CS231514B1 - Inaktivovaná olejová vakcína proti Aujeszkyho chorobě a sposob jej výroby - Google Patents

Abstract

Inaktivovaná olejová vakcína proti Aujeszkyho chorobě je určená na špecifickú profylaxiu Aujeszkyho choroby u vnímavých druhov hospodářských a úžitkových zvierat. Připravuje sa z atenuovaných kmeňov virusu Aujeszkyho choroby, ktoré sú neškodné pre ošípané všetkých věkových kategorií pri lubovolnej aplikácii, so zachovanou úplnou alebo čiastočnou patogenitou pre králíky. Virusová suspenzia so připravuje pomnožením v buňkových kulturách a následné sa inaktivuje účinkom formaldehydu a saponínu. Emulguje sa so zmesou adjuvantných olejov tak, aby vznikla dvojitá emulzia voda v oleji vo vodě.

Description

231514 3

Vynález sa týká inaktivovanej olejovejvakcíny proti Aujeszkyho chorobě vníma-vých druhov hospodářských a užitkovýchzvierat a spósobu jej výroby.

Virus Aujezskyho choroby vyvolává na-kažlivé ochorenie u viacerých druhov hospo-dářských a úžitkových zvierat, to je ošípa-ných, hovadzieho dobytka, oviec, psov, ma-čiek a kožušinových zvierat, ktoré sa vyzna-čujú vysokou morbiditou a mortalitou a za-příčiňuje vysoké národohospodářské straty.Ochranné očkovanie proti Aujeszkyho cho-robě sa doposial' robí prevážne pomocou ži-vých vakcín, vyrábaných z atenuovaných,respektive avirulentných kmeňov [Zuffa, A.,Grunert, Z., 1974: Les vaccines utilisés enTchecoslovaquie contre la maladie D‘Aujesz-ky., Cah. Méd. Vét. 43, 334 — 337; Bártha,A., 1961: Kísérletek az Aujeszky-féle virusvirulenciájának szelídítésére., Mágy. álla-torv. Lapja 16 (2), 42 — 45], Živé vakcínyz avirulentných kmeňov sú neškodné a ichaplikácia v primeranej dávke vyvolává uočkovaných zvierat ochranu proti klinické-mu ochoreniu pri ich kontakte s infekciou[Žuffa, O., 1976: The signifikance of speci-ím prophylaxie for control of Aujeszky‘s di-sease., Proč. 4-th Int. Pig Vet. Soc. Congr.Ames USA, G 10 (En}; Szabó, A., Grunert, Z., 1971: Presistence of virulent Pseudora-bles Virus in Herdis of Vaccinated and Non-vaccinated Pigs., Acta Virologica, 15, 87 až94], Proti používaniu živých vakcín sa vy-slovuji! námietky, že sa nimi vnáša do cho-vu a populácie ošípaných infekčně agens,ktoré móže u vakcinovaných zvierat pře-trvávat a pri přesune vakcinovaných zvie-rat do zdravých chovov sprostredkovať pře-nos infekcie [Škoda, R., 1976: The controlof Aujeszky‘s disease in large swine unitsby use of attenuated live vaccines. Proč. 4-thInst. Pig Vet. Soc. Congr., Ames. USA, G (6),Baskerville, A., Ferran, J. B., Dow, C., 1973:Aujeszky‘s disease in pigs., Vet. Bull. 43,(9), 465 — 480], Tieto námietky proti po-užívaniu živých vakcín sa stali opodstatně-nými najma potom, čo sa dokázalo, že virusAujeszkyho choroby, rovnako ako iné her-petické virusy 1'udí a zvierat, móže po pri-márné} infekcli, doprevádzanej klinickýmochorením alebo prebiehajúcej inaparent-ne, navodit pretrvávajúcu latentnú infek-ciu [Sabó, A., Rajčáni, }. 1976: Latent pseu-dorabies virus infection in pigs., Acta viro-logica, 20, 208 — 214],

Používanie živých vakcín je preto indiko-vané v oblastiach enzooticky zamořenýchAujeszkyho vírusom, kým v oblastiach a stá-tech so sporadickým výskytom Aujeszkyhochoroby sa odporúča používat vakcíny in-aktivované.

Osobitný význam a uplatnenie nájde účin-ná inaktivovaná vakcína proti Aujeszkyhochorobě pri ochrannom očkování hovadzie-ho dobytka, oviec a másožravcov. Tieto dru-hy zvierat sú totiž na infekciu AujeszkyhoVírusom velmi vnímavé, pričom ochorenie 4 prebieha vo všetkých prípadoch letálne. Ži-vé vakcíny, neškodné pre najnižšie věkovékategorie uvedených druhov zvierat, musiasa preto vyrábať z avirulentných kmeňov slimitovanou schopnosťou reprodukcie v or-ganizme očkovancov. To však znamená, žepři antigénnej stimulácii sa uplatňuje lenmalé množstvo inokulovaného vakcinačné-ho virusu, čoho prejavom je poměrně slabáimunitná odpověď. Pri inaktivovanej vakcí-ne možno do aplikačnej dávky koncentrovatpoměrně velké množstvo virusového mate-riálu, ktorého antigenitu možno ďalej po-tencovat vazbou na vhodné adjuvans.

Inaktivované vakcíny, vyrábané z orgá-nov experimentálně infikovaných zvierat,sa ukázali ako neúčinné. Prvé pokusy o pří-pravu účinnej inaktivovanej vakcíny protiAujeszkyho chorobě z virusu napestované-ho na buňkových kultúraoh a inaktivované-ho formaldehydom (Kooh, A., Abraham, E.,1952: Immunisationsversuche mit dem Au-jeszkyschen Virus., Acta vet. Hung. 11/4/,270 — 279; Žuffa, A., 1963: Versuch zurImmunisierung von Laboratoriumstiere undSchweinen mittels Formaldehyd- und UV//Strahlen inaktieviertem Aujeszky-Virus.,Arch. f. Exptl. Vet.-med. 17/3/, 593 — 613],alebo ultrafialovými lúčmi [predtým cito-vaný Žuffa, A., Beládi, I., Ivánovics, D., 1954:Immunisierung von Laboratoriumstieren mitdem Virus der Aujeszkyschen Krankheitnaoh Dessen Inaktivierung mit Ultraviolett-strahlen, Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung.2(1-2), 151 — 160], s použitím gélu hydro-xidu hlinitého ako adjuvans, sa ukázali ne-úspěšné. Ani rozrušenie infekčnosti Aujesz-kyho virusu, napestovaného na buňkovýchkultúrach, pomocou kyseliny dusitej ne-viedlo k přípravě účinnej inaktivovanej vak-cíny. Vo vakcínach připravených z vírusovinaktivovaných pomocou saponínu [Bar-binschi, C., Papadopol, M., 1966: Cercetariprivind imuzares in boala lui Aujeszky cuvacciu preparát din virus des cultura ab-sorbit si saponinat. Lucr. Inst. PasteurIII (1-1964), 71 — 84], alebo kryštáfovej vio-leti [Nedjalkov, S. a spol,, 1968: Versuchezur Herstellung von Vakzine gegen Aujesz-kysche Krankheit sus inaktiviertem Virus. 1. Mitt. Arch. exp. Vet. Med. 22, 499 — 507],nemožno vylúčiť přítomnost infekčného vi-rusu [predtým citovaný Baskerville a spol.1973], Efektivně jsou sa ukázala vakcínapřipravená Haralambievom a spol. [Hara-lambiev, H„ Mermerski, K., Simeonov, S„1967: Untersuchungen uber die Immunoge-nitat der mit Aethanol inaktivierten Vakzi-ne gegen dle Aujeszkysche Krankheit., Arch.exp. Vet. Med., 21(2), 501 — 507] z tkani-nového virusu inaktivovaného pomocou era-nolu s přidáním parafínového oleja ako ad-juvans. Nakolko ide o jednoduché zmieša-nie vody s olejom, dochádza po krátkodo-bom státi emulzie vakcíny k rozdeleniu navodnú a olejovú fázu. Simeonov a spol. [Si- 231514 meonov, S., Vasilev, V., Jotov, M., 1973: Srav-nitelno izpitvanie na saponinovi vaksinyprotiv bolesta na Aujeszky., Vet. Med., Nau-ki 350(2),, 83 — 88] nahradili olejové adju-vans saponínora. Porovnávali účinnost trochinaktivovaných vakcín, připravených pomo-cou formaldehydu, kryštálovej violeti a sa-ponínu. Borgen, H. C., Expensen, L., 1970:Immunizing efect of photoinacřivated pseu-dorabies virus., Zbl. Bakt. I. Orig., 214(1),13 — 16, předložili v uvedenej publikáciidokaž o tom, že vystavenie Aujeszkyho vi-rusu posobeniu ultrafialových lúčov vediek rozrušeniu jeho infekčnosti bez poruše-nia povrchových struktur virionov a týmk zachovaniu antigenity. Keďže testovanieimunizacných schopností virusu inaktivo-vaného ultrafialovými lúčmi sa robilo aplí-káciou velkých, pre praktické účely nepo-užitelných dávok, a nakofko technické ťaž-kosti inaktivácie a technologické problémyspracovania inaktivovaného virusu na vakcí-nu ostali nedorlešené, nenašiel tento spo-sob inaktivácie Aujeszkyho virusu pri výro-bě vakcíny proti Aujeszkyho chorobě prak-tické uplatnenie. Preukaznú imunitnú od-pověď vyvolala vakcína predstavujúca vi-rus napestovaný na bunkojev kultúre sta-bilnej škreščej linie BHK-21, inaktivovanýetyletylenimínom a viazaný ,na dietylamí-noetyl dextran [Škoda, R., Wittmann, G.,1973: Die Immunisierung von Schweinenmit Vakzinen aus Inaktiviertem Aujeszkv--Viirus. Zbl. Vet. Med. B(2Q), 127 — 138].

Jednorázové podanie vakcíny ošípaným vprimeraných dávkách vyvolalo aktívnu tvor-bu protilátok a chránenosť proti infekciidefinovaným množstvom virulentného viru-su. Neudává sa však stupeň imunity po ap-likaci! nižších dávok vakcíny, resp. u dobyt-ka len po dvojnásobnom očkovaní, ako sato vyžaduje pre: praktické používanie vak-cíny.

DeLagneau a spol. [DeLagneau, J. F. aspol. 1975: Immunisation contre la maladieD‘Aujeszky a 1‘aide d‘un nouveau vaccinhuileux a virus inactivé, Rec. Méd. Vet.151(151), 561 — 575] použili pre inaktivo-vanie Aujeszkyho virusu, pomnoženého nabunkovej linii 1B-RS-2, klasický sposob, toje formaldehyd a pre stlmulovanie antige-nity virusu lipoidné adjuvans. Dvojnásobnépodanie vakcíny vyvolalo u laboratórnychzvierat a ošípaných tvorbu protilátok v tlt-roch 1: 16 až 1: 128 a chránenosť proti in-fekcii definovaným množstvom letálnych dá-vek. Očinnú inaktivovanú vakcínu protiAujeszkyho chorobě připravil Genov a spol.tak, že virus inakttvoval 1,3-propiolaktónoma následné ho viazal na adjuvans predsta-vujúci gél hydroxidu hlinitého [Genov. I.,Řezačka, A., Genová, A., 1967: Polučavaneinaktivirana s betapropiolakton vakcínasrešču bolestta na Aueski s štam Ruse]. Ne-dostatkom tejto vakcíny je použitý inakti-vačný prostriedok, ktarý bol vyřaděný zozoznamu látok, použitelných pre přípravu biopreparátov, nakofko sa dokázala jehomutagenita [Pasrish, B. J., Searle, C. D.,1966: Carcinogenity of beta-propiolactonand 4-nitro quinoline N-Oxide for the skinof Guinea pig., Brit. ]. Gancer 2.3, 200 —205]. Žuffa a spol. připravili účinnú inakti-vovanú vakcínu proti Aujeszkyho chorobězo zmesi virulentného a atenuováného vi-rusu Aujeszkyho chorobě inaktivovaného e-íalalkoholom, naviazanej na olejové adju-vans [Zuffa, A., Brányik, A., Salaj, J., Žu-ffová, ]., Menšík, ]., Štěpánek, J., 1980: In-aktivovaná adjuvantná vakcína proti Aujesz-kyho chorobě a sposob jej přípravy. Autor-ské osvedčenie č. 201 802],

Nevýhodou doposial' navrhovaných inakti-vovaných vakcín proti Aujeszkyho choroběje, že na ich výrobu sa používajú virulent-né kmene virusu Aujeszkyho choroby jed-notlivo alebo v 1'ubovol'nom pomere zmie-šané s kmeňmi s čiastočne zníženou viru-lenciou. Ďalšou nevýhodou je nízká auti-génna stabilita virusu Aujeszkyho chorobyinaktivovaného etanolom v době před emul-gáciou s olejovým adjuvans. Táto skutoč-nosť nedovoluje súčasne vyrábaf inaktivo-vané aj živé avirulentné očkovacie látky,vzhfadom na vázne nebezpečenstvo laho-ratórnej kontaminácie a okrem toho zne-možňuje výrobnú spoluprácu s krajinami,ktorých předpisy nedovofujú používat viru-lentně virusové kmene vo výrobných pod-mienkach.

Uvedené nedostatky sú riešené inaktivo-vanou olejovou vakcínou proti Aujeszkyhochorobě vnímavých druhov hospodářskýcha úžitkových zvierat, obsahujúcou v ml 107až 109 TKID50 inaktivovaného atenuovanéihokmeňa Buk-TK-900/IVa uvedeného v Česko-slovenské] zbierke mikroorganizmov na Vý-skumnom ústave veterinárneho lekárstva vBrně, Hudcova 60, pod označením CCM V-94,alebo 10/ až 109 TKiDso inaktivovaného· ate-nuovaného kmeňa Buk-TK/650 uvedenéhov Československej zbierke mikroorganizmovna Výskumnom ústave veterinárneho lekár-stva v Brně, Hudcova 60, pod označenímCAMP V-265, emulgovaného· v olejovom ad-juvans a spoeobom jej výroby z atenuova-ného kmeňa virusu Aujeskyho choroby ne-škodných pre ©šípané všetkých věkovýchkategorií pri fubovofnej apiikácii, so zacho-vanou úplnou alebo čiastočnou patogenitoupre králíky, s výhodou použitia kmeňov

Buk-TK-900/IVa, alebo· Buk-TK/650, jedno-tlivo alebo v zmesi v 1'ubovoínom pomere,účinnej inaktivácie formaldehydom a sapo-nínom pri zachovaní antigenity a poměruinaktivačných látok k antigénom viruso-vých kmeňov. Sposob výroby vakcíny je za-ložený na tom, že atenuované kmene viru-su Aujeszkyho choroby neškodné pre oší-pané všetkých věkových kategorií pri l'ubo-vofnej apiikácii, so zachovanou úplnou, ale-bo čiastočnou patogenitou pre králíky, sajednotlivo pomnožujú na primárných kul- 231514 túrách, alebo subkultúrach kuřácích alebokačacích embryonálnych buniek, naraste-ných na skle, v suspenzii alebo na mikro-nosičoch. Pre pomnoženie vírusov je mož-né tiež použit vnímavé stabilně linie bu-niek s kontrolovanými biologickými vlast-nosťami. Na kultiváciu buňkových kultúrpoužitých pre pomnoženie atenuovanýchkmeňov Aujeszkyho virusu sa použijú vhod-né živné média, najma tie, ktoré obsahujúfragmenty bovínnsho mliečneho albuminua potřebné množstvo cicavčích, alebo vtá-čích sér [Portefield, J. S., 1967: Animal Tis-sue Culture, v zborníku pod edičným ve-dením Maramorosha, K. a Koprowského, H.,Acad. Press, New York], Nevylučuje sa po-užitie definovaných médií obsahujúcich lát-ky ovplyvňujúce metabolickú aktivitu bu-niek vo vrstvových, alebo suspenzných kul-turách. Buňkové kultury sa infikujú atenuo-vanými kmeňmi virusu Aujeskyho choroby,pri multiplicite infekcie od 0,1 do 1,0 TKIDsona jednu buňku. Po 24 až 48 hodinovej in-kubácii infikovaných kultur pri 37 °C sa zís-ká pomnožený virus v objeme udržovaciehomédia s infekčným titrom 107 až 109 TKIDsov 1 ml suspenzie. Připravená virusová sus-penzia sa zbaví buňkového detritu filtrá-ciou cez gázu. Virusové suspenzie atenuo-vaných kmeňov virusu Aujeszkyho choro-by s uvedenou hodnotou infekčného titrusa jednotlivo alebo v zmesi v 1'ubovol'nompomere zmiešajú a následné inaktivujú pů-sobením formaldehydu vo výslednej koncen-trácii od 0,05 do 0,20s hmotnostných percentpri teplote 25 až 35 °C počas 18 až 72 ho-din, účinkom saponínu, ktorý je súčasnezložkou adjuvancia, vo výslednej koncentrá-cii od 0,05 do 0,20 hmotnostných percentpri teplote 25 až 35 °C po dobu 18 až 72 ho-din, kombinovaným účinkom formaldehydua saponínu v jednom roztoku, alebo násled-ným přidáváním jednotlivých látok bezpro-středné po sebe, alebo do uplynutia 72 ho-din v uvedených koncentráciach počas 18až 72 hodin v rozsahu uvedených teplot.Po kontrole inaktivácie virusu, ktorá sa u-skutoční intramuskulárnou aplikáciou víru-sovej suspenzie králikom v dávkách 2 až10 ml, sa antigény emulgujú so známýmiolejmi v definovanom pomere vodnej fázyk olejom. Zmes adjuvantných olejov, obsa-huje minerálny olej o viskozite 20.10® až120.106 m2.s-1 a emulgátory v takom po-mere, aby vytvárali dvojitú emulziu vodav oleji vo vodě, ktorých zastúpenie vo vak-cíne představuje 13 až 52 hmotnostných percent, s výhodou 17,4 hmotnostných per-cent.

Uvedený příklad predmet vynálezu nijakneobmedzuje, ani nevyčerpáva. Příklad prevedenia

Primárné kultúry z kuřácích alebo ka-čacích embryí, ich subkultúry, alebo vní-mavé stabilně linie buniek s kontrolovaný-mi biologickými vlastnosťami, nařaste,né naskle, v suspenzii alebo na mikronoslěoch,sa zbavia rastového média pozostávajúcehoz Earleho roztoku s prídavkom 7 hmotnost-ných percent telacieho séra a 0,3 až 0,5hmotnostných percent hydrolyzátu laktal-bumínu. Buňkové kultury se opláchnu 1 až2krát fyziologickým roztokom tlmeným fos-fátrni a infikujú atenuovaným kmeňom Buk--TK-900/IVa, alelm Buk-TK/650 virusu Au-jeszkyho choroby, uvedenými v popisnejčasti, pri multiplicite infekcie 0,1 až 1,0TKIDso na buňku. Infikované buňkové kul-túry sa zalejú Earlovým roztokom, oboha-teným o 0,3 až 0,5 hmotnostných percenthydrolyzátu laktalbumínu a inkubujú počas24 až 48 hodin pri 37 °C. Po špecifickej de-generácii bunkovej kultúry, stanovenej mik-roskopicky, ®a virusová suspenzia zbaví buň-kového detritu filtráciou cez gázu do steril-ných fliaš z neutrálneho skla. Přidá sa form-aldehyd do výslednej koncentrácie 0,2 hmot-nostných percent a saponín do výslednejkoncentrácie 0,1 hmotnostných percent vovírusovej suspenzii. Inaktivačné prostriedkysa pridávajú v spoločnom roztoku, alebonásledným přidáváním jednotlivých látokbezprostředné po sebe. Inaktivácia prebiehapočas 72 hodin pri teplote 30 °C. Po kontro-le inaktivácie virusu, ktorá sa uskutoční in-tramuskulárnou aplikáciou inaktivovanej ví-rusovej suspenzie králikom v dávke 5 ml,sa inaktivovaná virusová suspenzia zmiešas 17,4 hmotnostnými percentami zmesi adju-vantných olejov a zmes sa emulguje homo-genizáciou v príslušnom zariadení pri labo-ratórnej teplote. Účinnost inaktivovanej olejovej vakcínyproti Aujeszkyho chorobě, podlá vynálezu,potvrdzujú výsledky v nasledujúcej tabul-ko, v ktorej sa uvádzajú titre neutralizujú-cich protilátok v krvnom sére zvierat vní-mavých na infekciu vírusom Aujeszkyhochoroby v závislosti na množstve i. m. apli-kované] vakcíny a chránenosf proti vyvolá-vajúcej infekcii definovaným množstvemsmrtelných dávok.

Claims (4)

g 19 231314 Tabulka 1 Druh zvierat Titre NV-protilátok v krvnomsére po dvojrázovej aplikácii--ml vakcíny 12 5 Chránenosť prod vyyolávajú-cej infekcii .. .LDjo u zvieratočkovaných ... m,l vakcíny 12 5 Masožravce , 4 — 16 8 — 32 N 102 103 N Ošípané 4 — 16 4 — 64 16 — 256 103 IQ4 104 Hovadzí doby- N 8 — 64 8 — 128 104 IQ6 10® tok PREDMET VYNALEZU

1. Inaktivovaná olejová vakcína protiAujeszkyho chorobě vnímavých druhov hos-podářských a užitkových druhov zvierat vy-značujúca sa tým, že 1 ml obsahuje 107 až109 TKIDso inaktivovaných atenuovanýchkmeňov virusu Aujeszkyho choroby neškod-ných pre ošípané všetkých věkových k-ate-górií pri l'ubovol'nej aplikácii, so zachova-nou úplnou alebo čiastočnou patogenitou prekrálíky, jednotlivo alebo v zmesi v 1'ubovol’-nom pomere, emulgované v olejovom adju-vans.

2. Inaktivovaná olejová vakcína, podl'abodu 1, vyznačujúca sa tým, že obsahujeinaktivováný atenuovaný kmen virusu Au-jeszkyho choroby Buk-TK-900/IVa CCM V--94.

3. Inaktivovaná olejová vakcína podl'a bo-du 1, vyznačujúca sa tým, že obsahuje in-aktivovaný atenuovaný kmeň virusu Aujesz-kyho choroby Buk-TK/650 CAMP V-265.

4. Sposob výroby vakcíny podl'a bodov 1až 3, vyznačujúce sa tým, že autenuovanékmene virusu Aujeszkyho choroby neškod-né pre ošípané všetkých věkových katego- rií pri 1'ubovol’nej aplikácii, co zachovanouúplnou alebo čiastočnou patogenitou prekrálíky, sa pomnožujú na primárných kul-túrach, alebo subkultúrach kuřácích alebokačacích embryonálnych buniek, alebo vní-mavých stabilných líniách buniek s kontro-lovanými biologickými vlastnosťami, naras-tených na skle, v suspenzii alebo na mikro-nosičoch sa jednotlivo alebo v lubovolnompomere zmiešajú a následné inaktivujú po-sobením formaldehydu vo výslednej kon-centrácii od 0,05 do 0,20 hmotnostných per-cent pri teplotě 25 až 35 °C počas 18 až 72hodin, účinkom saponínu vo výslednej kon-centrácii od 0,05 do 0,20 hmotnostných per-cent pri teplote 25 až 35 °C po dobu 18 až72 hodin alebo kombinovaným účinkomformaldehydu a saponínu v jednom roztokuv uvedených koncentračných pomeroch priteplote 25 až 3:5 °C počas 18 až 72 hodin anásledné sa emulguje virusová suspenzias 13 až 52 hmotnostnými percentami zmesiadjuvantnýoh olejov, ktorá obsahuje 1'ahkýminerálny olej a emulgátory.