CN1986815A - Hcv复制子穿梭载体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了新的HCV复制子穿梭载体,可用于克隆来源于感染HCV患者样品的HCV多核苷酸序列以及测试所形成复制子的药物敏感性。
Description
发明领域
本发明涉及新的HCV复制子穿梭载体,它们可用于筛选、测试以及评估HCV聚合酶抑制剂。
发明背景
丙型肝炎病毒是严重的健康问题,并且是遍及世界的慢性肝病的主要致因(Boyer,N.等人J.Hepatol.2000 32:98-112)。感染了HCV的患者有发展为肝硬化继之以肝细胞癌的风险,因此HCV是肝移植的主要指标。
据世界卫生组织所说,全世界有多于2亿感染者,其中每年有至少300万-400万人被感染。一旦被感染,大约20%的人能清除此病毒,其余的人会终生携带HCV。10-20%的慢性感染者最终发展为破坏肝脏的硬化或癌症。这种病毒性疾病通过污染的血液和血制品、污染的针头肠胃外传播,或者性传播以及由感染或携带病毒的母亲垂直传染给她们的后代。当前对HCV感染的疗法受限于单独用重组干扰素-α或联合核苷类似物病毒唑进行的免疫疗法,这种疗法在临床上具有有限的益处,对于基因型1尤为如此。现在急需能有效抗击慢性HCV感染的改进的治疗剂。
HCV已被归为包括黄病毒属、瘟病毒属和包括丙型肝炎病毒的肝炎病毒属的黄病毒科成员(Rice,C.M.,Flaviviridae:The viruses and theirreplication.In:Fields Virology,编辑:Fields,B.N.,Knipe,D.M.和Howley,P.M.,Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,Pa.,第30章,931-959页,1996)。HCV是有包膜病毒,其含有约9.4kb的正义单链RNA基因组。所述病毒基因组由5’非翻译区(UTR)、编码约3011氨基酸的多蛋白前体的长开放阅读框和短的3’UTR组成。所述5’UTR是HCV基因组中最为高度保守的部分,且对于起始和控制多蛋白翻译非常重要。
对HCV的遗传分析鉴定出了六种主要的基因型,它们在DNA序列上显示出大于30%的趋异性。每种基因型包含一系列更加密切相关的亚型,它们在核苷酸序列上显示出20-25%的趋异性(Simmonds,P.2004 J.Gen.Virol.85:3173-88)。已经区分出了多于30种亚型。在美国大约70%的感染者具有1a型和1b型感染。在亚洲1b型最为普遍。(X.Forns和J.Bukh,Clinics in Liver Disease 1999 3:693-716;J.Bukh等人,Semin.Liv.Dis.1995 15:41-63)。不幸的是,就对当前疗法的敏感性而言,1型感染比2型或3型基因型更差(N.N.Zein,Clin.Microbiol.Rev.,2000 13:223-235)。
瘟病毒和肝炎病毒开放阅读框的非结构蛋白质部分的遗传结构和多蛋白加工非常类似。这些正链RNA病毒具有单一的、大的、编码病毒复制所必需的全部病毒蛋白质的开放阅读框(ORF)。这些蛋白质作为多蛋白表达,通过细胞和病毒编码的蛋白酶进行翻译中或翻译后加工,从而形成成熟的病毒蛋白质。负责病毒基因组RNA复制的病毒蛋白质位于羧基末端。三分之二的开放阅读框被称之为非结构(NS)蛋白质。对于瘟病毒和肝炎病毒,成熟的非结构蛋白质从此非结构蛋白质编码区的氨基末端到此开放阅读框的羧基末端依次包含p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。
瘟病毒和肝炎病毒的NS蛋白质享有特异性蛋白质功能所特有的序列结构域。例如,这两类病毒的NS3蛋白都具有丝氨酸蛋白酶和解旋酶所特有的氨基酸序列基序(Gorbalenya等人Nature 1988 333:22;Bazan和Fletterick Virology 1989 171:637-639;Gorbalenya等人Nucleic Acid Res.1989 17.3889-3897)。类似地,瘟病毒和肝炎病毒的NS5B蛋白具有RNA指导的RNA聚合酶所特有的基序(Koonin,E.V.和Dolia,V.V.Crit.Rev.Biochem.Molec.Biol.1993 28:375-430)。
瘟病毒和肝炎病毒的NS蛋白质在病毒生命周期中的实际角色和功能完全类似。在这两种(病毒的)情况下,NS3丝氨酸蛋白酶负责水解加工在开放阅读框中位于其下游的多蛋白前体的所有的蛋白(Wiskerchen和Collett Virology 1991 184:341-350;Bartenschlager等人J.Virol.199367:3835-3844;Eckart等人Biochem.Biophys.Res.Comm.1993 192:399-406;Grakoui等人J.Virol.1993 67:2832-2843;Grakoui等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993 90:10583-10587;Ilijikata等人J.Virol.1993 67:4665-4675;Tome等人J.Virol.1993 67:4017-4026)。在这两种(病毒的)情况下,NS4A蛋白充当NS3丝氨酸蛋白酶的辅因子(Bartenschlager等人J.Virol.199468:5045-5055;Failla等人J.Virol.1994 68:3753-3760;Xu等人J.Virol.199771:53 12-5322)。这两种病毒的NS3蛋白还有解旋酶的功能(Kim等人Biochem.Biophys.Res.Comm.1995 215:160-166;Jin和Peterson Arch.Biochem.Biophys.1995,323:47-53;Warrener和Collett J.Virol.199569:1720-1726)。最后,瘟病毒和肝炎病毒的NS5B蛋白具有推测的依赖于RNA的RNA聚合酶活性(Behrens等人EMBO 1996 15:12-22;Lechmann等人J.Virol.1997 71:8416-8428;Yuan等人Biochem.Biophyys.Res.Comm.1997 232:231-235;Hagedorn,PCT WO 97/12033;Zhong等人J.Virol.199872:9365-9369)。
目前存在有限数量的已被承认的疗法可用于HCV感染的治疗。治疗HCV和抑制HCV NS5B聚合酶的新的和现存的方法已被综述于以下文献中:R.G.Gish,Sem.Liver.Dis.,1999 19:5;Di Besceglie,A.M.和Bacon,B.R.,Scientific American,1999年10月,80-85;G.Lake-Bakaar,Current andFuture Therapy for Chronic Hepatitis C Virus Liver Disease,Curr.Drug Targ.Infect Dis.2003 3(3):247-253;P.Hoffman等人,Recent patents onexperimental therapy for hepatitis C virus infection(1999-2002),Exp.Opin.Ther.Patents 2003 13(11):1707-1723;F.F.Poordad等人Developments inHepatitis C therapy during 2000-2002,Exp.Opin.Emerging Drugs 20038(1):9-25;M.P.Walker等人,Promising Candidates for the treatment ofchronic hepatitis C,Exp.Opin.investing.Drugs 2003 12(8):1269-1280;S.-L.Tan等人,Hepatitis C Therapeutics:Current Status and Emerging Strategies,Nature Rev.Drug Discov.2002 1:867-881;R.De Francesco等人,Approaching a new era for hepatitis C virus therapy:inhibitors of the NS3-4Aserine protease and the NS5B RNA-dependent RNA polymerase,AntiviralRes.2003 58:1-16;Q.M.Wang等人,Hepatitis C virus encoded proteins:targets for antiviral therapy,Drugs of the Future 2000 25(9):933-8-944;J.A.Wu和Z.Hong,Targeting NS5B RNA-Dependent RNA Polymerase forAnti-HCV Chemotherapy,Cur.Drug Targ.-Inf.Dis.2003 3(3):207-219。
尽管在理解病毒的基因组结构和病毒蛋白质的功能方面取得进展,HCV复制和发病机理的基本原理仍然未知。获得HCV复制的实验途径的主要挑战在于缺乏能生产有感染性的病毒颗粒的高效细胞培养系统。尽管已经报道过原代细胞培养物和某些人类细胞系的感染,但是那些系统所生产的病毒量和HCV复制水平太低而不容许详细分析。
有人曾经报道过在人肝细胞瘤细胞系Hub-7中以最低效率复制的具有选择性的亚基因组HCV RNA的构建。Lohman等人报道了通过缺失蛋白质编码区的C-p7或C-NS2区构建的衍生自克隆的全长HCV共有基因组(基因型1b)的复制子(I377/NS3-3′)(Lohman等人,science 1999 285:110-113)。此复制子包含如下元件:(i)融合到衣壳编码区12个氨基酸的HCV5′-UTR;(ii)新霉素磷酸转移酶基因(NPTII);(iii)来源于脑心肌炎病毒(EMCV)的内核糖体进入位点(IRES),插入到NPTII基因的下游,指导HCV蛋白质NS2或NS3至NS5B的翻译;以及(iv)3′-UTR。转染Hub-7细胞后,只有支持HCV RNA复制的那些细胞表达NPTII蛋白,并且出现药物G418的抗性。虽然来源于这种G418抗性菌落的细胞系包含丰富的RNA复制子和病毒蛋白质,但是只有百万分之一转染的Hub-7细胞支持HCV复制。
基于HCV-H基因型1a感染克隆构建过类似的具有选择性的HCV复制子(Blight等人,Science 2000 290:1972-74)。衍生自HCV-H的复制子不能建立起有效的HCV复制,这暗示上述Lohmann(1999)早期构建的复制子依赖于那些实验中所使用的特定的基因型1b的共有cDNA克隆。上述的Blight等人(2000)通过进行基于PCR的基因装配操作再现了上述Lohmann(1999)等人所构建的复制子,并且获得了抗G418的Huh-7细胞群体。测序独立的G418抗性细胞群体以确定高水平的HCV复制是否需要复制子对宿主细胞进行适应。鉴定出在HCV非结构蛋白质NS5A中成簇的多种独立的适应突变。这些突变在体外赋予增强的复制能力,与本领域早期构建的复制子(例如,I377/NS3-3′复制子转导效率为0.0001%)相比,转染细胞的转导效率在0.2%到10%范围内。
发明内容
本发明的特征在于发展了一种新的HCV复制子穿梭载体,其中在NS5B基因的5′和3′末端引入独特的限制酶切位点,以使来源于HCV感染患者样品的NS5B序列能够克隆入此穿梭载体,并且生成的复制子能用于评估对HCV聚合酶抑制剂的复制适合度和敏感性。由于HCV感染的个体患者通常包含由NS5B RNA聚合酶的高错误率所导致的遗传多样性病毒群,使用本发明的穿梭载体将能够表征特定患者来源的NS5B变体以及这些变体对药物治疗的敏感性或抗性。
因此,本发明提供了包含HCV多核苷酸序列的HCV复制子穿梭载体,其中HCV多核苷酸序列按照顺序包括:编码NS3蛋白的多核苷酸序列、编码NS4A蛋白的多核苷酸序列、编码NS4B蛋白的多核苷酸序列、编码NS5A蛋白的多核苷酸序列、识别位于距离编码NS5B蛋白的多核苷酸序列5’端1-20个核苷酸之间的AsiSI或SnaBI的限制酶序列、编码NS5B蛋白的多核苷酸序列以及识别位于距离编码NS5B蛋白的多核苷酸序列3’端1-20个核苷酸之间的SacII或RsrII的限制酶序列。在本发明的一个实施方案中,HCV多核苷酸序列衍生自HCV基因型1a或1b。在本发明的另一个实施方案中,对编码NS5B蛋白的多核苷酸序列进行了修饰,从而使NS5B蛋白没有功能。又在本发明的另一个实施方案中,HCV复制子穿梭载体包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的HCV多核苷酸序列。
本发明的另一实施方案提供了评估HCV聚合酶抑制剂控制受试者HCV感染的效力的方法,此方法包括如下步骤:提供感染HCV的受试者样品,PCR扩增来自样品中众多HCV准种的编码NS5B蛋白的多核苷酸序列(使用包含识别AsiSI或SnaBI的限制酶序列的有义链引物以及包含识别SacII或RsrII的限制酶序列的反义链引物),将PCR扩增的多核苷酸序列克隆到HCV复制子穿梭载体中以生成嵌合HCV复制子质粒,线性化所述嵌合HCV复制子质粒并对线性化的质粒进行体外转录从而生产嵌合HCV复制子RNA,用所述HCV复制子RNA转染Huh7细胞系,并测量所述HCV复制子RNA在HCV聚合酶抑制剂存在或不存在情况下的复制水平。
本发明的另一个实施方案提供了评估HCV聚合酶抑制剂控制受试者的HCV感染的效力的方法,此方法包括如下步骤:提供感染HCV的受试者样品,PCR扩增来自样品中众多HCV准种的编码NS5B蛋白的多核苷酸序列(使用包含识别AsiSI或SnaBI的限制酶序列的有义链引物以及包含识别SacII或RsrII的限制酶序列的反义链引物),将所述PCR扩增的多核苷酸序列克隆到HCV复制子穿梭载体中以生成嵌合HCV复制子质粒,将所述质粒转化到细胞中以产生众多转化细胞群体,合并这些群体并且从中分离嵌合HCV复制子质粒,线性化所述嵌合HCV复制子质粒,并对线性化的质粒进行体外转录从而生产嵌合HCV复制子RNA,用所述HCV复制子RNA转染Huh7细胞系,并测量所述HCV复制子RNA在HCV聚合酶抑制剂存在或不存在情况下的复制水平。
考虑到下文本发明的详细描述,结合所附的阐明典型实施方案的实施例,本发明前述的以及其它的优点和特征,以及实现所述优点和特征的方法,将变得更加明显。
附图的简短说明
图1为HCV复制子穿梭载体以及能够将患者来源的NS5B序列克隆到载体中的限制酶位点(显示为AsiSI和RsrII限制性位点)引入位置的图示。
图2提供了把患者来源的NS5B PCR样品克隆到复制子穿梭载体以及检测生成的复制子的实验设计图示。
图3显示与参照复制子(对于基因型1b参照复制子为Con 1,而基因型1a为H77)的敏感性相比较,遗传多样性的并且是初次治疗的临床分离群对HCV聚合酶抑制剂噻吩-2-羧酸和苯并噻二嗪的敏感性差异。
定义
术语“HCV复制子”是指来源于丙型肝炎病毒的能够指导产生自身拷贝的核酸。如本文中所用的,术语“复制子”包括RNA和DNA,以及它们的杂合体。例如,HCV基因组的双链DNA形式能用于产生构成HCV复制子的单链RNA转录本。HCV复制子可以包含全长HCV基因组或HCV亚基因组构建体(又称作“亚基因组复制子”)。例如此处所描述的HCV亚基因组复制子包含大部分病毒非结构蛋白质基因,但是缺失大部分编码结构蛋白质的基因。亚基因组复制子能够指导病毒亚基因组复制、亚基因组复制子复制所必需的所有病毒基因的表达,但不会生成病毒颗粒。
基本的HCV复制子是亚基因组构建体,含有HCV 5’-非翻译区(UTR)、HCV NS3-NS5B多蛋白编码区以及HCV 3’-UTR。也可以存在其它核酸区,如提供HCV NS2、HCV结构蛋白质和非HCV序列的那些核酸区。
HCV 5’-UTR区为蛋白质翻译和复制所需元件提供内核糖体进入位点(IRES)。HCV 5’-UTR区包括天然存在的延伸入HCV核心编码区约36个核苷酸的HCV 5’-UTR以及其功能衍生物。5’-UTR区可以存在于不同位置上,如处于编码选择蛋白、报告蛋白、蛋白质或HCV多蛋白的序列下游的位点。
除HCV 5’-UTR-PC区之外,非HCV IRES元件也可以存在于复制子中。非HCV IRES元件可以存在于不同位置上,包括编码HCV多蛋白区域的紧邻上游。可用的非HCV IRES元件的实例是EMCV IRES、脊髓灰质炎病毒IRES和牛病毒性腹泻病毒IRES。
HCV 3’-UTR帮助HCV复制。HCV 3’-UTR包括天然存在的HCV 3’-UTR及其功能衍生物。天然存在的3’-UTR包括多聚尿苷束以及大约100个核苷酸的额外区域。
NS3-NS5B多蛋白编码区提供可以在细胞中加工为不同蛋白质的多蛋白。可能成为复制子一部分的适当的NS3-NS5B多蛋白序列包括导致NS3-NS5B加工从而形成功能性复制机器的存在于不同HCV株中的序列及其功能等价物。可以通过测定诸如依赖于NS5B RNA的RNA聚合酶来测量适当的加工。
可以用本领域众所周知的技术测量NS5B蛋白提供RNA聚合酶活性的能力。当NS5B蛋白的RNA聚合酶活性实质上不可测量时,此蛋白变为“无功能的”,这可以通过诸如引入核苷酸取代、插入或缺失“修饰”NS5B蛋白的多核苷酸序列而实现。
“载体”是一段DNA,如质粒、噬菌体或粘粒,其上可以连接另一段DNA片段,从而实现所连DNA片段的复制、表达或整合。“穿梭载体”是指这样的载体,其中可以将DNA片段在特定的限制酶位点上插入到载体中或自载体中切下。插入穿梭载体的DNA片段通常编码目的多肽或RNA,并且设计限制酶位点以确保DNA片段在正确的阅读框内插入以用于转录和翻译。
可以用多种载体表达核酸分子。这样的载体包括染色体型载体、附加型载体和病毒来源的载体,例如,来源于细菌质粒、噬菌体、酵母附加体、酵母染色体元件(包括酵母人工染色体)、病毒(如杆状病毒、乳头状多瘤空泡病毒(如SV40)、牛痘病毒、腺病毒、痘病毒、伪狂犬病病毒、疱疹病毒以及逆转录酶病毒)的载体。载体还可来源于这些来源的组合,例如来源于质粒和噬菌体遗传元件的那些载体,如粘粒和噬菌粒。原核生物和真核生物宿主的适当的克隆和表达载体描述于Sambrook等人,(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第2版.Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,USA。
可以用已知的技术将包含适当核酸分子的载体导入适当的宿主细胞中进行繁殖或表达。宿主细胞可以包括细菌细胞(包括但不限于大肠杆菌(E.coli)、链霉菌(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、真核细胞(包括,但不局限于酵母、昆虫细胞(如果蝇)、动物细胞(如Huh-7、Hela、COS、HEK 293、MT-2T、CEM-SS和CHO细胞)以及植物细胞)。
载体通常包含能够选择包含重组体载体构建体的细胞亚群的选择标记。标记可以包含于含有此处所述的核酸分子的同一载体中或者不同的载体中。对于原核宿主细胞,标记包括四环素或氨苄青霉素的抗性基因,对于真核宿主细胞,标记包括二氢叶酸还原酶或新霉素抗性。不过,任何提供表型性状选择的标记都将是有效的。
“多核苷酸”或“核酸分子”通常指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸,可以是未经修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链DNA、单链和双链区混合的DNA、单链和双链RNA、单链和双链区混合的RNA、包含DNA和RNA的杂合分子(可以是单链,或更通常为双链,或单链和双链区的混合体)。此外,“多核苷酸”还指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者都含有的三链区。“多核苷酸”还包括相对较短的多核苷酸,经常称之为寡核苷酸。
此外,术语“DNA分子”仅仅指分子的一级和二级结构,并且不限制为任何特定的三级结构形式。因此,此术语包括双链DNA,尤其是在线性DNA分子(如限制性片段)、病毒、质粒和染色体中所见的双链DNA。在讨论特定双链DNA分子结构的时候,在此处可以按照正常的惯例描述序列,即仅仅给出沿DNA非转录链(即具有同源于mRNA的序列的链)5’到3’方向的序列。
“RNA分子”指核糖核苷酸的多聚形式,或者为单链形式,或者为双链螺旋形式。在讨论特定RNA分子结构的时候,在此处可以按照正常的惯例按照5’到3’方向描述给出的序列。
术语“限制酶序列”指由分别在特定核酸序列处或其附近切割双链DNA的细菌的酶所识别和切割的特定双链DNA序列。限制酶“AsiSI”识别序列5’GCGATCGC 3’并且在识别序列的T残基后(显示为 ▲)切割双链
3’CGC▲TAGCG 5’DNA。限制酶“SnaBI”识别序列5’TACGTA 3’并在所示的核酸位置
3’ATG▲CAT 5’切割。类似地,“SacII”识别和切割5’CCGCGG 3’,
3’GG▲CGCC 5’而“RsrII”识别和切割5’CGGACCG 3’或5’CGGTCCG 3’
3’GCCTG▲GC 5’ 3’GCCAG▲GC 5’。
本文所用术语“引物”指当被置于适宜的环境中时能够作为依赖模板的核酸合成的起始子功能性地起作用的寡核苷酸,其可以为RNA或DNA;
可以为单链或双链;可以来自生物系统,由限制酶消化产生,或者是合成制备。当与合适的核酸模板、适当的核酸的核苷三磷酸前体、聚合酶、适当的辅因子以及适当的条件(如适当的温度和pH)同时存在时,引物可以通过聚合酶的作用在其3’末端添加核苷酸而被延长(延伸),或通过相似活性产生引物延伸产物。可以视应用的特定条件和需求而定来改变引物长度。例如,在PCR反应中,引物通常长度为15-25或更多的核苷酸。引物必须与期望的模板充分互补以引发期望的延伸产物的合成,即,引物能够与期望的模板链以这样的方式退火,从而足以保证引物的3’羟基部分合适地并置,以用于通过聚合酶或类似的酶起始合成。引物序列并不需要呈现与期望模板的精确互补。例如,非互补的核苷酸序列(如限制酶识别序列)可以被连接在另外的互补引物的5’端。备选地,只要引物序列与期望的模板链的序列充分互补,足以为延伸产物的合成功能性地提供引物-模板复合物,非互补的碱基就可以被散布在寡核苷酸引物序列中。
本文所用术语“嵌合”是指由融合或剪接在一起的两个或多个不同来源的DNA所产生的DNA分子。
本文所用术语“准种”是指超优势HCV基因组序列(即基因型)微变体的集合,由于HCV复制过程中的高突变性,所述微变体在单个感染个体中,或者甚至在单个细胞克隆中形成。
本文所用术语“受试者”是指脊椎动物、哺乳动物物种的特定成员,包括但不限于啮齿动物、兔、地鼠(shrew)以及灵长类,后者包括人。
术语“样品”是指从受试者中分离出的组织或液体样品,例如,包括但不限于血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤表面部分、呼吸道、肠道及泌尿生殖道、泪液、唾液、乳液、血细胞、肿瘤、器官以及体外细胞培养组分的样品(包括但不限于培养细胞生长所产生的条件培养基、推断的病毒感染细胞、重组细胞和细胞成分)。
当外源或异源DNA或RNA导入细胞内之后,则细胞被它们“转化”或“转染”。转化或转染的DNA或RNA可以或不可以整合(共价连接)入染色体DNA组成的细胞基因组。例如,在原核生物、酵母和哺乳动物细胞中,转化的DNA可以维持在附加体元件(如质粒)中。至于真核细胞,稳定转化的细胞中转化DNA整合入染色体中,从而通过染色体复制遗传给子代细胞。真核细胞建立起的由包含转化DNA的子代细胞群所组成的细胞系或克隆证实了这种稳定性。在如本发明所描述的转化哺乳动物细胞的HCV复制子情况下,RNA分子如HCV RNA分子,具有半自主复制的能力。通过选择标志的存在或存在于复制子中的报告基因可以检测到携带HCV复制子的Huh-7细胞。
“克隆”是指通常通过有丝分裂来源于单个细胞或共同祖先的细胞群落。
实施例
给出如下的制备过程和实施例以便本领域的技术人员能更加清楚地理解和实施本发明。不应当把它们看作是限制本发明的范围,而应当仅仅看作是其说明性和代表性的实例。
实施例1
质粒的构建
瞬时HCV基因型1b Con1复制子载体rep PI-luc/ET如图1所示。该载体从R.Bartenschlager获取,含有从5’-UTR、NS3至NS5B蛋白到3’-UTR的公布于GenBank登录号AJ238799的HCV多核苷酸序列。它还包括控制萤火虫荧光素酶基因翻译的脊髓灰质炎病毒内核糖体进入位点(IRES)。在萤火虫荧光素酶基因的下游,来源于脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES控制HCV非结构基因(NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)的翻译。
用pUC18骨架代替pBR322骨架以修饰瞬时复制子repPI-luc/ET载体,从而产生复制子pPI-luc/ET/SC(SEQ ID NO:1)。在测试分析中,pPI-luc/ET/SC与repPI-luc/ET(参见表1)复制水平类似。
瞬时HCV基因型1a H77复制子载体pSS-1通过连接来源于PPI-luc/ET/SC的SpeI-BsrGI片段和来源于HCV基因型1a H77(Yanagi等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1997 94:8738-8743;GenBank编号AF011751)的BsrGI-SpeI片段生成,其中pPI-luc/ET/SC的SpeI-BsrGI片段包含pUC18骨架核酸序列、5’-UTR、脊髓灰质炎病毒IRES、萤火虫荧光素酶、EMCV IRES和NS3基因(基因型1b-Con1)5’末端75个氨基酸,HCV基因型1a H77的BsrGI-SpeI片段包含NS3基因的其余部分至3’-UTR,还包含NS5A基因中的S2204I适应突变(Blight等人2000)。pSS-1的全长核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
为了达到定点诱变的目的,创建包含pPI-luc/ET/SC或pSS-1片段中间载体(pSLP),该片段包括亚克隆到pBSKII+载体的NS5A 3’末端区、NS5B编码区和3’-UTR(XhoI-SpeI片段)。用Quick Change定点诱变试剂盒按照制造商的说明(Stratagene,La Jolla,CA,USA)在中间载体pSLP中引入突变,并且通过双链DNA测序加以确认。在中间载体pSLP中创建此处所描述的定点突变体,然后将突变体片段XhoI-SpeI亚克隆入复制子载体(pPI-luc/ET/SC或pSS-1)。
为了创建用于表型分析的HCV复制子穿梭载体,用中间载体pSLP在位于NS5B基因起点5’端1-20个核苷酸的NS5A基因3’末端以及位于NS5B基因终点3’端1-20个核苷酸的3’-UTR中引入酶的限制性位点。在pSLP载体中创建了这两个位置上限制性位点的几种组合,然后亚克隆到复制子穿梭载体中。用pPI-luc/ET/SC载体作为模板以合成基因型1b穿梭载体pSC_1b_NS5B_5’AsiSI_3’RsrII(SEQ ID NO:3)和pSC_1b_NS5B_5’AsiSI_3’SacII(SEQ ID NO:4)。用pSS-1作为模板载体以合成基因型1a穿梭载体pSS-1_1a_NS5B_5’AsiSI_3’RsrII(SEQ ID NO:7)。
pSC_1b_NS5B_5’AsiSI_3’SacII用于创建NS5B基因中两个BglII位点之间的缺失,去除1.044kb的片段以生成复制子穿梭载体pSC_1b_delNS5B_5’AsiSI_3’SacII(SEQ ID NO:5)。由于缺失功能性NS5B蛋白(参见表1),缺失复制子的复制能力被破坏。
还构建了非自我复制型HCV复制子穿梭载体,其中用大约1.0kb的包含lacZ启动子和来源于质粒pAmCyan(Clontech Laboratories Inc.)的海葵Anemonia majano青色荧光蛋白(AmCyan)基因的核苷酸序列片段代替pSC_1b_NS5B_5’AsiSI_3’RsrII和pSS-1_1a_NS5B_5’AsiSI_3’RsrII内的NS5B核酸序列,从而分别产生穿梭载体pSC_1b_5’AsiSI_lacZAmC_3’RsrII(SEQ ID NO:6)和pSS-1_1a_5’AsiSI_lacZAmC_3’RsrII(SEQ ID NO:8)。
用实施例3中所描述的表型分析评估了若干这些穿梭载体的复制能力,结果如表1所示。
实施例2
将从感染患者中扩增的NS5B PCR样品克隆到pSC_1b_NS5B_5’AsiSI_3’SacII和pSC_1b_delNS5B_5’AsiSI_3’SacII中
图2提供了把患者来源的NS5B PCR样品克隆到复制子穿梭载体以及检测生成的复制子的实验设计图示。简言之,通过PCR直接从感染HCV患者的血浆或从血浆中扩增的DNA生成编码NS5B蛋白的DNA序列,使用变性引物或患者特异性引物,其中有义链引物包含AsiSI限制性位点序列,而反义链引物含有SacII限制性位点序列。所用的有义链AsiSI引物包括:
5’-GGAGGCTAGTGAGGAC
GCGATCGCTTGCTCAATGTCCTA-3’
(SEQ ID NO:9)
5’-GGAGGCTAGTGAGGAC
GCGATCGCTTGCTCAATGTCTTA-3’
(SEQ ID NO:10)
5’-GGAGGCTAGTGAGGAC
GCGATCGCTTGCTCRATGTCCTA-3’
(SEQ ID NO:11)
5’-GGAGGCTAGTGAGGAC
GCGATCGCCTGCTCAATGTCTTA-3’
(SEQ ID NO:12)
5’-GGAGGCTAGTGAGGAC
GCGATCGCCTGCTCAATGTCCTA-3’
(SEQ ID NO:13)
5’-GGAGGCTAGTGAGGAC
GCGATCGCTTGCTCRATGTCTTA-3’
(SEQ ID NO:14)
5’-GGAGGCTAGTGAGGAC
GCGATCGCYTGYTCAATGTCTTA-3’
(SEQ ID NO:15)
5’-GGAGGCTAGTGAGGAC
GCGATCGCCTGCTCGATGTCTTA-3’
(SEQ ID NO:16)
5’-GGAGGCTAGTGAGGAC
GCGATCGCCTGTTCGATGTCCTA-3’
(SEQ ID NO:17)
5’-GGAGGCTAGTGAGGAC
GCGATCGCCTGCTCRATGTCCTA-3’
(SEQ ID NO:18)
5’-GGAGGCTAGTGAGGAC
GCGATCGCCTGCTCGATGTCCTA-3’
(SEQ ID NO:19)
所用的反义链SacII引物包括:
5’-GGCCTGGAGTGTTTAGCT
CCGCGGTCATCGGTTGGGGTA-3’
(SEQ ID NO:20)
5’-GGCCTGGAGTGTTTAGCT
CCGCGGTCAYCGGTTGGGGAG-3’
(SEQ ID NO:21)
5’-GGCCTGGAGTGTTTAGCT
CCGCGGTCATCGGTTGGGAAG-3’
(SEQ ID NO:22)
5’-GGCCTGGAGTGTTTAGCT
CCGCGGTCAACGGTTGGGAAG-3’
(SEQ ID NO:23)
5’-GGCCTGGAGTGTTTAGCT
CCGCGGTCATCGGTTGGGAAG-3’
(SEQ ID NO:24)
用Accuprime Pfx(KOD聚合酶,Invitrogen)以确保高保真性和高产量。退火温度取决于患者样品和引物组合在60℃-68℃的范围内。然后用Qiagen PCR纯化柱纯化PCR扩增的患者NS5B DNA,用限制性内切酶SgfI(AsiSI的同裂酶)和SacII(Promega)双酶切消化,用Qiagen凝胶提取试剂盒(Gel Extraction Kit)进行凝胶纯化。
通过用限制性内切酶SgfI和SacII(Promega)双酶切消化制备穿梭复制子载体pSC_1b_NS5B_5’AsiSI_3’SacII或缺失的穿梭复制子载体pSC_1b_delNS5B_5’AsiSI_3’SacII。用1%琼脂糖电泳和Qiagen’s GelExtraction Kit凝胶纯化把载体从消化的插入物中分离出来。然后用虾碱性磷酸酶(Roche Applied Science)处理纯化的载体。
用T4 DNA连接酶(Roche Applied Science)使25ng穿梭载体与消化的患者扩增子在14-16℃连接过夜。通常载体与插入物的比率为1∶2到1∶4。过夜连接后,将5μl反应产物转化入100μl DH5αMaximum EfficiencyCells(Invitrogen)中,并且在37℃表型表达一小时后铺板。当用多于20%的转化混合物铺板时,第二天将获取充足的菌落。
精选96个独立的菌落,接种到200μl的补充50μg/ml氨苄青霉素的Terrific Broth(TB)中。这种96孔“母”板于37℃过夜孵育。第二天用此板制备一个复制板。用48格复印工具将板复制到两个补充100μg/ml羧苄青霉素的LB板上。96个独立的200μl培养物还转入用于制备DNA的补充50μg/ml氨苄青霉素的TB培养基中。37℃过夜孵育后,在复制板上涂抹6ml LB,以获得96个克隆的杂合库,此杂合库用于小量制备DNA。37℃过夜摇床后,离心沉淀96个独立的1.5ml TB培养物,倾出上清,用Qiagen’s Qiaprep 96 Turbo Mini-DNA试剂盒提取质粒DNA。对这些用于复制子表型分析的代表混合的96个库的独立的分子克隆进行测序反应。
把质粒DNA杂合克隆库进行测序以确定患者样品的身份,并在体外转录反应前筛选潜在的污染DNA。对独立的分子克隆进行测序,用于后续深入分析以获得表型复制子分析结果和患者NS5B序列之间的认识。通常用0.5μg质粒DNA和8pmol测序引物。
实施例3
将从感染患者中扩增的NS5B PCR样品克隆到pSC_1b_NS5B_5’AsiSI_3’RsrII、pSC_1b_5’AsiSI_lacZAmC_3’RsrII,pSS-1_1a_NS5B_5’AsiSI_3’RsrII和pSS-1_1a_5’AsiSI_lacZAmC_3’RsrII中
用实施例2所描述的操作把NS5B PCR样品克隆到在NS5B基因的3’末端包含RsrII的载体中,不同之处在于使用如下包含RsrII限制性位点的反义链引物PCR扩增患者NS5B:
5’-GGCCTGGAGTGTTTAGCT
CGGACCGTCATCGRTTGGGGAG-3’
(SEQ ID NO:25)
5’-GGCCTGGAGTGTTTAGCT
CGGACCGTCACCGGTTGGGGAG-3’
(SEQ ID NO:26)
5’-GGCCTGGAGTGTTTAGCT
CGGACCGTCAYCGGTTGGGGAG-3’
(SEQ ID NO:27)
5’-GGCCTGGAGTGTTTAGCT
CGGACCGTCATCGGTTGGGAAG-3’
(SEQ ID NO:28)
5’-GGCCTGGAGTGTTTAGCT
CGGACCGTCAACGGTTGGGAAG-3’
(SEQ ID NO:29)
5’-GGCCTGGAGTGTTTAGCT
CGGACCGTCAACGGTTGGGGTA-3’
(SEQ ID NO:30)
5’-GGCCTGGAGTGTTTAGCT
CGGACCGTCATCGGTTGGGRAG-3’
(SEQ ID NO:31)
5’-GGCCTGGAGTGTTTAGCT
CGGACCGTCATCGGTTGGGGTA-3’
(SEQ ID NO:32)
5’-GGCCTGGAGTGTTTAGCT
CGGACCGTCATCGGTTGGGAAG-3’
(SEQ ID NO:33)
实施例4
复制子表型分析
A.体外转录RNA的制备
用Sca I限制酶(Roche)把5μg DNA质粒线性化。37℃过夜消化后,用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化DNA。按照制造商的方案(Ambion)用T7Mega script试剂盒对1μg线性化的DNA进行体外转录。37℃孵育2小时后,在37℃用DNAase处理30分钟以除去DNA模板。然后用按照制造商的方案(Ambion)用NucAway旋转柱来纯化体外转录的RNA。
B.肝细胞瘤细胞系
于37℃在含5%CO2的潮湿空气中用补充GlutamaxTM和100mg/ml丙酮酸钠(Cat#10569-010)的Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)培养基培养治愈的肝细胞瘤细胞系Huh7。培养基还补充有10%(v/v)FBS(Cat#16000-036)和1%(v/v)青霉素/链霉素(Cat#15140-122)。所以试剂都来源Invitrogen/Gibco。
C.瞬时复制子复制水平的确定
用电穿孔法把5μg体外转录的RNA转染400万治愈的Huh7细胞。然后将细胞重悬于含5%FBS的7.2ml DMEM中,并且按照50000细胞/孔(终体积90μl)铺于96孔板中。转染24小时后加入抑制剂,抑制剂稀释三倍,在DMSO中的终浓度为1%,加入抑制剂72小时后用LuciferaseAssay系统(Promega,cat#E1501)读取萤火虫荧光素酶报告信号。评估IC50值为与不加入化合物时相比萤火虫荧光素酶的信号报告水平减少50%时的抑制剂浓度。化合物2’-C-甲基-胞嘧啶核苷对pSS-1_1a_NS5B_5’AsiSI_3’RsrII和具有患者来源NS5S序列的复制子复制的抑制效应的检测结果显示于表2。
为了测试遗传多样性的并且是初次治疗的临床分离群对HCV聚合酶抑制剂的敏感性,扩增了来源于所述分离群的NS5B编码区并克隆到复制子穿梭复制子(来源于基因型1a的临床分离群克隆入pSS-1_1a_5’AsiSI_lacZAmC_3’RsrII,来源于基因型1b的临床分离群克隆入pSC_1b_5’AsiSI_lacZAmC_3’RsrII)中。对于每种临床分离群合并96个分子克隆。对合并的DNA进行体外转录。然后按照上文描述在不存在和存在聚合酶抑制剂的情况下把体外转录的RNA电转化到Huh-7细胞中,从而确定IC50。图3显示与参照复制子Con1(基因型1b)和H77(基因型1a)相比,在NS5B临床分离群中的HCV聚合酶抑制剂噻吩-2-羧酸和苯并噻二嗪所表现出来的可变效力。
D.NS5B测序
在瞬时分析过程中,为了确定来源于患者的哪些NS5B序列能够复制,瞬时转染3天后用RNeasy Qiagen试剂盒分离全细胞RNA。进行RT-PCR和NS5B区的直接测序。然后将来源于转染Huh7细胞的NS5B核酸序列与来源于96份克隆库的NS5B核酸序列以及对患者样品的HCV核苷酸直接测序所得到的序列进行比较。
表1
质粒 | 载体骨架 | RLU水平a | 复制水平b |
rep PI-luc/ET(WT)pET_1b_NS5B_5’SnaBI_3’SacIIpPI-luc/ET/SC(WT)pSC_1b_NS5B_5’SnaBI_3’SacIIpSC_1b_NS5B_5’AsiSI_3’SacIIpSC_1b_delNS5B_5’SnaBI_3’SacIIpSC_1b_delNS5B_5’AsiSI_3’SacII | rep PI-luc/ETrep PI-luc/ETpPI-luc/ET/SCpPI-luc/ET/SCpPI-luc/ET/SCpPI-luc/ET/SCpPI-luc/ET/SC | 106037/114192/82493110649/378978259492/231992/315318164426/319456/331168886337/198268354147/421737832895/170064不可检测不可检测 | 野生型水平野生型水平野生型水平无复制无复制 |
aRLU代表复制72小时后所观察到的萤火虫荧光素酶信号。每一栏的数字代表来源于独立实验的不同数据。
b复制水平与野生型载体(未引入限制性位点)相比较。
表2
NS5B序列 | 2’-C-Me-C IC50(μM)a |
pSS-1_1a_NS5B_5’AsiSI_3’RsrII临床分离群Pt5临床分离群Pt6临床分离群Pt7临床分离群Pt8临床分离群Pt9 | 0.4±0.030.3±0.050.3±0.040.3±0.050.4±0.070.4±0.06 |
a2’-C-甲基-胞嘧啶核苷对瞬时HCV复制子RNA复制(包含来源于基因型1a临床分离群的NS5B,插入在穿梭载体pSS-1_1a_NS5B_5’AsiSI_3’RsrII中)的抑制;平均IC50值和标准平均误差至少由n=3次实验决定。
序列表
<110>弗·哈夫曼-拉罗切有限公司
<120>HCV复制子穿梭载体
<130>23543
<160>33
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>11518
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pPI-luc/ET/SC的核苷酸序列
<400>1
cctgcaggta atacgactca ctatagccag cccccgattg ggggcgacac tccaccatag 60
atcactcccc tgtgaggaac tactgtcttc acgcagaaag cgtctagcca tggcgttagt 120
atgagtgtcg tgcagcctcc aggacccccc ctcccgggag agccatagtg gtctgcggaa 180
ccggtgagta caccggaatt gccaggacga ccgggtcctt tcttggatca acccgctcaa 240
tgcctggaga tttgggcgtg cccccgcgag actgctagcc gagtagtgtt gggtcgcgaa 300
aggccttgtg gtactgcctg atagggtgct tgcgagtgcc ccgggaggtc tcgtagaccg 360
tgcaccgttt aaacccccgt gctgctggaa gtcgatttca ggcttagggt aaccgtggac 420
ctcgaaaaca gacgcacaaa accaagttca atagaagggg gtacaaacca gtaccaccac 480
gaacaagcac ttctgtttcc ccggtgatgt cgtatagact gcttgcgtgg ttgaaagcga 540
cggatccgtt atccgcttat gtacttcgag aagcccagta ccacctcgga atcttcgatg 600
cgttgcgctc agcactcaac cccagagtgt agcttaggct gatgagtctg gacatccctc 660
accggtgacg gtggtccagg ctgcgttggc ggcctaccta tggctaacgc catgggacgc 720
tagttgtgaa caaggtgtga agagcctatt gagctacata agaatcctcc ggcccctgaa 780
tgcggctaat cccaacctcg gagcaggtgg tcacaaacca gtgattggcc tgtcgtaacg 840
cgcaagtccg tggcggaacc gactactttg ggtgtccgtg tttcctttta ttttattgtg 900
gctgcttatg gtgacaatca cagattgtta tcataaagcg aattggattg gccatccggt 960
gaaagtgaga ctcattatct atctgtttgc tggatccgct ccattgagtg tgtttactct 1020
aagtacaatt tcaacagtta tttcaatcag acaattgtat cataatggcg ggcccagaag 1080
acgccaaaaa cataaagaaa ggcccggcgc cattctatcc tctagaggat ggaaccgctg 1140
gagagcaact gcataaggct atgaagagat acgccctggt tcctggaaca attgctttta 1200
cagatgcaca tatcgaggtg aacatcacgt acgcggaata cttcgaaatg tccgttcggt 1260
tggcagaagc tatgaaacga tatgggctga atacaaatca cagaatcgtc gtatgcagtg 1320
aaaactctct tcaattcttt atgccggtgt tgggcgcgtt atttatcgga gttgcagttg 1380
cgcccgcgaa cgacatttat aatgaacgtg aattgctcaa cagtatgaac atttcgcagc 1440
ctaccgtagt gtttgtttcc aaaaaggggt tgcaaaaaat tttgaacgtg caaaaaaaat 1500
taccaataat ccagaaaatt attatcatgg attctaaaac ggattaccag ggatttcagt 1560
cgatgtacac gttcgtcaca tctcatctac ctcccggttt taatgaatac gattttgtac 1620
cagagtcctt tgatcgtgac aaaacaattg cactgataat gaattcctct ggatctactg 1680
ggttacctaa gggtgtggcc cttccgcata gaactgcctg cgtcagattc tcgcatgcca 1740
gagatcctat ttttggcaat caaatcattc cggatactgc gattttaagt gttgttccat 1800
tccatcacgg ttttggaatg tttactacac tcggatattt gatatgtgga tttcgagtcg 1860
tcttaatgta tagatttgaa gaagagctgt ttttacgatc ccttcaggat tacaaaattc 1920
aaagtgcgtt gctagtacca accctatttt cattcttcgc caaaagcact ctgattgaca 1980
aatacgattt atctaattta cacgaaattg cttctggggg cgcacctctt tcgaaagaag 2040
tcggggaagc ggttgcaaaa cgcttccatc ttccagggat acgacaagga tatgggctca 2100
ctgagactac atcagctatt ctgattacac ccgaggggga tgataaaccg ggcgcggtcg 2160
gtaaagttgt tccatttttt gaagcgaagg ttgtggatct ggataccggg aaaacgctgg 2220
gcgttaatca gagaggcgaa ttatgtgtca gaggacctat gattatgtcc ggttatgtaa 2280
acaatccgga agcgaccaac gccttgattg acaaggatgg atggctacat tctggagaca 2340
tagcttactg ggacgaagac gaacacttct tcatagttga ccgcttgaag tctttaatta 2400
aatacaaagg atatcaggtg gcccccgctg aattggaatc gatattgtta caacacccca 2460
acatcttcga cgcgggcgtg gcaggtcttc ccgacgatga cgccggtgaa cttcccgccg 2520
ccgttgttgt tttggagcac ggaaagacga tgacggaaaa agagatcgtg gattacgtcg 2580
ccagtcaagt aacaaccgcg aaaaagttgc gcggaggagt tgtgtttgtg gacgaagtac 2640
cgaaaggtct taccggaaaa ctcgacgcaa gaaaaatcag agagatcctc ataaaggcca 2700
agaagggcgg aaagtccaaa ttgtaagcgg ccgcgttgtt aaacagacca caacggtttc 2760
cctctagcgg gatcaattcc gccccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa 2820
taaggccggt gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat 2880
gtgagggccc ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct 2940
ctcgccaaag gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct 3000
tcttgaagac aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc 3060
gacaggtgcc tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa 3120
ccccagtgcc acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc 3180
gtattcaaca aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg 3240
gggcctcggt gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc 3300
ccgaaccacg gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat aataccatgg cgcctattac 3360
ggcctactcc caacagacgc gaggcctact tggctgcatc atcactagcc tcacaggccg 3420
ggacaggaac caggtcgagg gggaggtcca agtggtctcc accgcaacac aatctttcct 3480
ggcgacctgc gtcaatggcg tgtgttggac tgtctatcat ggtgccggct caaagaccct 3540
tgccggccca aagggcccaa tcacccaaat gtacaccaat gtggaccagg acctcgtcgg 3600
ctggcaagcg ccccccgggg cgcgttcctt gacaccatgc acctgcggca gctcggacct 3660
ttacttggtc acgaggcatg ccgatgtcat tccggtgcgc cggcggggcg acagcagggg 3720
gagcctactc tcccccaggc ccgtctccta cttgaagggc tcttcgggcg gtccactgct 3780
ctgcccctcg gggcacgctg tgggcatctt tcgggctgcc gtgtgcaccc gaggggttgc 3840
gaaggcggtg gactttgtac ccgtcgagtc tatgggaacc actatgcggt ccccggtctt 3900
cacggacaac tcgtcccctc cggccgtacc gcagacattc caggtggccc atctacacgc 3960
ccctactggt agcggcaaga gcactaaggt gccggctgcg tatgcagccc aagggtataa 4020
ggtgcttgtc ctgaacccgt ccgtcgccgc caccctaggt ttcggggcgt atatgtctaa 4080
ggcacatggt atcgacccta acatcagaat cggggtaagg accatcacca cgggtgcccc 4140
catcacgtac tccacctatg gcaagtttct tgccgacggt ggttgctctg ggggcgccta 4200
tgacatcata atatgtgatg agtgccactc aactgactcg accactatcc tgggcatcgg 4260
cacagtcctg gaccaagcgg agacggctgg agcgcgactc gtcgtgctcg ccaccgctac 4320
gcctccggga tcggtcaccg tgccacatcc aaacatcgag gaggtggctc tgtccagcac 4380
tggagaaatc cccttttatg gcaaagccat ccccatcgag accatcaagg gggggaggca 4440
cctcattttc tgccattcca agaagaaatg tgatgagctc gccgcgaagc tgtccggcct 4500
cggactcaat gctgtagcat attaccgggg ccttgatgta tccgtcatac caactagcgg 4560
agacgtcatt gtcgtagcaa cggacgctct aatgacgggc tttaccggcg atttcgactc 4620
agtgatcgac tgcaatacat gtgtcaccca gacagtcgac ttcagcctgg acccgacctt 4680
caccattgag acgacgaccg tgccacaaga cgcggtgtca cgctcgcagc ggcgaggcag 4740
gactggtagg ggcaggatgg gcatttacag gtttgtgact ccaggagaac ggccctcggg 4800
catgttcgat tcctcggttc tgtgcgagtg ctatgacgcg ggctgtgctt ggtacgagct 4860
cacgcccgcc gagacctcag ttaggttgcg ggcttaccta aacacaccag ggttgcccgt 4920
ctgccaggac catctggagt tctgggagag cgtctttaca ggcctcaccc acatagacgc 4980
ccatttcttg tcccagacta agcaggcagg agacaacttc ccctacctgg tagcatacca 5040
ggctacggtg tgcgccaggg ctcaggctcc acctccatcg tgggaccaaa tgtggaagtg 5100
tctcatacgg ctaaagccta cgctgcacgg gccaacgccc ctgctgtata ggctgggagc 5160
cgttcaaaac gaggttacta ccacacaccc cataaccaaa tacatcatgg catgcatgtc 5220
ggctgacctg gaggtcgtca cgagcacctg ggtgctggta ggcggagtcc tagcagctct 5280
ggccgcgtat tgcctgacaa caggcagcgt ggtcattgtg ggcaggatca tcttgtccgg 5340
aaagccggcc atcattcccg acagggaagt cctttaccgg gagttcgatg agatggaaga 5400
gtgcgcctca cacctccctt acatcgaaca gggaatgcag ctcgccgaac aattcaaaca 5460
gaaggcaatc gggttgctgc aaacagccac caagcaagcg gaggctgctg ctcccgtggt 5520
ggaatccaag tggcggaccc tcgaagcctt ctgggcgaag catatgtgga atttcatcag 5580
cgggatacaa tatttagcag gcttgtccac tctgcctggc aaccccgcga tagcatcact 5640
gatggcattc acagcctcta tcaccagccc gctcaccacc caacataccc tcctgtttaa 5700
catcctgggg ggatgggtgg ccgcccaact tgctcctccc agcgctgctt ctgctttcgt 5760
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tattttggca ggttatggag caggggtggc aggcgcgctc gtggccttta aggtcatgag 5880
cggcgagatg ccctccaccg aggacctggt taacctactc cctgctatcc tctcccctgg 5940
cgccctagtc gtcggggtcg tgtgcgcagc gatactgcgt cggcacgtgg gcccagggga 6000
gggggctgtg cagtggatga accggctgat agcgttcgct tcgcggggta accacgtctc 6060
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ccttgagggg gagccggggg atcccgatct cagcgacggg tcttggtcta ccgtaagcga 7500
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gacgccccca cattcggcca gatctaaatt tggctatggg gcaaaggacg tccggaacct 7860
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gacaccaatt gacaccacca tcatggcaaa aaatgaggtt ttctgcgtcc aaccagagaa 7980
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ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc 9660
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<210>2
<211>11509
<212>DNA
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<220>
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<400>2
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ccatgccaga aaggccgtag cccacatcaa ctccgtgtgg aaagaccttc tggaagacag 7920
tgtaacacca attgacacta ccatcatggc caagaacgag gttttctgcg ttcagcctga 7980
gaaggggggt cgtaagccag ctcgtctcat cgtgttcccc gacctgggcg tgcgcgtgtg 8040
cgagaagatg gccctgtacg acgtggttag caagctcccc ctggccgtga tgggaagctc 8100
ctacggattc caatactcac caggacagcg ggttgaattc ctcgtgcaag cgtggaagtc 8160
caagaagacc ccgatggggt tctcgtatga tacccgctgt tttgactcca cagtcactga 8220
gagcgacatc cgtacggagg aggcaattta ccaatgttgt gacctggacc cccaagcccg 8280
cgtggccatc aagtccctca ctgagaggct ttatgttggg ggccctctta ccaattcaag 8340
gggggaaaac tgcggctacc gcaggtgccg cgcgagcggc gtactgacaa ctagctgtgg 8400
taacaccctc acttgctaca tcaaggcccg ggcagcctgt cgagccgcag ggctccagga 8460
ctgcaccatg ctcgtgtgtg gcgacgactt agtcgttatc tgtgaaagtg cgggggtcca 8520
ggaggacgcg gcgagcctga gagccttcac ggaggctatg accaggtact ccgccccccc 8580
cggggacccc ccacaaccag aatacgactt ggagcttata acatcatgct cctccaacgt 8640
gtcagtcgcc cacgacggcg ctggaaagag ggtctactac cttacccgtg accctacaac 8700
ccccctcgcg agagccgcgt gggagacagc aagacacact ccagtcaatt cctggctagg 8760
caacataatc atgtttgccc ccacactgtg ggcgaggatg atactgatga cccatttctt 8820
tagcgtcctc atagccaggg atcagcttga acaggctctt aactgtgaga tctacggagc 8880
ctgctactcc atagaaccac tggatctacc tccaatcatt caaagactcc atggcctcag 8940
cgcattttca ctccacagtt actctccagg tgaaatcaat agggtggccg catgcctcag 9000
aaaacttggg gtcccgccct tgcgagcttg gagacaccgg gcccggagcg tccgcgctag 9060
gcttctgtcc agaggaggca gggctgccat atgtggcaag tacctcttca actgggcagt 9120
aagaacaaag ctcaaactca ctccaatagc ggccgctggc cggctggact tgtccggttg 9180
gttcacggct ggctacagcg ggggagacat ttatcacagc gtgtctcatg cccggccccg 9240
ctggttctgg ttttgcctac tcctgctcgc tgcaggggta ggcatctacc tcctccccaa 9300
ccgatgaagg ttggggtaaa cactccggcc tcttaagcca tttcctgttt tttttttttt 9360
tttttttttt tttttctttt tttttttctt tcctttcctt ctttttttcc tttctttttc 9420
ccttctttaa tggtggctcc atcttagccc tagtcacggc tagctgtgaa aggtccgtga 9480
gccgcttgac tgcagagagt gctgatactg gcctctctgc agatcaagta ctagtagagg 9540
cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt 9600
tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc 9660
aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa 9720
aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa 9780
tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc 9840
ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc 9900
cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag 9960
ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga 10020
ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc 10080
gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac 10140
agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg 10200
cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca 10260
aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa 10320
aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa 10380
ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt 10440
aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag 10500
ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat 10560
agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc 10620
cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa 10680
ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca 10740
gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa 10800
cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt 10860
cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc 10920
ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact 10980
catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc 11040
tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg 11100
ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct 11160
catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc 11220
cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag 11280
cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac 11340
acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg 11400
ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt 11460
tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatt 11509
<210>3
<211>11518
<212>DNA
<213>人工序列
<220>质粒pSC_1b_NS5B_5`AsiSI_3`RsrII的核苷酸序列
<400>3
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ccggtgagta caccggaatt gccaggacga ccgggtcctt tcttggatca acccgctcaa 240
tgcctggaga tttgggcgtg cccccgcgag actgctagcc gagtagtgtt gggtcgcgaa 300
aggccttgtg gtactgcctg atagggtgct tgcgagtgcc ccgggaggtc tcgtagaccg 360
tgcaccgttt aaacccccgt gctgctggaa gtcgatttca ggcttagggt aaccgtggac 420
ctcgaaaaca gacgcacaaa accaagttca atagaagggg gtacaaacca gtaccaccac 480
gaacaagcac ttctgtttcc ccggtgatgt cgtatagact gcttgcgtgg ttgaaagcga 540
cggatccgtt atccgcttat gtacttcgag aagcccagta ccacctcgga atcttcgatg 600
cgttgcgctc agcactcaac cccagagtgt agcttaggct gatgagtctg gacatccctc 660
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tagttgtgaa caaggtgtga agagcctatt gagctacata agaatcctcc ggcccctgaa 780
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cagatgcaca tatcgaggtg aacatcacgt acgcggaata cttcgaaatg tccgttcggt 1260
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aaaactctct tcaattcttt atgccggtgt tgggcgcgtt atttatcgga gttgcagttg 1380
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taccaataat ccagaaaatt attatcatgg attctaaaac ggattaccag ggatttcagt 1560
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cagagtcctt tgatcgtgac aaaacaattg cactgataat gaattcctct ggatctactg 1680
ggttacctaa gggtgtggcc cttccgcata gaactgcctg cgtcagattc tcgcatgcca 1740
gagatcctat ttttggcaat caaatcattc cggatactgc gattttaagt gttgttccat 1800
tccatcacgg ttttggaatg tttactacac tcggatattt gatatgtgga tttcgagtcg 1860
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gtattcaaca aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg 3240
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cacggacaac tcgtcccctc cggccgtacc gcagacattc caggtggccc atctacacgc 3960
ccctactggt agcggcaaga gcactaaggt gccggctgcg tatgcagccc aagggtataa 4020
ggtgcttgtc ctgaacccgt ccgtcgccgc caccctaggt ttcggggcgt atatgtctaa 4080
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catcacgtac tccacctatg gcaagtttct tgccgacggt ggttgctctg ggggcgccta 4200
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gcctccggga tcggtcaccg tgccacatcc aaacatcgag gaggtggctc tgtccagcac 4380
tggagaaatc cccttttatg gcaaagccat ccccatcgag accatcaagg gggggaggca 4440
cctcattttc tgccattcca agaagaaatg tgatgagctc gccgcgaagc tgtccggcct 4500
cggactcaat gctgtagcat attaccgggg ccttgatgta tccgtcatac caactagcgg 4560
agacgtcatt gtcgtagcaa cggacgctct aatgacgggc tttaccggcg atttcgactc 4620
agtgatcgac tgcaatacat gtgtcaccca gacagtcgac ttcagcctgg acccgacctt 4680
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gcacaggtac gctccagcgt gcaaacccct cctacgggag gaggtcacat tcctggtcgg 6720
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gacgccccca cattcggcca gatctaaatt tggctatggg gcaaaggacg tccggaacct 7860
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gaaatgccct atgggcttcg catatgacac ccgctgtttt gactcaacgg tcactgagaa 8220
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ggccataagg tcgctcacag agcggcttta catcgggggc cccctgacta attctaaagg 8340
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catccttcta gctcaggaac aacttgaaaa agccctagat tgtcagatct acggggcctg 8880
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cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 10320
cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 10380
gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta 10440
gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg 10500
gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg 10560
ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc 10620
atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc 10680
agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc 10740
ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag 10800
tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat 10860
ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg 10920
caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt 10980
gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag 11040
atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg 11100
accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt 11160
aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct 11220
gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac 11280
tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat 11340
aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat 11400
ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca 11460
aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccatt 11518
<210>4
<211>11518
<212>DNA
<213>人工序列
<220>质粒pSC_1b_NS5B_5`AsiSI_3`SacII的核苷酸序列
<400>4
cctgcaggta atacgactca ctatagccag cccccgattg ggggcgacac tccaccatag 60
atcactcccc tgtgaggaac tactgtcttc acgcagaaag cgtctagcca tggcgttagt 120
atgagtgtcg tgcagcctcc aggacccccc ctcccgggag agccatagtg gtctgcggaa 180
ccggtgagta caccggaatt gccaggacga ccgggtcctt tcttggatca acccgctcaa 240
tgcctggaga tttgggcgtg cccccgcgag actgctagcc gagtagtgtt gggtcgcgaa 300
aggccttgtg gtactgcctg atagggtgct tgcgagtgcc ccgggaggtc tcgtagaccg 360
tgcaccgttt aaacccccgt gctgctggaa gtcgatttca ggcttagggt aaccgtggac 420
ctcgaaaaca gacgcacaaa accaagttca atagaagggg gtacaaacca gtaccaccac 480
gaacaagcac ttctgtttcc ccggtgatgt cgtatagact gcttgcgtgg ttgaaagcga 540
cggatccgtt atccgcttat gtacttcgag aagcccagta ccacctcgga atcttcgatg 600
cgttgcgctc agcactcaac cccagagtgt agcttaggct gatgagtctg gacatccctc 660
accggtgacg gtggtccagg ctgcgttggc ggcctaccta tggctaacgc catgggacgc 720
tagttgtgaa caaggtgtga agagcctatt gagctacata agaatcctcc ggcccctgaa 780
tgcggctaat cccaacctcg gagcaggtgg tcacaaacca gtgattggcc tgtcgtaacg 840
cgcaagtccg tggcggaacc gactactttg ggtgtccgtg tttcctttta ttttattgtg 900
gctgcttatg gtgacaatca cagattgtta tcataaagcg aattggattg gccatccggt 960
gaaagtgaga ctcattatct atctgtttgc tggatccgct ccattgagtg tgtttactct 1020
aagtacaatt tcaacagtta tttcaatcag acaattgtat cataatggcg ggcccagaag 1080
acgccaaaaa cataaagaaa ggcccggcgc cattctatcc tctagaggat ggaaccgctg 1140
gagagcaact gcataaggct atgaagagat acgccctggt tcctggaaca attgctttta 1200
cagatgcaca tatcgaggtg aacatcacgt acgcggaata cttcgaaatg tccgttcggt 1260
tggcagaagc tatgaaacga tatgggctga atacaaatca cagaatcgtc gtatgcagtg 1320
aaaactctct tcaattcttt atgccggtgt tgggcgcgtt atttatcgga gttgcagttg 1380
cgcccgcgaa cgacatttat aatgaacgtg aattgctcaa cagtatgaac atttcgcagc 1440
ctaccgtagt gtttgtttcc aaaaaggggt tgcaaaaaat tttgaacgtg caaaaaaaat 1500
taccaataat ccagaaaatt attatcatgg attctaaaac ggattaccag ggatttcagt 1560
cgatgtacac gttcgtcaca tctcatctac ctcccggttt taatgaatac gattttgtac 1620
cagagtcctt tgatcgtgac aaaacaattg cactgataat gaattcctct ggatctactg 1680
ggttacctaa gggtgtggcc cttccgcata gaactgcctg cgtcagattc tcgcatgcca 1740
gagatcctat ttttggcaat caaatcattc cggatactgc gattttaagt gttgttccat 1800
tccatcacgg ttttggaatg tttactacac tcggatattt gatatgtgga tttcgagtcg 1860
tcttaatgta tagatttgaa gaagagctgt ttttacgatc ccttcaggat tacaaaattc 1920
aaagtgcgtt gctagtacca accctatttt cattcttcgc caaaagcact ctgattgaca 1980
aatacgattt atctaattta cacgaaattg cttctggggg cgcacctctt tcgaaagaag 2040
tcggggaagc ggttgcaaaa cgcttccatc ttccagggat acgacaagga tatgggctca 2100
ctgagactac atcagctatt ctgattacac ccgaggggga tgataaaccg ggcgcggtcg 2160
gtaaagttgt tccatttttt gaagcgaagg ttgtggatct ggataccggg aaaacgctgg 2220
gcgttaatca gagaggcgaa ttatgtgtca gaggacctat gattatgtcc ggttatgtaa 2280
acaatccgga agcgaccaac gccttgattg acaaggatgg atggctacat tctggagaca 2340
tagcttactg ggacgaagac gaacacttct tcatagttga ccgcttgaag tctttaatta 2400
aatacaaagg atatcaggtg gcccccgctg aattggaatc gatattgtta caacacccca 2460
acatcttcga cgcgggcgtg gcaggtcttc ccgacgatga cgccggtgaa cttcccgccg 2520
ccgttgttgt tttggagcac ggaaagacga tgacggaaaa agagatcgtg gattacgtcg 2580
ccagtcaagt aacaaccgcg aaaaagttgc gcggaggagt tgtgtttgtg gacgaagtac 2640
cgaaaggtct taccggaaaa ctcgacgcaa gaaaaatcag agagatcctc ataaaggcca 2700
agaagggcgg aaagtccaaa ttgtaagcgg ccgcgttgtt aaacagacca caacggtttc 2760
cctctagcgg gatcaattcc gccccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa 2820
taaggccggt gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat 2880
gtgagggccc ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct 2940
ctcgccaaag gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct 3000
tcttgaagac aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc 3060
gacaggtgcc tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa 3120
ccccagtgcc acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc 3180
gtattcaaca aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg 3240
gggcctcggt gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc 3300
ccgaaccacg gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat aataccatgg cgcctattac 3360
ggcctactcc caacagacgc gaggcctact tggctgcatc atcactagcc tcacaggccg 3420
ggacaggaac caggtcgagg gggaggtcca agtggtctcc accgcaacac aatctttcct 3480
ggcgacctgc gtcaatggcg tgtgttggac tgtctatcat ggtgccggct caaagaccct 3540
tgccggccca aagggcccaa tcacccaaat gtacaccaat gtggaccagg acctcgtcgg 3600
ctggcaagcg ccccccgggg cgcgttcctt gacaccatgc acctgcggca gctcggacct 3660
ttacttggtc acgaggcatg ccgatgtcat tccggtgcgc cggcggggcg acagcagggg 3720
gagcctactc tcccccaggc ccgtctccta cttgaagggc tcttcgggcg gtccactgct 3780
ctgcccctcg gggcacgctg tgggcatctt tcgggctgcc gtgtgcaccc gaggggttgc 3840
gaaggcggtg gactttgtac ccgtcgagtc tatgggaacc actatgcggt ccccggtctt 3900
cacggacaac tcgtcccctc cggccgtacc gcagacattc caggtggccc atctacacgc 3960
ccctactggt agcggcaaga gcactaaggt gccggctgcg tatgcagccc aagggtataa 4020
ggtgcttgtc ctgaacccgt ccgtcgccgc caccctaggt ttcggggcgt atatgtctaa 4080
ggcacatggt atcgacccta acatcagaat cggggtaagg accatcacca cgggtgcccc 4140
catcacgtac tccacctatg gcaagtttct tgccgacggt ggttgctctg ggggcgccta 4200
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cacagtcctg gaccaagcgg agacggctgg agcgcgactc gtcgtgctcg ccaccgctac 4320
gcctccggga tcggtcaccg tgccacatcc aaacatcgag gaggtggctc tgtccagcac 4380
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cggactcaat gctgtagcat attaccgggg ccttgatgta tccgtcatac caactagcgg 4560
agacgtcatt gtcgtagcaa cggacgctct aatgacgggc tttaccggcg atttcgactc 4620
agtgatcgac tgcaatacat gtgtcaccca gacagtcgac ttcagcctgg acccgacctt 4680
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gactggtagg ggcaggatgg gcatttacag gtttgtgact ccaggagaac ggccctcggg 4800
catgttcgat tcctcggttc tgtgcgagtg ctatgacgcg ggctgtgctt ggtacgagct 4860
cacgcccgcc gagacctcag ttaggttgcg ggcttaccta aacacaccag ggttgcccgt 4920
ctgccaggac catctggagt tctgggagag cgtctttaca ggcctcaccc acatagacgc 4980
ccatttcttg tcccagacta agcaggcagg agacaacttc ccctacctgg tagcatacca 5040
ggctacggtg tgcgccaggg ctcaggctcc acctccatcg tgggaccaaa tgtggaagtg 5100
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cgttcaaaac gaggttacta ccacacaccc cataaccaaa tacatcatgg catgcatgtc 5220
ggctgacctg gaggtcgtca cgagcacctg ggtgctggta ggcggagtcc tagcagctct 5280
ggccgcgtat tgcctgacaa caggcagcgt ggtcattgtg ggcaggatca tcttgtccgg 5340
aaagccggcc atcattcccg acagggaagt cctttaccgg gagttcgatg agatggaaga 5400
gtgcgcctca cacctccctt acatcgaaca gggaatgcag ctcgccgaac aattcaaaca 5460
gaaggcaatc gggttgctgc aaacagccac caagcaagcg gaggctgctg ctcccgtggt 5520
ggaatccaag tggcggaccc tcgaagcctt ctgggcgaag catatgtgga atttcatcag 5580
cgggatacaa tatttagcag gcttgtccac tctgcctggc aaccccgcga tagcatcact 5640
gatggcattc acagcctcta tcaccagccc gctcaccacc caacataccc tcctgtttaa 5700
catcctgggg ggatgggtgg ccgcccaact tgctcctccc agcgctgctt ctgctttcgt 5760
aggcgccggc atcgctggag cggctgttgg cagcataggc cttgggacgg tgcttgtgga 5820
tattttggca ggttatggag caggggtggc aggcgcgctc gtggccttta aggtcatgag 5880
cggcgagatg ccctccaccg aggacctggt taacctactc cctgctatcc tctcccctgg 5940
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gctcaatcaa tacctggttg ggtcacagct cccatgcgag cccgaaccgg acgtagcagt 6780
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cttgaaggca acatgcacta cccgtcatga ctccccggac gctgacctca tcgaggccaa 6960
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cacgccatgc gctgcggagg aaaccaagct gcccatcaat gcactgagca actctttgct 7620
ccgtcaccac aacttggtct atgctacaac atctcgcagc gcaagcctgc ggcagaagaa 7680
ggtcaccttt gacagactgc aggtcctgga cgaccactac cgggacgtgc tcaaggagat 7740
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gacgccccca cattcggcca gatctaaatt tggctatggg gcaaaggacg tccggaacct 7860
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gaaatgccct atgggcttcg catatgacac ccgctgtttt gactcaacgg tcactgagaa 8220
tgacatccgt gttgaggagt caatctacca atgttgtgac ttggcccccg aagccagaca 8280
ggccataagg tcgctcacag agcggcttta catcgggggc cccctgacta attctaaagg 8340
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cacgatgctc gtatgcggag acgaccttgt cgttatctgt gaaagcgcgg ggacccaaga 8520
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ggacccgccc aaaccagaat acgacttgga gttgataaca tcatgctcct ccaatgtgtc 8640
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tttctttttt tttttttttt tttttttttt ttttttttct cctttttttt tcctcttttt 9420
ttccttttct ttcctttggt ggctccatct tagccctagt cacggctagc tgtgaaaggt 9480
ccgtgagccg cttgactgca gagagtgctg atactggcct ctctgcagat caagtactac 9540
tagtagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg 9600
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tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca 9840
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gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag 11040
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gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac 11280
tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat 11340
aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat 11400
ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca 11460
aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccatt 11518
<210>5
<211>10473
<212>DNA
<213>人工序列
<220>质粒pSC_1b_delNS5B_5`AsiSI_3`SacII的核苷酸序列
<400>5
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atcactcccc tgtgaggaac tactgtcttc acgcagaaag cgtctagcca tggcgttagt 120
atgagtgtcg tgcagcctcc aggacccccc ctcccgggag agccatagtg gtctgcggaa 180
ccggtgagta caccggaatt gccaggacga ccgggtcctt tcttggatca acccgctcaa 240
tgcctggaga tttgggcgtg cccccgcgag actgctagcc gagtagtgtt gggtcgcgaa 300
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tgcaccgttt aaacccccgt gctgctggaa gtcgatttca ggcttagggt aaccgtggac 420
ctcgaaaaca gacgcacaaa accaagttca atagaagggg gtacaaacca gtaccaccac 480
gaacaagcac ttctgtttcc ccggtgatgt cgtatagact gcttgcgtgg ttgaaagcga 540
cggatccgtt atccgcttat gtacttcgag aagcccagta ccacctcgga atcttcgatg 600
cgttgcgctc agcactcaac cccagagtgt agcttaggct gatgagtctg gacatccctc 660
accggtgacg gtggtccagg ctgcgttggc ggcctaccta tggctaacgc catgggacgc 720
tagttgtgaa caaggtgtga agagcctatt gagctacata agaatcctcc ggcccctgaa 780
tgcggctaat cccaacctcg gagcaggtgg tcacaaacca gtgattggcc tgtcgtaacg 840
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aagtacaatt tcaacagtta tttcaatcag acaattgtat cataatggcg ggcccagaag 1080
acgccaaaaa cataaagaaa ggcccggcgc cattctatcc tctagaggat ggaaccgctg 1140
gagagcaact gcataaggct atgaagagat acgccctggt tcctggaaca attgctttta 1200
cagatgcaca tatcgaggtg aacatcacgt acgcggaata cttcgaaatg tccgttcggt 1260
tggcagaagc tatgaaacga tatgggctga atacaaatca cagaatcgtc gtatgcagtg 1320
aaaactctct tcaattcttt atgccggtgt tgggcgcgtt atttatcgga gttgcagttg 1380
cgcccgcgaa cgacatttat aatgaacgtg aattgctcaa cagtatgaac atttcgcagc 1440
ctaccgtagt gtttgtttcc aaaaaggggt tgcaaaaaat tttgaacgtg caaaaaaaat 1500
taccaataat ccagaaaatt attatcatgg attctaaaac ggattaccag ggatttcagt 1560
cgatgtacac gttcgtcaca tctcatctac ctcccggttt taatgaatac gattttgtac 1620
cagagtcctt tgatcgtgac aaaacaattg cactgataat gaattcctct ggatctactg 1680
ggttacctaa gggtgtggcc cttccgcata gaactgcctg cgtcagattc tcgcatgcca 1740
gagatcctat ttttggcaat caaatcattc cggatactgc gattttaagt gttgttccat 1800
tccatcacgg ttttggaatg tttactacac tcggatattt gatatgtgga tttcgagtcg 1860
tcttaatgta tagatttgaa gaagagctgt ttttacgatc ccttcaggat tacaaaattc 1920
aaagtgcgtt gctagtacca accctatttt cattcttcgc caaaagcact ctgattgaca 1980
aatacgattt atctaattta cacgaaattg cttctggggg cgcacctctt tcgaaagaag 2040
tcggggaagc ggttgcaaaa cgcttccatc ttccagggat acgacaagga tatgggctca 2100
ctgagactac atcagctatt ctgattacac ccgaggggga tgataaaccg ggcgcggtcg 2160
gtaaagttgt tccatttttt gaagcgaagg ttgtggatct ggataccggg aaaacgctgg 2220
gcgttaatca gagaggcgaa ttatgtgtca gaggacctat gattatgtcc ggttatgtaa 2280
acaatccgga agcgaccaac gccttgattg acaaggatgg atggctacat tctggagaca 2340
tagcttactg ggacgaagac gaacacttct tcatagttga ccgcttgaag tctttaatta 2400
aatacaaagg atatcaggtg gcccccgctg aattggaatc gatattgtta caacacccca 2460
acatcttcga cgcgggcgtg gcaggtcttc ccgacgatga cgccggtgaa cttcccgccg 2520
ccgttgttgt tttggagcac ggaaagacga tgacggaaaa agagatcgtg gattacgtcg 2580
ccagtcaagt aacaaccgcg aaaaagttgc gcggaggagt tgtgtttgtg gacgaagtac 2640
cgaaaggtct taccggaaaa ctcgacgcaa gaaaaatcag agagatcctc ataaaggcca 2700
agaagggcgg aaagtccaaa ttgtaagcgg ccgcgttgtt aaacagacca caacggtttc 2760
cctctagcgg gatcaattcc gccccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa 2820
taaggccggt gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat 2880
gtgagggccc ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct 2940
ctcgccaaag gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct 3000
tcttgaagac aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc 3060
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gtattcaaca aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg 3240
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ccgaaccacg gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat aataccatgg cgcctattac 3360
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ggacaggaac caggtcgagg gggaggtcca agtggtctcc accgcaacac aatctttcct 3480
ggcgacctgc gtcaatggcg tgtgttggac tgtctatcat ggtgccggct caaagaccct 3540
tgccggccca aagggcccaa tcacccaaat gtacaccaat gtggaccagg acctcgtcgg 3600
ctggcaagcg ccccccgggg cgcgttcctt gacaccatgc acctgcggca gctcggacct 3660
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ctgcccctcg gggcacgctg tgggcatctt tcgggctgcc gtgtgcaccc gaggggttgc 3840
gaaggcggtg gactttgtac ccgtcgagtc tatgggaacc actatgcggt ccccggtctt 3900
cacggacaac tcgtcccctc cggccgtacc gcagacattc caggtggccc atctacacgc 3960
ccctactggt agcggcaaga gcactaaggt gccggctgcg tatgcagccc aagggtataa 4020
ggtgcttgtc ctgaacccgt ccgtcgccgc caccctaggt ttcggggcgt atatgtctaa 4080
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catcacgtac tccacctatg gcaagtttct tgccgacggt ggttgctctg ggggcgccta 4200
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cacagtcctg gaccaagcgg agacggctgg agcgcgactc gtcgtgctcg ccaccgctac 4320
gcctccggga tcggtcaccg tgccacatcc aaacatcgag gaggtggctc tgtccagcac 4380
tggagaaatc cccttttatg gcaaagccat ccccatcgag accatcaagg gggggaggca 4440
cctcattttc tgccattcca agaagaaatg tgatgagctc gccgcgaagc tgtccggcct 4500
cggactcaat gctgtagcat attaccgggg ccttgatgta tccgtcatac caactagcgg 4560
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catgttcgat tcctcggttc tgtgcgagtg ctatgacgcg ggctgtgctt ggtacgagct 4860
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ctgccaggac catctggagt tctgggagag cgtctttaca ggcctcaccc acatagacgc 4980
ccatttcttg tcccagacta agcaggcagg agacaacttc ccctacctgg tagcatacca 5040
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cgggatacaa tatttagcag gcttgtccac tctgcctggc aaccccgcga tagcatcact 5640
gatggcattc acagcctcta tcaccagccc gctcaccacc caacataccc tcctgtttaa 5700
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cggcgagatg ccctccaccg aggacctggt taacctactc cctgctatcc tctcccctgg 5940
cgccctagtc gtcggggtcg tgtgcgcagc gatactgcgt cggcacgtgg gcccagggga 6000
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ccgtcaccac aacttggtct atgctacaac atctcgcagc gcaagcctgc ggcagaagaa 7680
ggtcaccttt gacagactgc aggtcctgga cgaccactac cgggacgtgc tcaaggagat 7740
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cctcagatca ttcaacgact ccatggcctt agcgcatttt cactccatag ttactctcca 7920
ggtgagatca atagggtggc ttcatgcctc aggaaacttg gggtaccgcc cttgcgagtc 7980
tggagacatc gggccagaag tgtccgcgct aggctactgt cccagggggg gagggctgcc 8040
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ccggctgcgt cccagttgga tttatccagc tggttcgttg ctggttacag cgggggagac 8160
atatatcaca gcctgtctcg tgcccgaccc cgctggttca tgtggtgcct actcctactt 8220
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gccaataggc catcctgttt ttttcccttt ttttttttct tttttttttt tttttttttt 8340
tttttttttt tttctccttt ttttttcctc tttttttcct tttctttcct ttggtggctc 8400
catcttagcc ctagtcacgg ctagctgtga aaggtccgtg agccgcttga ctgcagagag 8460
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cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg 8580
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gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 9240
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cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 9360
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tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc 9480
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cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca 9960
ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac 10020
tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca 10080
atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt 10140
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aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata 10320
ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc 10380
ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc 10440
cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc att 10473
<210>6
<211>10653
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pSC_1b_5`AsiSI_lacZAmC_3`RsrII的核苷酸序列
<400>6
cctgcaggta atacgactca ctatagccag cccccgattg ggggcgacac tccaccatag 60
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cggatccgtt atccgcttat gtacttcgag aagcccagta ccacctcgga atcttcgatg 600
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agacgtcatt gtcgtagcaa cggacgctct aatgacgggc tttaccggcg atttcgactc 4620
agtgatcgac tgcaatacat gtgtcaccca gacagtcgac ttcagcctgg acccgacctt 4680
caccattgag acgacgaccg tgccacaaga cgcggtgtca cgctcgcagc ggcgaggcag 4740
gactggtagg ggcaggatgg gcatttacag gtttgtgact ccaggagaac ggccctcggg 4800
catgttcgat tcctcggttc tgtgcgagtg ctatgacgcg ggctgtgctt ggtacgagct 4860
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ccatttcttg tcccagacta agcaggcagg agacaacttc ccctacctgg tagcatacca 5040
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cgttcaaaac gaggttacta ccacacaccc cataaccaaa tacatcatgg catgcatgtc 5220
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cgggatacaa tatttagcag gcttgtccac tctgcctggc aaccccgcga tagcatcact 5640
gatggcattc acagcctcta tcaccagccc gctcaccacc caacataccc tcctgtttaa 5700
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cggcgagatg ccctccaccg aggacctggt taacctactc cctgctatcc tctcccctgg 5940
cgccctagtc gtcggggtcg tgtgcgcagc gatactgcgt cggcacgtgg gcccagggga 6000
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cgtggaggtt acgcgggtgg gggatttcca ctacgtgacg ggcatgacca ctgacaacgt 6600
aaagtgcccg tgtcaggttc cggcccccga attcttcaca gaagtggatg gggtgcggtt 6660
gcacaggtac gctccagcgt gcaaacccct cctacgggag gaggtcacat tcctggtcgg 6720
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cttgaaggca acatgcacta cccgtcatga ctccccggac gctgacctca tcgaggccaa 6960
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aaagtcacca tggccaacgg tgggcccctt gcattctcct ttgacatact atctacagtg 7920
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cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc att 10653
<210>7
<211>11509
<212>DNA
<213>人工序列
<220>质粒pSS-1_1a_NS5B_5`AsiSI_3`RsrII的核苷酸序列
<400>7
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cctgacgccc ccacattcag ccaaatccaa gtttggctat ggggcaaaag acgtccgttg 7860
ccatgccaga aaggccgtag cccacatcaa ctccgtgtgg aaagaccttc tggaagacag 7920
tgtaacacca attgacacta ccatcatggc caagaacgag gttttctgcg ttcagcctga 7980
gaaggggggt cgtaagccag ctcgtctcat cgtgttcccc gacctgggcg tgcgcgtgtg 8040
cgagaagatg gccctgtacg acgtggttag caagctcccc ctggccgtga tgggaagctc 8100
ctacggattc caatactcac caggacagcg ggttgaattc ctcgtgcaag cgtggaagtc 8160
caagaagacc ccgatggggt tctcgtatga tacccgctgt tttgactcca cagtcactga 8220
gagcgacatc cgtacggagg aggcaattta ccaatgttgt gacctggacc cccaagcccg 8280
cgtggccatc aagtccctca ctgagaggct ttatgttggg ggccctctta ccaattcaag 8340
gggggaaaac tgcggctacc gcaggtgccg cgcgagcggc gtactgacaa ctagctgtgg 8400
taacaccctc acttgctaca tcaaggcccg ggcagcctgt cgagccgcag ggctccagga 8460
ctgcaccatg ctcgtgtgtg gcgacgactt agtcgttatc tgtgaaagtg cgggggtcca 8520
ggaggacgcg gcgagcctga gagccttcac ggaggctatg accaggtact ccgccccccc 8580
cggggacccc ccacaaccag aatacgactt ggagcttata acatcatgct cctccaacgt 8640
gtcagtcgcc cacgacggcg ctggaaagag ggtctactac cttacccgtg accctacaac 8700
ccccctcgcg agagccgcgt gggagacagc aagacacact ccagtcaatt cctggctagg 8760
caacataatc atgtttgccc ccacactgtg ggcgaggatg atactgatga cccatttctt 8820
tagcgtcctc atagccaggg atcagcttga acaggctctt aactgtgaga tctacggagc 8880
ctgctactcc atagaaccac tggatctacc tccaatcatt caaagactcc atggcctcag 8940
cgcattttca ctccacagtt actctccagg tgaaatcaat agggtggccg catgcctcag 9000
aaaacttggg gtcccgccct tgcgagcttg gagacaccgg gcccggagcg tccgcgctag 9060
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gttcacggct ggctacagcg ggggagacat ttatcacagc gtgtctcatg cccggccccg 9240
ctggttctgg ttttgcctac tcctgctcgc tgcaggggta ggcatctacc tcctccccaa 9300
ccgatgacgg tccgggtaaa cactccggcc tcttaagcca tttcctgttt tttttttttt 9360
tttttttttt tttttctttt tttttttctt tcctttcctt ctttttttcc tttctttttc 9420
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cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt 9600
tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc 9660
aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa 9720
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cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag 9960
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ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc 10080
gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac 10140
agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg 10200
cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca 10260
aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa 10320
aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa 10380
ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt 10440
aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag 10500
ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat 10560
agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc 10620
cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa 10680
ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca 10740
gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa 10800
cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt 10860
cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc 10920
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catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc 11040
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cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag 11280
cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac 11340
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<211>10644
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>8
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tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 10200
tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 10260
aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 10320
cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 10380
cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 10440
aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 10500
ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 10560
tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 10620
ccacctgacg tctaagaaac catt 10644
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<223>用于PCR扩增患者NS5B的AsiSI有义链引物
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<223>用于PCR扩增患者NS5B的AsiSI有义链引物
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<223>用于PCR扩增患者NS5B的AsiSI有义链引物
<400>13
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<223>用于PCR扩增患者NS5B的AsiSI有义链引物
<220>
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<222>(31)
<223>其中r为a或g
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<223>用于PCR扩增患者NS5B的AsiSI有义链引物
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<223>用于PCR扩增患者NS5B的AsiSI有义链引物
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<222>(31)
<223>其中r为a或g
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<223>用于PCR扩增患者NS5B的AsiSI有义链引物
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<223>用于PCR扩增患者NS5B的SacII反义链引物
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<223>其中y为c或t
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<223>用于PCR扩增患者NS5B的SacII反义链引物
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<223>用于PCR扩增患者NS5B的SacII反义链引物
<400>23
ggcctggagt gtttagctcc gcggtcaacg gttgggaag 39
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<220>
<223>用于PCR扩增患者NS5B的SacII反义链引物
<400>24
ggcctggagt gtttagctcc gcggtcatcg gttgggaag 39
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<223>用于PCR扩增患者NS5B的RsrII反义链引物
<220>
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<222>(32)
<223>其中r为a或g
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<223>用于PCR扩增患者NS5B的RsrII反义链引物
<400>26
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<223>用于PCR扩增患者NS5B的RsrII反义链引物
<220>
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<222>(29)
<223>其中y为c或t
<400>27
ggcctggagt gtttagctcg gaccgtcayc ggttggggag 40
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<220>
<223>用于PCR扩增患者NS5B的RsrII反义链引物
<400>28
ggcctggagt gtttagctcg gaccgtcatc ggttgggaag 40
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<220>
<223>用于PCR扩增患者NS5B的RsrII反义链引物
<400>29
ggcctggagt gtttagctcg gaccgtcaac ggttgggaag 40
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR扩增患者NS5B的RsrII反义链引物
<400>30
ggcctggagt gtttagctcg gaccgtcaac ggttggggta 40
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<220>
<223>用于PCR扩增患者NS5B的RsrII反义链引物
<220>
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<222>(38)
<223>其中r为a或g
<400>31
ggcctggagt gtttagctcg gaccgtcatc ggttgggrag 40
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<220>
<223>用于PCR扩增患者NS5B的RsrII反义链引物
<400>32
ggcctggagt gtttagctcg gaccgtcatc ggttggggta 40
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR扩增患者NS5B的RsrII反义链引物
<400>33
ggcctggagt gtttagctcg gaccgtcatc ggttgggaag 40
Claims (24)
1.包含HCV多核苷酸序列的HCV复制子穿梭载体,所述HCV多核苷酸序列依次包含:
(a)编码NS3蛋白的多核苷酸序列;
(b)编码NS4A蛋白的多核苷酸序列;
(c)编码NS4B蛋白的多核苷酸序列;
(d)编码NS5A蛋白的多核苷酸序列;
(e)识别位于距编码NS5B蛋白的多核苷酸5’端1-20个核苷酸处的AsiSI或SnaBI的限制酶序列;
(f)编码NS5B蛋白的多核苷酸序列;和
(g)识别位于距编码NS5B蛋白的多核苷酸3’端1-20个核苷酸处的SaeII或RsrII的限制酶序列;
2.权利要求1的HCV复制子穿梭载体,其中HCV多核苷酸序列来源于HCV基因型1a或基因型1b。
3.权利要求1的HCV复制子穿梭载体,其中编码NS5B蛋白的多核苷酸序列被修饰,从而使NS5B蛋白无功能。
4.包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的HCV多核苷酸序列的HCV复制子穿梭体载体。
5.评估HCV聚合酶抑制剂控制受试者HCV感染的效力的方法,包括如下步骤:
(a)提供来源于感染HCV的受试者的样品;
(b)PCR扩增来源于样品中众多HCV准种的编码NS5B蛋白的多核苷酸序列,使用包含识别AsiSI或SnaBI的限制酶序列的有义链引物和包含识别SaeII或RsrII的限制酶序列的反义链引物;
(c)将所述PCR扩增的多核苷酸序列克隆到HCV复制子穿梭载体中,从而产生嵌合HCV复制子质粒;
(d)线性化所述嵌合HCV复制子质粒并对所述线性化的质粒进行体外转录,从而产生嵌合HCV复制子RNA;和
(e)用所述HCV复制子RNA转染Huh7细胞系,并在HCV聚合酶抑制剂存在或不存在时测量所述HCV复制子RNA的复制水平。
6.权利要求5的方法,其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求1中的HCV复制子穿梭载体。
7.权利要求5的方法,其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求2中的HCV复制子穿梭载体。
8.权利要求5的方法,其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求3中的HCV复制子穿梭载体。
9.权利要求5的方法,其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求4中的HCV复制子穿梭载体。
10.评估HCV聚合酶抑制剂控制受试者HCV感染的效力的方法,包括如下步骤:
(a)提供来源于感染HCV的受试者的样品;
(b)PCR扩增来源于样品中众多HCV准种的编码NS5B蛋白的多核苷酸序列,使用包含选自SEQ ID NO:9到SEQ ID NO:19的有义链引物和包含选自SEQ ID NO:20到SEQ ID NO:33的反义链引物;
(c)将所述PCR扩增的多核苷酸序列克隆到HCV复制子穿梭载体中,从而产生嵌合HCV复制子质粒;
(d)线性化所述嵌合HCV复制子质粒并对所述线性化的质粒进行体外转录,从而产生嵌合HCV复制子RNA;和
(e)用所述HCV复制子RNA转染Huh7细胞系,并在HCV聚合酶抑制剂存在或不存在时测量所述HCV复制子RNA的复制水平。
11.权利要求10的方法,其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求1中的HCV复制子穿梭载体。
12.权利要求10的方法,其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求2中的HCV复制子穿梭载体。
13.权利要求10的方法,其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求3中的HCV复制子穿梭载体。
14.权利要求10的方法,其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求4中的HCV复制子穿梭载体。
15.评估HCV聚合酶抑制剂控制受试者HCV感染的效力的方法,包括如下步骤:
(a)提供来源于感染HCV的受试者的样品;
(b)PCR扩增来源于样品中众多HCV准种的编码NS5B蛋白的多核苷酸序列,使用包含识别AsiSI或SnaBI的限制酶序列的有义链引物和包含识别SacII或RsrII的限制酶序列的反义链引物;
(c)将所述PCR扩增的多核苷酸序列克隆到HCV复制子穿梭载体中,从而产生嵌合HCV复制子质粒;
(d)将所述质粒转化入细胞中以产生众多的转化细胞群落;
(e)合并所述群落并从合并的群落中分离嵌合HCV复制子质粒;
(f)线性化来源于步骤(e)的嵌合HCV复制子质粒并对所述线性化的质粒进行体外转录,从而产生嵌合HCV复制子RNA;和
(g)用所述HCV复制子RNA转染Huh7细胞系,并且在HCV聚合酶抑制剂存在或不存在时测量所述HCV复制子RNA的复制水平。
16.权利要求15的方法,其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求1中的HCV复制子穿梭载体。
17.权利要求15的方法,其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求2中的HCV复制子穿梭载体。
18.权利要求15的方法,其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求3中的HCV复制子穿梭载体。
19.权利要求15的方法,其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求4中的HCV复制子穿梭载体。
20.评估HCV聚合酶抑制剂控制受试者HCV感染的效力的方法,包括如下步骤:
(a)提供来源于感染HCV的受试者的样品;
(b)PCR扩增来源于样品中众多HCV准种的编码NS5B蛋白的多核苷酸序列,使用包含选自SEQ ID NO:9到SEQ ID NO:19的有义链引物和包含选自SEQ ID NO:20到SEQ ID NO:33的反义链引物;
(c)将所述PCR扩增的多核苷酸序列克隆到HCV复制子穿梭载体中,从而产生嵌合HCV复制子质粒;
(d)将所述质粒转化入细胞中以产生众多的转化细胞群落;
(e)合并所述群落并从合并的群落中分离嵌合HCV复制子质粒;
(f)线性化来源于步骤(e)的嵌合HCV复制子质粒并对所述线性化的质粒进行体外转录,从而产生嵌合HCV复制子RNA;和
(g)用所述HCV复制子RNA转染Huh7细胞系,并且在HCV聚合酶抑制剂存在或不存在时测量所述HCV复制子RNA的复制水平。
21.权利要求20的方法,其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求1中的HCV复制子穿梭载体。
22.权利要求20的方法,其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求2中的HCV复制子穿梭载体。
23.权利要求20的方法,其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求3中的HCV复制子穿梭载体。
24.权利要求20的方法,其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求4中的HCV复制子穿梭载体。
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