá smrtelným onemocněním na infekci už jednotkami Aujeszkyho viru· Užitá inaktivačni procedura byla pokusem na králících prokázána jako plně dostatečná pro zbaveni viru Aujeszkyho choroby infekciosity při zachovaná antigenicitě·

Doložení zkoušek účinnostii Zkoušeli se tři vakciny, z nichž A - Adjvantni inaktivovaná tkáňová vakoina, B - Iyofilizát

C - další vakcina

Vakciny byly aplikovány i.m· v následujioim množství, vždy třem králíkům:

Celá vakcinová dávka pro prase

1/2 vakcinačni dávka pro prase

1/4 vakcinačni dávka pro prase

1/10 vakcinačni dávky pro prase

1/20 vakcinačni dávka pro prase

199 36S

Za 11 dal pa vakclnaoi byli všichni králíci revkacinovánl stejnými dávkami a stejným způsobem· Za dalších 10 dnů byli králíci včetně třech nevakcinovaných kontrol infikováni virem Aujeazkého choroby (kmen Bucvrest 200 pasáž) v dávce 10^ W^q viru l«m· Po infekci byli králíci pozorováni 14 dni· Zkouška byla provedena dvakrát jako I a II titraoo·

I· titraoo

Vakcina	Vakcinačnl dávka
1/20	1/10	1/4	1/2	1/1
A	33	66	100	100	100
B	0	0	0	0	0
0	0	0	0	0	0
	% přežiti králíků po čelenži

II· titraoo

Vakcina	Vakcinačnl dávka
- .............1/20	1/10	1/4 - 1/2 .	1/1
A	33	33	50 100	100
B	0	0	33 33	66
C	0	0	0 0	33
	% Přežiti králíků po čelenži

U obou tltraoí bylo u vakoiny A dosaženo nejlepšiho výsledku· 100 % chráněnost je zaznamenávána po celé i poloviční dávce vakciny, zatímco další vakciny B a C nezajistily v žádném případě Imunitu všech vakcinovaných králíků· 17 obou pokusů ještě 5 % dávky vakoiny A chránili třetinu vakcinovaných zvířat· Kontrolní králičí uhynutí po čelenžl 4 a 5 den·

Doložení zkoušky neškodnosti!

Opět byly použity tři vakciny A, B, 0, které se aplikovaly 5ti králíkům váhy 2kg v dávce rovnající ae vakcinačnl dávce pro prase a dalším 5ti králíkům v dávce poloviční, tj·:

Vakcina A 5 om^ a 2,2

Vakcina B 2 cm^ a 1,- cm^

Vakoina 0 2 cm^ a 1,- cm^

Pozorovaná doba 21 dní·'

Výsledky zkouěek neškodnosti! Vakcina A 10· den po vakcinaci uhynul 1 králík, při celé vakcinačnl dávce· Jako příčina úhynu byla vyloučena infekce A«oh· U ostatních vakcin rovněž v případě jednoho úhynu nebyla původcem Aujeszkyho choroba·

Claims (4)

1· Adjuvantni inaktivovaná tkáňové vakoina proti Aujeszkyho chorobě, vyznačující so tim, žs jo tvořena lnaktivovanou mutaatou viru Aujezskyho choroby - CNOTO Ao 5/78 - dosahující v živném roztoku tkáňových kultur titry nejméně 10®*^ TCID^q /ml, ve smě si so vstřebatelným adjuvans v koneentraoi 6 až 8 %·

2· Způsob výroby adjuvantni inaktivovaná vakciny proti Aujoezkyhe chorobě podle bodu 1, vyznačující oo tim, žo infekční médium vnímavých buněk tkáňových kultur, infikovaných nejméně multlplloitou 1 mutanty viru Aujoszkyhe ohoroby - CNOTO Ao 5/78 na buňku a polnfekol uchovávaných při teplotě 56 až 37 °0, oo odebírá v době rozvinutého, virem vyvolaného poškozeni tkáně, s výhodou 20 hodin po infekci, tkáňová drť a virová aglomeráty se odstraní, ověří se množství - titr - viru, infekční médium se inaktivuje přidáním 10 % betapropiolaktonu do konečná konoentraoe 0,05 až 0,25 % za kontroly pH, podle výsledků titraoo se upraví koncentrace virového antigenu, nejQ C méně věak do hodnoty 10 ΤΟΙϋ^θ/ηΙ, přidají se antibiotika, adjuvans do konoentraoe 6 až 8 %, směs se promíchá, čímž vznikne viskozni očkovací látka·

3· Způsob výroby podle bodu 2, vyznačující se tim, Že selektovaná mutanta viru Aujeszkóhe ohoroby - CNCTO Ao 5/78 - dosahuje titry přesahující 9 log^TCJD^Q/ml na kulturách vepřových ledvinnýeh buněk ve formě primokultury nebo nejvhodněji stabilní linie - PK.

4. Způsob výroby podle bodu 2, vyznačující ee tim, že inaktivaoe probíhá při 30 až 37 °C Po dobu 15 až 30 minut·