CN208917204U - 用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿 - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开了一种用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿，该笼结构微孔培养皿由四个基本部分组成，第一个基本部分为底面修饰后的培养皿，第二个基本部分为修饰后的聚合物微孔阵列，第三个基本部分为细胞筛网，第四个基本部分为细胞培养基贮存池；该笼结构微孔培养皿可实现细胞接种、细胞长期培养、三维微组织形成、在线检测、多细胞三维共培养。利用本实用新型笼结构微孔培养皿进行生物实验时，节省试剂，通量高，易于操作，进行细胞体外三维培养效率高，质量好。
Description
技术领域
本实用新型涉及一种细胞体外三维微组织形成模型，特别是还涉及一种用于细胞体外三维微组织形成的培养皿装置，应用于生物细胞体外三维培养装置技术领域。
背景技术
细胞体外培养模式可简单分为二维培养和三维培养，其中较为传统且容易实现的是细胞体外二维培养，如孔板、培养瓶、皿等，尽管它们在生物医学研究中具有显著的价值，但该模式无法充分模拟具有复杂生物化学、生物物理因素的细胞微环境，也难以体现人体组织器官复杂的生理或病理环境，具有相当大的局限性，而细胞的体外三维培养具有更多优势。目前，细胞体外三维培养方式通常使用具有生物相容性的高分子材料或者天然生物提取物作为细胞支架材料，为细胞提供三维生长环境，或者利用悬滴法依靠细胞本身性质，特别是肿瘤细胞自身成团的特性，在体外培养细胞三维微团或微组织。然而，这些体外细胞三维培养模型，前者需要构建细胞支架，工艺繁琐，可适用的生物材料有限，且价格昂贵；后者悬滴法
产生的细胞微组织不易操控，很难适用于更多复杂生物学研究的要求，因此开发一种新型细胞体外三维微组织形成的简易模型成为亟待解决的问题之一。
与此同时，随着微加工技术的不断发展，特别是软刻蚀技术的快速推进，微孔板乃至具有特殊结构的微孔阵列开始出现，并因其细胞、试剂用量少，通量高，易操作等优势而被用于细胞培养的多个领域，或可成为解决细胞体外三维培养的新型技术手段，如何将微加工技术与细胞体外三维微组织培养结合，采用何种形式和结构的专用的简易装置，也成为亟待解决的问题。
实用新型内容
为了解决现有技术问题，本实用新型的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿，本实用新型笼结构微孔培养皿能应用于细胞体外三维微组织形成，本实用新型笼结构微孔培养皿可实现细胞接种、细胞长期培养、三维微组织形成、在线检测、多细胞三维共培养。利用本实用新型笼结构微孔培养皿进行生物实验时，节省试剂，通量高，易于操作，进行细胞体外三维培养效率高，质量好。
为达到上述发明创造目的，本实用新型采用下述技术方案：
一种用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿，所述笼结构微孔培养皿由四个基本部分拼接组装组成：
第一个基本部分为底面修饰后的培养皿，即在培养皿底部结合生物相容性材料薄膜层，形成培养皿容器内层；
第二个基本部分为修饰后的聚合物微孔阵列组件，采用具有镂空微孔阵列结构的生物相容性材料薄膜，使聚合物微孔阵列组件具有阵列式分布的细胞生长微孔槽，聚合物微孔阵列组件外缘尺寸小于培养皿容器内腔尺寸，能将聚合物微孔阵列组件设置于培养皿容器内的底部；
第三个基本部分为细胞筛网，设置于聚合物微孔阵列组件上方，细胞筛网对聚合物微孔阵列组件的具有阵列式分布的细胞生长微孔槽形成结网式覆盖结构，细胞筛网采用生物相容性材料网形的网片组件，网孔大小能满足原始待培养的细胞通过并进入聚合物微孔阵列组件的具有阵列式分布的细胞生长微孔槽内，并且使在培养皿容器内设置的聚合物微孔阵列组件的细胞生长微孔槽内经过培养后的长大的细胞组织或细胞微团无法通过穿越细胞筛网进行迁移；
第四个基本部分为细胞培养基贮存池，具有围堰式环形结构，作为培养皿上缘的延伸增高组件，细胞培养基贮存池与培养皿上缘连接，使培养皿容器内腔深度增加；
在所述笼结构微孔培养皿中，单个细胞能通过细胞筛网进入聚合物微孔阵列组件具有的阵列式分布的细胞生长微孔槽，在细胞生长微孔槽中经培养形成三维微组织，形成后的三维微组织将不能再通过细胞筛网，而被困于所述笼结构微孔培养皿中。
作为本实用新型优选的技术方案，第一个基本部分底面修饰后的培养皿与第二个基本部分修饰后的聚合物微孔阵列组件采用等离子体封接或可逆封接，形成连接界面结构，将聚合物微孔阵列组件固定安装在培养皿容器腔内底部位置处。
作为本实用新型优选的技术方案，第三个基本部分细胞筛网覆盖于聚合物微孔阵列组件上方，并使第三个基本部分细胞筛网与聚合物微孔阵列组件保持非接触状态，细胞筛网与培养皿直接连接，使细胞筛网对培养皿的开口形成结网式覆盖结构，将聚合物微孔阵列组件包封于由细胞筛网覆盖的培养皿容器中。当细胞筛网与培养皿直接连接时，优选采用胶水加热粘贴形成细胞筛网与培养皿的连接部分。
作为本实用新型优选的技术方案，第三个基本部分细胞筛网直接覆盖于聚合物微孔阵列组件上，并使第三个基本部分细胞筛网与聚合物微孔阵列组件保持直接接触状态，细胞筛网与聚合物微孔阵列组件直接连接，使细胞筛网对聚合物微孔阵列组件的具有阵列式分布的细胞生长微孔槽直接形成结网式覆盖结构，对聚合物微孔阵列组件的具有阵列式分布的细胞生长微孔槽的开口上缘直接进行包封。当细胞筛网与聚合物微孔阵列组件直接连接时，优选采用胶水加热粘贴形成细胞筛网与聚合物微孔阵列组件的连接部分。
作为本实用新型优选的技术方案，细胞培养基贮存池与培养皿上缘连接时，优选采用胶水加热粘贴形成细胞培养基贮存池环形端面与培养皿上缘表面的连接部分。
上述细胞筛网的筛网空隙形状优选为圆形、方形和多边形中的任意一种或任意几种的混合。
上述细胞筛网的筛网空隙尺寸大小优选为10～200微米。
上述培养皿优选采用采用具有中心孔的培养皿；进一步优选采用具有中心孔的玻底培养皿。
作为本实用新型优选的技术方案，将细胞培养基贮存池1与培养皿4上缘进行连接后，采用胶水对细胞培养基贮存池1环形端面与培养皿4上缘表面之间的缝隙进行辅助密封，使细胞培养基贮存池1与培养皿4连接形成一体式的生物培养容器。
本实用新型与现有技术相比较，具有如下实质性特点和优点：
1.本实用新型用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿，在接种细胞时，单个细胞可通过细胞筛网进入聚合物微孔阵列，在聚合物微孔阵列中经培养形成三维微组织，形成后的三维微组织将不能再通过细胞筛网，而被困于笼结构中，能实现体外培养细胞三维微团或微组织的培养；
2.本实用新型笼结构微孔培养皿可实现细胞接种、细胞长期培养、三维微组织形成、在线检测、多细胞三维共培养，实现高通量生物实验，满足更多复杂生物学研究的要求。
附图说明
图1为本实用新型实施例一用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿的分解结构示意图。
图2为本实用新型实施例一的细胞筛网的显微镜微观照片。
图3为本实用新型实施例一笼结构微孔培养皿中培养的HCC827细胞微组织显微镜照片。
图4为本实用新型实施例二笼结构微孔培养皿中培养的NCI-H460细胞微组织的显微镜照片。
图5为本实用新型实施例三笼结构微孔培养皿中培养的细胞三维共培养显微镜照片。
具体实施方式
本实用新型的优选实施例详述如下：
在本实施例中，参见图1～图3，一种用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿，所述笼结构微孔培养皿由四个基本部分拼接组装组成：
第一个基本部分为底面修饰后的培养皿4，即在培养皿4底部结合生物相容性材料薄膜层，形成培养皿4容器内层，对培养皿4内表面进行修饰，参见图1；
第二个基本部分为修饰后的聚合物微孔阵列组件3，采用具有镂空微孔阵列结构的生物相容性材料薄膜，使聚合物微孔阵列组件3具有阵列式分布的细胞生长微孔槽，聚合物微孔阵列组件3外缘尺寸小于培养皿4容器内腔尺寸，能将聚合物微孔阵列组件3设置于培养皿4容器内的底部，参见图1；
第三个基本部分为细胞筛网2，设置于聚合物微孔阵列组件3上方，细胞筛网2对聚合物微孔阵列组件3的具有阵列式分布的细胞生长微孔槽形成结网式覆盖结构，细胞筛网2采用生物相容性材料网形的网片组件，网孔大小能满足原始待培养的细胞通过并进入聚合物微孔阵列组件3的具有阵列式分布的细胞生长微孔槽内，并且使在培养皿4容器内设置的聚合物微孔阵列组件3的细胞生长微孔槽内经过培养后的长大的细胞组织或细胞微团无法通过穿越细胞筛网2进行迁移，参见图1～图3；
第四个基本部分为细胞培养基贮存池1，具有围堰式环形结构，作为培养皿4上缘的延伸增高组件，细胞培养基贮存池1与培养皿4上缘连接，使培养皿4容器内腔深度增加，参见图1；
制备了上述笼结构微孔培养皿的四个基本部分后，将它们依次封接组装成完整的笼结构微孔培养皿，然后，将笼结构微孔培养皿的表面进行修饰，修饰方法为：先将封接后的笼结构微孔培养皿整体经等离子体处理后，在紫外照射下进行灭菌处理，然后依次浸入PluronicF-127的水溶液、PBS缓冲溶液进行冲洗，然后向笼结构微孔培养皿中加入细胞用培养基，备用，参见图1～图3；
在所述笼结构微孔培养皿中，单个细胞能通过细胞筛网2进入聚合物微孔阵列组件3具有的阵列式分布的细胞生长微孔槽，在细胞生长微孔槽中经培养形成三维微组织，形成后的三维微组织将不能再通过细胞筛网2，而被困于所述笼结构微孔培养皿中，参见图1～图3。
在本实施例中，参见图1，第一个基本部分底面修饰后的培养皿4与第二个基本部分修饰后的聚合物微孔阵列组件3采用等离子体封接，形成连接界面结构，将聚合物微孔阵列组件3固定安装在培养皿4容器腔内底部位置处。
在本实施例中，参见图1～图3，第三个基本部分细胞筛网2覆盖于聚合物微孔阵列组件3上方，并使第三个基本部分细胞筛网2与聚合物微孔阵列组件3保持非接触状态，细胞筛网2与培养皿4直接连接，使细胞筛网2对培养皿4的开口形成结网式覆盖结构，将聚合物微孔阵列组件3包封于由细胞筛网2覆盖的培养皿4容器中。
在本实施例中，参见图1～图3，细胞培养基贮存池1与培养皿4上缘连接时，采用胶水加热粘贴形成细胞培养基贮存池1环形端面与培养皿4上缘表面的连接部分；当细胞筛网2与培养皿4直接连接时，采用胶水加热粘贴形成细胞筛网2与培养皿4的连接部分；当细胞筛网2与聚合物微孔阵列组件3直接连接时，采用胶水加热粘贴形成细胞筛网2与聚合物微孔阵列组件3的连接部分。该胶水是PDMS预聚体溶液。细胞筛网2为尼龙制成的方形孔隙筛网片，细胞筛网2的筛网空隙尺寸为100微米。
在本实施例中，参见图1～图3，一种本实施例用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿的制备方法，具体步骤如下：
a.利用软光刻蚀方法制备微孔阵列光刻胶模板，该光刻胶模版采用SU-8负性光刻胶或其他光刻胶，通过在模版基片上倾倒PDMS预聚体溶液，扣置表面硅烷化的成型PDMS薄片，并施加重物，再对成型PDMS薄片进行加热固化，然后采用剥离方式，从而得到具有镂空微孔阵列结构的PDMS薄膜，然后对PDMS薄膜表面进行等离子体处理，即得到修饰后的聚合物微孔阵列组件3，备用；聚合物微孔阵列组件3外缘尺寸小于培养皿4容器内腔尺寸，能将聚合物微孔阵列组件3设置于培养皿4容器内的底部；
b.将底面修饰后的培养皿4与在所述步骤a中得到的修饰后的聚合物微孔阵列组件3采用等离子体封接进行连接，将聚合物微孔阵列组件3设置于培养皿4容器内的底部；通过在培养皿4底部涂覆PDMS预聚体溶液，加热固化，得到底面修饰后的培养皿4；
c.在完成所述步骤b后，将细胞筛网2与培养皿4直接连接，使细胞筛网2覆盖于聚合物微孔阵列组件3上方，并使细胞筛网2与聚合物微孔阵列组件3保持非接触状态，使细胞筛网2对培养皿4的开口形成结网式覆盖结构，将聚合物微孔阵列组件3包封于由细胞筛网2覆盖的培养皿4容器中；细胞筛网2采用尼龙筛网；
d.将PDMS圆片经打孔制备内外圈为同心圆的圆环作为细胞培养基贮存池1，经过所述步骤c完成对聚合物微孔阵列组件3的包封后，采用胶水加热粘贴方法，将细胞培养基贮存池1与培养皿4上缘进行连接，使细胞培养基贮存池1环形端面与培养皿4上缘表面形成连接部分，从而将四个基本部分封接组装成完整的笼结构微孔培养皿整体形式；细胞培养基贮存池1具有围堰式环形结构，作为培养皿4上缘的延伸增高组件，细胞培养基贮存池1与培养皿4上缘连接，使培养皿4容器内腔深度增加；
e.在所述步骤d中将细胞培养基贮存池1与培养皿4上缘进行连接后，对将四个基本部分封接组装成完整的笼结构微孔培养皿进行后处理，将一体式笼结构微孔培养皿的表面进行修饰，修饰方法为：先将封接后的笼结构微孔培养皿整体经等离子体处理后，在紫外照射下进行灭菌处理，然后依次浸入Pluronic F-127的水溶液、PBS缓冲溶液进行冲洗，然后向笼结构微孔培养皿中加入细胞用培养基，备用。
本实施例制备了上述笼结构微孔培养皿的四个基本部分后，将它们依次封接组装成完整的笼结构微孔培养皿，主要流程为：将第一个基本部分底面修饰后的培养皿4与第二个基本部分修饰后的聚合物微孔阵列组件3采用等离子体封接，第一个基本部分底面修饰后的培养皿4与第三个基本部分细胞筛网2、第四个基本部分细胞培养基贮存池1采用特质胶水加热粘贴，培养皿4的开口上缘表面和细胞培养基贮存池1的底端表面将细胞筛网2压紧连接，该特质胶水是PDMS预聚体溶液。
实验测试分析：
利用本实施例用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿进行细胞体外培养试验。利用本实施例制备笼结构微孔培养皿，其细胞筛网2为孔隙100微米的尼龙筛网，如图2和3所示，开展肺肿瘤细胞体外三维微组织形成研究。实验中，分别接种1×105个/mL肺非小细胞肺癌中的EGFR突变腺癌细胞株HCC827细胞于笼结构微孔培养皿中，细胞进入笼结构的聚合物微孔阵列组件3具有阵列式分布的细胞生长微孔槽中，经6天培养，得到HCC827细胞微团，如图3所示。
本实施例笼结构微孔培养皿能用于体外细胞三维微组织的形成，该笼结构微孔培养皿由四个基本部分组成，第一个基本部分为底面修饰后的培养皿4，第二个基本部分为修饰后的聚合物微孔阵列组件3，第三个基本部分为细胞筛网2，第四个基本部分为环形的细胞培养基贮存池1；该笼结构微孔培养皿能实现细胞接种、细胞长期培养、三维微组织形成、在线检测、多细胞三维共培养。在本实施例笼结构微孔培养皿中，单个HCC827细胞可通过细胞筛网2进入聚合物微孔阵列组件3具有阵列式分布的细胞生长微孔槽，在聚合物微孔阵列组件3中经培养形成三维微组织，形成后的三维微组织将不能再通过细胞筛网2，而被困于笼结构中。
实施例二
本实施例与实施例一基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，参见图4，一种用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿及其制备方法与实施例一相同。
实验测试分析：
利用本实施例用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿进行细胞体外培养试验。利用本实施例制备笼结构微孔培养皿，其细胞筛网2为孔隙100微米的尼龙筛网，如图4所示，开展肺肿瘤细胞体外三维微组织形成研究。实验中，分别接种1×105个/mL肺非小细胞肺癌中的大细胞癌NCI-H460细胞于笼结构微孔培养皿中，细胞进入笼结构的聚合物微孔阵列组件3具有阵列式分布的细胞生长微孔槽中，经6天培养，得到NCI-H460细胞微组织，如图4所示。
本实施例笼结构微孔培养皿能用于体外细胞三维微组织的形成，该笼结构微孔培养皿由四个基本部分组成，第一个基本部分为底面修饰后的培养皿4，第二个基本部分为修饰后的聚合物微孔阵列组件3，第三个基本部分为细胞筛网2，第四个基本部分为环形的细胞培养基贮存池1；该笼结构微孔培养皿能实现细胞接种、细胞长期培养、三维微组织形成、在线检测、多细胞三维共培养。在本实施例笼结构微孔培养皿中，单个NCI-H460细胞可通过细胞筛网2进入聚合物微孔阵列组件3具有阵列式分布的细胞生长微孔槽，在聚合物微孔阵列组件3中经培养形成三维微组织，形成后的三维微组织将不能再通过细胞筛网2，而被困于笼结构中。
实施例三
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，参见图5，一种用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿及其制备方法与实施例一相同。
实验测试分析：
利用本实施例用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿进行细胞体外培养试验。利用本实施例制备笼结构微孔培养皿，其细胞筛网2为孔隙100微米的尼龙筛网，如图5所示，开展肺肿瘤细胞与血管内皮细胞三维共培养研究。实验中，接种1×105个/mL肺非小细胞肺癌中的大细胞癌NCI-H460细胞于笼结构微孔培养皿中，经3天培养，得到NCI-H460细胞微组织，在微组织上加入80微升基底膜提取物，37度形成凝胶状，在其上接种2×105个/mL人脐带静脉血管内皮细胞HUVEC，形成细胞共培养，经共聚焦显微镜三维片层拍照，如图5所示。
本实施例笼结构微孔培养皿能用于体外细胞三维微组织的形成，该笼结构微孔培养皿由四个基本部分组成，第一个基本部分为底面修饰后的培养皿4，第二个基本部分为修饰后的聚合物微孔阵列组件3，第三个基本部分为细胞筛网2，第四个基本部分为环形的细胞培养基贮存池1；该笼结构微孔培养皿能实现细胞接种、细胞长期培养、三维微组织形成、在线检测、多细胞三维共培养。在本实施例笼结构微孔培养皿中，单个NCI-H460细胞和单个人脐带静脉血管内皮细胞HUVEC皆可通过细胞筛网2进入聚合物微孔阵列组件3具有阵列式分布的细胞生长微孔槽，在聚合物微孔阵列组件3中经培养形成三维微组织，形成后的三维微组织将不能再通过细胞筛网2，而被困于笼结构中。
实施例四
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，一种用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿的制备方法，具体步骤如下：
a.本步骤与实施例一相同；
b.将底面修饰后的培养皿4与在所述步骤a中得到的修饰后的聚合物微孔阵列组件3采用可逆封接进行连接，将聚合物微孔阵列组件3设置于培养皿4容器内的底部；通过在培养皿4底部涂覆PDMS预聚体溶液，加热固化，得到底面修饰后的培养皿4；
c.在完成所述步骤b后，将细胞筛网2与培养皿4直接连接，使细胞筛网2覆盖于聚合物微孔阵列组件3上方，并使细胞筛网2与聚合物微孔阵列组件3保持非接触状态，使细胞筛网2对培养皿4的开口形成结网式覆盖结构，将聚合物微孔阵列组件3包封于由细胞筛网2覆盖的培养皿4容器中；细胞筛网2采用PDMS筛网；
d.本步骤与实施例一相同；
e.本步骤与实施例一相同。
本实施例制备了上述笼结构微孔培养皿的四个基本部分后，将它们依次封接组装成完整的笼结构微孔培养皿，主要流程为：将第一个基本部分底面修饰后的培养皿4与第二个基本部分修饰后的聚合物微孔阵列组件3采用等离子体封接，第一个基本部分底面修饰后的培养皿4与第三个基本部分细胞筛网2、第四个基本部分细胞培养基贮存池1采用特质胶水加热粘贴，培养皿4的开口上缘表面和细胞培养基贮存池1的底端表面将细胞筛网2压紧连接，该特质胶水是PDMS预聚体溶液。本实施例细胞筛网2采用PDMS筛网，特质胶水是PDMS预聚体溶液，使材料种类简单，更好地满足生物相容性要求。
实验测试分析：
利用本实施例用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿进行细胞体外培养试验。利用本实施例制备笼结构微孔培养皿，其细胞筛网2为孔隙100微米的尼龙筛网，开展肺肿瘤细胞体外三维微组织形成研究。实验中，分别接种1×105个/mL肺非小细胞肺癌中的EGFR突变腺癌细胞株HCC827细胞于笼结构微孔培养皿中，细胞进入笼结构的聚合物微孔阵列组件3具有阵列式分布的细胞生长微孔槽中，经6天培养，得到HCC827细胞微团。
本实施例笼结构微孔培养皿能用于体外细胞三维微组织的形成，该笼结构微孔培养皿由四个基本部分组成，第一个基本部分为底面修饰后的培养皿4，第二个基本部分为修饰后的聚合物微孔阵列组件3，第三个基本部分为细胞筛网2，第四个基本部分为环形的细胞培养基贮存池1；该笼结构微孔培养皿能实现细胞接种、细胞长期培养、三维微组织形成、在线检测、多细胞三维共培养。在本实施例笼结构微孔培养皿中，单个HCC827细胞可通过细胞筛网2进入聚合物微孔阵列组件3具有阵列式分布的细胞生长微孔槽，在聚合物微孔阵列组件3中经培养形成三维微组织，形成后的三维微组织将不能再通过细胞筛网2，而被困于笼结构中。
实施例五
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，一种用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿，其第三个基本部分细胞筛网2直接覆盖于聚合物微孔阵列组件3上，并使第三个基本部分细胞筛网2与聚合物微孔阵列组件3保持直接接触状态，细胞筛网2与聚合物微孔阵列组件3直接连接，使细胞筛网2对聚合物微孔阵列组件3的具有阵列式分布的细胞生长微孔槽直接形成结网式覆盖结构，对聚合物微孔阵列组件3的具有阵列式分布的细胞生长微孔槽的开口上缘直接进行包封。
在本实施例中，一种本实施例用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿的制备方法，具体步骤如下：
a.本步骤与实施例一相同；
b.将细胞筛网2与在所述步骤a中得到的修饰后的聚合物微孔阵列组件3直接连接，使细胞筛网2直接覆盖于聚合物微孔阵列组件3上，并使细胞筛网2与聚合物微孔阵列组件3保持直接接触状态，使细胞筛网2对聚合物微孔阵列组件3的具有阵列式分布的细胞生长微孔槽直接形成结网式覆盖结构，对聚合物微孔阵列组件3的具有阵列式分布的细胞生长微孔槽的开口上缘直接进行包封；
将细胞筛网2与聚合物微孔阵列组件3直接连接时，先采用胶水加热粘贴方法，将细胞筛网2与聚合物微孔阵列组件3直接连接，形成有网的聚合物微孔阵列组件3；
c.将底面修饰后的培养皿4与在所述步骤b中得到的覆有细胞筛网2的修饰后的聚合物微孔阵列组件3采用等离子体封接进行连接，使覆盖细胞筛网2的聚合物微孔阵列组件3设置于培养皿4容器内的底部；培养皿4采用普通培养皿的玻底培养皿，通过在培养皿4底部涂覆PDMS预聚体溶液，加热固化，得到底面修饰后的培养皿4；细胞筛网2采用PLGA筛网；
d.本步骤与实施例一相同；
e.本步骤与实施例一相同。
实验测试分析：
利用本实施例用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿进行细胞体外培养试验。利用本实施例制备笼结构微孔培养皿，其细胞筛网2为孔隙100微米的尼龙筛网，开展肺肿瘤细胞体外三维微组织形成研究。实验中，分别接种1×105个/mL肺非小细胞肺癌中的EGFR突变腺癌细胞株HCC827细胞于笼结构微孔培养皿中，细胞进入笼结构的聚合物微孔阵列组件3具有阵列式分布的细胞生长微孔槽中，经6天培养，得到HCC827细胞微团。
本实施例笼结构微孔培养皿能用于体外细胞三维微组织的形成，该笼结构微孔培养皿由四个基本部分组成，第一个基本部分为底面修饰后的培养皿4，第二个基本部分为修饰后的聚合物微孔阵列组件3，第三个基本部分为细胞筛网2，第四个基本部分为环形的细胞培养基贮存池1；该笼结构微孔培养皿能实现细胞接种、细胞长期培养、三维微组织形成、在线检测、多细胞三维共培养。在本实施例笼结构微孔培养皿中，单个HCC827细胞可通过细胞筛网2进入聚合物微孔阵列组件3具有阵列式分布的细胞生长微孔槽，在聚合物微孔阵列组件3中经培养形成三维微组织，形成后的三维微组织将不能再通过细胞筛网2，而被困于笼结构中。
实施例六
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，一种用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿，其第三个基本部分细胞筛网2直接覆盖于聚合物微孔阵列组件3上，并使第三个基本部分细胞筛网2与聚合物微孔阵列组件3保持直接接触状态，细胞筛网2与聚合物微孔阵列组件3直接连接，使细胞筛网2对聚合物微孔阵列组件3的具有阵列式分布的细胞生长微孔槽直接形成结网式覆盖结构，对聚合物微孔阵列组件3的具有阵列式分布的细胞生长微孔槽的开口上缘直接进行包封。
在本实施例中，一种本实施例用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿的制备方法，具体步骤如下：
a.本步骤与实施例一相同；
b.本步骤与实施例一相同；
c.将细胞筛网2与在所述步骤b中设置于培养皿4容器内的底部的聚合物微孔阵列组件3进行直接连接，使细胞筛网2直接覆盖于聚合物微孔阵列组件3上，并使细胞筛网2与聚合物微孔阵列组件3保持直接接触状态，使细胞筛网2对聚合物微孔阵列组件3的具有阵列式分布的细胞生长微孔槽直接形成结网式覆盖结构，对聚合物微孔阵列组件3的具有阵列式分布的细胞生长微孔槽的开口上缘直接进行包封；细胞筛网2采用海藻酸钙筛网；
将细胞筛网2与聚合物微孔阵列组件3直接连接时，先采用胶水加热粘贴方法，将细胞筛网2与设置于培养皿4容器内底部的聚合物微孔阵列组件3直接连接，在培养皿4容器内形成有网的聚合物微孔阵列组件3；
d.本步骤与实施例一相同；
e.本步骤与实施例一相同。
本实施例的第三个基本部分细胞筛网2直接覆盖于聚合物微孔阵列组件3上，并使第三个基本部分细胞筛网2与聚合物微孔阵列组件3保持直接接触状态，细胞筛网2与聚合物微孔阵列组件3直接连接，使细胞筛网2对聚合物微孔阵列组件3的具有阵列式分布的细胞生长微孔槽直接形成结网式覆盖结构，对聚合物微孔阵列组件3的具有阵列式分布的细胞生长微孔槽的开口上缘直接进行包封。
实验测试分析：
利用本实施例用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿进行细胞体外培养试验。利用本实施例制备笼结构微孔培养皿，其细胞筛网2为孔隙100微米的尼龙筛网，开展肺肿瘤细胞体外三维微组织形成研究。实验中，分别接种1×105个/mL肺非小细胞肺癌中的EGFR突变腺癌细胞株HCC827细胞于笼结构微孔培养皿中，细胞进入笼结构的聚合物微孔阵列组件3具有阵列式分布的细胞生长微孔槽中，经6天培养，得到HCC827细胞微团。
本实施例笼结构微孔培养皿能用于体外细胞三维微组织的形成，该笼结构微孔培养皿由四个基本部分组成，第一个基本部分为底面修饰后的培养皿4，第二个基本部分为修饰后的聚合物微孔阵列组件3，第三个基本部分为细胞筛网2，第四个基本部分为环形的细胞培养基贮存池1；该笼结构微孔培养皿能实现细胞接种、细胞长期培养、三维微组织形成、在线检测、多细胞三维共培养。在本实施例笼结构微孔培养皿中，单个HCC827细胞可通过细胞筛网2进入聚合物微孔阵列组件3具有阵列式分布的细胞生长微孔槽，在聚合物微孔阵列组件3中经培养形成三维微组织，形成后的三维微组织将不能再通过细胞筛网2，而被困于笼结构中。
实施例七
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，一种用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿的制备方法，具体步骤如下：
a.本步骤与实施例一相同；
b.本步骤与实施例一相同；
c.在完成所述步骤b后，将细胞筛网2与培养皿4直接连接，使细胞筛网2覆盖于聚合物微孔阵列组件3上方，并使细胞筛网2与聚合物微孔阵列组件3保持非接触状态，使细胞筛网2对培养皿4的开口形成结网式覆盖结构，将聚合物微孔阵列组件3包封于由细胞筛网2覆盖的培养皿4容器中；细胞筛网2采用聚碳酸酯筛网；
d.将PDMS圆片经打孔制备内外圈为同心圆的圆环作为细胞培养基贮存池1，经过所述步骤c完成对聚合物微孔阵列组件3的包封后，采用胶水加热粘贴方法，将细胞培养基贮存池1与培养皿4上缘进行连接，使细胞培养基贮存池1环形端面与培养皿4上缘表面形成连接部分，从而将四个基本部分封接组装成完整的笼结构微孔培养皿整体形式；在将细胞培养基贮存池1与培养皿4上缘进行连接后，继续采用胶水加热粘贴方法，对细胞培养基贮存池1环形端面与培养皿4上缘表面之间的缝隙进行辅助密封，使细胞培养基贮存池1与培养皿4连接形成一体式的生物培养容器；所述细胞培养基贮存池1具有围堰式环形结构，作为培养皿4上缘的延伸增高组件，细胞培养基贮存池1与培养皿4上缘连接，使培养皿4容器内腔深度增加；
e.本步骤与实施例一相同。
本实施例使用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿的一体式外壁无缝连接，防止培养液外溢。
实施例八
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，一种用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿的制备方法，具体步骤如下：
a.本步骤与实施例一相同；
b.将底面修饰后的培养皿4与在所述步骤a中得到的修饰后的聚合物微孔阵列组件3采用可逆封接进行连接，将聚合物微孔阵列组件3设置于培养皿4容器内的底部；培养皿4采用具有中心孔的玻底培养皿，通过在培养皿4底部涂覆PDMS预聚体溶液，加热固化，得到底面修饰后的培养皿4；
c.在完成所述步骤b后，将细胞筛网2与培养皿4直接连接，使细胞筛网2覆盖于聚合物微孔阵列组件3上方，并使细胞筛网2与聚合物微孔阵列组件3保持非接触状态，使细胞筛网2对培养皿4的开口形成结网式覆盖结构，将聚合物微孔阵列组件3包封于由细胞筛网2覆盖的培养皿4容器中；细胞筛网2采用聚聚苯乙烯筛网；
d.本步骤与实施例一相同；
e.本步骤与实施例一相同。
在本实施例，采用具有中心孔的玻底培养皿的作用在于，能配合使用共聚焦显微镜等对显微拍照工作距离有限制的设备进行光学检测及片层扫描。
上面结合附图对本实用新型实施例进行了说明，但本实用新型不限于上述实施例，还可以根据本实用新型的实用新型创造的目的做出多种变化，凡依据本实用新型技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本实用新型的实用新型目的，只要不背离本实用新型用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿的技术原理和实用新型构思，都属于本实用新型的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿，其特征在于，所述笼结构微孔培养皿由四个基本部分拼接组装组成：
第一个基本部分为底面修饰后的培养皿(4)，即在培养皿(4)底部结合生物相容性材料薄膜层，形成培养皿(4)容器内层；
第二个基本部分为修饰后的聚合物微孔阵列组件(3)，采用具有镂空微孔阵列结构的生物相容性材料薄膜，使聚合物微孔阵列组件(3)具有阵列式分布的细胞生长微孔槽，聚合物微孔阵列组件(3)外缘尺寸小于培养皿(4)容器内腔尺寸，能将聚合物微孔阵列组件(3)设置于培养皿(4)容器内的底部；
第三个基本部分为细胞筛网(2)，设置于聚合物微孔阵列组件(3)上方，细胞筛网(2)对聚合物微孔阵列组件(3)的具有阵列式分布的细胞生长微孔槽形成结网式覆盖结构，细胞筛网(2)采用生物相容性材料网形的网片组件，网孔大小能满足原始待培养的细胞通过并进入聚合物微孔阵列组件(3)的具有阵列式分布的细胞生长微孔槽内，并且使在培养皿(4)容器内设置的聚合物微孔阵列组件(3)的细胞生长微孔槽内经过培养后的长大的细胞组织或细胞微团无法通过穿越细胞筛网(2)进行迁移；
第四个基本部分为细胞培养基贮存池(1)，具有围堰式环形结构，作为培养皿(4)上缘的延伸增高组件，细胞培养基贮存池(1)与培养皿(4)上缘连接，使培养皿(4)容器内腔深度增加；
在所述笼结构微孔培养皿中，单个细胞能通过细胞筛网(2)进入聚合物微孔阵列组件(3)具有的阵列式分布的细胞生长微孔槽，在细胞生长微孔槽中经培养形成三维微组织，形成后的三维微组织将不能再通过细胞筛网(2)，而被困于所述笼结构微孔培养皿中。
2.根据权利要求1所述用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿，其特征在于：第一个基本部分底面修饰后的培养皿(4)与第二个基本部分修饰后的聚合物微孔阵列组件(3)采用等离子体封接或可逆封接，形成连接界面结构，将聚合物微孔阵列组件(3)固定安装在培养皿(4)容器腔内底部位置处。
3.根据权利要求1所述用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿，其特征在于：第三个基本部分细胞筛网(2)覆盖于聚合物微孔阵列组件(3)上方，并使第三个基本部分细胞筛网(2)与聚合物微孔阵列组件(3)保持非接触状态，细胞筛网(2)与培养皿(4)直接连接，使细胞筛网(2)对培养皿(4)的开口形成结网式覆盖结构，将聚合物微孔阵列组件(3)包封于由细胞筛网(2)覆盖的培养皿(4)容器中。
4.根据权利要求3所述用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿，其特征在于：当细胞筛网(2)与培养皿(4)直接连接时，采用胶水加热粘贴形成细胞筛网(2)与培养皿(4)的连接部分。
5.根据权利要求1所述用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿，其特征在于：第三个基本部分细胞筛网(2)直接覆盖于聚合物微孔阵列组件(3)上，并使第三个基本部分细胞筛网(2)与聚合物微孔阵列组件(3)保持直接接触状态，细胞筛网(2)与聚合物微孔阵列组件(3)直接连接，使细胞筛网(2)对聚合物微孔阵列组件(3)的具有阵列式分布的细胞生长微孔槽直接形成结网式覆盖结构，对聚合物微孔阵列组件(3)的具有阵列式分布的细胞生长微孔槽的开口上缘直接进行包封。
6.根据权利要求5所述用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿，其特征在于：当细胞筛网(2)与聚合物微孔阵列组件(3)直接连接时，采用胶水加热粘贴形成细胞筛网(2)与聚合物微孔阵列组件(3)的连接部分。
7.根据权利要求1～6中任意一项所述用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿，其特征在于：细胞培养基贮存池(1)与培养皿(4)上缘连接时，采用胶水加热粘贴形成细胞培养基贮存池(1)环形端面与培养皿(4)上缘表面的连接部分。
8.根据权利要求1～6中任意一项所述用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿，其特征在于：细胞筛网(2)的筛网空隙形状为圆形、方形和多边形中的任意一种或任意几种的混合；或者，细胞筛网(2)的筛网空隙尺寸大小为10～200微米。
9.根据权利要求1～6中任意一项所述用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿，其特征在于：培养皿(4)采用具有中心孔的培养皿。
10.根据权利要求1～6中任意一项所述用于体外细胞三维微组织形成的笼结构微孔培养皿，其特征在于：将细胞培养基贮存池(1)与培养皿(4)上缘进行连接后，采用胶水对细胞培养基贮存池(1)环形端面与培养皿(4)上缘表面之间的缝隙进行辅助密封，使细胞培养基贮存池(1)与培养皿(4)连接形成一体式的生物培养容器。
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