CS199865B1 - Kombinovaná vakcina proti Aujeezkyho chorobě a G-střevním pathogenním mikrobům a způsob Jeho výroby - Google Patents

Description

(54) Kombinovaná vakcina proti Aujeezkyho chorobě a G-střevním pathogenním mikrobům a způsob Jeho výroby

Předmětem vynálezu je kombinovaná adjuvantní inaktivovaná vakcina proti Aujeszkyho chorobě (AD) a G-střevním pathogenním mikrobům, která navozuje rezistenci imunizovaných zvířat, nebo Jejich potomstva pasivně předanou protilátkou a způsob výroby této vakciny.

Virus Aujeezkyho choroby (AV) vyvolává u postižených vnímavých zvířat onemocnění centrálního nervového systému a dýchacího traktu se smrtelnými důsledky, předevěím u mladých jedinců. Výskyt tohoto onemocnění, hlavně ve velkochovech zvířat, zejména u selat a norků. Z G-mikroorganismů vyvolávajících onemocnění zažívacího traktu je u prasat nejčastější příčinou onemocnění skupina enteropathogenních E coli, které kromě infekce zažívacího traktu mohou vést i k celkovému septickému stavu, často končícímu úhynem.

Některé serotypy mikrobů rodu Escherichia jsou spojeny s infekčním onemocněním častěji, což je podmíněno výraznými faktory virulence, jako např.tvorbou enterotoxinu. Povrchová struktura - stěna - těchto baktérií představuje jednak biologicky aktivní složku mikroba, umožňující přilnutí ke sliznici střeva, jednak je výrazným antigenem. Z řady vlastností biologických je významná schopnost lipopolysacharidového komplexu, tzv. endotoxinu nespecificky potencovat antigenní podnět. Mnohočetnoet a variabilita biologických vlastností včetně vlrulace a antigenní struktura předpokládají pro úspěšnou prevenci chorob vyvolávaných mikroby rodu Eecherichia předpokládá užití kombinovaných antigenů. Separátní imunizace jednotlivými antigenními typy je v terénu nerealizovatelná.

199 865

199 865

Rezistence proti infekcím, kromě faktorů podmiňujících přirozenou rezistenci, je dána přítomností protilátek neutralizujících schopnost vyvolat infekční proces _u imunitou zprostředkovanou buňkami. Jednotlivé faktory rezistence proti danému infekčnímu činiteli se uplatňují u různých živočišných druhů v různém rozsahu v závislosti na genetických vlastnostech hostitele odrážejících se ve složení buněčných povrchů a způsobů metabolismu, přítomností nespecifických inhibitorů a jejich nespecificky působících mechanizmů a pathogenese příslušného infekčního onemocnění.

V aktivní imunisaci proti infekcím je zásadní podmínkou aplikace určité minimální antigenní masy vhodnou cestou, která by vyvolala dostačující protilátkovou odpověď, přičemž mikrobiální antigen musí mít zachovánu složku podmiňující indukci syntézy protilátek, schopných neutralizovat rozvoj infekčního onemocnění. U virovýoh infekcí se předpokládá, že podmínkou pro vyvolání infekce je přilnutí viru na buňku v místě odpovídajícího receptoru HOLLAND J.J. Enterovirua enhance into specific host cells, and subseguent alterations of cell protein and nucleis acid synthesis, bact. Rev. 1964, 28 ( 3 , tedy protilátka neutralizující virus musí blokovat determinanty povrchu virové části odpovídající těmto receptorům. V ojedinělých případech lze účinně zasáhnout do rozvoje infekčního procesu neutralizací složek uplatňujících se i v jiném stupni replikačního cyklu viru, jako např. imunizací proti neuraminidéze myxovirů.

V aktivní imunizaci je možno využít tzv. adjuvantního účinku některých látek, která jednak umožní produkci protilátek do vyšších titrů, jednak stimulují tzv. buňkami zprostředkovanou imunitu.

Z přehledu světové literatury o možnosti použití inaktivované vakciny k prevenci a tlumení AD je možno se pokusit o některá zobecnění:

1) předpokladem účinnosti virového antigenu je šetrná inaktivační procedura, ponechávající povrchové struktury virionu bez poškození BORGEN H.C., BSPENSEN L. : Xmmunizing effect of photolnaotlvated pseudorabies virus Zbl. Bakt. Parasit kde l.Orig. 1970,

214 s 13 až 16 .

2) Vakcina musí představovat dostatečný antigenní impuls, který je dán koncentrací viru Borgen H.C., Espensen L. 1970, ŠKODA R., WITTMANN G. : Die Immunísierung vom Schweinen mit Vakzinen aus lnaktivirten Aujeszky-Virus Zbl.Vet. med. 1973, Heft 2 ( 127 ažl38.

3) 0 výsledku imunizace rozhoduje i zvolené imunizační schéma ŠKODA R., JAKUBÍK J. i Immunísierung von Schweinen mit Aujeszky-virus-Vakzinen, hergestellt aus zwel Plaguenvarianten des Virus Zbl.Vet. med. 1974, B 21, 234 až 241 .

Inaktivovaná vakcina vypracovaná s ohledem na uvedené předpoklady se ve své účinno-> sti může vyrovnat, měřeno tirem neutralisačních protilátek, vakoinám attenuovaným BORGEN H.C., ESPENSEN L. : Immunizing effect of photoinactivated pseudorabies virus Zbl. Bakt.Parasit kde 1. Orlg.1970, 214 i 13 až 16 , bez rizika pro novorozená selata a vysoko březí prasnice BOYADZHIEV S., GENEV Kh., GENOV I., VACHEN B., STOYANOV V., KALCHEV I.

> Studios on Aujszky 's disease. I. Comparison of vaccines. Vet.med.Naukl (Sofia) 1967,

4/9 « 19 až 26, HASIČ M., PETROVld M. t Kann durch Kristalvioletvykzine gegen Sohweinepest die Aujeszkysche Krankheit iibertragen werden ? Zbl.Bakt. Parasitkde. 1962, l.Orig.

199 865

185 <145 až 154 a bez omezení její aplikace na ohniska Infekce.

V žádném případě není možno souhlasit již s tvrzením MANNINGER R., MOCSY J. I Traité des meladies internee des anlmaux doméstiguee Paris< Vigot Fréres 1959, pp. 457 až 464 , že aktivní Imunizace proti AD není možná. Nelze souhlasit ani s názorem KRETZSCHMARK C. t Untersuchungen zur Epizootologie der Ausjeszkyschen Krankheit beim Schwein und daraus sich ergebende Schlůesforgerungen fiír Prophylaxie und Bekampfung. Mh.Vet.Med.<1964, 17 < 248 až 257 a ŽUFFA A. : Versuch zur Immunisierung von Laboratoriumstieren und Schweinen mlttels Formaldehyd. und-UV Strahlen - lnaktivierten Aujeszyk-Virus Arch.exp.Vet.med. 1963, 17 <595 až 613 , že infikovaná vakoina proti AD je neúčinná.

V posledních letech vypracovaná tkáňová inaktivdvaná adjuvantni vakoina proti Aujeszkyho chorobě výrazným způsobem řeSila problematiku likvidace a prevence Aujeszkyho ohoroby, zvláště ve velkochovech. Přes svou účinnost zvyšovala počet již tak četných^Vakoinačních zákroků. Jako monovatelní vakoina neměla výhody dané případnou potencí antigenního ipulsu, který se uplatní u kombinovaných vakcin.

Uvedené nevýhody odstraňuje kombinovaná vakcina proti Aujeszkyho chorobě a G-střevním pathogenním mikrobům a způsob její výroby podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že v jednom mLobsahuje 10⁸’^ až 10θ’^ tcID^q inaktivované mutanty viru Aujeszkyho choroby,

H

CNCTC AO 5/78, a 10 až 10 inaktivovaných bakteriálních G-jedinců například enteropathogenních Escherichia coli anebo ealmonel, v lipoidnom adjuvans.

Způsob výroby kombinované vakciny kde virus Aujeszkyho choroby CNCTC AO 5/78, se kultivuje na tkáňových kulturách, nejvýhodněji na buňkách stabilní linie vepřové ledviny (PK v bezserovém udržovacím médiu, při teplotě 36 až 37 °C po dobu 18 až 48 hodin, v závislosti na úplném rozpadu infikovaných buňek a potom se oddělené buněčné drti inaktivují beta propiolaktonem, homogenizuje se při teplotě do 42 C a lipoidním adjuvans a s 10 až

Q inaktivovanými G-jedinci, především enteropathogeními Escherichia coli nebo ealmonel. Ve vakcině užité adjuvans je tvořeno vstřebatelnou llpoidní směsí, která se smíchá s virovou suspenzí nejvýhodněji při teplotě 30 až 37 °C s přidáním bakteriální suspenze G-mikrobů, jejiohž antlgení potence byla zvýrazněna opakovaným rozrušením jejioh těl opakovaným zmrazením a rozmražením.

Jednou z výhod kombinované vakciny je použití mutanty AV podle vynálezu. Tato mutanta viru Aujeszkyho choroby byla získána trojnásobnou klonizací laboratirního kmene AVI z SVÚ Praha - Lysolaje, selekcí plaků morfologicky distinktníoh po proběhnutí dvou replikačních cyklů na buňkách linie PK kultivovaných pod agarovou pokrývkou za teploty 36 °C. Získaný klonus je charakterizován s

a) zachovanou antigenní strukturou

b) zachovanou virulenoí pro prase, králíka, morče a myš

o) schopnost rychlé tvorby nekrotiukýoh ložisek v buňkách PK (plaky do 24 hod.)

Q

d) schopnost dosáhnout v infekčním médiu vysoké koncentrace (titry TCID^q 10 log. 10 a vyšší na ml média). Účinný antigenní podnět je zajištěn velice šetrnou inaktivační procedurou představovanou použitím propiolaktonu v konečných koncentracích 0,05 až 0,25 %· Imunizační účinek je podstatně zvýšen přidáním vstřebatelného lipoidního adjuvans, které

199 865 kromě potenciace účinku vakoiny má výhodu v tom, že nevyžaduje nucený výsek partií jatečných zvířat, kde byla vakcina aplikována a která evou konzistencí odpovídá požadavku techniokých možností pro masovou aplikaci a přítomnost Lipopolieacharinového komplexu ve vakcině přítomných bakteriálních členů. Kromě stimulace humorálníoh protilátek adjuvana a Lipopoliaacharidový komplex kladně ovlivňuje i buňkám zprostředkovanou imunitu. Výsledek imunizace je ovlivněn vhodně zvolenou pozologií, dávkováním a revakcinaoí. Otevřené imunizační schéma prokázalo výhody vnitrosvalového podání očkovací látky proti podání striktně podkožnímu a do podkožního tuku, především při alamnestické odpovědi. Vakcinace kombinovanou vakcinou AV a vybranými kmeny E.coli vede k potenciaci antigenního impulsu AV a současné tvorbě protilátek proti bakteriálním kmenům, které se s výhodou uplatní v kolostrální imunitě.

Pro hladinu protilátek je vhodná revakcinace v období tří až pěti týdnů po primovakcinaci. Revakcinace oplodněných samic, např. 7 až 14 dní před porodem, vede k ochraně selat kolostrem po dobu pivních týdnů po porodu, tedy v době největší vnímavosti zvířete na AV a antéropatagenní coli. Zásadní výhodou aplikace kombinované vakciny podle vynálezu proti vakcinám s živým AV je možnost jejich použití v prevenci AD, především v oblastech s jejich výskytem, bez rizika vnesení živého viru do stáda. Aplikace inaktivované vakciny vede k zastavení projevu infekce 3 až 5 dnů poimunizačního zákroku. Tento rychlí účinek je vysvětlitelný boosterovacím efektem vakciny v promořeném chovu. Jedinci nereagující na aplikaci vakciny jsou výjimkou. Vakcina nevyvolává místní ani celkovou reakci a lze je bez rizika použít i u vysokobřezích zvířat. Uvedené výhody se vztahují i na bakteriální kmeny zahrnuté v kombinované vakcině. Protilátky proti těmto kmenům chrání novorozence v rizikovém období před enteropathogenními mikroby odpovídajících serotypů. Účinnost vakciny je zaručena po dobu alespoň 6. měsíců při skladování při teplotě 3 až 7 °C.

Vakcina co do účinnosti byla ověřena na prasatech, morčatech, králících a výsledky, které ukazují na obecnou schopnost této vakciny indukovat tvorbu protilátek. Výroba vakciny předpokládá použití běžných ingrediencí a samotný výrobní postup se obejde bez náročněj šiho přístrojového vybavení. V podstatě zahrnuje vybavení laboratoře tkáňových kultur a při velkovýrobě možnost sterilního doplnění výrobku.

Směs ateropathogenních E.coli potencuje účinnost infikovaných vakoin proti AD, používajících ijiné adjuvans oproti vynálezu.

Příklad způsobu výroby kombinované vakciny - předpis pro 1000 ml.

Earlovým roztokem s 0,5 % laktalbuminhydrolysátu o pH 7,6 propláchnuté kultury buňek linie vepřové ledviny PK se infikují objemem 1 ml vysokotitréžnx mutanty viru Aujeszkyho m 8 5 choroby - CNCTC AO 5/78 - mající titr alespoň 10 * /ml a virus se ponechá absorbovat na buňky 20 minut při teplotě 36 °C. Po adsorpci sa přidá udržovací médium v objemu 100 na Roux láhev 1200 m - Earlův roztok s 0,5 % laktalbuminhydrolysátu pH 7,6 po úpravě 7,5 % NaHCO^ - a kultury se ponechají inkubovat při teplotě 36 až 37 °C do doby jejich úplného rozpadu, který se zpravidla objeví mezi 20 až 48 hodinami od infekce.

V době úplného citopathického poškození kultur virovou replikací se médium jednotli5

199 865 vých infikovaných kultur smíchá, centrifuguje se při 6000 ot/min po 10 minut za použití úhlové hlavy v centrifuee T 23 Janetzki a supernatanty se opět smíchají.

Virová centrifugovaná suspenze se temperuje na teplotu 37 °C a inaktivuje se přidáním desetiprocentního, na chladničkovou teplotu předchlazeneho, betapropiolaktonu do konečné koncentrace 0,15 %. Inaktivace probíhá při teplotě 36 až 37 °C po dobu 30 minut, během kterých se suspenze alespoň 2x promíchá a podle potřeby se upraví pH, které zpravidla po přidání betapropiolaktonupoklesne. Po 30 minutách inaktivace se kontroluje pH, případně se upraví na 7,6 a k virové suspenzi se přidá 1/5 objemu gramnegativních střevních tyčinek pomnožených v Earlově roztoku s 0,5 % laktalbuminhydrolysátu dvacetihodinovou inkubací při v o 8 teplotě 36 C, obsahující v 1 ml 10 bakteriálních jedinců, které byly vystaveny dvojnásobnému cyklu mražení a rozmražení a inaktivovány formolem v konečné koncentraci 0,4 % po dobu 48 hodin při 36 °C. Vakcina pro očkování prasnic zahrnuje obvykle stejné objemy kmenů 157, 147, 64, 149, 141 typizovaných podle 0 antigenu, přičemž alespoň dva z těchto kmenů mají přítomný LT enterotoxin a antigen fimbriální K 88, Salmonella choleraesuis.

Inaktivovaná virová suspenze se směsí inaktivováných bakteriálních kmenů předehřátá na 37 °C se za neustálého intenzivního míchání v mixeru nebo za použití míchačky smíchá s 85 ml rozehřátého Aguasorbu a to nejprve přidáním adjuvans s 250 ml směsi, vyčká se vazby suspenze na adjuvans, což se projeví zhoustnutím směsi přibližně po jednominutovém míchání a dále se za neustálého míchání pozvolna přidává zbytek suspenze. Současně se do vakciny přidávají antibiotika penicilín a streptomyoin do konečné koncentrace aa 500 j resp. gamma/ml vakciny, a fungizon 5 ug/ml. Celková doba míšení dostačující k dokonalé homogenizaci nepřekračuje 5 minut, obvykle dostačují 4 minuty. Adjuvanstní vakcina se sterilně plní do lékovek a uzavírá gumovými zátkami a kovovými oblímkami. Až do doby použití se uchovává při chladničkové teplotě 4 až 6 °C.

Vakoina podle vynálezu má toto složení :

8.5

1. Udržovací médium kultur obsahující v 1 ml 10 ΤΟΙϋ^θ mutanty viru

Aujeszkyho choroby-CNCTC Ao 5/78, inaktivovaná 0,15% betapropiolaktonu 72 díly

Směs E.ooli mající 0 antigeny 157, 147,64, současně β přítomností LT enterotoxinu a K 88 antigenu. inaktivovaných 0,4% formolem 20 dílů

Aguasorb hydrofilní bezvodý 8 dílů

Penicilín a streptomvcin aa 500 j resp. gamma/ml Fungizon 5 um/ml

2. Udržovací médium tkáňových kultur obsahujíoí v 1 ml 10®’° TCKD mutanzv viru Aujeszkyho choroby CNCTC Ao 5/78, inaktivovaná 0,35% betapropiolaktonu 73 díly

Směs E.coli mající 0 antigeny 149, 141,147 a Salmonella choleraesuia, přičemž alespoň jeden z kmenů E.coli (0149 » K 88 a,c,) produkuje LT enteroxln a má K 88 antigen, inaktivovaných 0,4% formolen 20 dílů dílů

Aguasorp hydrofilní bezvodý

Penicilín a streptomyoin aa 1000 j, resp. gamma/ml Fungizon ug/ml

199 865

Neškodnost vakciny se ověřuje jednak v průběhu její výroby, jednak u hotového produktu. V průběhu výroby se kontrolují testy sterility v bujónu a na krevním agaru za aerobních a anaerobních podmínek kultivace sterilita bakteriální suspenze a to pro každý kmen ve vakcině použitý (ověřováno 1 % objemu každého kmene). Bezpečnost kombinované adjuvantní vakciny se ověřuje testem na třech králících, kterým se intramuskulárně aplikuje 2 ml vakciny a sleduje se klinický stav zvířete, vč. teplotní křivky. Očkovaní králíci slouží i pro ověření účinnosti vakciny a to současně vyhodnocením titrů neutralizačních protilátek aleepoň 1 i,l6 a jsou-li pokusná zvířata ochráněna před infekční zátěží po revakcinaci (titry 128 až 256). Titry aglutinačních protilátek se hodnotí přímou aglu.tinační reakcí β jednotlivými kmeny jednak povařenými, jednak inaktivovánými formolem. Za vvhovující je pokládána vakcina, která vede k titrům aglutinačních protilátek alespoň 1 i 80 proti jednotlivým kmenům přítomným ve vakcině (kalkulováno na vlastní ředění séra bez přidání antigenu), přičemž největší důraz je kladený na reakce s formalizovanými antigeny.

Přítomnost LT enteroxinu v preparátu je hodnocena kvantitativně před inaktivací titrací bakteriálního filtrátu na VĚRO v buňkách. Za vhodný je pokládán preparát mající titr alespoň 64.

Pro použití kombinované vakciny proti viru Aujeszkyho chorobě a G-tyčkám, která byla aplikována v průběhu hromadného onemocnění selat a prasnic došlo k tomuto prukému poklesu ztrát :

I. čtvrtletí 1977 - 700 ks úhynu 27,25 % z počtu narozených

IX. čtvrtletí 1977 - 259 ke úhynu 11,10 % z počtu narozených

III. čtvrtletí 1977 - 162 ks úhynu 6,03 % z počtu narozených

V dalším období již nedocházelo k výskytu nákazy.

Claims (3)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Kombinovaná vakcina proti Aujeszkyho chorobě a G-střevním pathogenním mikrobům, vyznačující ee tím, že v 1 ml obsahuje 10⁸’^ _ag 10^’^ TCID inaktivované mutanty viru 5 8 ^5θ

   Aujeszkyho choroby CNCTC AO 5/78 a 10^? až 10 inaktivovaných bakteriálních G-jedinců , např. enteropathogenních Escherichia coli a nebo salmonel, v lipiodnom adjuvans.
2. 2. Způsob výroby kombinované vakciny podle bodu 1, vyznačující se tím, že virus Aujeszkyho choroby CNCTC AO 5/78 se kultivuje na tkáňových kulturách, nejvýhodněji na buňkách stabilní linie vepřové ledviny (PK) v bezsérovém udržovacím médiu při teplotě 36 až 37 °C po dobu 18 až 48 hodin v závislosti na úplném rozpadu infikovaných buňek a potom se po oddělení buňečné drti inaktivuje betapropiolaktonem, homogenizuje se při teplotě do

   42 °c s lipoidním adjuvans a s 10^ až 10® inaktivovánými G-jedinci, především enteropathogenními Escherichia coli nebo salmonel.
3. 3. Způsob výroby podle bodu 2, vyznačující se tím, že ve vakcině užité adjuvans je tvořeno vstřebatelnou liplodní směsí, která se smíchá s virovou suspenzí nejvýhodněji při

   199 865 teplotě 30 až 37 °c s přidáním bakteriální suspenze G-mikrobů, jejichž antigenní potence byla zvýrazněna opakovaným rozrušením jejich těl ©pakovaným zmrazením a rozmražením.