CS196052B1 - Kmen mikroorganismu Corynebacterium glutamicum CCM 3286 - Google Patents

Description

Vynález se týká kmene mikroorganismu Corynebacterium glutamicum CCM 3 286, který je nový a který je charakterizován inhíbicí při růstu v minimálním médiu již nízkými koncentracemi L-threoninu a schopností hromadit v médiu s vhodnými zdroji uhlíku, dusíku a minerálních solí, doplněném kultivační tekutinou po kultivaci producenta L-homoserinu, za aerobních podmínek, při neutrálním pH, v rozmezí teplot 27 až 32 °C vysoká množství L-lysinu.

Do roku 1970 byly nejčastěji používanými mikroorganismy při fermentační výrobě L-lysinu auxotrofní mutanty druhů rodů Corynebacterium a Brevibacterium. Bylo však zjištěno, že vhodnými producenty L-lysinu mohou být i mutanty jiné než auxotrofní. Pracujíce s výchozím kmenem Brevibacterium flavum ATCC 14 067 izolovali Sáno a Shiio /J. gen, appl. Microbiol. 1 7 , 97 , 1 97 1 / mutanty citlivé na threonin, methionin a threonin + + methionin, které v minimálním médiu byly inhibovány nízkými koncentracemi threoninu nebo methioninu. Inhibici. růstu bylo možno potlačit přidáním methioninu nebo threoninu do média. Tyto mutanty hromadily v médiu relativně vysoká množství L-lysinu /30 g/1/.

Schopnost citlivých mutant hromadit vysoká množství L-lysinu není specifická jen pro druh Brevibacterium flavum, ale byla zaznamenána i u druhu Brevibacterium lactofermentum, jak o tom svědci využití citlivých mutant obou těchto druhů pří fermentační přípravě L-lysinu, popsané ve francouzském pat. spise Č. 1 533 688, kde jsou uvedeny mutanty B. flavum a B. lactofermentum, citlivé na threonin nebo mutanty současně na threonin citlivé i dependentftí, produkující v médiu s cukrem v 72. až 120. hodině kultivace L-lysin v množství 10 až 35 g/1.

Produkci výše zmíněných dosud známých kmenů převyšuje kmen, který je předmětem tohoto vynálezu, a to nový kmen mikroorganismu Corynebacterium glutamicum, uložený v Československé sbírce mikroorganismů University J. E. Purkyne v Brně, tř. Obránců míru 10, pod označením CCM 3 286.

Hlavní výhodou nového kmene je zvýšená produkce L-lysinu, přesahující 50 g/1, a to při trojstupňové kultivaci v produkčním médiu se sacharosou, hydrolysátém arašídové mouky a minerálními solemi, doplněném kultivační tekutinou po kultivaci producenta L-horaoserinu /kmen Corynebacterium sp.

366-EMS/329/, ve fermentačním tanku za vhodného míchání a vzdušnění, za udržování pH v rozmezí 6,8 až 7,2 čpavkem a při teplotě 29 °C. Další výhodou nového kmene je snížená spotřeba sacharosy během kultivace. Ve srovnání se standardním sbírkovým kmenem Brevibacterium flavum ATCC 21 127 je spotřeba sacharosy o 25 7 nižší.

Nový kmen mikroorganismu Corynebacterium glutamicum CCM 3 286 je charakterizován následujícími morfologicko-kultivačními a fyziologickými vlastnostmi.

Morf o logicko-kultivační vlas tnosti: grampozitivní, nepohyblivé a nešporulující kokky až krátké tyčinky o velikosti 1,6 x 1,9 až 35 um, s metachrornát ickými granuly, vyskytující se jednotlivě, v párech i v nepravidelných shlucích.

Na masopeptonovém agaru tvoří okrouhlé, hladké, lesklé, krémově bílé kolonie, s rov196052 nými okraji. Na masopeptonovéra šikmém agaru vytváří intenzívni bílý nárůst po celém povrchu agaru, k pigmentaci nedochází.

Při růstu v bujónu lze zaznamenat zákal a sediment, blanka se netvoří.

Na krevním agaru tvoří kulaté, hladké, šedé kolonie s rovnými okraji, nehemolyzuj i cí.

Fyziologické vlastnosti:

Optimální teplota: 27 až 32 °C.

Optimální pH: 7,0 až 7,2.

Termorezistence: 56 °C 1 hod., °C 10 min.

Aerobní mikroorganismus.

Želatinu neztekucuje.

Lakmusové mléko odbarvuje, ale nesráží.

Glukosu, fruktosu a sacharosu zkvašuje. škrob hydrolyzuje jen slabě.

Celulosu nerozkládá.

Dusičnany neredukuje.

Sirovodík netvoří.

Indol netvoří.

Test na katalázu: pozitivní.

Test na methylenovou modř: negativní.

Voges-Proskauerův test: negativní.

K růstu vyžaduje nový kmen biotin. Methionin jen růst stimuluje. Produkci L-lysinu stimuluje homoserin.

Nový kmen byl indukován z výchozího prototrofního kmene Corynebacterium glutaminum, a to 18hodinovým působením 0,05 M roztoku ethylmethansulfonátu ve fosfátovém pufru /pH 7,2/ na 24 hodin starou promytou buněčnou suspenzi výchozího kmene a vyočkováním promyté suspenze po aplikaci mutagenu na plotny s minimálním médiem s přídavkem a bez přídavku 500 ^ug L-threoninu/ml. Kolonie vyrostlé po 48 až 72 hodinách inkubace při 28 °C na plotnách bez threoninu, ne však na plotnách s threoninem, byly vyočkovány na šikmé masopeptonové agary a kultury vyrostlé na Šikmých agarech, po ověření citlivosti na threonin, byly testovány na schopnost produkovat L-lysin.

Způsob fermentační výroby L-lysinu s použitím nového kmene je pro ilustraci popsán v následujícím příkladu provedení.

Příklad provedení

Kulturou kmene Corynebacterium glutamicum CCM 3 286, 24 hod. starou, vyrostlou na masopeptonovém Šikmém agaru, se očkuje 60 ml inokulačního média v 750 ml Erlenmayerově baňce, jež má toto složení /v g/:

glukosa kukuřičný výluh /65 % sušiny/ voda

20,0

15,0

000 ml pH 7,0, sterilizace 30 min při 120 °C. Po zaoČkování se inkubuje na reciproké třepačce /91 kyvů/min, délka kyvu 9 cm/ 24 hodin při 28 °C. Získaným inokulem se v množství 6,25 7» obj. očkují dvoulitrové fermentační tanky, plněné 800 ml média tohoto složení /v g/ :

sacharosa 50,0 kukuřičný výluh /65 % sušiny/ 15,0 voda 1 000 ml pH 6,8 až 7,0; sterilizace při 122 kPa 3x po 30 min. Médium se míchá 750 až 780 obratek/min a vzdušní 0,5 1/min/obj. média. Teplota 29 °C, délka kultivace 18 hod. Inokulem z očkovacího tanku v množství 6,25 % obj. se očkuje 800 ml produkčního média ve dvoulitrovém ferméntačním tanku, jež má toto složení /v g/:

sacharosa 200,0 kyselý hydrolyzát arašídové mouky 165,0 prim. fosforečnan draselný 2,0 síran hořečnatý kryst. 0,5 uhličitan vápenatý 20,0 kultivační tekutina kmene

Corynebacterium sp.

366 EMS/329 120,0 ml kyselina citrónová 5,0 biotin 1,0

L-methionin 20,0 voda 1 000 ml pH 7,0, sterilizace při 122 kPa 3x po 30 minutách. Míchání 710 až 750 obr./min, vzdušnění 0,8 1/min/obj. média. Teplota 29 °C. Odpěňování během kultivace sójovým olejem. pH se upravuje v šestihodinových intervalech čpavkem na 7,0. Během kultivace se přidává 70% roztok sacharosy, a to po 50 ml v 18., 30. a 42. hodině kultivace. Délka kultivace 96 hod. Obsah L-lysinu se stanovuje manometricky s použitím dekarboxylázy lysinu. Produkce v 96. hodině je 53 g/1.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT

   VYNÁLEZU

   Kmen mikroorganismu Corynebacterium glutamicum CCM 3 286, citlivý na L-threonin a produkující L-lysin.