CS196586B1 - Process for the purification of l-asparaginase with antitumor effect - Google Patents
Process for the purification of l-asparaginase with antitumor effect Download PDFInfo
- Publication number
- CS196586B1 CS196586B1 CS105876A CS105876A CS196586B1 CS 196586 B1 CS196586 B1 CS 196586B1 CS 105876 A CS105876 A CS 105876A CS 105876 A CS105876 A CS 105876A CS 196586 B1 CS196586 B1 CS 196586B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- asparaginase
- enzyme
- purification
- antitumor effect
- separated
- Prior art date
Links
- 108010024976 Asparaginase Proteins 0.000 title claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 6
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 title claims description 4
- 102100025573 1-alkyl-2-acetylglycerophosphocholine esterase Human genes 0.000 title description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 title description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 14
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 14
- 229920002845 Poly(methacrylic acid) Polymers 0.000 claims description 6
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims description 3
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 claims description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101100387923 Caenorhabditis elegans dos-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000004584 polyacrylic acid Substances 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu čištění enzymu L-asparaginázy s protinádorovou účinností. Tento enzym zvaný též L-asparaginamidohydroláza, produkovaný při submerzní kultivaci některých bakterií, zejména Escherichia coli, nabyl nověji na významu pro svou terapeutickou účinnost při některých formách lidské leukemie, např. při akutní lymfoblastické leukémii.The invention relates to a method for purifying L-asparaginase enzyme having antitumor activity. This enzyme, also called L-asparaginamidohydrolase, produced by submerged cultivation of some bacteria, particularly Escherichia coli, has recently become more important for its therapeutic efficacy in some forms of human leukemia, such as acute lymphoblastic leukemia.
Aktivita tohoto enzymu je určena mezinárodní jednotkou (IU), což je takové množství enzymu, které uvolní 1 μιτιοΙ NH4 + hydrolýzou L-asparaginu za 1 minutu za optimálních podmínek, hodnoty pH a teploty.The activity of this enzyme is determined by the International Unit (IU), which is the amount of enzyme that liberates 1 μιτιοΙ NH 4 + by hydrolyzing L-asparagine per minute under optimal conditions, pH and temperature.
mg nejčistšího, několikrát krystalovaného enzymu vykazuje aktivitu až 300 IU.mg of the purest, several times crystallized enzyme has an activity of up to 300 IU.
Čištění L-asparaginázy, která při mikrobiální kultivaci zůstává vázána na obsah buňky a musí být uvolňována destrukcí buněčné stěny, zahrnuje řadu technologických stupňů, které jsou obtížné a nákladné a poskytují jen velmi nízké výtěžky enzymu. Známé postupy pracují pomocí trakčního srážení bud' síranem amonným nebo organickými rozpouštědly (US pat. spis č. 3 440 042, francouzský pat. spis č.Purification of L-asparaginase, which remains cell-bound in microbial culture and must be released by cell wall destruction, involves a number of technological steps that are difficult and costly and yield only very low enzyme yields. The known processes operate by means of traction precipitation with either ammonium sulfate or organic solvents (U.S. Pat. No. 3,440,042, French Pat.
010 927) a vedou k preparátům o enzymové aktivitě nejvýše 50 lU/mg bílkovin. Proto je třeba získané preparáty dále čistit od průvodních cizorodých bílkovin, nejčastěji chromatografií na rozličných adsorbenciích (A. Arens se sp., Z. Physiol. Chem. 351, 197, 1970) nebo tepelnou denaturací (DOS 1 916 723, 1 927 517, francouzský pat. spis č. 2 010 963).010 927) and result in preparations having an enzyme activity of not more than 50 IU / mg protein. Therefore, the obtained preparations should be further purified from accompanying foreign proteins, most often by chromatography on various adsorbents (A. Arens et al., Z. Physiol. Chem. 351, 197, 1970) or by thermal denaturation (DOS 1 916 723, 1 927 517, French Pat. No. 2,010,963).
Bylo zjištěno, že lze L-asparaginázu s protinádorovou účinností podstatně zbavit původních cizorodých proteinů a endotoxinu, postupuje-li se způsobem podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se na surový nebo částečně předčištěný enzym, získaný z desintegrovaných buněk produkčního mikroorganismu působí ve vodném prostředí s hodnotou pH 3,9 až 5,5, s výhodou 4,2 až 4,5, kyselinou polymethakrylovou s průměrnou molekulovou vahou 10 000 až 30 000, s výhodou 15 000 až 20 000, vyloučené balasty se oddělí a z čirého roztoku se izoluje vyčištěný enzym, například srážením ethanolem.It has been found that L-asparaginase with antitumor activity can be substantially freed of the original foreign proteins and endotoxin when the process according to the invention is carried out by treating a crude or partially pre-purified enzyme obtained from disintegrated cells of the producing microorganism with aqueous medium having a pH of 3.9 to 5.5, preferably 4.2 to 4.5, with polymethacrylic acid having an average molecular weight of 10,000 to 30,000, preferably 15,000 to 20,000, separated ballasts from the clear solution isolating the purified enzyme, for example by ethanol precipitation.
Za uvedených podmínek odstraní kyselina polymethakrylová zcela selektivně cizorodé vysokomolekulární příměsi z roztoku, přičemž zůstává enzym zcela nedotčen. Karboxylové polykyseliny, například kyselina polyakrylová nebo polymethakrylová byly již využity pro selektivní izolaci některých bázických antibiotik, například streptomycinu (čs. pat. spis č. 84779), avšak pro selektivní čištění L-asparaginázy nebylo použití těchto látek dosud popsáno ani v patentové ani v odborné literatuře.Under these conditions, polymethacrylic acid completely removes foreign high molecular weight impurities from the solution whilst leaving the enzyme intact. Carboxylic polyacids, such as polyacrylic acid or polymethacrylic acid, have already been used for the selective isolation of some basic antibiotics, such as streptomycin (U.S. Pat. No. 84779), but the use of these compounds has not been described in the patent or expert literature.
190586190586
Po oddělení vysrážených podílů se vyčištěný enzym získá z roztoku v pevné formě buď lyofilizací nebo srážením přídavkem organického, s vodou mísitelného rozpouštědla, nejčastěji ethanolu. Získá se tak jž velmi čistá substance L-asparaginázy, vhodná k finální operací — krystalizaci.After separation of the precipitated fractions, the purified enzyme is recovered from the solution in solid form either by lyophilization or precipitation by addition of an organic, water-miscible solvent, most often ethanol. A very pure L-asparaginase substance is thus obtained, suitable for the final crystallization operation.
Podrobnosti způsobu podle vynálezu vyplývají z následujících příkladů provedení.The details of the process according to the invention follow from the following examples.
Příklad provedeníExemplary embodiment
Příklad 1Example 1
50,0 g izolované surové L-asparaginázy EC-2 o účinnosti 36 lU/mg bílkovin, získané po kultivaci kmene Escherichia coli uvolněním do vodného prostředí z mechanicky desintegrovaných oddělených buněk a vysrážením dvojnásobným objemem ethanolu, se rozpustí ve 350 ml destilované vody. K roztoku se přidá 40 ml 15 % roztoku draselné soli kyseliny polymethakrylové o průměrné molekulové hmotnosti 20 000. Za míchání se upraví pH směsi na hodnotu 4,2 přísadou asi 41 ml 10% kyseliny octové. Po oddělení vysrážených doprovodných vysokomolekulárních látek se z čirého roztoku vysráží enzym 1,5násobným objemem ethanolu, oddělí, promyje ethanolem a vysuší. Výtěžek 8,5 g bílého prášku s účinností 151 lU/mg bílkovin, což odpovídá výtěžku 70 %.Dissolve 50.0 g of isolated crude L-asparaginase EC-2 of 36 IU / mg protein obtained after cultivation of the Escherichia coli strain by release to an aqueous medium from mechanically disintegrated discrete cells and precipitation with a double volume of ethanol and dissolve in 350 ml of distilled water. 40 ml of a 15% strength polymethacrylic acid potassium salt having an average molecular weight of 20,000 are added to the solution. The pH of the mixture is adjusted to 4.2 with stirring by adding about 41 ml of 10% acetic acid. After separation of the precipitated high-molecular-weight accompanying substances, the enzyme is precipitated from the clear solution by 1.5 times the volume of ethanol, separated, washed with ethanol and dried. Yield 8.5 g of white powder with an efficiency of 151 IU / mg protein, corresponding to a yield of 70%.
Příklad 2Example 2
50,0 g surové L-asparaginázy jako v příkladu 1, se rozpustí ve 300 ml destilované vody, přidá se 30 ml 11 % vodného roztoku kyseliny polymethakrylové o průměrné molekulové hmotnosti 15 000. Reakční směs se okyselí kyselinou octovou na pH 4,5. Po oddělení vysrážených průvodních látek se získá enzym lyofilizací čirého supernatantu ve formě bílého prášku s účinností 130 lU/mg bílkovin, což odpovídá výtěžku 75 %.50.0 g of crude L-asparaginase as in Example 1 was dissolved in 300 ml of distilled water, 30 ml of an 11% aqueous solution of polymethacrylic acid having an average molecular weight of 15,000 were added. The reaction mixture was acidified with acetic acid to pH 4.5. After separation of the precipitated concomitants, the enzyme is obtained by lyophilizing the clear supernatant as a white powder with an efficiency of 130 IU / mg protein, corresponding to a yield of 75%.
PŘEDMĚT VYNÁLEZUSUBJECT OF THE INVENTION
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS105876A CS196586B1 (en) | 1976-02-19 | 1976-02-19 | Process for the purification of l-asparaginase with antitumor effect |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS105876A CS196586B1 (en) | 1976-02-19 | 1976-02-19 | Process for the purification of l-asparaginase with antitumor effect |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS196586B1 true CS196586B1 (en) | 1980-03-31 |
Family
ID=5343972
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS105876A CS196586B1 (en) | 1976-02-19 | 1976-02-19 | Process for the purification of l-asparaginase with antitumor effect |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS196586B1 (en) |
-
1976
- 1976-02-19 CS CS105876A patent/CS196586B1/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ståhl et al. | The synthesis of a D-amino acid ester in an organic media with α-chymotrypsin modified by a bio-imprinting procedure | |
| US3389133A (en) | Process for isolating and purifying soluble ribonucleic acid | |
| EP0176068B1 (en) | Process for the preparation of the stereoisomers of 1-amino-alkylphosphonic or 1-amino-alkylphosphinic acids | |
| SU1232148A3 (en) | Method of producing insulin of man | |
| CS196586B1 (en) | Process for the purification of l-asparaginase with antitumor effect | |
| US3652536A (en) | Novenamine compounds and derivatives | |
| US2885433A (en) | O-carbamyl-d-serine | |
| US4035234A (en) | Process for the preparation of the kallikrein-trypsin inhibitor | |
| US4608340A (en) | Immobilized aminoacylase enzyme | |
| PL81272B1 (en) | ||
| US4229571A (en) | Glucocorticoid sparing factor and process for the production of the same | |
| US2481763A (en) | Technique for isolating subtilin | |
| DE2645548C3 (en) | Endonucleases and processes for their preparation | |
| EP0059182B1 (en) | A process for isolating aminoacylase enzyme from a mammal kidney extract | |
| JPH0998779A (en) | Trehalose synthase, method for producing the same, and method for producing trehalose using the same | |
| JPH0482863A (en) | Production of p-nitrobenzyl alcohol malonic monoester | |
| JP3240011B2 (en) | Method for producing L-threo-β-hydroxyamino acid | |
| SU403190A1 (en) | ||
| EP0477647B1 (en) | Enzymatic deacylation of acyl-aminosorboses and its use for the production of 1-desoxynojirimicin | |
| JP3078599B2 (en) | Method for producing L-3,4-dihydroxyphenylserine derivative | |
| JPH0191789A (en) | Production of optically active beta-substituted glutaric acid monoester | |
| JP2886576B2 (en) | Preparation of cyclohexanecarboxylic acid derivatives | |
| SU819118A1 (en) | Method of preparing d-riboloso-1,5-diphosphate | |
| SU487940A1 (en) | Production Method - Amino Acids | |
| JPH06165693A (en) | Production of d-erythro-beta-hydroxyamino acid |