CN201828561U

CN201828561U - 一种微囊藻毒素mc-rr快速检测试剂盒

Info

Publication number: CN201828561U
Application number: CN2010205481734U
Authority: CN
Inventors: 张根义; 赵春城; 朱程琳; 孙秀兰; 杜前明; 郑立功; 陈波; 单金莲
Original assignee: WUXI BAIAOSEN TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: WUXI BAIAOSEN TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2010-09-29
Filing date: 2010-09-29
Publication date: 2011-05-11
Anticipated expiration: 2020-09-29

Abstract

本实用新型提供一种微囊藻毒素MC-RR的快速检测试剂盒。试剂盒的组成包括：微囊藻毒素MC-RR酶标物、微囊藻毒素MC-RR标准品、包被微囊藻毒素MC-RR抗体的酶标板、酶标物稀释试剂、洗涤试剂、显色试剂A、显色试剂B、终止试剂、标本稀释试剂。本实用新型还公开了一种应用上述试剂盒检测水中微囊藻毒素MC-RR的方法，它包括：首先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。应用ELISA试剂盒检测水中的微囊藻毒素MC-RR，具有检测特异性强、灵敏度高、分析能力大、检测速度快、费用低廉等优点，能适应大规模样品的快速筛查和预警监测。

Description

一种微囊藻毒素MC-RR快速检测试剂盒

技术领域

本实用新型涉及一种微囊藻毒素MC-RR的快速检测试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

微囊藻毒素（Microcystin，简称MC）是蓝藻产生的一类天然毒素。而科学家的研究表明，被微囊藻毒素污染的饮用水和水产品，给人类健康带来了巨大威胁。微囊藻是一类卑微的生物，但它们有时会表现出超乎寻常的生命力。不论常规的自来水处理工艺，还是将水煮沸，都难以有效去除微囊藻毒素。研究显示，即使在300摄氏度高温下微囊藻毒素仍然可以保留一部分活性。

微囊藻毒素在我国存在最普遍，含量相对较多的是MC-LR和MC-RR，其中L、R分别代表亮氨酸、精氨酸。微囊藻毒素MC-RR，是一类具生物活性的单环七肽，其化学结构式，如图1所示。

微囊藻毒素水华的频繁暴发严重威胁着生态安全和人类的饮水安全，对水中微囊藻毒素及时准确的监测非常重要。目前对水体中微囊藻毒素检测技术的研究开发非常活跃，主要有高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）、酶联免疫吸附试验（Emzyme-Linkde Immunosorbent Assay，ELISA）以及蛋白磷酸酶酶抑制试验（Protein Phosphatase Inhibition Assay，PPIA）等。

常规的理化检测方法，特别是液相色谱和质谱分析设备体积庞大、价格昂贵、需要环境条件较高的室内环境、而且还需要专门的技术人员操作、前处理复杂、检测费用昂贵；并且由于微囊藻毒素异构体众多，且性质近似，缺少相应标准品，成为微囊藻毒素大规模筛查的限制条件。而磷酸酶酶抑制试验虽然都能很好地检测出毒素，但是存在灵敏度不高或检测过程繁琐，样品能量小等不足。酶联免疫吸附试验(ELISA)是基于抗原－抗体特异性反应的分析方法，具有检测特异性强、灵敏度高、分析能量大、检测速度快、费用低廉等优点，而且能适应大规模样品的快速筛查和预警监测而被人们所重视和采用。

酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）是将酶的催化反应与抗原抗体的免疫学反应结合起来的一种检测技术。由于抗原、抗体反应的高度专一性，加之酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，因此能使测定方法达到很高的特异性和灵敏度。ELISA方法作为体外诊断及科学研究的手段，集中了抗原抗体反应的特异性和酶促反应的放大作用，理想的底物显示信号使其结果的判读更为客观、简单和快捷。

水中微囊藻毒素MC-RR的ELISA快速检测试剂盒还未见有此类专利报道。本实用新型专利利用ELISA技术建立了检测水中微囊藻毒素MC-RR的快速检测试剂盒及其检测方法。

实用新型内容

本实用新型需要解决的技术问题是提供一种灵敏度高、特异性强、使用方便、可以快速地检测水中微囊藻毒素MC-RR的ELISA快速检测试剂盒，以及这种试剂盒的检测方法。

为了解决上述技术问题，本实用新型的技术方案是：用于检测水中微囊藻毒素MC-RR的ELISA试剂盒的组成包括盒体，在盒体内设有微囊藻毒素MC-RR酶标物、微囊藻毒素MC-RR标准品、包被微囊藻毒素MC-RR抗体的酶标板、酶标物稀释试剂、洗涤试剂、显色试剂A、显色试剂B、终止试剂、标本稀释试剂。

本实用新型还提供一种水中微囊藻毒素MC-RR的ELISA检测方法。

本实用新型试剂盒的检测原理为：

一种微囊藻毒素MC-RR快速检测试剂盒是直接竞争酶联免疫吸附实验（ELISA）。已知微囊藻毒素MC-RR浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。微囊藻毒素MC-RR标准品和样品中的抗原竞争性地与酶标板上的微囊藻毒素MC-RR抗体结合。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入显色试剂A、B，和酶结合物同时作用，产生颜色，颜色的深浅和样品中微囊藻毒素MC-RR的浓度呈比例关系。

本实用新型中检测结果分析过程为：用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值（B）除以第一个标准溶液（O标准）的吸光度值（B_O）再乘以100%，即百分吸光度值。计算公式为：

百分吸光度值（%）＝（B/B_O）×100%

以微囊藻毒素MC-RR标准品浓度（μg/L）值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品的百分吸光度值，相对应每一个样品的浓度则可从标准曲线上读出样本中微囊藻毒素MC-RR的含量。

与现有技术相比，本实用新型具有如下的积极效果：

（1）本实用新型首次公开了一种检测水中微囊藻毒素MC-RR的ELISA试剂盒及检测方法，可定性或定量分析样品中的微囊藻毒素MC-RR，适合工厂生产；

（2）简单快捷。本实用新型的试剂盒所有试剂均为已配制好的工作液，可以直接操作无需处理，减少了操作步骤，可以快速，灵敏检测水环境或藻类制品中的微囊藻毒素MC-RR，避免了复杂的操作，对设备要求低，可以适应多种检测环境，以及多种检测需要；并且本实用新型的试剂盒样本用量小，试剂保存时间长，对操作者无毒性，对环境无污染等；

（3）灵敏度高。最小的检测浓度小于等于0.10ng/ml；

（4）特异性强。与其它微囊藻毒素结构类似物交叉反应率小于20%；

（5）重复性好。板内、板间变异数均小于10%；

（6）准确性高。回收率高。一般大于70%。

附图说明

图1：微囊藻毒素MC-RR的化学结构式；

图2：检测微囊藻毒素MC-RR的试剂盒示意图；

1、微囊藻毒素MC-RR标准品，2、显色试剂A、B，3、微囊藻毒素MC-RR酶标物酶标物

4、酶标物稀释试剂，5、标本稀释试剂，6、洗涤试剂，7、终止试剂，8、包被微囊藻毒素MC-RR抗体的酶标板

图3：微囊藻毒素MC-RR快速检测试剂盒的标准曲线图；

图4：人工抗原的合成图。

具体实施例

具体实施例1 人工抗原的合成及鉴定

微囊藻毒素MC-RR是一种小分子多肽，分子量为1038.2，是一种典型的半抗原。将它与载体蛋白结合而形成免疫抗原。为满足研究需要，我们将MC-RR分别与两种载体蛋白结合，制备了免疫抗原和包被抗原。如图4所示。

1 免疫抗原的制备

微囊藻毒素MC-RR和匙孔血蓝蛋白KLH采用“活泼酯法”偶联，按合成反应式（1）用0.1mL DMF溶解0.5mgMC-RR，加入溶解于DMF的EDC·HCl 0.75mg和NHS 0.75mg，振荡5min，室温反应30分钟，4℃冰箱过夜，得MC-RR活泼酯衍生物（Ⅰ）；3mg KLH溶于3mL0.1M pH9.6碳酸盐缓冲液中，将上述MC-RR活泼酯衍生物（Ⅰ）缓慢滴加入KLH溶液中，混匀，避光室温反应2小时。用0.01M PBS透析三天后分装，－20℃保存。

抗原的鉴定：采用紫外图谱分析法进行鉴定，通过波长200～400nm范围内的紫外光谱扫描是鉴定偶联物合成是否成功的常用方法。在波长238nm，测得偶联比为17。

注意：KLH溶解时，轻轻摇匀，禁止剧烈振荡。

2包被抗原的制备

微囊藻毒素MC-RR和牛血清白蛋白采用“碳二亚胺法”偶联，按合成反应式（2），0.5 mg微囊藻毒素MC-RR溶解于0.25mL乙醇中，再加入0.75mL去离子水，然后加入132 mgEDC·HCl，逐滴加入溶于1mL25%乙醇的2mgBSA，随后再加入132 mgEDC·HCl，混匀，4℃反应过夜。用0.01M PBS透析三天后分装，－20℃保存。

具体实施例2 微囊藻毒素MC-RR抗体的制备

以微囊藻毒素MC-RR作为免疫原，第一次免疫：1ml弗氏完全佐剂(FCA)与100ug抗原／1ml　PBS（一只兔子用量）充分研磨混匀，达到“油包水”的状态，分四点注射：双腋下、腹股沟；

第二次免疫：间隔4周，换用弗氏不完全佐剂，其余同第一次免疫；

第三次免疫：间隔4周，换用弗氏不完全佐剂，其余同第一次免疫；

测定血清效价，间接ELISA，10ug／ml抗原包被，效价1:64000以上可以放血，也可以再加强免疫一次：生理盐水稀释抗原，耳缘静脉注射，一周内放血。

具体实施例3 微囊藻毒素MC-RR酶标物的制备

酶标记抗体中的酶为辣根过氧化物酶（HRP），HRP-微囊藻毒素MC-RR酶标记物采用戊二醛交联法制备，具体如下：

1．取10mg HRP溶于0.2 mL1.25%戊二醛(用0.01mol/L、pH6.8磷酸盐缓冲溶液将25%戊二醛稀释为1.25%)，室温（20℃左右）反应结合18h；

2．用0.15mol/LNaCl平衡过的Sephadex G-50凝胶柱洗脱，除去游离的戊二醛，或用0.01mol/L，pH7.2 PBS，4℃透析过夜；

3．将5mg微囊藻毒素MC-RR抗体溶于1mL0.15mol/L NaCl，再与醛化HRP溶液（10mg/mL）混合；

4．加入0.1mL 1mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液（调节pH至9.0～9.6），4℃，电磁搅拌下结合24h；

5．加入0.1mL0.2mol/L赖氨酸（0.29g溶于10mL蒸馏水），4℃放置2h，以封闭残留的醛基，终止反应；

6．装入透析袋，以0.01mol/L、pH7.2 PBS，4℃透析过夜，或通过Sephadex G-200凝胶柱层析，用PBS洗脱，收集第1峰洗脱液，加入等量60%甘油，测工作效价后，小量分装，4℃或-20℃保存。

具体实施例4 检测微囊藻毒素MC-RR直接竞争ELISA试剂盒的组建

ELISA检测试剂盒包括以下组分：

1．微囊藻毒素MC-RR标准品：浓度分别为0μg/L、0.1μg/L、0.25μg/L、0.50μg/L、1μg/L和2μg/L，共六瓶；

2．包被微囊藻毒素MC-RR抗体的96孔聚苯乙烯酶标板，其制备方法如下：

按照常规方法：用离子强度为0.05mol/L~0.10mol/L，pH9.0~9.6碳酸盐缓冲液稀释包被抗体，将适量的包被抗体溶液加在聚苯乙烯酶标板上，4℃过夜。次日，加磷酸盐缓冲液洗板后，拍干，用包被液量150%~200%体积比的BSA溶液（3g/L）封闭。然后，在硅胶干燥器内放置过夜，加干燥剂密封包装；

3．微囊藻毒素MC-RR酶标物：HRP-微囊藻毒素MC-RR酶标物浓度为1-10 mg/L；

4．底物显色液：A液为0.1mol/L pH值为5.0的醋酸钠-柠檬酸缓冲液配制成0.3%过氧化氢储备液，每1mL缓冲液加入15μL储备液，制成使用液；B液为四甲基联苯胺，先用丙酮配成0.2mg/mL溶液，用0.1mol/L pH值为5.0的醋酸钠-柠檬酸缓冲液配制成0.2mg/L溶液；

5．洗涤液：含0.05%吐温-20的PBST缓冲液，pH值为7.4；

6．酶标物稀释液：含0.01%吐温-20的PBST缓冲液，pH值为7.4；

7．样品稀释液：含0.1%吐温-20的PBST缓冲液，pH值为7.4；

8．终止液： 2.0mol/L的H₂SO₄溶液；

9．盖板膜为8cm×12cm遮光防水不胶膜，可在潮湿环境下多次使用；

10．一次性滴管，包括1~3mL一次性塑料刻度滴管；

所有试剂在盒内按使用顺序摆放，试剂盒的保存温度为4℃保存。

具体实施例5 样品中微囊藻毒素MC-RR的检测

1．样品前处理：取待测水样，用样品稀释液1:10稀释，制备样品溶液。

2．试剂盒检测：

（1）将向包被微囊藻毒素MC-RR抗体的酶标板中加入样品或微囊藻毒素MC-RR标准品，并加入微囊藻毒素MC-RR酶标物，同时设置空白和阴性对照孔；

（2）轻轻振荡30秒，37℃ 30分钟；

（3）倾去孔内的液体，用洗涤液注满各孔，然后倒掉洗涤液，如此反复2-5次，最后一次在吸水纸上拍干；

（4）加入显色溶液A、B到酶标板孔中，37℃反应10-15min，颜色显蓝色，再加入终止液，立即变成黄色；

（5）用酶标仪读出OD450nm值，以不加微囊藻毒素MC-RR酶标物的小孔作为空白调零。

3．结果分析

绘制标准曲线，相对应每一个样品中微囊藻毒素MC-RR的含量可从标准曲线上读出，也可以用回归方程计算出样品中微囊藻毒素MC-RR的含量。测得的吸光度与样品中的微囊藻毒素MC-RR含量成反比，可通过标准曲线计算微囊藻毒素MC-RR的含量。

虽然结合以上实施例来描述本实用新型，但应当理解本实用新型并不限于所公开的实施例和附图，而是覆盖了落在本实用新型精神和范围内的所有修改和变形。

Claims

1.一种微囊藻毒素MC-RR快速检测试剂盒，组成包括：微囊藻毒素MC-RR酶标物、微囊藻毒素MC-RR标准品、包被微囊藻毒素MC-RR抗体的酶标板、酶标物稀释试剂、洗涤试剂、底物试剂、显色试剂、终止试剂、标本稀释试剂。