CS265945B1 - Vakcína proti Infekční rhinotracheltldě Inaktlvovaná a způsob Její výroby - Google Patents

Abstract

Řešení se týká vakciny proti infekční bovinnl rhinotracheitidě. Ve vakcinační dávce je obsaženo 1θ7,SStkid^q inaktivovaného viru kmene CAMP V-317. Ke kultivaci viru se používají primární kultury telecí ledviny, které se kultivují v Earlově solné směsi s 10 % séra prostého protilátek proti viru IBR, pří teplotě 34 až 38 °C po dobu 2 až 5 dnů, následně se zbaví buněčného detritu, chemicky se inaktivuje a upraví se do aplikační formy. Antigen se koncentruje například ultrafiltrací nebo ultracentrifugací. Chemická inaktivace se provádí glutaraldehydem ve výsledné koncentraci 0,02 až 0,05 hmot. při teplotách 4 až 40 °C. Inaktivovaný virus se pro použiti smíchá s lipoidnim adjuvans do podoby tekuté vakcíny nebo se lyofilizuje s lyofilizačním médiem na bázi sacharózy a želatiny a před použitím se rozpouští v lipoidnim adjuvans.

Description

Vynález se týká vakcíny proti infekční bovinní rhinotracheitidě skotu (IBR) a způsobu její výroby. V širším pojetí se vynález dotýká profylaxe infekční bovinní rhinotracheitidy, onemocnění, které hraje významnou roli v komplexu infekčních onemocnění skotu. z tohoto důvodu je studiu a prevenci věnována velká pozornost. Diagnostickým šetřením založeným na využití imunoenzymatických testů bylo prokázáno, že IBR je v našich chovech značně rozšířena <1 působí )nko Ί η | i ,. | , kletý významně ιιη<|η I I vně ovllvňitfo ekonomik,, chovu nkotn v jednotlivých zemědělských závodech. Především proces reprodukce, odchovu zdravých telat a nákazy prostých býčků od potenciálních matek.

Nákaza je charakterizována tím, že se klinicky manifestuje v několika formách a ohrožuje zvířata všech věkových kategorií, a tím může přivodit přímé i nepřímé ztráty. Nejzávažnější a u nás nejčastěji zjišťovanou formou je respirační onemocnění telat a narušení průběhu březosti (úhyn plodu, aborty) u krav.

Původce, virus IBR, má tendenci persistovat v organismu zvířat bez zjevných příznaků a vylučovat se jen v určitých momentech vyprovokovaných působením faktorů vnějšího prostředí (léčba kortokosteroidy, transport zvířat, souběžná invaze Dictyocaulus viniparus, superinfekce virem PI-3, porod u krávy apod.) . Tato infikovaná zvířata však hrají významnou roli v rozšiřování nákazy. Latentně infikované matky mohou vzhledem k exacerbaci infekce vyprovokované porodem přenášet infekční virus na svá telata, která mohou být zdrojem infekce pro další zvířata.

Současné epizootologické poznatky odvozené na základě rozsáhlých sériologických vyšetření ukazují, že titry protilátek v krevních sérech jednotlivých zvířat vystavených přirozené kontaktní infekci jsou rozdílné a kolísají v širokém rozmezí - od negativních až k vysoce pozitivním hodnotám. Koncentrace protilátek v krevních sérech a v kolostru a mléce krav je odrazem stupně celkové imunity daného zvířete a determinuje j^k možnost exacerbace latentních infekčních procesů (řestup viru do březí dělohy), tak i vnímavost novorozených telat k infekci.

Z hlediska komplexní profylaxe IBR je tedy důležité navodit a trvale udržet vysokou úroveň imunity u všech v chovu ustájených a infekci vystavených zvířat.

Cílem autorského kolektivu proto bylo vyvinout vhodný neškodný a vysoce účinný imunopreparát - inaktivovanou vakcínu s dostatečně dlouhou dobou exspirace a definovat indikaci pro její použití v prevenci IBR i‘ v rámci komplexních profylaktických programů zaměřených na úplné ozdravení chovů od této nákazy.

V současné době jsou v zemích s rozvinutou živočišnou výrobou a vyspělou veterinární službou ke specifické imunoprofylaxi IBR využívány jednak vakcíny živé, obsahující atenuovaný virus IBR, jednak vakcíny inaktivované.

Jednoznačnou přednost atenuovaných vakcín, tj. nízké výrobní náklady, výrazně snižuje skutečnost, že kmeny viru IBR navozují stav latentní infekce a mohou být společně s virulentními kmeny hostitelem vylučovány a rozšiřovány na vnímavá nevakcinovaná zvířata /PASTORET aj., Infect. Immun., 29, 1980, 483 až 488). Atenuované vakcíny jsou tedy použitelné jen ke snižování ztrát a omezení výskytu klinicky manifestních infekcí. V žádném případě nelze s jejich použitím počítat při celkovém tlumení nákazy a ozdravování (NETTLETON aj., Vet. Rec., 107, 1980, 379 až 382).

Z toho důvodu je v současné době preferováno použití inaktivovaných vakcín, u kterých je vznik latentní infekce vyloučena které zvyšují celkovou, úroveň stáda, omezují reaktivaci latentních infekcí, spolehlivě chrání plod a znemožňují infekci. Umožňují postupné vytěsňováni viru z populace skotu. Jsou proto použitelné i v rámci imunoprofylaktickych programů orientovaných na postupné ozdravování chovů od IBR.

Základním parametrem účinnosti inaktivovaných vakcín jsou titry protilátek zjišEované v krevních sérech vakcinovaných zvířat za 28 až 42 dnů po imunizaci. Titry protilátek zjišEované po aplikaci vakcíny připravené podle této PV (1:8 až 1:128) odpovídají titrům dosahovaným i u zahraničních preparátů připravených z jiných kmenů a jinými pracovními postupy. (SWEAT, R. T,., J. Am. Vet. Med. Ass . , 182, 1983 , 809 až 811).

Výhodou vakcíny připravené podle postupu uvedeného v této přihlášce je, že navozuje nejen humorálhí imunitu stejné úrovně jako vakcína BORINAK (Bioveta Nitra), ale prokazatelně i specifickou imunitu zprostředkovanou buňkami. Skutečnost, že vakcína podle tohoto postupu je připravována v lyofilizovaném stavu, prodlužuje dobu její exspirace na nejméně 12 měsíců.

Podstatou vynálezu je inaktivovaná vakcína proti infekční bovinní rhinotracheitidě

8 a způsob její výroby vyznačující se tím, že obsahuje minimálně 10 ' ΤΚΙϋ^θ inaktivovaného viru kmene CAMP V-317 v jedné vakcinační dávce. Virus se kultivuje v buněčné kultuře primární telecí ledviny, k jejíž kultivaci bylo použito sérum prosté specifických protilátek proti viru infekční bovinní rhinotracheitidy, při teplotě 34 až 38 °C po dobu 2 až 5 dnů. Získaný virus se zbaví buněčného detritu, chemicky se inaktivuje a upraví se do aplikační podoby. Antigen se koncentruje např. ultrafiltrací a ultracentrifugací. Chemická inaktivace se provádí glutaraldehydem ve výsledné koncentraci 0,02 až 0,05 % hmot, při teplotách 4 až 40 °C. Inaktivovaný virus se pro použití míchá s lipoidním adjuvans do podoby tekuté vakcíny, nebo se lyofilizuje s lyofilizačním médiem na bázi sacharózy a želatiny a před použitím se rozpouští v lipoidním adjuvans.

Předností navrhované vakcíny je dobrá protilátková odpověd po vakcinaci a revakcinaci zvířat dávkou 2 cm¹, jak u zvířat bez přítomnosti humorálních protilátek, tak v jejich přítomnosti .

Dosažené geometrické průměry titrů protilátek zjištěné v různých skupinách zvířat, případně v jejich kolostru

Počet ___________Hladiny protilátek

	zvířat	Před vakc.	Za 21 dnů po vakc.	Za 21 dnů po revak.	V kolostru	u telat po pití kolostra
Zvířata infikovaná bez vakc.	9	8,00	5,65	5,65	6,34	14,25
Zvířata infikovaná s vakc.	30	7,55	57,01	120,81	170,85	80,63
Zvířata neinf. s vakc.	23	0	2,20	47,55	-	-

Buňkami zprostředkovaná specifická imunitní odpověd telat po aplikaci inaktivované vakcíny proti IBR a po čelenžní i. nas. infekci virulentním kmenem IBR.

	Tele-1	Tele-2	Tele-3	Tele-4
Před vakcinaci BTL	SI = 0	SI = 0	SI = 0	SI = 0
(infekcí) LMI	0 %	0 %	0 %	0 %
LAI	0 %	0 %	0 %	0 %
První reakce BTL	6d., SI = 4	Od., SI = 0	-
po revakcinaci LMI	3d., 20%	17d., 15%	—	—
LAI	3d., 45%	3d., 20%	-	—
Nejvyšší BTL	21d., SI = 9	5 Od. , SI = 0	18d., SI = 70	-
reakce po LMI	3d., 20%	17d., 15%	31d., 40%	—
revakcinaci LAI	3d., 45%	21d., 40%	3d., 63%	—

r

265945	Tele-1	4
Tele-2	Tele-3	Tele-4
První reakce po i. nas. infekci virem IBR	BTL LMI LAI	3d. 7d. 3d.	, SI = 5 , 40% , 35%	3d., SI = 2,9 7d., 45 % 14d., 20%	-	14d., SI = 2 3d., 29% 3d., 60%
No jνγΓιΠ í t o· •Ί k < ·υ 11< > 1 . nas. infekci virem IBR	ΠΤΓ, LMI LAI	lid. /<1. 14d.	, SI - 1 1, , 40% , 45%	1 1(,.1., SI - 75 7(1., 45% 14d., 20%	lid., si 7d. , 40% 14d., 30%	7 / 1 4<1. , lil -2 3d., 29% 3d., 60%
Vylučování viru IBR nosní slizničí po i^. nas. inf.		neg		3 dny 103 - 100’5 TK!D50	neg.	7 dní 105'75 - 101 TKID50
Titr sérových protilátek v době i. nas. inf. (ELISA)		1:6	300	1:1 350	1:7 100	neg.
Klinické příznaky onemoc. po i. nas. inf.		-		-	-	-

Legenda: Tele-1 - vakcinováno 2x Tele-2 - vakcinováno 2x Tele-3 - vakcinováno 3x Tele-4 - kontrolní, nevakcinované BTL = test blastické transformace lymfocytů LMI = test inhibice imgrace leukocytů LAI = test inhibice adherace leukocytů SI = stimulační test d = dny po vakcinaci nebo infekci

Přikladl .

Uvedený příklad předmět vynálezu nijak neomezuje ani nevyčerpává.

Virový antigen

Pro výrobu vakcíny se použije virus infekční bovinní rhinotracheitidy kemne CAMP V-317, který byl izolovaný z telat nemocných akutním respiračním onemocněním v buněčných kulturách primárních telecích ledvin kultivovaných v Earlově solné směsi doplněné o 0,3 % laktalbumin6 8 3

-hydrolyzátu. Pro výrobu vakcíny je možno použít virus s titrem 10 ' ΤΚΙΟ^θ v 1 cm a vyšším.

Buněčná kultura pro pomnožení viru

K infekci se použije 5 dnů stará kultura primárních telecích ledvinových buněk pomnožených v Earlově solné směsi s 0,3 % hmot laktalbumin-hydrolyzátu a 10 % hmot, bovinního .

inaktivovaného séra prostého protilátek proti viru bovinní rhinotracheitidy. Kontrola nepřítomnosti specifických protilátek proti viru IBR se provádí ELISA testem a virus neutralizačním testem.

Narostlá kultura se zbaví růstového média se sérem a infikuje se virem IBR absorpcí dávkou 0,05 TKID₅₀ na buňku. Po absorpci viru na buněčnou kulturu se přidá udržovací médium - Earlova solná směs s 0,3 % hmot, laktalbumin-hydrolyzátu. Infikované buněčné kultury se inkubují 4 dny při 37 °C. V této době dojde ke vzniku cytopatogenního efektu.

Pomnožený virus se zbaví buněčného detritu při přetížení 3 000 g odstředěním po dobu 15 minut. Čistý virus se pak koncentruje přes ultrafiltr zachycující částice s molekulovou hmotností vyšší jak 20 000. Virus se koncentruje lOx. Koncentrovaný virus se inaktivuje glutaraldehydem v koncentraci 0,125 % hmot, při teplotě 37 C po dobu 2 hodin. U inaktivované— ho viru se upraví pH na 7,0; přidá se protektivní lyofilizační médium obsahující želatinu a sacharozu a provede se lyofilizace. Lyofilizovaný antigen se před použitím ředí v lipoidním adjuvans a aplikuje se zvířatům. Výhodou takto připravené vakcíny je dlouhá doba exspirace.

K ředění vakcíny je možno použít lipoidní adjuvans následujícího složení:

Destilovaná voda

Parafinový olej

Lanolin

Tween 80 (polyoxyetylovaný monoolean sorbitolu)

000 cm³

600 ctn³

300 g

100 g

Příklad 2

Koncentrovaný a inaktivovaný virus připravený podle příkladu 1 se smíchá s lipoidním adjuvans a takto vzniklá vakcína se do použití uchovává v tekutém stavu.

Složení tekuté vakcíny:

Koncentrovaný antigen IBR 30cm

Parafinový olej 62cm

Montanid 103 8cm

Claims (6)

1. Vakcína proti infekční bovinní rhinotracheitidě inaktivovaná, vyznačující se tím, že 6 8 obsahuje minimálně 10 ' ΤΚΙϋ₅θ inaktivovaného viru infekční bovinní rhinotracheitidy kmene CAMP V-317 v jedné vakcinační dávce.

2. Způsob výroby vakcíny vyznačující se tím, že virus se kultivuje v buněčné kultuře primární telecí ledviny, k jejíž kultivaci bylo použito sérum prosté specifických protilátek proti viru infekční bovinní rhinotrocheitidy při teplotě 34 až 38 C po dobu 2 až 5 dnů, následně se zbaví buněčného detritu, chemicky se inaktivuje a upraví do aplikační formy.

3. Způsob výroby vakcíny podle bodu 2 vyznačující se tím, že se virový antigen koncentruje například ultrafiltrac?í nebo ultracentrifugací.

4. Způsob výroby vakcíny podle bodu 2 vyznačující se tím, že chemická inaktivace se provádí glutaraldehydem ve výsledné koncentraci 0,02 až 0,5 % hmot, při teplotách 4 až 40 °C.

5. Způsob výroby vakcíny podle bodu 2 vyznačující se tím, že inaktivovaný virus se před použitím smíchá s lipoidním adjuvans do podoby tekuté vakcíny.

6. Způsob výroby vakcíny podle bodu 2 vyznačující se tím, že inaktivovaný virus se lyofilizuje s lyofilizačním médiem na bázi sacharózy a želatiny a před použitím se rozpouští v lipoidním adjuvans.