CS196586B1 - Způsob čištění enzymu L-asparaginázy s protinádorovou účinností - Google Patents
Způsob čištění enzymu L-asparaginázy s protinádorovou účinností Download PDFInfo
- Publication number
- CS196586B1 CS196586B1 CS105876A CS105876A CS196586B1 CS 196586 B1 CS196586 B1 CS 196586B1 CS 105876 A CS105876 A CS 105876A CS 105876 A CS105876 A CS 105876A CS 196586 B1 CS196586 B1 CS 196586B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- asparaginase
- enzyme
- purification
- antitumor effect
- separated
- Prior art date
Links
- 108010024976 Asparaginase Proteins 0.000 title claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 6
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 title claims description 4
- 102100025573 1-alkyl-2-acetylglycerophosphocholine esterase Human genes 0.000 title description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 title description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 14
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 14
- 229920002845 Poly(methacrylic acid) Polymers 0.000 claims description 6
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims description 3
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 claims description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101100387923 Caenorhabditis elegans dos-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000004584 polyacrylic acid Substances 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu čištění enzymu L-asparaginázy s protinádorovou účinností. Tento enzym zvaný též L-asparaginamidohydroláza, produkovaný při submerzní kultivaci některých bakterií, zejména Escherichia coli, nabyl nověji na významu pro svou terapeutickou účinnost při některých formách lidské leukemie, např. při akutní lymfoblastické leukémii.
Aktivita tohoto enzymu je určena mezinárodní jednotkou (IU), což je takové množství enzymu, které uvolní 1 μιτιοΙ NH4 + hydrolýzou L-asparaginu za 1 minutu za optimálních podmínek, hodnoty pH a teploty.
mg nejčistšího, několikrát krystalovaného enzymu vykazuje aktivitu až 300 IU.
Čištění L-asparaginázy, která při mikrobiální kultivaci zůstává vázána na obsah buňky a musí být uvolňována destrukcí buněčné stěny, zahrnuje řadu technologických stupňů, které jsou obtížné a nákladné a poskytují jen velmi nízké výtěžky enzymu. Známé postupy pracují pomocí trakčního srážení bud' síranem amonným nebo organickými rozpouštědly (US pat. spis č. 3 440 042, francouzský pat. spis č.
010 927) a vedou k preparátům o enzymové aktivitě nejvýše 50 lU/mg bílkovin. Proto je třeba získané preparáty dále čistit od průvodních cizorodých bílkovin, nejčastěji chromatografií na rozličných adsorbenciích (A. Arens se sp., Z. Physiol. Chem. 351, 197, 1970) nebo tepelnou denaturací (DOS 1 916 723, 1 927 517, francouzský pat. spis č. 2 010 963).
Bylo zjištěno, že lze L-asparaginázu s protinádorovou účinností podstatně zbavit původních cizorodých proteinů a endotoxinu, postupuje-li se způsobem podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se na surový nebo částečně předčištěný enzym, získaný z desintegrovaných buněk produkčního mikroorganismu působí ve vodném prostředí s hodnotou pH 3,9 až 5,5, s výhodou 4,2 až 4,5, kyselinou polymethakrylovou s průměrnou molekulovou vahou 10 000 až 30 000, s výhodou 15 000 až 20 000, vyloučené balasty se oddělí a z čirého roztoku se izoluje vyčištěný enzym, například srážením ethanolem.
Za uvedených podmínek odstraní kyselina polymethakrylová zcela selektivně cizorodé vysokomolekulární příměsi z roztoku, přičemž zůstává enzym zcela nedotčen. Karboxylové polykyseliny, například kyselina polyakrylová nebo polymethakrylová byly již využity pro selektivní izolaci některých bázických antibiotik, například streptomycinu (čs. pat. spis č. 84779), avšak pro selektivní čištění L-asparaginázy nebylo použití těchto látek dosud popsáno ani v patentové ani v odborné literatuře.
190586
Po oddělení vysrážených podílů se vyčištěný enzym získá z roztoku v pevné formě buď lyofilizací nebo srážením přídavkem organického, s vodou mísitelného rozpouštědla, nejčastěji ethanolu. Získá se tak jž velmi čistá substance L-asparaginázy, vhodná k finální operací — krystalizaci.
Podrobnosti způsobu podle vynálezu vyplývají z následujících příkladů provedení.
Příklad provedení
Příklad 1
50,0 g izolované surové L-asparaginázy EC-2 o účinnosti 36 lU/mg bílkovin, získané po kultivaci kmene Escherichia coli uvolněním do vodného prostředí z mechanicky desintegrovaných oddělených buněk a vysrážením dvojnásobným objemem ethanolu, se rozpustí ve 350 ml destilované vody. K roztoku se přidá 40 ml 15 % roztoku draselné soli kyseliny polymethakrylové o průměrné molekulové hmotnosti 20 000. Za míchání se upraví pH směsi na hodnotu 4,2 přísadou asi 41 ml 10% kyseliny octové. Po oddělení vysrážených doprovodných vysokomolekulárních látek se z čirého roztoku vysráží enzym 1,5násobným objemem ethanolu, oddělí, promyje ethanolem a vysuší. Výtěžek 8,5 g bílého prášku s účinností 151 lU/mg bílkovin, což odpovídá výtěžku 70 %.
Příklad 2
50,0 g surové L-asparaginázy jako v příkladu 1, se rozpustí ve 300 ml destilované vody, přidá se 30 ml 11 % vodného roztoku kyseliny polymethakrylové o průměrné molekulové hmotnosti 15 000. Reakční směs se okyselí kyselinou octovou na pH 4,5. Po oddělení vysrážených průvodních látek se získá enzym lyofilizací čirého supernatantu ve formě bílého prášku s účinností 130 lU/mg bílkovin, což odpovídá výtěžku 75 %.
PŘEDMĚT VYNÁLEZU
Claims (1)
- PŘEDMĚT VYNÁLEZUZpůsob čištění enzymu L-asparaginázy s proti nádorovou účinností, vyznačující se tím, že se na surový nebo částečně předčištěný enzym, získaný z desintegrovaných buněk produkčního mikroorganismu, působí ve vodném prostředí s hodnotou pH 3,9 až 5,5 s výhodou 4,2 až 4,5, kyselinou polymethakrylovou s průměrnou molekulovou hmotností 10 000 až 30 000, s výhodou 15 000 až 20 000, vyloučené balasty se oddělí a z čirého roztoku se izoluje vyčištěný enzym, například srážením ethanolem.Cena: 2,40 KčsMTZ O 21 82 R 5615
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS105876A CS196586B1 (cs) | 1976-02-19 | 1976-02-19 | Způsob čištění enzymu L-asparaginázy s protinádorovou účinností |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS105876A CS196586B1 (cs) | 1976-02-19 | 1976-02-19 | Způsob čištění enzymu L-asparaginázy s protinádorovou účinností |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS196586B1 true CS196586B1 (cs) | 1980-03-31 |
Family
ID=5343972
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS105876A CS196586B1 (cs) | 1976-02-19 | 1976-02-19 | Způsob čištění enzymu L-asparaginázy s protinádorovou účinností |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS196586B1 (cs) |
-
1976
- 1976-02-19 CS CS105876A patent/CS196586B1/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ståhl et al. | The synthesis of a D-amino acid ester in an organic media with α-chymotrypsin modified by a bio-imprinting procedure | |
| US3389133A (en) | Process for isolating and purifying soluble ribonucleic acid | |
| EP0176068A2 (de) | Verfahren zur Herstellung der Stereoisomeren von 1-Amino-alkylphosphonsäuren oder 1-Amino-alkylphosphinsäuren | |
| SU1232148A3 (ru) | Способ получени инсулина человека | |
| CS196586B1 (cs) | Způsob čištění enzymu L-asparaginázy s protinádorovou účinností | |
| US3652536A (en) | Novenamine compounds and derivatives | |
| DE2509482C2 (de) | Verfahren zur Herstellung des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors aus Rinderlunge | |
| US3597323A (en) | Method of purifying l-asparaginase | |
| US2885433A (en) | O-carbamyl-d-serine | |
| US4608340A (en) | Immobilized aminoacylase enzyme | |
| PL81272B1 (cs) | ||
| US3381027A (en) | Preparation and recovery of methyl 2-ketogluconate | |
| US4229571A (en) | Glucocorticoid sparing factor and process for the production of the same | |
| US4532214A (en) | Method for isolation of aminoacylase | |
| DE2645548C3 (de) | Endonucleasen und Verfahren zu ihrer Herstellung | |
| JP4405631B2 (ja) | 共役リノール酸異性体の精製方法 | |
| EP0059182B1 (en) | A process for isolating aminoacylase enzyme from a mammal kidney extract | |
| JPH0998779A (ja) | トレハロース合成酵素、その製法及びそれを用いたトレハロースの製造法 | |
| JPH0482863A (ja) | ｐ―ニトロベンジルアルコールマロン酸モノエステルの製造法 | |
| KR880001120B1 (ko) | 엘라스타제의 정제 방법(Elastase의 精製方法) | |
| JP3240011B2 (ja) | Ｌ−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸の製造法 | |
| SU403190A1 (cs) | ||
| EP0477647B1 (de) | Enzymatische De-Acylierung von Acyl-Aminosorbosen und dessen Verwendung bei der Herstellung von 1-Desoxynojirimicin | |
| JPH0191789A (ja) | 光学活性β−置換グルタル酸モノエステルの製造法 | |
| JP2886576B2 (ja) | シクロヘキサンカルボン酸誘導体の製法 |