CN86108331A

CN86108331A - 标记蛋白质的放射性卤化小分子

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Publication number: CN86108331A
Application number: CN198686108331A
Authority: CN
Inventors: 丹尼尔·斯科特·威尔伯; 艾伦·理查德·弗里茨伯格; 戴维·舒斯特·琼斯
Original assignee: Poniard Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Poniard Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1986-04-21
Filing date: 1986-12-03
Publication date: 1987-11-04
Also published as: JPH09208507A; JPH09194406A; JPS62277331A; JPH08143490A

Abstract

标记蛋白质的放射性卤化小分子，其化学式为 *X-Ar-R，其中*X是放射性卤素，Ar是芳环或是芳香杂环，R是短链取代基，该取代基在保存蛋白质生物活性的适度条件例如酰化作用下，为不高度活化Ar环，在Ar环上放射性卤素*X被取代，并是适合于与蛋白质结合的官能团。化学式的化合物可连接到蛋白质上，例如单克隆抗体或血浆蛋白质(或者连接到载体，例如氨基酸聚合物，它又可连接到蛋白质)，为诊断和治疗应用提供了试剂。

Description

本发明涉及标记蛋白质，尤其是抗体的放射性囟化小分子，用于临床诊断和治疗，以及涉及把高比活放射性卤素引进蛋白质分子。

放射性卤化蛋白质是广泛的科学研究的课题，并有可能作为在试管内和体内的各种各样的临床应用。例如，放射性碘标记的铁蛋白用在试管中诊断测定血清内铁蛋白浓度。放射性碘标记的甲状腺刺激激素应用于类似的测定。

卤素的放射性核素具有的一些特性，使它们对诊断图象和放射性治疗很有吸引力。例如，放射性碘中，碘-123（半衰期＝13小时，159千电子伏γ，电子俘获）对于用现时的γ照相机摄象几乎是理想的，碘-131（半衰期＝8天，364千电子伏γ，β粒子）在产生较低射线透度的图象时，已证明在甲状腺的临床放射性治疗中是有用的。同样地，溴放射性核素中例如溴-75（半衰期＝1.6小时，阳电子）和溴-76（半衰期＝16小时，阳电子）具有一些特性，使它们对阳电子X线体层照相法摄象具有吸引力，溴-77（半衰期＝2.4天，一些γ，电子俘获）具有一些特性，使它对放射性治疗具有吸引力。其它放射性囟素，如氟-18（半衰期＝110分钟，阳电子）和砹-211（半衰期＝7.2小时，α电子）对于放射性摄象及放射性治疗也是具有吸引力的选择物。

集中在癌组织的单克隆抗体的生长，由于这些抗体对肿瘤细胞表面抗原的高度专一性和亲和力，增加了放射性标记抗体对诊断和/或治疗的临床应用的希望。抗体的高度专一性使它们成为理想的选择物，作为载体分子加上有效的放射性核素，把放射性传送到癌部位。

遗憾的是，目前还没有常规的用于体内的放射性卤素标记抗体的临床诊断或治疗应用。业已证明抗体和其它蛋白质的直接放射性卤素标记是困难的。抗体对放射性标记反应条件显示出不同的敏感性，以及放射性卤化作用所必要的氧化反应条件是特别有害的。蛋白质的直接放射性碘化作用已成常规，但常常发生蛋白质生物活性的适度还原，附加的放射性标记的稳定性也会变化。例如，已发现抗体的放射性碘损失，对于某些标记抗体，在24小时内竟高达50%。放射性溴化比放射性碘化需要更强的氧化反应条件，如果得到作为氧化剂的酶并不贵和不难，则试图直接放性溴化蛋白质正已略有成效。此外，蛋白质的直接放射性卤化基本上发生在酪氨酰残余物，酪氨酸的活化酚环增加了邻位取代放射性卤素标记生成物的内在电子不稳定性，放射性卤素标记也蒙受空间位阻影响，并且还得到脱碘酶，该脱碘酶分解结构上类似的甲状腺激素，例如甲状腺素。

为直接放射性卤化所需要的防止发生蛋白质受到苛刻反应条件的一种方法是使用小分子，该小分子可以在分离反应器中被放射性标记，随后在适度的反应条件下连接到蛋白质。这种方法是市场上可买到的鲍尔顿-亨特试剂，N-琥珀酰亚胺基-3-（4-羟苯基）丙酸酯的依据，因此，用放射性碘得到适度的放射性标记产品（35～60%标记蛋白质的产量），但是放射性碘标记的稳定性遇到上述化学上类似的放射性碘化酪氨酰残余物的相同问题。同样地，市场上可买到的伍德试剂、（甲基-4-羟基苯甲亚胺酸盐（hydroxy benzimidate），在接合到蛋白质之前可以放射性碘化。然而，放射性碘化产品也受邻-碘化酚的内在不稳定性影响，即使这些试剂不产生所要求的稳定放射性标记，固为蛋白质的少量减话化起固于它们的应用，故这些诚剂已广泛用作放射性碘化。

为把高比活性放射性碘引入这些分子，需要话化芳环，固此酚环用于鲍尔顿-亨特和伍德试剂。最理想的是能够把放射性囟素引入小分子，该小分子含有不同于酚的芳环，以致更稳定地接合放射性标记。此外，如果羟基不存在，放射性标记就较少受到电子和空间位阻的影响。

文献中最近报导叙述了他机金属中间体的用途，把高比活性放射性卤素引入简单有机分子的非活化芳环，而不引入较复杂的有机分子，这些分子可以连接到蛋白质上，并无上述缺点。

本发明提供一种快速而有效的方法，即在保存蛋白质生物活性的条件下，把高比活性卤素放射性核素引入接合到蛋白质的小分子的非活化芳环。放射性卤素在非活化芳环上的取代，提供了一种比现有技术在活化芳环如酚上的取代具有更稳定的放射性标记蛋白质。此外，为了使放射性标记较少受脱碘酶反应，可以在不含羟基官能度的芳环上对位或间位取代放射性卤素。

按照本方法，卤芳基化合物用下列有机金属基团之一使之金属化，所述基团为Sn（n-Bu）₃或SnMe₃。生成的芳基锡化合物可以用下列有机金属基团之一，在特定位置反应中金属转移，所述基团为HgX₂，Hg（oAc）₂，Bx₃或BZ₃，其中X是Cl、Br或I，Z是烷基或烷氧基。随后，金属化化合物通过脱金属反应而放射性卤化，可以添加适合于与蛋白质结合的官能团或者在放射性卤化前进行添加。

还提供了化学式R₁-Ar-R₂的化合物，其中R₁或是放射性卤素或是上述有机金属基团之任一种，Ar是芳环或芳香杂环，R₂是短链取代基，该取代基在保存蛋白质生物活性的条件下，为不高度活化芳环，并是适合于与蛋白质结合的官能团。本发明的放射性卤化小分子可与蛋白质，例如用于诊断和治疗的单克隆抗体结合。

图1、2、3和4表示相应的生物分布数据图。如实例14所述，根据本公开加强放射性标记单克隆抗体内的稳定性。

本发明目的在于放射性卤化化学式Ⅰ的小分子

＊X-Ar-R （Ⅰ）

其中：＊X是放射性卤素，Ar是芳环或是芳香杂环，R是短链取代基，该取代基在保存蛋白质生物活性的适度条件例如酰化作下，为不高度活化Ar环，在Ar环上放射性卤素＊X被取代，并是适合于与蛋白质结合的官能团。化学式Ⅰ化合物可连接到蛋白质上，例如单克隆抗体或血浆蛋白质（或者连接到载体，例如氨基酸聚合物，它又可连接到蛋白质），为诊断和治疗应用提供了试剂。

如本文所用的，符号＊X表示碘的任一种放射性同位素，特别是I-123、I-125和I-131;溴，特别是Br-75、Br-76和Br-77;氟，特别是F-18;以及砹，特别是At-211。为诊断图象用的优先放射性卤素＊X包括I-131以及γ照相机摄象的最佳是I-123;以及用于阳电子X线体层摄象：F-18、Br-75和Br-76。用于临床放射性治疗，优先的放射性卤素＊X包括I-131、Br-77和At-221。用于试管内放射性免疫测定的优先放射性卤素＊X包括I-125和I-131。根据本发明，为了使放射性卤素较少受到脱卤酶的分解影响，相对于取代基R，放射性卤素＊X最好在Ar环的对位或间位。

符号Ar表示任一芳环或芳香杂环。优先的Ar环包括苯、吡啶、呋喃和噻吩，后三种环由于增加水溶性而转移。放射性卤素接合到Ar环碳原子好于接合到烷基碳原子，这归因于在芳环或芳香杂环中增加了碳-卤键的结合强度。Ar环的特征不是临界状态的，可以是单环双环、三环或更高数目的环，但是单环是最佳的，因为增加了水溶性。Ar环可由全部碳原子构成，或者可含有杂原子，例如氮、氧或硫。芳香杂环的夹杂原子，例如氮、氧或硫。芳香杂环的夹杂物例如吡啶、呋喃或噻吩可以促进增加放射性碘化小分子轭合物的水溶性。除了＊X和R，Ar环上另外的取代物用极性取代基，例如亚硝酸、磺酸、羧酸或二烷基氨基，也可用来增加水溶性。增加水溶性理想的是在与蛋白质共轭反应中得到较高的产量（和较少的可能聚集物），以及引起抗体轭合物亲油性的较少干扰。添加别的取代基颇能控制酶催降解作用。

符号R表示符合列三个条件的任一取代基：第一，R取代基对于亲电子的取代作用为不应高度活化Ar环。换言之，R不可通过键合连接Ar环，因为键合增加Ar环的电子密度相当于由游离羟基或伯氨基取代产生的量。第二，R应是短链取代基，以便非共轭的或分解的放射性卤化小分子可以快速地通过肾排出。因此，R在芳基键和蛋白质共轭的官能团之间可含有一个烷基或别的间隔基链，但如此间隔基链应含不多于5个直链碳原子为好，而最好不多于3个直链碳原子。第三，R取代基在适度的共轭条件例如酰化或酰胺化下，应支承可以加以共轭蛋白质以及保存蛋白质生物活性的官能团。于是，R提供一种官能团（这里称作Q），例如酰亚胺酯或亚氨酸酯，用于共价接合到在氨基酸或蛋白质的碳水化合物残余物、糖蛋白或载体分子例如氨基酸聚合物上相应的官能团（或共轭连接部位），氨基酸聚合物又可共轭蛋白质分子。

用于上述目的的适宜官能团Q包括酚酯（例如对一硝基苯酚）、酰亚胺酯类（例如琥珀酸亚胺酯）、亚氨酸酯、酐类、酰基琥珀酸亚胺酯类、醛类、异硫氰酸盐类、硫羟、重氮基、胺类、肼类、烷基卤化物类、迈克尔接受体α，β-不饱和羰基化合物例如马来酰亚胺类，以及其它可用来把分子通过共价键连接到蛋白质的基团。同时提供的是化学式Ⅰ的放射性卤化小分子，其中R取代基支承官能团Q的前体。适宜的前体包括：羧酸，其中Q是酚酯、酰亚胺酯、酐、酰基琥珀酸亚胺或马来酰亚胺;腈，其中Q是氨酸酯;醇，其中Q是乙醛;卤化物，其中Q是异硫氰酸盐、硫、硫羟、肼或胺;以及胺，其中Q是重氮基或马来酰亚胺。

典型的R取代基包括酰亚胺酯、烷基酰亚胺酯类、酰氨基烷基亚胺酯类、亚氨酸酯、烷基亚氨酸酯类、及酰氨基烷基亚氨酸酯。

本发明典型的放射性卤化小分子包括化学式Ⅱ和Ⅲ的化合物：

其中：＊X是上述的放射性卤素，n是整数，以及Q是上述的官能团。放射性卤素在芳环Ar上可配作任意的异构体。为了使放射性卤素较少受到空间不稳定性以及由于脱碘酶分解作用的影响，对位或间位取代为最佳。间隔基组分（CH₂）n可以是直链或支链烷基，或是含直至12而最好不多于5个直链碳原子杂烷基。在最佳实施例中，不多于3个直链碳原子，使官能团Q与芳环分开;即n＝0、1、2或3。为了快速弄清楚诊断图象的天然本底放射性强度，以及用最小剂量来照射活体器官，烷基间隔基组分应减少，以使非共轭化合物以及化学上或酶分解的放射性卤化化合物通过肾就可以迅速弄清楚，而不通过心或肝的脂肪酸降解途径。另一方面，应用放射性标记芳基环和蛋白质之间的短烷基或杂烷基肯定是合乎理想的。

本发明的放射性卤化小分子的说明但非限制的实例包括：N-琥珀酰亚胺基3-（4′-〔¹³¹I〕碘苯基）-丙酸酯;甲基3-（4′-〔¹³¹I〕碘苯基）丙酯基亚氨酸;N-琥珀酰亚胺基4-〔¹³¹I〕碘苯甲酸酯;甲基4-〔¹³¹I〕碘苯甲亚胺酸盐（iodobenzimidate）N-琥珀酰亚胺基4-〔¹³¹I〕碘苯甲酰氨基乙酸酯或N-琥珀酰亚胺基4-〔¹³¹I〕碘马尿酸酯;甲基4-〔¹³¹I〕碘苯甲酰氨基乙亚胺酸盐（acetimidate）;以及4-〔¹³¹I〕碘苯甲酰氨基乙酰腈。

本发明提供化学式Ⅳ的有机金属中间体分子：

M-Ar-R （Ⅳ）

其中：M是Sn（n-Bu）₃（Bu是丁基）、SnMe₃（Me是甲基）、HgX（X是Cl、Br或I）、HgOAc（OAc是乙酸、B（OH）₂或BZ₂（Z是含有不多于5个，最好含更少碳原子的烷基或烷氧基），Ar和R都根据化学式Ⅰ所定义。有机金属基M最好是对位或间位。本发明有机金属中间体分子非限制的说明例包括：N-琥珀酰亚胺基3-（4′-三丁基甲锡烷基苯基）丙酸酯;甲基3-（4′-丁基甲锡烷基苯基）丙酯基亚氨酸;N-琥珀酰亚胺基4-三丁基甲锡烷基苯甲酸酯;甲基4-三丁基甲锡烷基苯甲亚胺酸盐;N-琥珀酰亚胺基4-三丁基甲锡烷基苯甲酰氨基乙酸酯或N-琥珀酰亚胺基4-三丁基甲锡烷基马尿酸酯;甲基4-三丁基甲锡烷基苯甲酰氨基乙亚胺酸盐;以及4-三丁基甲锡烷基苯甲酰氨基乙酰腈。

提供一种合成化学式1化合物的方法，概括地说，下述三种反应之一可以用来金属化支承官能团Q或其前体的卤芳族衍生物任意位置上的异构体。该金属化可使用三烷基锡试剂，例如Sn（n-Bu）₃或SnMe₃。生成的芳基锡化合物可以金属转移到与下列有机汞或有或有机硼试剂之一一起在有效位置反应中。这些试剂为：HgX₂、Hg（OAc）₂、BX₃或BZ₃，其中X是Br、I或最好是Cl，Z烷基或烷氧基。生成的有机金属中间体可选择下述金属化反应制取。甲锡烷基化或其它金属化反应制取。甲锡烷基化或其它金属化化合物通过脱金属化反应，最好在出现官能团Q之后，进行放射性囟化。

所述有机金属试剂可通过已知化学方法得到，并且在市场上可买到，例如从Alpha Products Danvers，MA。

化学式Ⅳ的有机金属中间体分子的前体可通过已知化学方法得到或在市场上买到。适宜的前体分子包括：对-溴代和对-碘苯甲酸（Pfaltz and Bauer，Stamford，Conn.）;对-溴代和对-碘苄腈（Pfaltz and Bauer）。在下面实施例1叙述了合成高产量对-溴苯丙酸的方法。按J.Org.Chem 41（7）：1187～1191页，1976年所述可以完成酸向相应腈的转化。

可从通过下述三种显然不同的反应之任一种进行芳基锡烷的合成，在第一种反应中，卤芳族化合物与正-丁基锂在接近-100℃下反应，或与镁在室温下反应，随后，芳基金属与三烷基锡试剂的卤化物衍生物，最好是与三-正-丁基锡反应。在第二种反应中，卤芳族化合物与六烷基二锡和四个（三苯膦）钯反应。在第三种反应中，卤芳族化合物与三烷基甲锡烷基碱（例如三甲基甲锡烷基钠）在0℃条件下在四甘醇二甲醚中进行反应。

通过以前叙述的方法（Orgonometallic Chem.Rev.1：305～329页，1966年;Tetrahedron 38（12）：1713～1754页，1982年）或者最好通过上述芳基锡烷的金属转移，进行有机汞和有机硼中间体的合成。芳基锡化合物与所述有机汞基或有机硼基之一的金属转移可以达到在芳环上有效位置的取代。例如与BCl₃的金属转移，产生相应的芳基-BCl₂化合物，然后该化合物可以是转化成相应芳基-B（OH）₂化合物的碱。与Hg（OAc）₂的反应产生相应的芳基-HgOAc化合物，该化合物可以经过与囟化物离子（X）反应，进一步转化成芳基HgX。

把尚待放射性标记化合物连接到蛋白质要求官能团Q的有效性，例如可通过羰化物前体基转化成含有适当离去基的酯如羟基琥珀酸亚胺酯，或者通过氰基前体转化成亚氨酸酯而提供。这种转化可认为是在蛋白质上活化与相应官能团反应的分子，例如氨基（如赖氨酸残余物），硫羟或羟基（或不太可取的羰化物）。由于碱金属中间体的亲核性，当使用这些试剂时，活化的酰亚胺酯和亚氨酸酯或其它对上述官能团Q敏感的亲核试剂只可在三烷基锡官能度引到芳环以后合成。因此我们已发现第二种芳基锡烷合成反应尤其可用于制备对亲核反应敏感的化合物。在引入放射性卤素之前，使活化的酰亚胺酯和亚氨酸酯或其它官能团Q避免放射化学产品的损失，以及避免混合另外生成的放射化学杂质。

在放射性卤化步骤以前，用无水四氢呋喃（THF）的双环己基碳化二亚胺（DCC）和N-羟基琥珀酸亚胺（NHS），可以完成芳基锡或另外金属化衍生物从游离羧酸或其甲锡烷基酯类转化到N-琥珀酸亚胺基酯类。然而，藉芳基金属键，尤其是芳基锡键的酸不稳定性，从氰基化合物合成亚氨酸酯是有问题的。因此，在亚氨酸酯生成之前，可以放射性卤化含氰基化合物。最佳方法是用六烷基二锡和四个（三苯膦）钯（用第二种芳基锡烷合成方法）形成相应的囟苄腈或囟芳基烷基腈的亚氨酸酯，接着金属化含亚氨酸化合物。

通过有效位置的脱金属反应，相应的N-羟基琥珀酸亚胺基酯类的放射性卤化会产生所要求的化合物。由于水解N-琥珀酸亚胺基酯类的可能性，因此利用反应时间趋于最小值的条件可以进行该反应。例如藉缩短反应时间以便水解作用减至最小，反应物可在室温下进行。换言之，可以利用水解作用相对缓慢的反应混合物。意想不到的是乙酸加入到反应混合物，大大地放慢了N-琥珀酸亚胺基酯的水解。例如，已发现4-三-正-丁基甲锡烷基-苯甲酸酯的N-琥珀酸亚胺基酯在5%乙酸/甲醇溶液中经过数目还是稳定的，有利于排除短时间的制约，例如经常与鲍尔顿-亨特方法中要求时间短的限制的矛质就可被排除。

放射性卤化反应混合物应具有稀的硫代硫酸钠溶液，该溶液在任何纯化或污染处理之前加入。在放射性标记蛋白质的纯化之前或纯化期间，通过层析法分离，可容易地完成剩余放射性囟化物的分离。

放射性卤化反应最好在质子溶剂，例如在水、甲醇、乙醇，或其混合物中进行。乙醇溶剂通常在放射性化合物加到蛋白质溶液（或反之亦然）之前可以去除。另一方面，由于两相系统可提供一种从标记化合物分离游离放射性卤化物的简便方法，因此非质子溶剂（例如四氯化碳）可用于放射性卤性。

放射性卤化可通过放射高效液相色谱法进行监测和纯化，例如，在反相高效液相色谱层析柱（C-18）上，用MeOH/1%HOAc的水混合物洗提。

同时提供了用于临床的放射性药物仪器，包括含有化合物Ⅳ的管瓶，该化合物具有与适当试剂一道的适当的官能团Q，以致引入放射性囟素会得到所要求的放射性卤化分子，然后放射性卤化产品可共轭蛋白质，例如具有分离小瓶的单克隆抗体。所述仪器还包括一个或更多的用于剩余前体和来自放射性卤化蛋白质产品杂质的小层析柱。

由下列实施例进一步说明本发明。

实施例1

3-（4′-溴苯基）丙酸的合成

在氮气气氛下，使烧瓶装有溶于无水四氢呋喃（THF）的10.0克2，4，4-三甲基-2-噁唑啉（88毫摩尔），在-78℃（干冰/丙酮浴）经过10分钟达到平衡。缓慢地向烧瓶加入55毫升正-丁基锂（1.6，85毫摩尔）。然后，在氮气气氛及-78℃下，.把浅黄色溶液转送到第二个烧瓶，瓶中装有含29.4克（100毫摩尔）4-溴苄基溴化物的200毫升无水四氢呋喃。加料结束，即在-78℃下搅拌该反应混合物20分钟，然后移去冷却浴，继续搅拌3小时。

谨慎地加入200毫升饱和NHCl，并且分离两相。四氢呋喃层在无水MgSO₄上干燥，蒸发而得到油。该油溶于200毫升二甲氧基乙烷和100毫升3当量浓度HCl，加热5小时到回流，生成的溶液注到冰上，得到浅褐色固体（产量：17克）。

这种固体溶于大约300毫升15%KOH，用200毫升二乙醚萃取，该KOH溶液用冰进行稀释，并用浓盐酸酸化，得到白色沉淀物用水充分洗涤（产量：10克）。

实施例2

4-三-正丁基甲锡烷基苄腈的合成

在氮气气氛下，使烧瓶装有溶于新鲜蒸馏过的无水四氢呋喃的1当量（例如10毫摩尔）4-溴苄腈，在大约-100℃（二乙醚/液氮浴）经过约30分钟达到平衡。然后加入1.1当量（例如11毫摩尔）正-丁基溶液（2.3摩尔溶于己烷），以这样的比例使反应温度保持低于-90℃。加料结束后，反应混合物在大约-100℃时再搅拌5分钟。

然后滴入含有1.1当量（例如11毫摩尔）三-正-丁基氯化物的无水四氢呋喃溶液。如前所述，以这样的比例加料，使反应温度保持在-90℃以下。加料结束后，反应混合物在大约-100℃搅拌30分钟，然后移去冷却浴，两个多小时可使反应混合物达到室温。

用旋转式蒸发除去四氢呋喃，得到乳状油，该油溶于CH₂Cl₂，用水洗涤后在MgSO₄上干燥，蒸发CH₂Cl₂得到96%稀薄黄色油，在132℃/100微米蒸馏纯化这种油，得到一种纯度85%的无色油，通过高效液相色谱法分析：¹H核磁共振（CDCl₃）δ0.68～2.0（m，27H），7.68（S，4H）。

实施例3

三-正-丁基甲锡烷基4-（三-正-丁基甲锡烷基）苯甲酸酯的合成

方法1：在备有温度计、辅助漏斗和磁性搅拌棒的烧瓶内，对冷却到-100℃（二乙醚/液氮）的2.01克（10毫摩尔）4-溴苯甲酸（α产品）容于100毫升无水四氢呋喃的溶液滴入13.5毫升（21毫摩尔）含有1.55当量正-丁基锂的己烷（Aldrich），以这样的比例，使瓶内温度不超过-90℃。该粘性混合物可升温到-78℃，并且添加5.70毫升（6.83克，21毫摩尔）正-三丁基锡氯化物（Aldrich）超过15分钟。当加料结束，使混合物达到室温并搅拌1小时，然后，把150毫升（NH₄）₂SO₄饱和溶液加到该混合物中，并用150毫升二乙醚进行萃取。用盐水洗涤上层溶液后用MgSO₄干燥，经过滤和浓缩，得到7.49克液体。用硅胶层析（25%EtOAc/己烷）法纯化，得到2.32克（33%）如粘油的三-正-丁基甲锡烷基4-（三-正-丁基甲锡烷基）苯甲酸酯：¹H核磁共振（CCl₄）δ0.32～2.70（m，54H），7.50（d，J＝7赫兹，2H），7.99（d，J＝7赫兹，2H），IR（neat）1635，1450，1315/厘米。

方法2：在氮气气氛下，对1.00克（5毫摩尔）4-溴苯甲酸（α）溶于7.6毫升六丁基二锡（Alfa）和10毫升甲苯的搅拌悬浮液加入58毫克四个（三苯膦）钯（O）（Aldrich），该混合物在95℃下搅拌20小时。当冷却时，有机混合物在100毫升100%KF水溶液和100毫升二乙醚之间分配，用盐水洗涤乙醚层，用MgSO₄干燥，经过滤和浓缩，通过球形冷凝管蒸馏得到1.14克（33%）如粘油的三-正-丁基甲锡烷基4-（三正-丁基甲锡烷基）苯甲酸酯：在200～250℃，0.25毫米汞柱下蒸馏。

实施例4

N-琥珀酰亚胺基4-（三-正-丁基甲锡烷基）苯甲酸酯的合成

对1.29克（1.84毫摩尔）3-正-丁基甲锡烷基4-（三-正-丁基甲锡烷基）苯甲酸酯溶于18.4毫升无水四氢呋喃的溶液加入-417毫克（2.02毫摩尔）双环己基碳化二亚胺（Sigma）和212毫克（1.84毫摩尔）N-羟基琥珀酸亚胺（Sigma），该混合物在室温下搅拌15小时，然后，对该混合物加入三滴HOAc。过滤除去固体，并浓缩该混合物。用硅胶层析法（25%EtOAc/己烷）纯化得到731毫克（78%）N-琥珀酰亚胺基4-（三-正-丁基甲锡烷基）苯甲酸酯：¹H核磁共振（CDCl₃）δ0.50～2.20（m，27H），2.90（S，4H），7.5（d，J＝8赫兹，2H），8.06（d，J＝8赫兹，2H）。IR（neat）1780，1750，1190，1055，980/厘米。

实施例5

4-（三-正-丁基甲锡烷基）马尿酸的合成

对406毫克（0.80毫摩）N-琥珀酰亚胺基4-（三-丁基甲锡烷基）苯甲酸酯溶于6.4毫升CH CN的溶液加入224微升（160毫克，1.60毫摩尔）Et N（Fisher），接着加入60毫克（0.80毫摩尔）甘氨酸（Fisher）溶丁1.6毫升的水溶液。该混合物在室温下搅拌1小时，然后在10毫升5%盐酸水溶液和10毫升Et₂O之间分配。用盐水洗涤Et₂O层，用MgSO₄\干燥，经过滤和浓缩，得到374毫克（100%）4-（三-正-丁基甲锡烷基）马尿酸，足以进一步反应的粘性油纯度：¹H核磁共振（CDCl₃）δ0.40～2.50（m，27H），3.94～4，53（m，2H），6.70～7.25（m，1H），7.53（d，J＝8赫兹，2H），9.00～9.65（brd S，1H）。IR（neat）具有较强吸收率 \\3330，1720，1635，1535/厘米的3600～2300宽谱带。

实施例6

N-琥珀酰亚胺基4-（三-正-丁基甲锡烷基）马尿酸盐的合成

对378毫克（0.80毫摩尔）4-（三-正-丁基甲锡烷基）马尿酸溶于8毫升四氢呋喃的溶液加入182毫克双环己基碳化二亚胺（Sigma）随后加入92毫克N-羟基琥珀亚胺（Sigma）。该混合物在室温下搅拌6小时，然后加入3滴乙酸。过滤该混合物，将滤液浓缩到油性固体，用硅胶（50%EtOAc/己烷）层析法纯化得到158毫克（35%）白色固体的纯N-琥珀酰亚胺基4-（三-正-丁基甲锡烷基）马尿酸盐：熔点109～111℃（EtOAc/己烷）;¹H核磁共振（CDCl₃）δ0.33～2.27（m，27H），2.85（s，4H），4.66（d，J＝6赫兹，2H），7.02（t，J＝6赫兹，1H），7.63（d，J＝8赫兹，2H），7.89（d，J＝8赫兹，2H）。

实施例7

三-正-丁基甲锡烷基3-（4′-三-正-丁基甲锡烷基苯基）丙酸盐的合成

将2.29克（10毫摩尔）3-（4′-溴苯基）丙酸的125毫升四氢呋喃和25毫升己烷的溶液（烧瓶装有氮气入口管、辅助漏斗和温度计，在氮气气氛下），冷却到-100℃（二乙醚/液氮）。对该溶液滴入1.35毫升（21毫摩尔）1.55摩尔含丁基锂的己烷（Aldrich）溶液，以这样的比例在溶液的温度不超过-90℃。使生成的粘性物料在半个多小时升温到-75℃，并以1分多钟滴入5.70毫升正-三丁基锡氯化物（Aldrich）。然后，该混合物又变成液体，在-75℃搅拌30分钟后移去冷却浴，继续搅拌该混合物直至达到室温。把100毫升饱和（NH₄）₂SO₄溶液加到流混合物中，在分液漏斗内的摇动后，上层液体依次用100毫升10%KF溶液，50毫升盐水洗涤，用MgSO₄干燥，经过滤和浓缩，得到7.5克蜡状固体。1.00克这种物料从水/丙酮的两次再结晶产生405毫克（42%）白色粉末的三-正-丁基甲锡烷基3-（4′-三-正-丁基甲锡烷基苯基）丙酸盐：熔点59～60℃;¹H核磁共振（CDCl₃）δ0.50～2.34（m，54H），2.75（m，4H），7.23（d，J＝8赫兹，2H），7.45（d，J＝8赫兹，2H）;IR（溶解）1695，1530/厘米。

实施例8

N-琥珀酰亚胺基3-（4′-三-正-丁基甲锡烷基苯基）丙酸酯的合成

对460毫克（0.63毫摩尔）三-正-丁基甲锡烷基3-（4′-三-正-丁基甲锡烷基苯基）丙酸酯溶于6.5毫升无水四氢呋喃的溶液加入143毫克（0.69毫摩尔）双环己基碳化二亚胺（Sigma），接着加入73毫克（0.63毫摩尔）N-羟基琥珀酸亚胺（Sigma），搅拌该混合物24小时，并加入37微升（38毫克，0.63毫摩尔）乙酸。该混合物过滤和浓缩，用硅胶层析法（EtOAc/己烷）纯化，得到大约195毫克（58%）粘性油的N-琥珀酰亚胺基3-4′-三-正-丁基甲锡烷基苯基）丙酸酯：¹H核磁共振（CDCl₃）δ0.38～2.15（m，27H），2.53～3.32（m，8H），7.20（d，J＝8赫兹，2H），7.38（d，J＝8赫兹，2H）;IR（neat）1820.1790，1740，1185，1045/厘米。

实施例9

甲基4-溴苯甲亚胺酸盐（bormobenzimidate）的合成

使Hcl气体通过7.2克（40毫摩尔）4-溴苄腈（Pfaltz和Bauer）溶于20毫升甲醇的悬浮液，直至所有固体进入溶液。该混合物放入冰箱内，在4℃下经过90小时，形成甲基4-溴苯甲亚胺酸盐（bromobenzimidate）盐酸盐的长形针状结晶体。通过真空过滤收集该盐，得到8.17克（81%）长形白色针状结晶体，并在50毫升10%冰冻的Na₂CO₃溶液和50毫升二乙醚之间分配1.33克盐酸盐而转化成碱。二乙醚层用50毫升盐水洗涤，用MgSO₄干燥，经过滤和浓缩，并用己烷再结晶，得到0.83克（60%总产量）针状纯甲基4-溴苯甲亚胺酸盐：熔点64～65℃;¹H核磁共振（CDCl₃）3.91（S，3H），7.60（S，4H），7.53～7.90（brd，1H）。

实施例10

甲基4-（三-正-丁基甲锡烷基）苯甲亚胺酸盐的合成

在氮气气氛下，对214毫克（1.0毫摩尔）甲基4-溴苯甲亚胺酸盐溶于2毫升甲苯的溶液加入1.52毫升（1.74克30毫摩尔）六丁基二（Alfa），随后加入11毫克（0.01毫摩尔）四个（三苯膦）钯（O）（Aldrich）。该混合物在油浴中，75～80℃下加热18小时，当冷却时，该混合物分配在10毫升10%KF水溶液和10毫升二乙醚中。用MgSO₄干燥乙醚层，再经过滤和浓缩，通过硅胶层析法（25%EtOAc/己烷）纯化油性浓缩物，得到226毫克（53%）粘性油的纯甲基4-（三-正-丁基甲锡烷基）苯甲亚胺酸盐：¹H核磁共振（CCl₄）δ0.54～2.18（m，27H），3.87（S，3H），7.45（d，J＝8赫兹，2H），7.67（d，J＝8赫兹，2H）;IR（neat）3340，1635/厘米。

实施例11

4-（3′-丙酸）苯基溴化汞的合成

在20℃（水浴）下，对96毫克（0.30毫摩尔）乙酸汞（Aldrich）溶于15毫升无水四氢呋喃的溶液加入1.72毫升乙酸，接着加入218毫克三-正-丁基甲锡烷基3-（4′-三-正-丁基甲锡烷基苯基）丙酸盐溶于1毫升四氢呋喃的溶液。生成的溶液在20℃时搅拌1小时，并加入15毫升3%KBr水溶液，再经1小时后，用旋转蒸发器去除大部分四氢呋喃，直至出现白色沉淀物，用15毫升水稀释该混合物。通过真空过滤收集该沉淀物，用少量EtOH进行洗涤，得到93毫克（72%）白色固体的4-（3′-丙酸）苯基溴化汞：¹H核磁共振（DMSO-d₆）δ2.23～3.09（m，4H），7.17（d，J＝8赫兹，2M），7.39（d，J＝8赫兹，2H），质谱（CI）m/z431，433（M+18.7，6.0），351（27），133（100）。

用同样的方法完成含有有机硼基团的金属转移。

实施例12

N-琥珀酰亚胺基4-（三-正-丁基甲锡烷基）苯甲酸酯的放射性碘化

对装有10～50微克N-琥珀酰亚胺基4-（三-正-丁基甲锡烷基）苯甲酸酯（0.02～0.10微摩尔）溶于50微升5%HOAc/甲醇的管瓶中加入溶于10～20微升甲醇的10～20微克（0.08～0.15微摩尔）N-氯琥珀酸亚胺。对该溶液加入10微升Na¹²⁵I溶液（在Delbecco的磷酸盐缓冲盐水中的稀释;Gibco实验室）。（100微居里-2毫居里）3～5分钟后，加入20微升0.25微克/毫升Na₂S₂O₅溶液，该反应混合物用50微升磷酸盐缓冲溶液进一步稀释，并在溶液面上吹氮气流，直至体积减少到仅仅含水（约80微升），得到75～95%放射性标记产品。该产品可直接用作蛋白质标记试验，如下文所述。

用类似方法进行碘-131的放射性碘化得类似的产率。

实施例13

用放射性卤化小分子标记蛋白质

将上例粗制含水放射性碘化酯混合物转送到装有缓冲蛋白质溶液（PH8.5～9）的管瓶，或反之亦然。在室温下，5分钟内完成共轭反应，共轭得率的幅度大约35～60%。或是用胶渗透层析柱或是用小孔过滤设备（例如Centricon超速离心机）纯化标记蛋白质，除去未共轭放射性物。

实施例13的放射性卤化蛋白质产品可用于放射性诊断和治疗。例如，单克隆抗体或与肿瘤细胞结合抗原起特殊反应的抗原结合片段，可用这种方法进行放射性卤化，然后用于摄象哺乳动物体内肿瘤细胞的位置：可以引入适当量的放射卤化抗体，例如，通过静脉注射引入患者体内，然后，闪烁检测器例如γ照相机扫描动物体。这种放射性卤化抗体也可引入哺乳动物体内，用于肿瘤放射性治疗。

往往集中在器官或病变组织的其它蛋白质和肽也可用这种方法进行放射性卤化，并用来检测体内平衡和病变状态的偏差。例如，放射性卤化血纤维蛋白原可通过体内摄象用以测定深度静脉血栓症。脑垂体的病变的吸收和其它肽激素也可用类似方法检测。

又一个实施例是按照本公开的放射性卤化抗体，可应用在试管放射性免疫测定。

因为在共轭物的未活化芳环或未活化芳香杂环上取代放射性卤素，所以可稳定地放射性标记前面提到的所有放射性卤化蛋白质。此外，在没有羟基官能度的情况下，在对位或间位取代放射性卤素，使放射性的卤素较少受到体内脱碘酶的分解。

实施例14

生物分布研究

由下列动物试验说明了本发明的放射性碘化蛋白质小分子，与按常规通过含酚芳环放射性碘化蛋白质相比，有益于在体内的稳定性。在试验中，放射性碘的甲状腺吸收（如由颈部放射性所测定）用作体内代谢的测定。

用实施例12的放射性碘化产品标记的抗体注射12只老鼠，在注射后2小时、24小时、48小时和72小时，死了三组老鼠，用常规技术立即可测定放射性标记的生物分布。所得结果示于图1和2，其中使用了下列符号：BL，血;TA，尾部;TU，黑素瘤;SK，皮肤;MU，骨骼肌;BO，骨;LU，肺;LI，肝;SP，脾脏;ST，胃;NE，颈部（包括甲状腺）;KT，肾;和IN，肠。结果以百分剂量/克组织或百分总剂量选择示出（图表表示的百分总剂量，对于血、皮肤、肌肉和骨骼仅表示小部分总的体内活性）。注意，甲状腺的活性量不随由起始2小时开始累计的时间而增加。

作为24小时稳定性比较，另外三只老鼠用同一抗体相同的量，但通过已知氯胺-T氧化用放射性碘直接标记的抗体进行注射，按上述方法测定放射性标记的生物分布，结果示于图3和4。

参考图3和4，在24小时内，本发明试剂和现有技术的试剂在皮肤、骨、肝、肾和肠中的生物分布是很相似的，说明了放射性标记抗体同样地起作用。在对比中，用氯胺-T标记蛋白质注射的动物体内，胃和颈部积累了相当大部分注射的放射性碘，表明了通过氯胺-T标记蛋白质的代谢，很可能产生游离放射性碘。这些对比实验的结果说明了本发明对-碘苯基标记的抗体在体内稳定得多，第一次说明了含有高比活性放射性碘的未活化芳环在体内是不代谢的，或不脱碘化的。无论是通过氯胺-T氧化直接标记，还是用鲍尔顿-亨特或伍德试剂间接标记，对照数据（图3和图4）被认为一般可与放射性标记含酚芳环匹敌。

用F（ab′）所示的辅助生物分布研究通过这种方法放射性碘化的抗体片段在体内的代谢作用是稳定的。此外，这种类型的放射性标记试剂比以上讨论的全部标记抗体制剂更快速地清除，在72小时内，在体内器官中留下最少的残余物。

尽管本发明结合最佳实施例予以叙述，但普通技术人员阅读本说明书之后，能够实施各种变化、等效的取代以及其它改变本文所述组合物和合成方法。为此，企图得到专利保护仅仅是受权利要求书及其相应内容所含定义的限制。

Claims

1、一种化合物，其化学式为

＊X-Ar-R

其中：

＊X是碘、溴、氟或砹的放射性同位素，

Ar是芳环或是芳香杂环；以及

R是短链取代基，该取代基在保存蛋白质生物活性的条件下，为不高度活化环，在环上被取代放射性同位素，并支承适合于与蛋白质结合的官能团。

2、根据权利要求1所述的化合物，其中＊X是I-123、I-125、I-131、Br-75、Br-76、Br-77、F-18或At-211。

3、根据权利要求1所述的化合物，其中在取代基R上的官能团选自酚酯、酰亚胺酯、亚氨酸酯、酐、酰基琥珀酸亚胺酯、醛、异硫氰酸盐、硫羟、重氮基、胺、肼、烷基囟化物和马来酰亚胺。

4、根据权利要求1所述的化合物，其中R是酰亚胺酯、烷基酰亚胺酯、酰氨基烷基亚胺脂、亚氨酸酯、烷基亚氨酸酯或酰氨基烷基亚氨酸酯。

5、根据权利要求1所述的化合物，其中＊X是相对于取代基R的对位或间位。

6、根据权利要求1所述的化合物，其选自下述基团：N-琥珀酰亚胺基3-（4′-〔＊X〕囟苯基）丙酸酯;甲基3-（4′-〔＊X〕囟苯基）-丙酯基亚氨酸;N-琥珀酰亚胺基4-〔＊X〕囟苯甲酸酯;甲基4-〔＊X〕halobenzimidate;N-琥珀酰亚胺基4-〔＊X〕囟苯甲酰氨基乙酸酯或N-琥珀酰亚胺基4-〔＊X〕囟马尿酸酯，甲基4-〔＊X〕囟苯甲酰氨基acetimidate;以及4-〔＊X〕囟苯甲酰氨基乙酰腈。

7、具有化学式M-Ar-R的化合物，其中：M是S_n（n-Ba）₃、SnMe₃、HgX₂（X是Cl、Br或I）、HgOAc、B（OH）₂或BZ₃（Z是烷基或烷氧基）;

Ar是芳环或芳香杂环;以及

R是短链取代基，该取代基在保存蛋白质生物活性的条件下，为不高度活化环，在环上被取代M，并支承适合于与蛋白质结合的官能团。

8、根据权利要求7所述的化合物，其中在取代基R上官能团选自酚酯、酰亚胺酯、亚氨酸酯、酐、酰基琥珀酸亚胺酯、醛、异硫氰酸盐、硫羟、重氮基、胺、肼、烷基囟化物和马来酰亚胺。

9、根据权利要求7所述的化合物，其中R是酰亚胺酯、烷基酰亚胺酯、酰氨基烷基亚胺酯、亚氨酸酯、烷基亚氨酸酯或酰氨基烷基亚氨酸酯。

10、根据权利要求7所述的化合物，其中M是相对于取代基R的对位或间位。

11、根据权利要求7所述的化合物，其选自下述基团：N-琥珀酰亚胺基3-（4′-三丁基甲锡烷基苯基）丙酸酯;甲基3-（4′-三丁基甲锡烷基苯基）丙酯基亚氨酸;N-琥珀酰亚氨基4-三丁基甲锡烷基苯甲酸酯;甲基4-三丁基甲锡烷基benzimidate;N-琥珀酰亚氨基4-三丁基甲锡烷基苯甲酰氨基乙酸酯或N-琥珀酰亚氨基4-三丁基甲锡烷基马尿酸酯;甲基4-三丁基甲锡烷基苯甲酰氨基acetimidate;以及4-三丁基甲锡烷基苯甲酰氨基乙酰腈。

12、标记分子式

＊X-Ar-R

蛋白质的放射性囟化小分子的一种合成方法，

其中＊X是碘、溴、氟或砹的放射性同位素，Ar是芳环或是芳香杂环，R是短链取代基，该取代基在保存蛋白质生物活性的条件下，为不高度活化环，环上被取代放射性同位素，并支承适合于与蛋白质结合的官能团，所述合成方法包括下述步骤：

（a）囟素在支承官能团或官能前体的囟芳族化合物上取代有机金属基团，该有机金属基团选自Sn（n-Bu）₃和SnMe₃;

（b）在步骤（a）的产品上，把任一前体基团转化成官能团;以及

（c）囟化脱金属的步骤（a）或（b）的含官能团产品，以排除有机金属基团，并由此取代碘、溴、氟或砹的放射性同位素。

13、根据权利要求12所述的方法，其中步骤（a）的囟芳族化合物是对位或间位取代的囟素。

14、根据权利要求12所述的方法，其中：官能团选自酚酯、酰亚胺酯、亚氨酸酯、酐、酰基琥珀酸亚胺酯、醛、异硫氰酸盐、硫羟、重氮基、胺、肼、烷基囟化物马来酰亚胜。

15、根据权利要求12所述的方法，其中官能团前体选自羧酸、腈、醇和胺。

16、根据权利要求12所述的方法，其中在步骤（a）中的前体是羧酸，在步骤（b）中的官能团是酰亚胺酯。

17、根据权利要求12所述的方法，其中步骤（a）包括步骤（ⅰ）囟芳族化合物或是与正-丁基锂在-100℃下反应，或是与镁在室温时反应，（ⅱ）步骤（ⅰ）的反应产品与有机金属基团反应。

18、根据权利要求12所述的方法，其中步骤（a）包括囟芳族化合物与六烷基锡和四个（三苯膦）钯反应。

19、根据权利要求12所述的方法，其中步骤（a）包括囟芳族化合物与三烷基甲锡烷基碱在0℃，四甘醇二甲醚中进行反应。

20、根据权利要求12所述的方法，其中步骤（a）进一步包括用选自HgX₂、Hg（OAc）₂、BX₃和BZ₃的有机金属基团同芳基锡取代化合金属转移，其中X是Cl、Br或I，Z是烷基或烷氧基。

21、标记分子式

＊X-Ar-R

蛋白质的放射性囟化小分子的一种合成方法，

其中＊X是碘、溴、氟或砹的放射性同位素，Ar是苯环或芳香杂环，R是短链取代基，该取代基在保存蛋白质生物活性的条件下，为不高度活化环，环上被取代放射性同位素，并支承适合于与蛋白质结合的官能团，所述合成方法包括下述步骤：

（a）囟素在支承官能团前体的囟芳族化合物上取代有机金属基团，该有机金属基团选自Sn（n-Bu）₃和SnME₃;

（b）囟化脱金属的步骤（a）的产品，以排除有机金属基团，并由此取代碘、溴、氟或砹的放射性同位素;以及

（c）在步骤（b）的产品上，把前体基团转化成官能团。

22、根据权利要求21所述的方法，其中步骤（a）的囟芳族化合物是对位或间位取代的囟素。

23、根据权利要求21所述的方法，其中基团的前体选自羧酸、腈、醇和胺。

24、根据权利要求21所述的方法，其中官能团选自酚酯、酰亚胺酯、亚氨酸酯、酐、酰基琥珀酸亚胺酯、醛、异硫氰酸盐、重氮基、胺、肼、烷基囟化物马来酰亚胺。

25、根据权利要求21所述的方法，其中前体基团是腈，官能团是亚氨酸酯。

26、根据权利要求21所述的方法，其中步骤（a）包括步骤（ⅰ）囟芳族化合物或与正-丁基锂在-100℃下反应，或是与镁在室温时反应，（ⅱ）步骤（ⅰ）的反应产品与有机金属基团反应。

27、根据权利要求21所述的方法，其中步骤（a）包括囟芳族化合物与六烷基锡和四个（三苯膦）钯反应。

28、根据权利要求21所述的方法，其中步骤（a）包括囟芳族化合物与三烷基甲锡烷基碱在0℃，四甘醇二甲醚中反应。

29、根据权利要求21所述的方法，其中步骤（a）进一步包括用选自HgX₂、Hg（OAc）₂、BX₃和BZ₃的有机金属基团同芳基锡取代化合物金属转移，其中X是Cl、Br或I，Z是烷基或烷氧基。

30、放射性囟化蛋白质的方法包括以含水介质、氨基、硫羟、或在所述蛋白质上的羟基与权利要求1的化合物反应的步骤。

31、放射性囟化权利要求30方法的蛋白质产品。

32、根据权利要求30所述的方法，其中所述蛋白质或是用于放射诊断，或是用于放射性治疗，或是两者兼用。

33、根据权利要求30所述的方法，其中所述蛋白质选自由抗体、抗原结合片段、氨基酸聚合物、血浆蛋白和肽激素。

34、根据权利要求30所述的方法，其中所述蛋白质是单克隆抗体。

35、根据权利要求34所述的方法，其中所述单克隆抗体与肿瘤细胞抗原起特殊反应的。

36、放射性囟化权利要求35方法的单克隆抗体产品。

37、摄象哺乳动物内肿瘤细胞位置的方法包括把权利要求35产品的有效量引入体内，然后用闪烁检测器扫描动物体的步骤。

38、放射性治疗肿瘤的方法包括把权利要求35产品的有效量引入哺乳动物体内的步骤。

39、在体内摄象的方法包括下列步骤，把放传性囟化蛋白质引入哺乳动物体内，然后，用闪烁检测器方法扫描动物体，改进的技术包括引入权利要求31的放射性囟化蛋白质。

40、标记分子式

＊X-Ar-R

蛋白质的放射性囟化小分子的一种合成方法，

其中＊X是碘、溴、氟或砹的放射性同位素，Ar是苯环或芳香杂环，R是短链取代基，该取代基在保存蛋自质生物活性的条件下，为不高度活化环，该环上被取代放射性同位素，并支承适合于与蛋白质结合的官能团，所述合成方法包括下述步骤：

（a）形成相应的囟苄腈或囟芳基烷基腈的亚氨酸酯;

（b）囟素在步骤（a）产品上取代有机金属基团，该有机金属基团选自Sn（n-Bu）₃和SnMe₃，以及取代包括步骤（a）的含亚氨酸产品与六烷基锡和四个（三苯膦）钯反应;

（c）囟化脱金属的步骤（b）的产品，以排除有机金属基团，并由此取代碘、溴、氟或砹的放射性同位素。