CN105209048A - 用于测定对病毒抑制剂的病毒敏感性的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于有效且准确测定丙型肝炎病毒(HCV)或HCV群对干扰素(IFN)、利巴韦林(RBV)、核苷抑制剂(NI)、2’C-甲基腺苷(2’CMeA)、索非布韦(SOF)或非核苷抑制剂A或B(NNI-A或NNI-B)的易感性的方法和组合物。所述方法可包括关于IFN、RBV、NI-1、2’CMeA、SOF、NNI-A或NNI-B易感性测定HCV的基因型或HCV的表型。所述方法还可包括基于所测定的基因型或表型选择合适的治疗。

Description

用于测定对病毒抑制剂的病毒敏感性的方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请No.61/802,212；2013年6月4日提交的美国临时申请No.61/831,134；和2013年6月27日提交的美国临时申请No.61/839,947的优先权。这些申请各自的整个内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明的实施方式涉及测定丙型肝炎病毒(“HCV”)或HCV群对HCV抑制剂的易感性的方法。用于测定易感性的方法包括基因型或表型方法。
背景技术
HCV影响估计世界上1.7亿人，包括4百万美国人，或约1％的美国人口，因而其为最常见的血液携带疾病。HCV感染在大致55～85％的患者中成为慢性病症。慢性HCV感染的晚期并发症包括肝硬化，肝细胞癌，及死亡。对于预防HCV感染没有有效疫苗。
HCV是含有大致9,000个核苷酸(9kb)的正义线性单链RNA基因组的有包膜病毒。HCV与黄病毒及瘟病毒一起分类进黄病毒科(Flaviviridae)。HCV基因组的单开放阅读框被翻译而产生单蛋白产物，然后其被进一步加工产生更小的活性蛋白，包括3种结构蛋白(核衣壳(C)和2种包膜糖蛋白(E1和E2))和7种非结构蛋白(包括丝氨酸蛋白酶(非结构蛋白3(NS3))，辅因子(非结构蛋白4A(NS4A))，非结构蛋白5A(NS5A)，及RNA依赖性RNA聚合酶(非结构蛋白5B(NS5B)等)。
HCV株基于种系发生(遗传序列)由“基因型”分组成6个基因型(即1～6)之一，其在基因型内被进一步表征为几种不同亚型(例如1a，1b，1c)。用一种HCV基因型感染不必然给患者提供针对该基因型或任何其他基因型的HCV的免疫力，由此，用多于一种HCV基因型分离物同时感染是可能的。大部分HCV基因型是地理学上不同的。在北美洲，欧洲和日本，HCV基因型1(GT1)是最普遍的。在基因型1HCV之内，亚型1a和1b更普遍，亚型1c仅是少数成分。然而在其它地区，非基因型1的HCV基因型(非-GT1)是普遍的。
在针对HCV的直接作用抗病毒(DAA)剂被批准之前，护理HCV感染的标准依赖于通过响应于用聚乙二醇化干扰素α(PEG-IFN)组合利巴韦林(RBV)进行24～48周治疗的免疫调节的病毒复制的间接阻遏。对治疗的响应在患者之中有差异，如下文所进一步讨论的，大致40～60％的患者达到病毒复制的持续阻遏(持续的病毒学应答，SVR)。并非所有对标准PEG-IFN/RBV治疗具有初始应答的HCV-感染患者维持他们的应答，如通过血浆中可检测的HCVRNA的上升水平证明的。由于PEG-IFN/RBV治疗的功效可变性和低耐受性，在临床前发展程序和临床试验中正在评价直接靶向HCV复制的大量新抗病毒药剂，目前已批准了4种DAA(波普瑞韦、替拉瑞韦、西咪匹韦、索非布韦)。批准的DAA包括聚合酶抑制剂(索非布韦)和蛋白酶抑制剂(波普瑞韦、替拉瑞韦、西咪匹韦)。靶向分别由HCV基因组的NS3、NS5A和NS5B区编码的病毒蛋白酶、非结构蛋白5A或RNA-依赖性RNA聚合酶(RdRp)的另外的抑制剂正在进行深入开发(参见例如，开发中的药物列表，http://www.hcvadvocate.org/hepatitis/hepC/Quick_Ref_Guide.pdf)。
HCV的NS5B区是1,773个核苷酸长，其编码HCVRdRp酶。HCVRdRp酶“拷贝”HCVRNA基因组并产生正义和负义HCVRNA，因此RdRp对于病毒复制是必要的。目前正开发许多核苷(核苷酸)抑制剂(NI)和小分子非核苷抑制剂(NNI)，最近索非布韦(SOF)已被批准用于组合疗法。NI通过与用于在活性位点结合的RdRp的天然底物(三磷酸核糖核苷)竞争来发挥作用。NNI变构性地结合并通过非-竞争性机理抑制RdRp活性。NNI可还被分组为基于它们的化学结构和靶结合位点相区别的几个亚类。对特定RdRp抑制剂的抗性已被报道与位于该酶内、通过改变RdRp结构(例如，NNI)或通过改善RdRp区别抑制剂和天然底物的能力(例如，NI)来限制抑制剂结合的某些氨基酸突变有关。
由于现有的HCV抑制剂不同地影响GT1HCV和其他基因型的HCV(即非GT1HCV)，因而已实现了不同的优选治疗方案。在批准不同的蛋白酶抑制剂或核苷抑制剂SOF与PEG-IFN/RBV的组合使用之前，护理GT1病毒感染的标准是用聚乙二醇化干扰素α(PEG-IFN)组合利巴韦林(RBV)。目前，护理GT1、GT4、GT5和GT6HCV的标准是用聚乙二醇化干扰素α(PEG-IFN)组合利巴韦林(RBV)和索非布韦(SOVALDI，GileadSciences，SOF)，并且护理GT2和GT3HCV的标准是RBV和SOF。护理不适于接受IFN的患者中的GT1HCV的标准包括SOF、RBV和蛋白酶抑制剂西咪匹韦(OLYSIO，JanssenTherapeuticas，Titusville，NJ)。先前已观察到，感染非-GT1病毒的患者在PEG-IFN/RBV治疗后相较于患有GT1病毒的患者通常达到更高的持续病毒学应答(SVR)速率。非-GT1病毒相较于GT1病毒的较好的SVR还在使用核苷(核苷酸)聚合酶抑制剂(NI)的临床试验中被观察到。基因型之间不同应答的原因尚不清楚，但可包括病毒性质和相对抑制剂易感性。在任何情况下，高度期望的是拥有测定感染个体的HCV的抑制剂易感性的方法以确定针对该个体的最佳治疗方案。
作为护理HCV感染的现行标准的一部分的抑制剂利巴韦林是一种前药，其在代谢时组装嘌呤RNA核苷酸并干扰病毒复制所需的RNA代谢。利巴韦林如何影响病毒复制的机制仍是未知的。虽然针对利巴韦林已经提出了许多机制，但到目前为止其均未被证实，并且可能存在多种机制负责其作用。利巴韦林基本上不掺入DNA，但是对于DNA合成确实具有剂量依赖性抑制效应并且对基因表达还具有其它效应。其还是患者贫血的原因。在其上测试利巴韦林的非灵长类动物物种中已注意到显著的致畸作用，并且已注意到利巴韦林在体内具有长半衰期。在目前使用的易感性测定法中利巴韦林还对细胞是有毒的，从而使得难以准确地测定其对特定HCV群的效应。将有利的是，拥有准确和有效测定感染个体的HCV对利巴韦林的易感性的方法，以确定将利巴韦林包括在针对该个体的治疗方案中是否是合适的，或潜在地确定治疗持续时间。
同样作为护理HCV感染的现行标准的一部分的抑制剂索非布韦是一种NS5B聚合酶抑制剂。索非布韦是经历细胞内代谢以形成药理学活性的尿苷三磷酸类似物(GS-461203)的核苷酸前药。索非布韦模拟核苷酸但用作链终止子。当索非布韦代替正常核苷酸时，病毒不能复制。当与利巴韦林组合施用时，经报道的索非布韦的不利效应是疲劳和头痛，并且当与PEG-IFN组合施用时，索非布韦的最常见的不利效应是疲劳、头痛、恶心、失眠和贫血。
尽管几种目前可利用的抑制剂已显示在抑制病毒复制方面是有效的，它们因具有快速突变速率(导致该药物施用给感染的个体后快速出现对抗病毒药剂治疗剂的易感性降低的突变HCV)而易受病毒抗性发展的影响。这种对特定药物的易感性降低使得使用该药物的治疗对于所述被感染个体无效。由于此原因，医师能监测药物易感性以便为各HCV感染个体确定最适当的治疗方案是重要的。
因此，存在对于可用于有效且准确地测定对靶向HCV多肽的药物(例如利巴韦林和核苷(核苷酸)抑制剂)的易感性的方法和组合物的需求。期望的方法和组合物会有助于评估(a)HCV抑制剂易感性的天然变化和/或(b)会表示HCV抑制剂抗性群的出现和存留或衰变的预处理、处理中和处理后抑制剂易感性的差异。还需要可用于评价HCV群的相对复制能力(RC)的方法。本发明满足了这些和其他需求。
发明概述
本申请提供用于有效且准确测定混合的丙型肝炎病毒(HCV)群对HCV抑制剂的易感性的方法和组合物。
提供了用于选择用于患有丙型肝炎病毒(HCV)感染的患者的治疗的方法。在某些实施方式中，所述方法可包括下述步骤：获得来自患者的生物样品，其中所述生物样品包含来自所述患者的HCV或HCV群；测定所述HCV或HCV群的基因型；和基于所测定的HCV的基因型确定适当的治疗过程，这可包括抑制剂和/或治疗持续时间。在一些实施方式中，如果所述HCV或HCV群包含大量的基因型2(GT2)HCV、基因型3(GT3)HCV、基因型4(GT4)HCV或其组合，所述治疗可包括含有利巴韦林或核苷抑制剂的治疗方案。在一些实施方式中，如果所述HCV或HCV群包含大量的GT2HCV，所述治疗可包括含有索非布韦的治疗方案。如果所述HCV或HCV群包含大量的GT3HCV、GT4HCV或其组合，所述治疗可不包括索非布韦或可包括较长时期的索非布韦治疗。如果所述HCV或HCV群包含GT2HCV或GT3HCV，所述治疗可不包括靶向位点B的非核苷抑制剂(NNI-B)或可包括使用该抑制剂的较长的治疗，并且如果所述HCV或HCV群包含GT2HCV，所述治疗可不包括靶向位点A的非核苷抑制剂(NNI-A)或可包括使用该抑制剂的较长的治疗。
还提供了测定丙型肝炎病毒(HCV)或HCV病毒群对HCV抑制剂的易感性的方法，其中所述HCV抑制剂是干扰素(IFN)、利巴韦林(RBV)、一种或多种核苷(核苷酸)抑制剂包括例如核苷(核苷酸)抑制剂诸如核苷抑制剂-1(NI-1)、2’C-甲基腺苷(2’CMeA)、索非布韦(SOF)或靶向位点A或B的非核苷抑制剂(NNI-A或NNI-B)。在一些实施方式中，所述方法可包括下述步骤：测定所述HCV或HCV群的基因型；和如果所述HCV或HCV群包含基因型2(GT2)HCV、基因型3(GT3)HCV、基因型4(GT4)HCV或其组合，则测定所述HCV或HCV群相较于参照病毒可能具有对利巴韦林的增加的易感性；如果所述HCV或HCV群包含GT2HCV，则测定所述HCV或HCV群可能具有对索非布韦的增加的易感性；如果所述HCV或HCV群包含GT3HCV、GT4HCV或其组合，则测定所述HCV或HCV群可能具有对索非布韦的降低的易感性；如果所述HCV或HCV群包含GT2HCV、GT3HCV或其组合，则测定所述HCV或HCV群可能具有对靶向位点B的非核苷抑制剂(NNI-B)的降低的易感性；或者如果所述HCV或HCV群包含GT2HCV，则测定所述HCV或HCV群可能具有对靶向位点A的非核苷抑制剂(NNI-A)的降低的易感性。
提供了测定丙型肝炎病毒(HCV)或HCV群对HCV聚合酶抑制剂的易感性的方法。在一些实施方式中，所述HCV抑制剂是干扰素(IFN)、利巴韦林(RBV)、一种或多种核苷(核苷酸)抑制剂包括例如核苷(核苷酸)抑制剂诸如核苷抑制剂-1(NI-1)、2’C-甲基腺苷(2’CMeA)、索非布韦(SOF)或靶向位点A、B、C或D的非核苷抑制剂(NNI-A、NNI-B、NNI-C、NNI-D)。所述方法可包括下列步骤：向细胞导入包含来自所述HCV病毒群的患者来源片段的抗性测试载体，其中所述细胞或抗性测试载体包含产生依赖于所述HCV的可检测信号的指示物核酸；在不存在或存在增加浓度的HCV抑制剂的情况下测量细胞中指示物基因的表达；建立针对所述HCV抑制剂的药物易感性的标准曲线，其中在所述标准曲线中检测IC50倍数变化值、IC95倍数变化值或两者，或者检测斜率；将所述HCV群的IC50倍数变化值、IC95倍数变化值或两者与对照HCV群的IC50倍数变化值、IC95倍数变化值或两者进行比较，或者将所述HCV群的标准曲线的斜率与对照HCV群的标准曲线的斜率进行比较；以及当所述HCV群的IC50倍数变化值、IC95倍数变化值或两者相较于对照HCV群的IC50倍数变化值、IC95倍数变化值或两者更低时，测定所述HCV群包含对所述HCV抑制剂具有增加的易感性的HCV颗粒，或者当所述HCV群的标准曲线的斜率相较于对照群的标准曲线降低时，测定所述HCV群包含对所述HCV聚合酶抑制剂具有减小的易感性的HCV颗粒。所述HCV抑制剂可以是例如，干扰素(IFN)、利巴韦林(RBV)、一种或多种核苷(核苷酸)抑制剂包括例如核苷抑制剂-1(NI-1)、2’C-甲基腺苷(2’CMeA)、索非布韦(SOF)或靶向位点A或B的非核苷抑制剂(NNI-A或NNI-B)。在某些特定实施方式中，对照HCV群包括Con1HCV或H77HCV。在某些特定实施方式中，对照HCV群是来自在用HCV抑制剂治疗之前的患者的HCV群。在某些实施方式中，抗性测试载体包含患者来源片段和指示物核酸。在一些实施方式中，患者来源片段包含HCV的NS5B区。在某些实施方式中，指示物基因包括萤光素酶基因。在这些方法的某些实施方式中，宿主细胞是Huh7细胞。
在某些实施方式中，所述方法用于帮助确定适合于患者的治疗方案。在某些实施方式中，所述方法还包括确定所检测的IC95倍数变化值对IC50倍数变化值的比率，其中该比率的变化表示HCV对抑制剂的易感性的变化。在某些实施方式中，所述方法用于帮助确定适合于患者的治疗方案。本文描述的这些数据可用于告知临床试验设计、治疗前决策(例如，待使用的药物，待组合的药物的数量，治疗持续时间)以及用于评价抗性。特别地，表型数据结合临床结果数据可进一步加强所述测定的效用，例如用于开发临床临界值。
附图说明
本发明方法的非限制性实施方式例示于以下图。
图1是测定HCV抑制剂易感性的表型测定的示意图。此图使用HCV抑制剂靶向HCV蛋白酶NS3、非结构性蛋白5A(NS5A)和聚合酶NS5B作为实例。因此，在此例中，测试群的NS3、NS5A或NS5B区包括在复制子测试载体中。
图2是显示代表性的HCV抑制剂易感性曲线的图，在x-轴上标绘HCV抑制剂浓度，在y-轴上标绘作为百分比抑制的易感性的倍数变化。指示了IC50和IC95。斜率可由基于对数S形函数的曲线拟合计算。例如，抑制等于上部-(上部+下部)除以(1+浓度/中心)^斜率)。简言之，斜率等于log(95/100-95)/Δx。Δx等于log(IC95)-log(IC50)。
图3是显示本测定法的准确度、精确度、重复性、敏感性和线性度的表。
图4进一步显示使用含有来自患者样品的NS5B群的克隆子的批间变化。代表性的重复性数据显示于两个图中，左图为NNI-A易感性的数据，右图为重复能力的数据。来自测定1的数据标绘于x-轴上，来自测定2的数据标绘于y-轴上。发现2或更高的倍数变化可用此测定重复性地检测到。
图5和6显示非-GT1病毒对核苷抑制剂(NI)和利巴韦林的易感性相较于GT1病毒的变化。原始数据显示于图5中，并且该数据图示于图6中。在图6A中，显示了GT1病毒数据。非-GT-1病毒的易感性的数据示于图6B中。在图6A和6B中，IC倍数变化标绘在y轴上，并且抑制剂和IC值标绘在x轴上。在图6C和6D中，IC50或IC95倍数变化分别标绘在y轴上，并且抑制剂和HCV基因型标绘在x轴上。
图7示出三个表，其显示不同基因型的HCV病毒对干扰素(IFN)、利巴韦林(RBV)、核苷抑制剂(NI-1)、2’C-甲基腺苷(2’CMeA)、索非布韦(SOF)的易感性的变化。原始数据显示在表图7中。标示了抑制剂和基因型以及具有所标示的基因型的病毒的数量(“值的数量”)。显示了各病毒基因型针对各抑制剂的IC50倍数变化的中位数、最大值、最小值和范围(相较于参照病毒的IC50)。所有测试的基因型之间的IC50倍数变化的范围显示在表的底部。
图8是使用Wilcoxon秩和检验显示不同基因型的病毒之间对干扰素、利巴韦林、核苷抑制剂、2’C-甲基腺苷(2’CMeA)、索非布韦(SOF)的易感性变化的显著性的表。抑制剂显示在第一列中，进行比较的两种病毒的基因型显示在第二和第三列中。这两种病毒之间的易感性差异(IC50倍数变化)的统计学显著性显示在第四列中，具有P<0.05的那些被标示为“是”以显示该差异是统计学上显著的。
图9显示不同基因型GT1(a/b)、GT2(a/b/k)、GT3(a)和GT4(a/d/n/未知)的病毒对干扰素、利巴韦林和核苷(核苷酸)抑制剂例如NI-1、2’C-甲基腺苷(2’CMeA)、索非布韦(SOF)的易感性的变化。相较于参照病毒值的IC50倍数变化标绘在y轴上，并且抑制剂和所测试的病毒的基因型标绘在x轴上。在x轴上由数字而无亚型标示的基因型表示该列中显示的结果包括从该表型评价的所有亚型的结果(例如，比较1列中所示的点与1a列和1b列所示的点)。
图10显示了不同基因型GT1、GT2、GT3和GT4的病毒对非核苷抑制剂的易感性的变化。在图10A和10B中，针对Con1参照不定的IC50或IC95倍数变化分别标绘在y轴上，并且抑制剂和HCV基因型标绘在x轴上。
发明详述
本发明特别地提供了测定HCV群对抗-HCV药物的易感性或测定感染患者的HCV的复制能力的方法。下文进一步描述所述方法以及可用于实施所述方法的组合物。
定义和缩写
以下是在本文定义的如在本申请中使用的术语：
“PCR”是“聚合酶链式反应”的缩写。
“HCV”是丙型肝炎病毒的缩写。在某些实施方式中，HCV是指HCV基因型1。在某些实施方式中，HCV是指HCV基因型1a、1b、2、2a、2b、3或4。
本文所用的20种遗传编码的L-氨基酸的氨基酸符号是常规的，示意如下：
表1
单字母缩写 三字母缩写 氨基酸
A Ala 丙氨酸
N Asn 天冬酰胺
R Arg 精氨酸
D Asp 天冬氨酸
C Cys 半胱氨酸
Q Gln 谷氨酰胺
E Glu 谷氨酸
G Gly 甘氨酸
H His 组氨酸
I Ile 异亮氨酸
L Leu 亮氨酸
K Lys 赖氨酸
单字母缩写 三字母缩写 氨基酸
M Met 甲硫氨酸
F Phe 苯丙氨酸
P Pro 脯氨酸
S Ser 丝氨酸
T Thr 苏氨酸
W Trp 色氨酸
Y Tyr 酪氨酸
V Val 缬氨酸
除非另外提到，当多肽序列表示为单字母和/或三字母缩写系列时，根据通常实践，序列以N→C方向呈现。序列中的个体氨基酸在本文表示为AN，其中A是序列中该氨基酸的标准单字母符号，以及N是序列中的位置。突变在本文表示为A1NA2，其中A1是参照蛋白序列中该氨基酸的标准单字母符号，A2是突变的蛋白序列中该氨基酸的标准单字母符号，N是氨基酸序列中的位置。例如，G25M突变表示在第25位氨基酸处从甘氨酸至甲硫氨酸的变化。突变在本文也可表示为NA2，其中N是氨基酸序列中的位置，A2是突变的蛋白序列中该氨基酸的标准单字母符号(例如，25M表示第25位氨基酸处从野生型氨基酸至甲硫氨酸的变化)。此外，突变在本文也可表示为A1NX，其中A1是参照蛋白序列中该氨基酸的标准单字母符号，N是氨基酸序列中的位置，X表示突变的氨基酸可为任何氨基酸(例如，G25X表示第25位氨基酸处从甘氨酸至任何氨基酸的变化)。此符号一般在突变的蛋白序列中的氨基酸未知时使用，如果突变的蛋白序列中的氨基酸可为除了在参照蛋白序列中发现的之外的任何氨基酸，或如果突变的位置中的氨基酸被观察为在该位置处2种或更多种氨基酸的混合。氨基酸位置基于包括突变的区域所来源的蛋白的全长序列进行编号。DNA序列中核苷酸和点突变的表示是类似的。此外，突变也可在本文表示为例如A1NA2A3A4，其中A1是参照蛋白序列中氨基酸的标准单字母符号，N是氨基酸序列中的位置，A2、A3和A4是可存在于突变蛋白序列中的氨基酸的标准单字母符号。
说明书中用于指包含特定核碱基序列的核酸的缩写是常规单字母缩写。由此，当包括在核酸中时，天然存在的编码核碱基如下缩写：腺嘌呤(A)，鸟嘌呤(G)，胞嘧啶(C)，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。除非另外特别说明，表示为一系列单字母缩写的单链核酸序列以及双-链序列的上部链是以5’→3’方向呈现的。
如本文所用，短语“表型测定”是测量特定病毒(诸如，例如HCV)或病毒群(诸如，例如感染受试者的HCV群)的表型的测试。可测量的表型包括，但不限于，病毒或病毒群对特定化学品或生物学抗病毒药剂的抗性或易感性或者测量病毒的复制能力。
如本文所用，“基因型测定”是测定生物或生物群的基因型(例如，基因型1、2、3、4)、生物或生物群的基因型亚型(例如基因型1a、1b、2a、2b)的测定。在某些实施方案中，基因型测定涉及某一或某些基因的核酸序列或反映特定基因型或基因型亚型的相关序列的测定。
如本文所用，术语“突变”是指氨基酸序列或对应核酸序列中相对于参照核酸或多肽的变化。对于本发明的某些实施方式，参照核酸是用于与HCV基因型1b群比较的Con1HCV的核酸或用于与HCV基因型1a群比较的H77HCV的核酸。同样，参照多肽是由Con1或H77HCV核酸序列编码的多肽。或者，参照核酸或多肽可来自在用HCV抑制剂处理之前的患者群。尽管肽的氨基酸序列可直接由例如Edman降解或质谱测定，但更通常地，肽的氨基酸序列从编码肽的核酸的核苷酸序列推知。可使用本领域已知的任何测定核酸序列的方法，例如，Maxam-Gilbert测序(Maxam等人，1980，MethodsinEnzymology65:499)，双脱氧测序(Sanger等人，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74:5463)或基于杂交的方法(见例如，Sambrook等人，2001，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，3.sup.rded.，NY；及Ausubel等人，1989，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishing
AssociatesandWileyInterscience，NY)。如本文所用，术语“位置”和“密码子”互换使用来指示序列中的具体氨基酸。在某些实施方式中，突变已知与药物易感性的改变相关。例如，某些NS5B突变与对核苷(核苷酸)抑制剂(NI；例如，S282T突变体)或靶向位点A(NNI-A；例如，L392I和P495A/L突变体)、位点B(NNI-B；例如，M423T)、位点C(NNI-C；例如，C316Y和Y448H)或位点D(NNI-D；例如，C316Y)的非核苷聚合酶抑制剂的易感性减小相关。
如本文所用，术语“突变体”是指含有相对于参照病毒、基因或蛋白具有一个或更多变化的序列的病毒、基因或蛋白。术语“肽”、“多肽”和“蛋白”通篇互换使用。类似地，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”通篇互换使用。
术语“野生型”在本文用于指不包含已知与药物易感性的变化(减小或增加)相关的突变的病毒基因型。如本文所用，术语“药物易感性”和“抑制剂易感性”互换使用。
如本文所用，术语“易感性”指病毒对特定药物的应答。对药物具有降低或减小的易感性的病毒可能对该药物具有抗性或可能对于使用该药物的治疗较不敏感。相反，对药物具有增加或增强的易感性(超易感性)的病毒对于使用该药物的治疗更敏感。在某些实施方式中，公开的用于测定易感性的方法可由医疗提供者用来帮助确定针对患者的适当的治疗方案。
如本文所用，短语样品中具有给定基因型的HCV的“大量(asubstantialamount)”是指样品内HCV的这样的量，其使得使用有效用于该HCV基因型的治疗的抑制剂来对样品进行的处理同样有效减少样品中活HCV的量。
术语“IC95”是指95％抑制致病微生物(例如，HCV)繁殖所需要的样品中药物的浓度。术语“IC50”是指50％抑制致病微生物的繁殖所需要的样品中药物的浓度。
如本文所用，术语“倍数变化”是患者病毒和参照病毒的药物易感性的数字比较。例如，突变HCVIC50与药物-敏感参照HCVIC50的比是倍数变化。1.0的倍数变化指示患者病毒与药物-敏感参照病毒呈现相同程度的药物易感性。倍数变化小于1指示患者病毒相比药物-敏感参照病毒更敏感。倍数变化大于1指示患者病毒相比药物-敏感参照病毒更不敏感。倍数变化等于或大于临床临界值是指患者病毒应答该药物的概率更低。倍数变化小于临床临界值是指患者病毒对该药物敏感。
短语“临床临界值”是指药物灵敏度结束的特定点。其被定义为患者用特定药物治疗失败的概率显著增加时药物易感性水平。临界值对于不同抗病毒药剂不同，如在临床研究中测定的。在临床试验中通过评价抗性和结果数据来测定临床临界值。在治疗起始测量表型药物易感性。治疗应答，诸如病毒载量变化，在预定的时间点通过治疗过程监测。药物易感性与治疗应答相关，临床临界值由与治疗失败关联的易感性水平测定(总体试验结果的统计学分析)。
如果病毒具有一种性质，例如与对抗病毒治疗的易感性减小相关的基因型或突变，则病毒可能对该抗病毒治疗的“易感性减小的可能性增加”。如果具有性质的病毒群相比缺少该性质的在其它方面相似的病毒群平均而言对该抗病毒治疗更不易感，则病毒的该项性质与易感性减小相关。由此，对于赋予减小的易感性而言，该性质的存在与减小的易感性之间的关联无需是绝对的，也不需要该性质必需的(即，该性质在减少易感性中起到因果作用)或足够的(即，单独存在该性质就足够)。
术语“％序列同源性”在本文与术语“％同源性”，“％序列同一性”，及“％同一性”互换使用，其是指当通过使用序列比对程序比对时，2个或更多肽序列之间的氨基酸序列同一性水平。例如，如本文所用，80％同源性与由定义的算法测定的80％序列同一性含义相同，因此，给定序列的同源物在给定序列的长度上具有大于80％序列同一性。示例性的序列同一性水平包括，但不限于，与给定序列具有60、70、80、85、90、95、98％或更大序列同一性。
可用于测定2个序列之间的同一性的例示计算机程序包括，但不限于，在互联网http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上以公共渠道可利用的BLAST程序套件，例如，BLASTN，BLASTX和TBLASTX，BLASTP和TBLASTN。也可参见Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215:403-10(特别参照公开的默认设置，即，参数w＝4，t＝17)和Altschul等人，1997，NucleicAcidsRes，25:3389-3402。当相对于GenBank蛋白序列和其他公共数据库中的氨基酸序列评价给定氨基酸序列时，序列搜索一般使用BLASTP程序来进行。对于搜索已针对GenBank蛋白序列和其他公共数据库中的氨基酸序列在全部阅读框翻译的核酸序列，BLASTX程序是优选的。BLASTP和BLASTX使用11.0的开放缺口罚分和1.0的延伸缺口罚分的默认参数运行，并且利用BLOSUM-62矩阵。见Altschul等人，1997。
为测定2个或更多序列之间的“％同一性”，通过使用例如，MacVector6.5版的CLUSTAL-W程序，用默认参数操作，包括10.0的开放缺口罚分，0.1的延伸缺口罚分，及BLOSUM30相似性矩阵，来进行所选择序列的优选比对。
术语“极性氨基酸”是指具有在生理学pH不带电、但具有至少一个其中被2个原子共享的电子对由原子之一更紧密维持的键的侧链的亲水氨基酸。遗传编码的极性氨基酸包括Asn(N)、Gln(Q)、Ser(S)和Thr(T)。
“非极性的氨基酸”是指具有在生理学pH不带电并且具有其中被2个原子共享的电子对通常由2个原子中的每一个等同维持的键的侧链(即，侧链不是极性的)的疏水氨基酸。遗传编码的非极性的氨基酸包括Ala(A)、Gly(G)、Ile(I)、Leu(L)、Met(M)和Val(V)。
“亲水氨基酸”是指根据Eisenberg等人，1984，J.Mol.Biol.179:125-142的标准化共有疏水性尺度呈现小于0的疏水性的氨基酸。遗传编码的亲水氨基酸包括Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Glu(E)、Gln(Q)、His(H)、Lys(K)、Ser(S)和Thr(T)。
“疏水氨基酸”指根据Eisenberg等人，1984，J.Mol.Biol.179:125-142的标准化共有疏水性尺度呈现大于0的疏水性的氨基酸。遗传编码的疏水氨基酸包括Ala(A)、Gly(G)、Ile(I)、Leu(L)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Trp(W)、Tyr(Y)和Val(V)。
“酸性氨基酸”是指具有小于7的侧链pK值的亲水氨基酸。酸性氨基酸由于氢离子的失去而在生理学pH下一般具有带负电的侧链。遗传编码的酸性氨基酸包括Asp(D)和Glu(E)。
“碱性氨基酸”是指具有大于7的侧链pK值的亲水氨基酸。碱性氨基酸由于与水合氢离子缔合而在生理学pH下一般具有带正电的侧链。遗传编码的碱性氨基酸包括Arg(R)、His(H)和Lys(K)。
术语“抗性测试载体”，如本文所用，是指包含患者来源片段和指示物基因的一个或更多核酸。在抗性测试载体包含多于一个核酸的情况中，患者来源片段可包含于一个核酸中，指示物基因包含于不同核酸中。例如，指示物基因和患者来源片段可处于同一载体中，或可处于分开的载体中。抗性测试载体的DNA或RNA因此可含于一个或更多DNA或RNA分子中，并可作为一个或更多DNA或RNA分子被导入宿主细胞。术语“患者来源片段”，如本文所用，是指包含对应于感染患者的HCV的核酸序列的HCV核酸序列的一种或更多核酸，其中所述核酸序列编码作为抗-HCV药物的靶的HCV基因产物。“患者来源片段”可由本领域技术人员通过已知的适当技术制备，包括，例如，从由存在于被感染患者的细胞(例如，外周血单核细胞，PBMC)、血清或其他体液中的病毒RNA制备的病毒DNA或互补DNA(cDNA)进行分子克隆或聚合酶链反应(PCR)扩增。“患者来源片段”优选通过使用其中感染患者的HCV自患者分离后未通过培养进行传代的技术分离，或如果病毒被培养，则培养最少代数以减少或基本上消除培养中突变的选择。术语“指示物”、“指示物核酸”或“指示物基因”，如本文所用，是指编码蛋白、DNA结构或RNA结构的核酸，其直接或通过反应引起可测量的或显著的方面(例如，可测量的波长的颜色或光)，或在DNA或RNA用作指示物的情况中，引起特定DNA或RNA结构的变化或产生。优选的指示物基因是萤光素酶。其他指示物基因描述于下文中并为本领域所熟知。
测定对HCV抑制剂的易感性的基因型方法
在某些实施方案中，方法可包括下述步骤：获得来自患者的生物样品，其中所述生物样品包含来自所述患者的HCV或HCV群；测定所述HCV或HCV群的基因型；和基于所测定的HCV的基因型确定适当的治疗过程。如果所述HCV或HCV群包含大量的基因型2(GT2)HCV、基因型3(GT3)HCV、基因型4(GT4)HCV或其组合，所述治疗可包括利巴韦林。如果所述HCV或HCV群包含大量的GT2HCV，所述治疗可包括索非布韦，以及如果所述HCV或HCV群包含大量的GT3HCV、GT4HCV或其组合，则所述治疗可不包括索非布韦。
还提供了用于测定丙型肝炎病毒(HCV)或HCV病毒群对HCV抑制剂的易感性的方法，其中所述HCV抑制剂是干扰素(IFN)、利巴韦林(RBV)、一种或多种核苷(核苷酸)抑制剂包括例如核苷抑制剂-1(NI-1)、2’C-甲基腺苷(2’CMeA)或索非布韦(SOF)。在某些实施方案中，所述方法包括下列步骤：测定所述HCV或HCV群的基因型；和如果所述HCV或HCV群包含基因型2(GT2)HCV、基因型3(GT3)HCV、基因型4(GT4)HCV或其组合，则测定所述HCV或HCV群相较于参照病毒可能具有对利巴韦林的增加的易感性；如果所述HCV或HCV群包含GT2HCV，则测定所述HCV或HCV群可能具有对索非布韦的增加的易感性；或如果所述HCV或HCV群包含GT3HCV、GT4HCV或其组合，则测定所述HCV或HCV群可能具有对索非布韦的降低的易感性。
HCV或HCV群的基因型可通过本领域普通技术人员已知的任何方法(例如测序)来测定。可使用本领域中已知的用于测定核酸序列的任何方法，例如Maxam-Gilbert测序(Maxam等人，1980,MethodsinEnzymology65:499)，双脱氧测序(Sanger等人，1977,Proc.Natl.Acad.Sci.USA74:5463)或基于杂交的方法(见例如，Sambrook等人，2001，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，3.sup.rded.，NY；和Ausubel等人，1989，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociatesandWileyInterscience,NY)。
特定核酸序列的测定可通过各种方法实现，包括但不限于，基于等位基因特异性限制性内切酶切割的限制性片段长度多态性检测(Kan和Dozy,1978,Lancetii:910-912)，错配修复检测(Faham和Cox，1995，GenomeRes5:474-482)，MutS蛋白的结合(Wagner等人，1995,NuclAcidsRes23:3944-3948)，变性梯度凝胶电泳(Fisher等人，1983,Proc.Natl.Acad.Sci.80:1579-83)，单链构象多态性检测(Orita等人，1983,Genomics5:874-879)，错配碱基对上的RNA酶裂解(Myers等人，1985,Science230:1242)，异源双链DNA的化学(Cotton等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:4397-4401)或酶促(Youil等人，1995,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:87-91)切割，基于寡核苷酸特异性引物延伸的方法(Syvanen等人，1990,Genomics8:684-692)，遗传位分析(Nikiforov等人，1994,NuclAcidsRes22:4167-4175)，寡核苷酸连接测定(Landegren等人，1988,Science241:1077)，寡核苷酸特异性连接链反应(“LCR”)(Barrany，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:189-193)，缺口-LCR(Abravaya等人，1995,NuclAcidsRes23:675-682)，使用本领域中公知的标准方法的放射性或荧光DNA测序，以及肽核酸(PNA)测定(Orum等人，1993,Nucl.AcidsRes.21:5332-5356；Thiede等人,1996,Nucl.AcidsRes.24:983-984)。
此外，病毒DNA或RNA用于杂交或扩增测定中以检测牵涉基因结构的异常包括点突变、插入、缺失和基因组重排。这样的测定可包括但不限于，Southern分析(Southern,1975,J.Mol.Biol.98:503-517)、单链构象多态性分析(SSCP)(Orita等人，1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2766-2770)和PCR分析(美国专利No.4,683,202；4,683,195；4,800,159；和4,965,188；PCRStrategies,1995Innisetal.(eds.),AcademicPress,Inc.)。
这样的诊断方法可包括例如，使病毒核酸与一种或多种被标记的核酸试剂(包括重组DNA分子、克隆的基因或其简并变体)在有利于这些试剂与其互补序列特异性退火的条件下进行接触和温育。优选地，这些核酸试剂的长度是至少15至30个核苷酸。在温育后，从核酸分子杂交物去除所有的未退火核酸。随后检测已杂交的核酸的存在，如果任何这样的分子存在的话。使用这种检测方案，来自病毒的核酸可例如被固定至固相载体，例如膜或塑料表面(例如微量滴定板或聚苯乙烯珠之上的)。在这样的情况下，在温育后，上述类型的未退火的、被标记的核酸试剂被容易地去除。剩余的经退火的被标记的核酸试剂的检测通过使用本领域公知的标准技术完成。核酸试剂已退火至的编码区序列可与根据已知的编码区序列所预期的退火模式相比较以确定特定的基因型或序列是否存在。
这些技术可容易地调整以提供用于测定病毒基因组中包膜蛋白可变区的长度和/或包膜蛋白糖基化位点数目的高通量方法。例如，来自Affymetrix(Affymetrix,Inc.,Sunnyvale,Calif.)的基因阵列可用于快速鉴定大量的个体病毒的基因型。Affymetrix基因阵列以及制造和使用这样的阵列的方法描述于例如美国专利No.6,551,784、6,548,257、6,505,125、6,489,114、6,451,536、6,410,229、6,391,550、6,379,895、6,355,432、6,342,355、6,333,155、6,308,170、6,291,183、6,287,850、6,261,776、6,225,625、6,197,506、6,168,948、6,156,501、6,141,096、6,040,138、6,022,963、5,919,523、5,837,832、5,744,305、5,834,758、和5,631,734中，其各自通过引用整体并入本文。
此外，Ausubel等人,eds.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,2002,Vol.4,Unit25B,Ch.22(其通过引用整体并入本文)提供了关于构建和使用基因阵列用于测定大量的病毒分离物的基因型的进一步指导。最后，美国专利No.6,670,124；6,617,112；6,309,823；6,284,465；和5,723,320(其各自通过引用整体并入本文)描述了可由本领域技术人员容易地调整用于快速鉴定大量的病毒基因型的相关阵列技术。
用于基因特异性核酸分子的检测的替代性诊断方法可包括其扩增，例如通过PCR(美国专利No.4,683,202；4,683,195；4,800,159；和4,965,188；PCRStrategies,1995Innisetal.(eds.),AcademicPress,Inc.)，随后使用本领域技术人员公知的技术检测扩增的分子。所得的扩增序列可与如果被扩增的核酸仅含有各基因的正常拷贝所会预期的那些序列进行比较以确定基因突变是否存在。
还可使用针对病毒基因产物即病毒蛋白或病毒肽片段的抗体来检测病毒蛋白中的突变。或者，可通过本领域已知的任何测序方法对目标病毒蛋白或肽片段进行测序以产生目标蛋白的氨基酸序列。这种方法的一个例子是可用于测序小蛋白质或多肽的Edman降解法。较大的蛋白质可首先通过本领域中已知的化学或酶促试剂(例如溴化氰，羟基胺，胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶)进行切割，随后通过Edman降解法测序。
测定对HCV抑制剂的易感性的表型方法
提供了用于测定丙型肝炎病毒(HCV)群对HCV抑制剂的易感性的方法，其包括下列步骤：向细胞导入包含来自所述HCV病毒群的患者来源片段的抗性测试载体，其中所述细胞或抗性测试载体包含产生依赖于所述HCV的可检测信号的指示物核酸；在不存在或存在增加浓度的HCV抑制剂的情况下测量细胞中指示物基因的表达；建立针对所述HCV抑制剂的药物易感性的标准曲线，其中在所述标准曲线中检测IC95倍数变化值；将所述HCV群的IC95倍数变化值与对照HCV群的IC95倍数变化值进行比较；和当所述HCV群的IC95倍数变化值相较于对照HCV群的IC95倍数变化值更高时，测定所述HCV群包含对所述HCV抑制剂具有减小的易感性的HCV颗粒。
在某些方面，HCV抑制剂靶向HCV聚合酶。HCV抑制剂可为例如核苷(核苷酸)抑制剂(NI)或非核苷抑制剂(NNI)。在一些实施方式中，HCV是靶向聚合酶的位点A、B、C或D的非核苷抑制剂(NNI-A，NNI-B，NNI-C或NNI-D)。在某些方面，HCV抑制剂靶向NS5A。在一些实施方式中，HCV群和对照HCV群包含HCV基因型1、基因型2、基因型3或基因型4。在某些实施方式中，HCV群和对照HCV群可包含HCV基因型1a、1b、2a或2b。在某些特定实施方式中，对照HCV群包含Con1HCV或H77HCV。在某些其他特定实施方式中，对照HCV群是来自在用HCV抑制剂治疗之前的患者的HCV群。在某些实施方式中，抗性测试载体包含患者来源的片段和指示物核酸。在一些实施方式中，患者来源的片段包含HCV的NS5B区。在某些实施方式中，指示物基因包含萤光素酶基因。在这些方法的实施方式中，宿主细胞是Huh7细胞。在某些实施方式中，所述方法用于帮助确定针对患者的适合的治疗方案。在某些实施方式中，所述方法进一步包括测定IC50倍数变化值，以及测定IC95倍数变化值对IC50倍数变化值的比率，其中所述比率的变化指示HCV对所述抑制剂的易感性的变化。
还提供了用于测定丙型肝炎病毒(HCV)群对HCV抑制剂的易感性的方法，包括下列步骤：向细胞导入包含来自HCV病毒群的患者来源片段的抗性测试载体，其中所述细胞或抗性测试载体包括产生依赖于HCV的可检测信号的指示物核酸；在不存在或存在增加浓度的HCV抑制剂的情况下测量细胞中指示物基因的表达；确定HCV群对该HCV抑制剂的药物易感性的标准曲线；比较HCV群的标准曲线的斜率与对照HCV群的标准曲线的斜率；及当HCV群的标准曲线的斜率相比对照群的标准曲线的斜率有降低时，测定所述HCV群包含对所述HCV抑制剂具有减小的易感性的HCV颗粒。在某些方面，HCV抑制剂靶向HCV聚合酶。HCV抑制剂可为例如核苷(核苷酸)抑制剂(NI)或非核苷抑制剂(NNI)。在一些实施方式中，HCV是靶向HCV聚合酶的位点A、B、C或D的非核苷抑制剂(NNI-A，NNI-B，NNI-C或NNI-D)。在某些方面，HCV抑制剂靶向NS5A。在一些实施方式中，HCV群和对照HCV群包含HCV基因型1、基因型2、基因型3或基因型4。在某些实施方式中，HCV群和对照HCV群可包含HCV基因型1a、1b、2a或2b。在某些特定实施方式中，对照HCV群包含Con1HCV或H77HCV。在某些其他特定实施方式中，对照HCV群是来自在用所述HCV抑制剂治疗之前的患者的HCV群。在某些实施方式中，抗性测试载体包含患者来源的片段和指示物核酸。在一些实施方式中，患者来源的片段包含HCV的NS5B区。在某些实施方式中，指示物基因包含萤光素酶基因。在这些方法的某些实施方式中，宿主细胞是Huh7细胞。在某些实施方式中，所述方法用于帮助确定针对患者的适合的治疗方案。
还提供了测定丙型肝炎病毒(HCV)群对HCV抑制剂的易感性的方法，包括下列步骤：向细胞导入包含来自HCV病毒群的患者来源片段的抗性测试载体，其中所述细胞或抗性测试载体包含产生依赖于HCV的可检测信号的指示物核酸；在不存在或存在增加浓度的HCV抑制剂的情况下测量细胞中指示物基因的表达；测定HCV群对HCV抑制剂的药物易感性的标准曲线；比较HCV群的最大百分比抑制与对照HCV群的最大百分比抑制；及当HCV群的最大百分比抑制相比对照群的最大百分比抑制有降低时，测定该HCV群包含对该HCV抑制剂具有减小的易感性的HCV颗粒。在某些方面，HCV抑制剂靶向HCV聚合酶。HCV抑制剂可为，例如，核苷(核苷酸)抑制剂(NI)或非核苷抑制剂(NNI)。在一些实施方式中，HCV是靶向HCV聚合酶的位点A、B、C或D的非核苷抑制剂(NNI-A，NNI-B，NNI-C或NNI-D)。在某些方面，HCV抑制剂靶向NS5A。在某些方面，HCV抑制剂靶向NS3。在一些实施方式中，HCV群和对照HCV群包含HCV基因型1、基因型2、基因型3或基因型4。在某些实施方式中，HCV群和对照HCV群可包含HCV基因型1a、1b、2a或2b。在某些特定实施方式中，对照HCV群包含Con1HCV或H77HCV。在某些其他特定实施方式中，对照HCV群是来自在用所述HCV抑制剂治疗之前的患者的HCV群。在某些实施方式中，抗性测试载体包含患者来源的片段和指示物基因。在一些实施方式中，患者来源的片段包含HCV的NS5B区。在某些实施方式中，指示物基因包含萤光素酶基因。在这些方法的某些实施方式中，宿主细胞是Huh7细胞。在某些实施方式中，所述方法用于帮助确定针对患者的适合的治疗方案。
表型易感性分析
在某些实施方式中，测定特定病毒的HCV抑制剂易感性的方法包括：在HCV抑制剂的存在下培养包含患者来源片段和指示物基因的宿主细胞，测量宿主细胞中指示物基因的活性；及比较如测量的指示物基因的活性与指示物基因的参照活性，其中指示物基因的测量活性相对于参照活性之间的差异与HCV对HCV抑制剂的易感性相关联，由此测定HCV对HCV抑制剂的易感性。在某些实施方式中，指示物基因的活性依赖于由患者来源片段编码的多肽的活性。在优选的实施方式中，患者来源片段包含编码NS5B的核酸序列。在其他实施方式中，患者来源片段编码HCV蛋白酶NS3或NS5A蛋白。在某些实施方式中，患者来源片段从HCV得到。
在某些实施方式中，指示物基因的参照活性通过在不存在HCV抑制剂的情况下测定指示物基因的活性来测定。在某些实施方式中，指示物基因的参照活性通过测定参照HCV对NI或NNI的易感性来测定。在某些实施方式中，参照活性通过用标准实验室病毒片段实施本发明的方法来测定。在某些实施方式中，标准实验室病毒片段包含来自HCV株Con1或H77的核酸序列。
在某些实施方式中，HCV被测定为对HCV抑制剂具有减小的易感性。在某些实施方式中，HCV被测定为对HCV抑制剂具有增加的易感性。在某些实施方式中，患者来源片段已在反转录和聚合酶链反应(PCR)的反应中或在单独的PCR反应中制备。
在某些实施方式中，所述方法另外地包括在培养宿主细胞之前用包含患者来源片段和指示物基因的病毒颗粒感染宿主细胞的步骤。
在某些实施方式中，指示物基因是萤光素酶基因。在某些实施方式中，指示物基因是lacZ基因。在某些实施方式中，宿主细胞是人细胞。在某些实施方式中，宿主细胞是人肝癌细胞。在某些实施方式中，宿主细胞是Huh7细胞。在其他实施方式中，宿主细胞是Huh7衍生物(例如，Huh7.5，Huh7.5.1)。Huh7.5细胞-人肝细胞细胞系通过用IFN矫正稳定选择的含有HCV复制子的细胞系来产生。(BlightKJ等人，JVirol76:13001–13014，2002)。在某些其他实施方式中，宿主细胞是HepG2细胞，Hep3B细胞，或其衍生物。在某些实施方式中，宿主细胞源于人肝癌细胞系。在某些实施方式中，宿主细胞是原代肝细胞(例如，来自胚胎，成人或再生肝)。在另一些实施方式中，宿主细胞是淋巴细胞(例如，B细胞，B细胞淋巴瘤)。
在另一方面，本发明提供包含患者来源片段和指示物基因的载体。在某些实施方式中，患者来源片段包含编码HCVNS3，NS5A或NS5B的核酸序列。在某些优选的实施方式中，患者来源片段包含编码HCVNS5B的核酸序列。在某些实施方式中，指示物基因的活性依赖于HCVNS5B的活性。
在某些实施方式中，指示物基因是功能性指示物基因。在某些实施方式中，指示物基因是非-功能性指示物基因。在某些实施方式中，指示物基因是萤光素酶基因。
在另一方面，本发明提供包含本发明的载体的包装宿主细胞。在某些实施方式中，包装宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。在某些实施方式中，包装宿主细胞是人宿主细胞。在某些实施方式中，宿主细胞是Huh7细胞。在其他实施方式中，宿主细胞是Huh7衍生物(例如，Huh7.5，Huh7.5.1)。Huh7.5细胞-人肝细胞细胞系是通过用IFN矫正稳定选择的含有HCV复制子的细胞系来产生的。(BlightKJ等人JVirol76:13001–13014，2002)。在某些其他实施方式中，宿主细胞是HepG2细胞，Hep3B细胞，或其衍生物。在某些实施方式中，宿主细胞源于人肝细胞瘤细胞系。在某些实施方式中，宿主细胞是原代肝细胞(例如，来自胚胎，成人或再生肝)。在另一些实施方式中，宿主细胞是淋巴细胞(例如，B细胞，B细胞淋巴瘤)。
在另一方面，本发明提供测定感染患者的HCV是否对HCV抑制剂易感或有抗性的方法。在某些实施方式中，所述方法包括根据本发明的方法测定HCV对HCV抑制剂的易感性，及比较测定的HCV对HCV抑制剂的易感性与HCV对HCV抑制剂的易感性的标准曲线。在某些实施方式中，HCV对HCV抑制剂的易感性相对于标准曲线的减小表示HCV对所述HCV抑制剂有抗性。在某些实施方式中，HCV对HCV抑制剂的易感性的减小量指示HCV对所述HCV抑制剂易感性变弱的程度。在某些实施方式中，HCV抑制剂是核苷(核苷酸)抑制剂(NI)或蛋白酶抑制剂。在某些实施方案中，HCV抑制剂是干扰素。在一些实施方案中，干扰素可包括例如聚乙二醇化干扰素α2a、聚乙二醇化干扰素α2b、聚乙二醇化干扰素λ、前述的亲本物或衍生物、或干扰素家族中具有抗HCV活性的任何成员或其衍生物。在其他实施方式中，HCV抑制剂是靶向聚合酶的位点A、B、C或D的非核苷抑制剂(NNI)(NNI-A，NNI-B，NNI-C或NNI-D)。在某些其他方面，HCV抑制剂靶向NS5A。在某些其他方面，HCV抑制剂靶向NS3。在一些实施方式中，HCV抑制剂可为以下之一或以下一种或更多的组合：
NS3：
BILN-2061，VX-950，SCH-503,034，SCH-900,518，TMC-435,350，R-7227(ITMN-191)，MK-5172，MK-7009，BI-201,335，BMS-650,032，BMS-824,393，PHX-1766，ACH-1625，ACH-2684，VX-985，BMS-791,325，IDX-320，GS-9256，GS-9451，ABT-450，VX-500，BIT-225
NS5A：
BMS-790,052，GSK-2336805，PPI-461，ABT-267，GS-5885，ACH-2928，AZD-7295
NS5B：
NM-283，RG-7128，R-1626，PSI-7851，IDX-184，MK-0608，PSI-7977，PSI-938，GS-6620，TMC-649,128，INX-189，VX-759，VCH-916，VX-222，ANA-598，HCV-796，GS-9190，GS-9669，ABT-333，PF-4878691，IDX-375，ABT-837,093，GSK-625,443，ABT-072。
在另一方面，本发明提供测定感染患者的HCV对HCV抑制剂的抗性的进展或发展的方法。在某些实施方式中，所述方法包括在第一时间根据本发明的方法测定HCV对HCV抑制剂的易感性；在更晚的第二时间根据本发明的方法评定HCV抑制剂的有效性；及比较在第一和第二时间评定的HCV抑制剂的有效性。在某些实施方式中，患者来源片段在约第一时间从患者得到。在某些实施方式中，在更晚的第二时间HCV对HCV抑制剂的易感性相较于第一时间的减小指示感染患者的HCV的HCV抑制剂抗性的发展或进展。
在另一方面，本发明提供测定感染患者的HCV对HCV抑制剂的易感性的方法。在某些实施方式中，所述方法包括在改变浓度的HCV抑制剂的存在下培养包含从HCV获得的患者来源片段和指示物基因的宿主细胞，针对改变的HCV抑制剂浓度测量宿主细胞中指示物基因的活性；及测定HCV对HCV抑制剂的IC50，IC95或其比率，其中HCV对HCV抑制剂的IC50，IC95或其比率指示HCV对HCV抑制剂的易感性。在某些实施方式中，指示物基因的活性依赖于由患者来源片段编码的多肽的活性。在某些实施方式中，患者来源片段包含编码NS5B，NS5A和/或NS3的核酸序列。在某些实施方式中，HCV的IC50，IC95或其比率可通过将观察的指示物基因的活性相对抗-HCV药物浓度的对数进行作图来测定。或者，HCV对HCV抑制剂的易感性通过将曲线的斜率或在曲线中鉴定的HCV的最大抑制与参照病毒的曲线进行比较来测定。
在另一方面，本发明提供测定感染患者的HCV群对HCV抑制剂的易感性的方法。在某些实施方式中，该方法包含在HCV抑制剂的存在下培养包含来自HCV群的多个患者来源片段和指示物基因的宿主细胞，测量宿主细胞中指示物基因的活性；及比较如测量的指示物基因的活性(通过IC50，IC95或其比率，或斜率或最大抑制百分比测量)与指示物基因的参照活性，其中指示物基因的测量的活性相对于参照活性之间的差异与HCV对HCV抑制剂的易感性相关联，由此测定HCV对HCV抑制剂的易感性。在某些实施方式中，指示物基因的活性依赖于由多个患者来源片段编码的多个多肽的活性。在某些实施方式中，患者来源片段包含编码NS5B、NS5A或NS3的核酸序列。在某些实施方式中，多个患者来源片段通过对从患者样品获得的多个核酸扩增患者来源片段来制备。
在另一方面，本发明提供测定感染患者的HCV群对HCV抑制剂的易感性的方法。在某些实施方式中，该方法包含在改变浓度的HCV抑制剂的存在下培养包含自HCV群获得的多个患者来源片段和指示物基因的宿主细胞，针对改变浓度的HCV抑制剂测量宿主细胞中指示物基因的活性；及测定HCV群对抗病毒药物的IC50，IC95或其比率，其中HCV群对HCV抑制剂的IC50，IC95或其比率指示HCV群对HCV抑制剂的易感性。在某些实施方式中，宿主细胞包含患者来源片段和指示物基因。在某些实施方式中，指示物基因的活性依赖于由多个患者来源片段编码的多个多肽的活性。在某些实施方式中，多个患者来源片段包含编码NS5B，NS5A或NS3的核酸序列。在某些实施方式中，HCV群的IC50，IC95或其比率可通过将观察的指示物基因的活性相对于抗-HCV药物浓度的对数进行作图来测定。在某些实施方式中，多个患者来源片段通过对从患者样品获得的多个核酸扩增患者来源片段来制备。在某些其他实施方式中，HCV对HCV抑制剂的易感性通过将曲线的斜率或在曲线中鉴定的HCV的最大抑制与参照病毒的曲线进行比较来测定。
抗性测试载体的构建
在某些实施方式中，抗性测试载体可通过将患者来源片段插入指示物基因病毒载体来制造。一般而言，在该实施方式中，抗性测试载体不包含产生完全感染性病毒颗粒所必需的全部基因。在某些实施方式中，抗性测试载体可通过将患者来源片段插入包装载体来制造，而指示物基因包含于第二载体内，例如指示物基因病毒载体。在某些实施方式中，抗性测试载体可通过将患者来源片段插入包装载体来制造，而将指示物基因整合到待用抗性测试载体感染的宿主细胞的基因组中。
如果药物旨在靶向多于一种功能性病毒序列或病毒基因产物，可将包含各功能性病毒序列或病毒基因产物的患者来源片段导入抗性测试载体。在联合治疗的情况中，其中评价靶向相同的或两种或更多不同功能性病毒序列或病毒基因产物的两种或更多抗-HCV药物时，可将包含每一种这样的功能性病毒编码序列或病毒基因产物的患者来源片段插入抗性测试载体。依赖于选择的特定构建体，可将患者来源片段插入指示物基因病毒载体或例如包装载体中独特限制性位点或特定的位置处，被称为患者序列接受位点。
可无限制地使用由本领域技术人员已知的任何适合的克隆技术将患者来源片段插入抗性测试载体。例如，经II类限制性位点导入质粒主链和患者来源片段进行克隆，其更为优选，或通过尿嘧啶DNA糖基化酶引物克隆。
患者来源片段可由分子克隆或基因扩增或其改良的任何方法，通过如下所述在待被导入抗性测试载体的患者来源片段的末端导入患者序列接受位点来获得。在优选的实施方式中，基因扩增方法诸如PCR可用于在PCR反应中使用的引物末端掺入对应于患者序列接受位点的限制性位点。类似地，在分子克隆方法诸如cDNA克隆中，可在用于第1或第2链cDNA合成的引物的末端掺入限制性位点，或在诸如DNA(无论克隆的或未克隆的DNA)的引物-修复的方法中，可将限制性位点掺入用于修复反应的引物。患者序列接受位点和引物可设计为改善患者来源片段的展示。具有经设计的患者序列接受位点的抗性测试载体组允许在单独一种抗性测试载体中可能会展示不足的患者来源片段的展示。
抗性测试载体可由通过导入患者序列接受位点修饰指示物基因病毒载体，扩增或克隆患者来源片段及向指示物基因病毒载体中在患者序列接受位点精确地导入扩增的或克隆的序列来制备。在某些实施方式中，抗性测试载体可自指示物基因病毒载体构建，其进而可源于基因组病毒载体或亚基因组病毒载体和指示物基因盒，其各自在以下描述。抗性测试载体然后可被导入宿主细胞。或者，在某些实施方式中，抗性测试载体可通过将患者序列接受位点导入包装载体，扩增或克隆患者来源片段，及向包装载体中在患者序列接受位点精确地插入扩增的或克隆的序列，及将指示物基因病毒载体与此包装载体共转染来制备。
在一个优选的实施方式中，可将抗性测试载体随包装表达载体一起导入包装宿主细胞，如下定义，以产生用于药物抗性和易感性测试(在本文被称为“基于颗粒的测试”)的抗性测试载体病毒颗粒。在替代性的实施方式中，可在包装表达载体的缺失下将抗性测试载体导入宿主细胞，以实施药物抗性和易感性测试(在本文被称为“非基于颗粒的测试”)。如本文所用，“包装表达载体”提供这些因子，诸如包装蛋白(例如，结构蛋白诸如核心和包膜多肽)，反式作用因子或复制缺陷型HCV所需的基因。在该情况中，有复制能力的病毒基因组以使得其不能自身复制的方式弱化。这是指，尽管包装表达载体可产生拯救在含有弱化基因组的细胞中存在的缺陷病毒基因组所需的反式作用或丢失基因，但弱化的基因组不可拯救其自身。这样的实施方式对于制备含有不含有产生完全感染性病毒颗粒必需的全部病毒基因的抗性测试载体的病毒颗粒特别有用。
在某些实施方式中，抗性测试载体包含指示物基因，尽管如上述，指示物基因无需必然存在于抗性测试载体中。指示物基因的实例包括，但不限于，编码β-半乳糖苷酶的大肠埃希氏菌(E.coli)lacZ基因，来自例如萤火虫(Photonispyralis)(萤火虫)或肾海鳃(Renillareniformis)(肾海鳃)的编码萤光素酶的luc基因，编码碱性磷酸酶、绿色荧光蛋白的大肠埃希氏菌(E.coli)phoA基因和编码氯霉素乙酰转移酶的细菌CAT基因。优选的指示物基因是萤火虫萤光素酶。指示物基因的另外的实例包括、但不限于容易由测定法(诸如放射免疫测定(RIA)，或荧光活化的细胞分选(FACS))测量的分泌蛋白或细胞表面蛋白，包括例如生长因子、细胞因子和细胞表面抗原(例如分别为生长激素，Il-2或CD4)。另一些例示指示物基因包括选择基因，也被称为可选择的标志物。对于哺乳动物细胞适合的可选择标志物的实例是二氢叶酸还原酶(DHFR)，胸苷激酶，潮霉素，新霉素，zeocin或大肠埃希氏菌gpt。在指示物基因的上述实例的情况中，指示物基因和患者来源片段是离散的，即不同及分开的基因。在一些情况中，患者来源片段也可用作指示物基因。在其中患者来源片段对应于作为抗-HCV药剂的靶的一种或更多HCV基因的一个这样的实施方式中，HCV基因之一也可作为指示物基因。例如，病毒蛋白酶基因可因其切割发色底物的能力或其活化无活性酶原、进而切割发色底物的能力而作为指示物基因，在各情况中产生颜色反应。
如上所述，抗性测试载体可自指示物基因病毒载体组装。如本文所用，“指示物基因病毒载体”是指包含指示物基因和其控制元件及一个或更多病毒基因或编码区的载体。指示物基因病毒载体可自下文定义的指示物基因盒和“病毒载体”组装。指示物基因病毒载体可另外地包括增强子，剪接信号，多聚腺苷酸化序列，转录终止子或其他调控序列。另外，指示物基因病毒载体中的指示物基因可以是功能性的或无功能的。在作为抗病毒药物的靶的病毒片段未包括在指示物基因病毒载体中的情况中，它们可在第2载体中提供。“指示物基因盒”包含指示物基因和控制元件，并且任选地在其端配置有限制酶切割位点，以便于将该盒导入病毒载体。“病毒载体”是指包含以下一些或全部的载体：编码基因产物的病毒基因，控制序列，病毒包装序列，及在反转录病毒的情况中，整合序列。病毒载体可另外地包括一个或更多病毒片段，其中的一个或更多片段可为抗病毒药物的靶。含有病毒基因的病毒载体的两个实例在本文被称为“基因组病毒载体”和“亚基因组病毒载体”。“基因组病毒载体”是可包含致使病毒无复制能力(例如不能表达产生完全感染性病毒颗粒必需的全部蛋白，但其另外保存完全病毒的mRNA表达及加工特征)的一个或更多病毒基因的缺失的载体。在HCV药物易感性和抗性测试的一个实施方式中，基因组病毒载体包含NS5B，NS5A和NS3编码区。“亚基因组病毒载体”是指包含可编码作为抗病毒药物的靶的蛋白的一个或更多病毒基因的编码区的载体。在一个优选的实施方式中，亚基因组病毒载体包含HCV聚合酶编码区，或其部分。在某些实施方式中，病毒编码基因可在天然增强子/启动子控制下。在某些实施方式中，病毒编码区可处于外源病毒或细胞增强子/启动子控制下。在一个优选的实施方式中，基因组或亚基因组病毒编码区可处于天然增强子/启动子区或CMV立即-早期(IE)增强子/启动子控制下。在含有作为靶或编码作为一种或更多抗病毒药物的靶的蛋白的一个或更多病毒基因的指示物基因病毒载体的某些实施方式中，载体可包含患者序列接受位点。患者来源片段可被插入在指示物基因病毒载体中的患者序列接受位点，其然后被称为抗性测试载体，如上所述。
“患者序列接受位点”是载体中用于插入患者来源片段的位点。在某些实施方式中，该位点可为：(1)由定点诱变导入载体的独特限制性位点；(2)载体中天然存在的独特限制性位点；或(3)可通过使用替代性的克隆方法(例如UDG克隆)插入患者来源片段的选择的位点。在某些实施方式中，患者序列接受位点由定点诱变导入指示物基因病毒载体。患者序列接受位点可位于或接近于作为抗病毒药物的靶的病毒蛋白的编码区。优选选择用于导入患者序列接受位点的病毒序列，使得不对该位置的氨基酸编码序列中制造变化。如果在该位置制造氨基酸编码序列的变化，则该变化优选是保守性变化。优选患者序列接受位点可位于病毒基因组的相对保守的区内，以有助于患者来源片段的导入。或者，患者序列接受位点可位于功能性地重要的基因或调控序列之间。患者序列接受位点可位于或接近于相对保守的病毒基因组区，以允许由用于向患者来源片段导入对应限制性位点的引物引发。为了进一步改善患者来源片段的展示，该引物可设计为简并库，以容纳病毒序列异质性，或可掺入具有多碱基-配对能力的残基诸如脱氧肌苷(I)。可在药物抗性和易感性测试中一起使用具有限定相同的或重叠限制性位点间隔的患者序列接受位点的抗性测试载体组，以提供含有与给定患者序列接受位点相同的内部限制性位点的患者来源片段的展示，其单独在任一种抗性测试载体中将会展示不足。
本发明的载体的构建采用本领域熟知的标准连接和限制技术。参见，例如，Ausubel等人，2005，CurrentProtocolsinMolecularBiologyWiley--Interscience和Sambrook等人，2001，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，N.Y。分离的质粒，DNA序列或合成的寡核苷酸可被切割，剪裁并以期望的形式再连接。掺入合成DNA的全部DNA构建体的序列可由DNA序列分析确认。参见，例如，Sanger等人，1977，P.N.A.S.USA74:5463-5467。
除了以上讨论的元件之外，本文所用的载体也可含有选择基因，也称为可选择的标志物。在某些实施方式中，选择基因编码被所述载体转化的宿主细胞的存活或生长所必需的蛋白。对于哺乳动物细胞适合的可选择标志物的实例包括二氢叶酸还原酶基因(DHFR)，鸟氨酸脱羧酶基因，多药物抗性基因(mdr)，腺苷脱氨酶基因，及谷氨酰胺合酶基因。当这样的可选择标志物成功地转移进哺乳动物宿主细胞时，被转化的哺乳动物宿主细胞如果处于选择性压力下可生存。有2种广泛使用的不同类别的选择性方案。第1类别基于细胞的代谢，使用缺乏独立于补充培养基而进行生长的能力的突变细胞系。第2类别被称为显性选择，指在任何细胞类型中使用的选择方案，不需要使用突变细胞系。这些方案一般使用药物来阻拦宿主细胞生长。具有新基因的那些细胞会表达赋予药物抗性的蛋白，并且会在选择中生存。这种显性选择的实例使用药物新霉素(见Southern和Berg，1982，J.Molec.Appl.Genet.1:327)，霉酚酸(见Mulligan和Berg，1980，Science209:1422)，或潮霉素(见Sugden等人，1985，Mol.Cell.Biol.5:410-413)。以上给出的3个实例采用处于真核生物细胞控制下的细菌基因，以赋予分别对适当的药物新霉素(G418或庆大霉素)，xgpt(霉酚酸)或潮霉素的抗性。
宿主细胞
在某些实施方式中，本发明的方法包含培养包含患者来源片段和指示物基因的宿主细胞。在某些实施方式中，宿主细胞可为哺乳动物细胞。在某些实施方式中，宿主细胞可源于作为病毒感染的主要靶的人组织和细胞。源于人的宿主细胞允许抗病毒药物有效进入细胞及由细胞酶促机械转变为抗病毒抑制剂的代谢关联形式。在一些实施方式中，宿主细胞在本文可被称为“包装宿主细胞”，“抗性测试载体宿主细胞”，或“靶宿主细胞”。“包装宿主细胞”是指提供本文所用的复制缺陷型病毒载体(诸如例如抗性测试载体)需要的反式作用因子和病毒包装蛋白的宿主细胞，以产生抗性测试载体病毒颗粒。包装蛋白可提供抗性测试载体本身、包装表达载体或二者之内含有的病毒基因的表达。包装宿主细胞可为用一种或更多包装表达载体转染的宿主细胞，且当用抗性测试载体转染后，在本文被称为“抗性测试载体宿主细胞”，有时被称为包装宿主细胞/抗性测试载体宿主细胞。
在某些实施方式中，宿主细胞是Huh7细胞。在其他实施方式中，宿主细胞是Huh7衍生物(例如，Huh7.5，Huh7.5.1)。Huh7.5细胞-人肝细胞细胞系通过用IFN矫正稳定选择的含有HCV复制子的细胞系来产生。(BlightKJ等人，JVirol76:13001–13014，2002)。在某些其他实施方式中，宿主细胞是HepG2细胞，Hep3B细胞，或其衍生物。在某些实施方式中，宿主细胞源于人肝细胞瘤细胞系。在某些实施方式中，宿主细胞是原代肝细胞(例如，来自胚胎，成人或再生肝)。在另一些实施方式中，宿主细胞是淋巴细胞(例如，B细胞，B细胞淋巴瘤)。
除非另外提供，本文用于转化宿主细胞的方法是Graham及vanderEb，1973，Virology52:456-457的磷酸钙共沉淀方法。替代性的转染方法包括，但不限于，电穿孔，DEAE-葡聚糖方法，脂转染及生物弹道轰击。见，例如，Kriegler，1990，GeneTransferandExpression:ALaboratoryManual，StocktonPress。
宿主细胞可用本发明的表达载体转染，并在经改良以适合于诱导启动子、选择转化体或扩增基因的常规营养培养基中培养。宿主细胞在添加谷氨酰胺及无抗生素的F12:DMEM(Gibco)50:50中培养。培养条件，诸如温度、pH等，是那些之前为表达所选择的宿主细胞使用的，并且对于本领域普通技术人员将是显而易见的。
药物易感性和抗性测试
药物易感性和抗性测试可在一种或更多宿主细胞中实施。病毒药物易感性测定为给定百分比的指示物基因表达被抑制的抗病毒药剂浓度(例如,抗病毒药剂的IC50是50％的指示物基因表达被抑制的浓度)。可使用本发明的方法为标准实验室病毒片段或自未受药物处理的患者(即,未接收任何抗病毒药物的患者)的病毒片段建立给定抗病毒药物的药物易感性标准曲线。相应地，病毒药物抗性可通过比较对该给定标准物的药物易感性或通过在相同的患者中随时间进行连续测量，通过对给定患者检测病毒药物易感性的减小来测定，如由指示物基因表达的增加抑制(即降低的指示物基因表达)确定。
在某些实施方式中，抗性测试载体病毒颗粒由通过用抗性测试载体及包装表达载体转染包装宿主细胞而制备的第一宿主细胞(抗性测试载体宿主细胞)产生。抗性测试载体病毒颗粒然后可用于感染第二宿主细胞(靶宿主细胞)，在其中测量指示物基因的表达。包含用抗性测试载体转染的包装宿主细胞(其然后被称为抗性测试载体宿主细胞)及靶细胞的这种两细胞系统在功能或非-功能指示物基因的情况下使用。功能指示物基因在转染包装宿主细胞后有效表达，由此，需要用抗性测试载体宿主细胞上清液感染靶宿主细胞，以精确地测定药物易感性。具有变换的(permuted)启动子，变换的编码区，或倒置的内含子的非功能指示物基因在转染包装宿主细胞后不发生有效表达，由此，靶宿主细胞的感染可通过由抗性测试载体宿主细胞和靶宿主细胞的共培养或通过使用抗性测试载体宿主细胞上清液感染靶宿主细胞来达到。
在第二类型的药物易感性和抗性测试中，单一宿主细胞(抗性测试载体宿主细胞)也作为靶宿主细胞。包装宿主细胞被转染及产生抗性测试载体病毒颗粒，一些包装宿主细胞也成为被抗性测试载体颗粒感染的靶。采用单一宿主细胞类型的药物易感性和抗性测试用包含具有变换的启动子、变换的编码区或倒置的内含子的非-功能指示物基因的病毒抗性测试载体是可能的。该指示物基因在第一细胞转染后不发生有效表达，而仅在第二细胞感染后有效表达，由此提供测量待评估的抗病毒药剂的效应的机会。在使用包含功能指示物基因的抗性测试载体的药物易感性和抗性测试的情况中，使用单一细胞类型的共培养过程或抗性和易感性测试均不可用于靶细胞的感染。包含功能指示物基因的抗性测试载体可使用两细胞体系，其中利用来自抗性测试载体宿主细胞的过滤上清液来感染靶宿主细胞。
在某些实施方式中，基于颗粒的抗性测试可用源于基因组病毒载体的抗性测试载体实施，其可与包装表达载体共转染。或者，基于颗粒的抗性测试可用源于亚基因组病毒载体的抗性测试载体(其与包装表达载体共转染)实施。在本发明的另一实施方式中，非-基于颗粒的抗性测试可在包装表达载体缺失的情况下使用以上描述的各抗性测试载体通过转染选择的宿主细胞来实施。
在基于颗粒的易感性和抗性测试的情况中，抗性测试载体病毒颗粒可由可通过用上述抗性测试载体及包装表达载体转染包装宿主细胞制备的第一宿主细胞(抗性测试载体宿主细胞)产生。然后抗性测试载体病毒颗粒可用于感染在其中测量指示物基因的表达的第二宿主细胞(靶宿主细胞)。在第二类型的基于颗粒的易感性和抗性测试中，单一宿主细胞类型(抗性测试载体宿主细胞)充当两个目的：给定培养物中的一些包装宿主细胞可被转染及产生抗性测试载体病毒颗粒，在相同的培养物中的一些宿主细胞可为由此产生的抗性测试载体颗粒感染的靶。采用单一宿主细胞类型的抗性测试用包含具有变换的启动子的非-功能指示物基因的抗性测试载体是可能的，因为这样的指示物基因可在允许的宿主细胞感染后有效表达，但在转染相同的宿主细胞类型后不发生有效表达，由此提供测量待评估的抗病毒药剂的效应的机会。由于类似原因，采用2个细胞类型的抗性测试可通过共培养2个细胞类型来实施，作为用自第一细胞类型的上清液获得的病毒颗粒感染第2细胞类型的替代。
在非-基于颗粒的易感性和抗性测试的情况中，抗性测试可通过在包装表达载体的缺失下，用抗性测试载体转染单一宿主细胞来实施。非-基于颗粒的抗性测试可使用包含具有变换的启动子、变换的编码区或倒置的内含子的非-功能指示物基因的抗性测试载体实施。这些非-基于颗粒的抗性测试通过在包装表达载体缺失下用各抗性测试载体转染单一宿主细胞类型来实施。尽管这些抗性测试载体之内含有的非-功能指示物基因在转染宿主细胞后不会有效表达，其中仍有自非-基于病毒颗粒的反转录得到的可检测指示物基因表达。反转录和链转移导致变换的非-功能指示物基因转变为非变换的功能指示物基因。由于反转录完全依赖于各抗性测试载体之内含有的聚合酶基因的表达，可就它们抑制由抗性测试载体之内含有的患者来源片段编码的聚合酶基因产物的能力测试抗病毒药剂。
包装宿主细胞可用抗性测试载体和适当的包装表达载体转染而产生抗性测试载体宿主细胞。在某些实施方式中，可将个体抗病毒药剂在它们转染时以适当的浓度范围加入包装宿主细胞的各个板。在转染之后24～48小时，靶宿主细胞可通过用抗性测试载体宿主细胞或用自抗性测试载体宿主细胞的过滤上清液获得的抗性测试载体病毒颗粒共培养而感染。可将各抗病毒药剂或其组合在感染前或感染时加入靶宿主细胞，以实现转染期间存在的给定药剂或多种药剂的相同终浓度。在其他实施方式中，抗病毒药剂在包装宿主细胞培养物中可省略，而仅在感染前或感染时添加到靶宿主细胞中。
通过共培养或用过滤的病毒上清液感染的靶宿主细胞中指示物基因的表达或抑制的测定可通过测量指示物基因表达或活性来实施。例如，在指示物基因是萤火虫luc基因的情况中，可测量萤光素酶活性。与在抗病毒药剂缺乏下运行的对照相比在给定抗病毒药剂或多种抗病毒药剂的存在下用抗性测试载体病毒颗粒的给定制备物感染的靶宿主细胞观察的萤光素酶活性的减小通常与抗病毒药剂浓度的对数相关，呈S形曲线。对于由存在于抗性测试载体中的患者来源片段编码的病毒靶产物，此抑制曲线可用于计算所述药剂或药剂组合的表观抑制性浓度(IC)。
在一种细胞易感性和抗性测试的情况中，宿主细胞可用抗性测试载体和适当的包装表达载体转染而产生抗性测试载体宿主细胞。可将个体抗病毒药剂或其组合在它们转染时以适当的浓度范围加入转染细胞的个体板中。在转染之后24～72小时，可收集细胞及测定指示物基因(例如萤火虫萤光素酶)活性。由于培养物中的转染细胞不会有效表达指示物基因，因此培养物中的转染细胞以及培养物中的超感染细胞可作为靶宿主细胞用于指示物基因表达。相比抗病毒药剂缺乏下运行的对照，对于在给定抗病毒药剂或多种药剂存在下转染的细胞观察的萤光素酶活性的减小通常与抗病毒药剂浓度的对数相关，呈S形曲线。对于由存在于抗性测试载体中的患者来源片段编码的病毒靶产物，此抑制曲线可用于计算所述药剂或药剂组合的表观抑制性浓度(IC)，斜率和/或最大抑制百分比。
抗病毒药物/药物候选物
加入测试系统的抗病毒药物可在选择的时间加入，这取决于抗病毒药物的靶。在某些实施方式中，HCV抑制剂是核苷(核苷酸)抑制剂(NI)或蛋白酶抑制剂(PI)。在某些实施方案中，HCV抑制剂是干扰素。在一些实施方案中，干扰素可包括例如聚乙二醇化干扰素α2a、聚乙二醇化干扰素α2b、聚乙二醇化干扰素λ、前述的亲本物或衍生物、或干扰素家族中具有抗HCV活性的任何成员或其衍生物。在其他实施方式中，HCV抑制剂是非核苷抑制剂(NNI)。在一些实施方式中，HCV抑制剂是靶向HCV聚合酶的位点A、B、C或D的NNI(NNI-A，NNI-B，NNI-C或NNI-D)。在一些实施方式中，HCV抑制剂可以靶向NS3(例如，BILN-2061，VX-950，SCH-503,034，SCH-900,518，TMC-435,350，R-7227(ITMN-191)，MK-5172，MK-7009，BI-201,335，BMS-650,032，BMS-824,393，PHX-1766，ACH-1625，ACH-2684，VX-985，BMS-791,325，IDX-320，GS-9256，GS-9451，ABT-450，VX-500，BIT-225)，靶向NS5A(例如，BMS-790,052，GSK-2336805，PPI-461，ABT-267，GS-5885，ACH-2928，AZD-7295)或靶向NS5B(例如，NM-283，RG-7128，R-1626，PSI-7851，IDX-184，MK-0608，PSI-7977，PSI-938，GS-6620，TMC-649,128，INX-189，VX-759，VCH-916，VX-222，ANA-598，HCV-796，GS-9190，GS-9669，ABT-333，PF-4878691，IDX-375，ABT-837,093，GSK-625,443，ABT-072)，以及其组合，并且可在抗性测试载体病毒颗粒感染时以测试浓度加入靶宿主细胞的个体板。或者，抗病毒药物可贯穿整个测定存在。测试浓度选自如下浓度范围：一般为约0.1nM和约100μM之间，约1nM和约100μM之间，约10nM和约100μM之间，约0.1nM和约10μM之间，约1nM和约10μM之间，约10nM和约100μM之间，约0.1nM和约1μM之间，约1nM和约1μM之间，或约0.01nM和约0.1μM之间。
在某些实施方式中，可在本发明的药物易感性测试中测试候选抗病毒药化合物。可将候选抗病毒药化合物以适当的浓度及在选择的时间(依赖于候选抗病毒的蛋白靶)而加入测试系统。或者，可测试多于一种候选抗病毒药化合物或可与抗病毒药物组合测试候选抗病毒药化合物。可通过测量指示物基因的活性来评价候选抗病毒药化合物的有效性。如果候选化合物在抑制病毒多肽活性上有效，则相对于候选化合物缺失下观察的活性而言，候选化合物存在下指示物基因的活性将会减小。在此实施方式的另一方面，药物易感性和抗性测试可用于筛选病毒突变体。鉴定对已知的抗病毒药物或候选抗病毒药物的抗性突变体后，可分离抗性突变体及分析DNA。由此可组装病毒抗性突变体文库，从而能够单独或与其他已知或推定的抗病毒药剂组合筛选候选抗病毒药剂。
测定HCV的复制能力的方法
在另一方面，本发明提供测定丙型肝炎病毒(HCV)的复制能力的方法。在某些实施方式中，所述方法包括培养包含患者来源片段和指示物基因的宿主细胞，测量宿主细胞中指示物基因的活性，其中测量的指示物基因活性相对于参照活性之间的指示物基因活性指示HCV的复制能力，由此测定HCV的复制能力。在某些实施方式中，指示物基因的活性依赖于由患者来源片段编码的多肽的活性。在某些实施方式中，患者来源片段包含编码NS5B，NS3和/或NS5A的核酸序列。
在某些实施方式中，指示物基因的参照活性是通过实施本发明的方法，用标准实验室病毒片段测定的活性量。在某些实施方式中，标准实验室病毒片段包含来自HCV株Con1或H77的核酸序列。在其他实施方式中，参照病毒片段是来自用抑制剂治疗之前的患者HCV的核酸序列。
在某些实施方式中，HCV被测定为相对于参照具有增加的复制能力。在某些实施方式中，HCV被测定为相对于参照具有减小的复制能力。在某些实施方式中，宿主细胞是Huh7细胞。在某些实施方式中，患者来源片段编码NS5B，NS3和/或NS5A。
在某些实施方式中，表型分析可通过使用重组病毒测定(“RVA”)实施。在某些实施方式中，RVA使用由自患者病毒扩增的病毒载体和病毒基因序列之间的同源重组产生的病毒贮液。在某些实施方式中，RVA病毒贮液通过连接自患者病毒扩增的病毒基因序列进病毒载体而产生。在某些实施方式中，患者来源片段编码NS5B，NS3和/或NS5A。
测定复制能力的方法可以例如用来自扩增的病毒基因序列的核酸使用。如下文讨论，核酸可从本领域技术人员已知含有病毒基因序列的任何样品扩增，没有任何限制。例如，样品可为来自用病毒感染的人或动物的样品或来自病毒细胞培养物的样品。在某些实施方式中，病毒样品包含遗传修饰的实验室株。在某些实施方式中，遗传修饰的实验室株包含定点突变。在其他实施方式中，病毒样品包含野生型分离物。在某些实施方式中，野生型分离物获自未受治疗的患者。在某些实施方式中，野生型分离物获自经历治疗的患者。
然后抗性测试载体(“RTV”)可通过使用本领域已知的将基因序列掺入载体的任何方法，通过将扩增的病毒基因序列掺入复制缺陷型病毒载体而构建。在一个实施方式中，使用限制酶和常规克隆方法。参见Sambrook等人，2001，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，3.sup.rded，NY；及Ausubel等人，1989，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingAssociatesandWileyInterscience，NY。在一个优选的实施方式中，使用ApaI，PinAI和XhoI限制酶。优选地，复制缺陷型病毒载体是指示物基因病毒载体(“IGVV”)。在一个优选的实施方式中，病毒载体含有检测RTV复制的手段。优选地，病毒载体包含萤光素酶基因。
测定可通过首先用RTVDNA和表达另一病毒(例如)兼嗜性鼠白血病病毒(MLV))的包膜蛋白的质粒共转染宿主细胞来实施。转染后，可自细胞培养物收获病毒颗粒，用于在变化量的抗病毒药物的存在下感染新鲜靶细胞。新鲜靶细胞中单轮病毒复制的完成可由检测载体中含有的复制的手段检测。在一个优选的实施方式中，检测复制的手段是指示物基因。在一个优选的实施方式中，指示物基因是萤火虫萤光素酶。在该优选的实施方式中，单轮病毒复制的完成导致萤光素酶的产生。
在某些实施方式中，被评价的HCV株是HCV的野生型分离物。在其他实施方式中，被评价的HCV株是HCV的突变株。在某些实施方式中，该突变体可从患者分离。在其他实施方式中，突变体可由定点诱变或本领域技术人员已知的其他相当的技术构建。在另一些实施方式中，突变体可从细胞培养物分离。培养物可包含通过在抗病毒化合物存在下细胞培养的多代，以选择在该化合物的存在下在培养物中累积的突变。
在一个实施方式中，病毒核酸(例如HCVRNA)从血浆样品提取，病毒编码区的片段或整个病毒编码区可由方法诸如但不限于PCR扩增。见，例如，Hertogs等人，1998，Antimicrob.AgentsChemother.42(2):269-76。在一个实例中，患者来源的片段可由反转录-PCR扩增，然后用多数那些序列被缺失的质粒共转染进宿主细胞。然后同源重组可导致嵌合病毒的产生。嵌合病毒的复制能力可通过本领域已知的任何细胞活力测定来测定，并且与参照的复制能力相比较，以评定是否病毒具有改变的复制能力或对抗病毒药物有抗性或超敏感性。在某些实施方式中，参照可为统计学显著数目的个体病毒分离物的复制能力。在其他实施方式中，参照可为参照病毒(诸如Con1或H77)的复制能力。例如，基于MT4细胞-3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物的细胞活力测定可用于允许高样品通量的自动化系统。
可将本领域技术人员已知的评价病毒对抗病毒药物的表型易感性的其他测定进行调整以测定复制能力或测定抗病毒药物易感性或抗性。
本领域技术人员会认可，上述用于测定HCV的复制能力的方法可容易进行调整以实施测定HCV抑制剂易感性的方法。类似地，本领域技术人员会认可，上述用于测定抑制剂易感性的方法可容易进行调整以实施测定HCV的复制能力的方法。测定复制能力的方法的调整通常可包含在改变浓度的抗病毒药物的存在下实施本发明的方法。由此，可测定HCV对药物的易感性。类似地，在任何抗病毒药物的缺失下实施测定抑制剂易感性的方法可提供该方法中使用的HCV的复制能力的量度。
用于测定易感性或复制能力的计算机实施的方法
在另一方面，本发明提供用于测定HCV对HCV抑制剂的易感性或测定HCV的复制能力的计算机实施的方法。在该实施方式中，本发明的方法被改动以适于利用现代计算机的处理能力。本领域技术人员可容易以该方式调整所述方法。
在某些实施方式中，本发明提供用于测定HCV对HCV抑制剂的易感性的计算机实施的方法。在某些实施方式中，该方法包括向计算机存储器中输入关于根据本发明的方法测定的指示物基因的活性和指示物基因的参照活性的信息，和比较根据本发明的方法测定的指示物基因的活性与指示物基因的参照活性的指令；及在计算机存储器中比较根据本发明的方法测定的指示物基因的活性与指示物基因的参照活性，其中指示物基因的测量的活性相对于参照活性之间的差异与HCV对HCV抑制剂的易感性关联，由此测定HCV对HCV抑制剂的易感性。
在某些实施方式中，该方法还包括在计算机显示器上显示HCV对HCV抑制剂的易感性。在某些实施方式中，该方法还包括在纸上打印HCV对HCV抑制剂的易感性。
在另一方面，本发明提供显示根据本发明的方法测定的HCV对HCV抑制剂的易感性的打印输出。在再一方面，本发明提供包含显示根据本发明的方法测定的HCV对HCV抑制剂的易感性的数据的计算机可读介质。
在另一方面，本发明提供测定HCV的复制能力的计算机实施的方法。在某些实施方式中，所述方法包括向计算机存储器中输入关于根据本发明的方法测定的指示物基因的活性和指示物基因的参照活性的信息和比较根据本发明的方法测定的指示物基因的活性与指示物基因的参照活性的指令；及在计算机存储器中比较根据本发明的方法测定的指示物基因的活性与指示物基因的参照活性，其中测量的指示物基因的活性相对于参照活性的比较指示HCV的复制能力，由此测定HCV的复制能力。
在某些实施方式中，该方法还包括在计算机显示器上显示HCV的复制能力。在某些实施方式中，该方法还包括在纸上打印HCV的复制能力。
在另一方面，本发明提供显示HCV的复制能力的打印输出，其中复制能力根据本发明的方法测定。在再一方面，本发明提供包含显示HCV的复制能力的数据的计算机可读介质，其中复制能力根据本发明的方法测定。
在再一方面，本发明提供包含用于实施本发明的方法的计算机可读指令的产品。
在仍另一方面，本发明提供被构造成实施本发明的方法的计算机系统。
病毒和病毒样品
本领域技术人员已知的任何病毒(无限制地)可用作在本发明的方法中使用的患者来源片段或病毒序列的来源。在某些实施方式中，病毒是HCV，可为基因型1，基因型2，基因型3，基因型4，基因型5或基因型6。在本发明的一个实施方式中，病毒是HCV基因型1、2、3或4。在某些实施方式中，病毒是HCV基因型1a、1b、2a或2b。
获得患者来源片段或病毒基因序列的病毒可见于由本领域已知的用于获得病毒样品的任何手段获得的病毒样品中。该方法包括，但不限于，自被病毒感染的个体获得病毒样品或自病毒培养物获得病毒样品。在一个实施方式中，病毒样品从被病毒感染的人个体得到。病毒样品可从感染的个体身体的任何部分或预期含有病毒的任何分泌物得到。这样的部分和分泌物的实例包括，但不限于血，血清，血浆，痰，淋巴液，精液，阴道粘液，肝活组织检查和其他体液样品。在一个优选的实施方式中，样品是血，血清或血浆样品。
在另一实施方式中，患者来源片段或病毒编码区序列可从能够多获自培养物的病毒得到。在一些实施方式中，培养物可从实验室得到。在其他实施方式中，培养物可从保藏机构(例如美国典型培养物保藏中心)得到。
在另一实施方式中，患者来源片段或病毒编码区序列可从遗传修饰的病毒得到。病毒可通过使用本领域已知的用于遗传修饰病毒的任何方法进行遗传修饰。例如，病毒可在实验室培养物中生长期望的代数。在一个实施方式中，不应用选择性压力(即，不使病毒经历有利于具有特定特征的病毒复制的处理)，新突变通过随机遗传漂移蓄积。在另一个实施方式中，当病毒在培养物中生长时向病毒施加选择性压力(即，使病毒在有利于具有一种或更多特征的病毒发生复制的条件下生长)。在一个实施方式中，选择性压力是抗病毒治疗。可将任何已知的抗病毒治疗用作选择性压力。
在另一方面，患者来源片段或病毒编码区序列可通过诱变病毒，病毒基因组，或一部分病毒基因组进行制造。本领域已知的任何诱变方法可用于此目的。在某些实施方式中，诱变是基本上随机的。在某些实施方式中，基本上随机的诱变通过使病毒、病毒基因组或病毒基因组的部分暴露于诱变处理来实施。在另一实施方式中，将编码作为抗病毒治疗的靶的病毒蛋白的编码区或基因诱变。基本上随机的诱变处理的实例包括例如暴露于诱变物质(例如溴化乙锭、甲磺酸乙酯、乙基亚硝基脲(ENU)等)、辐射(例如紫外线光)，可转座的元件(例如Tn5、Tn10)的插入和/或除去或者在细胞、细胞提取物中或具有增加的诱变速率的体外复制系统复制。参见，例如，Russell等人，1979，Proc.Nat.Acad.Sci.USA76:5918-5922；Russell，W，1982，EnvironmentalMutagensandCarcinogens:ProceedingsoftheThirdInternationalConferenceonEnvironmentalMutagens。本领域技术人员能够理解，尽管这些诱变方法中每一种在分子水平上基本是随机的，但其各具有自身优选的靶。
在另一方面，患者来源片段或病毒编码区序列可通过使用定点诱变制造。可使用本领域已知的任何定点诱变方法(见例如，Sambrook等人，2001，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，第3版，NY；及Ausubel等人，2005，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingAssociatesandWileyInterscience，NY及Sarkar和Sommer，1990，Biotechniques，8:404-407)。定点诱变可针对例如特定编码区、基因或基因组区，编码区、基因或基因组区的特定部分，或者编码区、基因或基因组区之内的一个或少数特定核苷酸。在一个实施方式中，定点诱变基于一个或更多标准而针对病毒基因组区、编码区、基因、基因片段或核苷酸。在一个实施方式中，使编码区或基因或者部分编码区或基因经历定点诱变，因为其编码已知或怀疑是抗病毒治疗的靶的蛋白，例如，编码HCVRNA依赖性RNA聚合酶的NS5B编码区或其部分。在另一个实施方式中，为定点诱变选择编码区或基因的部分或者编码区或基因之内的一个或少数核苷酸。在一个实施方式中，待诱变的核苷酸编码已知或怀疑与抗病毒化合物相互作用的氨基酸残基。在另一个实施方式中，待诱变的核苷酸编码已知或怀疑在对一种或更多抗病毒药剂有抗性或易感性或超敏感性的病毒株中发生突变的氨基酸残基。在另一个实施方式中，诱变的核苷酸编码所编码的氨基酸残基在该蛋白质的一级序列中和已知或怀疑与抗病毒化合物相互作用或者已知或怀疑在对一种或更多抗病毒药剂有抗性或易感性或超敏感性的病毒株中发生突变的残基相邻或者在其附近。在另一个实施方式中，诱变的核苷酸所编码的氨基酸在该蛋白质的二级、三级或四级结构中和已知或怀疑与抗病毒化合物相互作用或者已知或怀疑在具有改变的复制能力的病毒株中发生突变的残基相邻或者在其附近。在另一个实施方式中，诱变的核苷酸编码的氨基酸残基位于已知或怀疑结合抗病毒化合物的蛋白质的活性位点处或附近。
实施例
实施例1
用于表型分析的样品的制备
样品制备和扩增
多数样品作为冷冻的血浆接收并伴随包括HCV基因型和/或亚型(例如，1a、1b、2、3、4)和病毒载量的信息。将样品解冻，如果需要，以冷冻的等份存储，并处理200μL等份。通过添加含有离液剂的裂解缓冲剂破坏病毒颗粒。基因组病毒RNA(vRNA)从病毒裂解物中使用寡核苷酸连接的磁珠提取。将纯化的vRNA在反转录酶(RT)反应中用作第一链cDNA合成的模板。将得到的cDNA用作第1轮巢式聚合酶链反应(PCR)的模板，其导致整个NS5B区的扩增。由于不同基因型之间的序列变异，使用特异性RT和第1及第2轮PCR引物。如果没有基因型和/或亚型信息可供利用，可依次或平行使用多于1个引物组。
将患者来源的片段克隆进抗性测试载体
第2轮(巢式)PCR扩增引物组含有能够使NS5B扩增产物克隆进用于表型药物易感性分析的HCV复制子抗性测试载体(RTV)内的限制性内切酶识别/切割位点。PCR产物由琼脂糖凝胶电泳和随后柱层析纯化，以除去残留的引物、引物-二聚体和非特异性反应产物，然后使其经历限制性内切酶消化。消化反应通过使用柱层析纯化，然后将扩增产物连接进萤光素酶报告复制子RTV内。连接反应用于转化感受态大肠埃希氏菌。质粒DNA使用二氧化硅柱层析自细菌培养物纯化，由分光光度法定量。
RTVRNA的制备
在RTV体外转录之前，由限制性内切酶消化对质粒DNA模板线性化，并进行柱纯化。RTV含有用于在体外转录后适当终止复制子RNA的丁型肝炎病毒核酶序列。体外转录的RNA被柱纯化，定量，通过使用电泳分离评价完整性。
实施例2
测定HCV抑制剂易感性的表型测定
将RTVRNA电穿孔进Huh7细胞系，将电穿孔的细胞在连续稀释的抑制剂的存在和不存在下温育。RNA输入通过测量在电穿孔后4小时电穿孔的细胞中产生的萤光素酶活性的量来监测。萤光素酶活性表示为相对光单位(RLU)。通过在电穿孔后72～96小时，相对于RNA输入和对照参照复制子RTV(Con1)，评价在抑制剂不存在的情况下萤光素酶活性来测定复制能力(RC)。利用复制缺陷型Con1复制子(Con1聚合酶缺陷)来测定检验背景(数据未显示)。抑制剂易感性通过评价在电穿孔后72～96小时，在抑制剂存在和不存在下RTV复制的能力来测定。在各系列稀释的抑制剂浓度下的％抑制如下推导：
[1-(抑制剂存在下的萤光素酶活性÷抑制剂不存在下的萤光素酶活性)]x100
抑制剂易感性特征谱(曲线)来源于这些值，并且从拟合的曲线外推抑制数据(例如，IC50，即50％减少病毒复制所需要的抑制剂浓度；及IC95，即95％减少病毒复制所需要的抑制剂浓度)。抑制数据报道为相对于在相同的测定批次中处理的参照RTV(例如，参照的IC50倍变化(FC))的倍数变化(例如，IC50(样品)/IC50(参照))。HCVNS5B测定流程图的一个实例显示于图1中，代表性的抑制剂易感性曲线显示于图2。
测定准确度通过评价RTV的HCV聚合酶抑制剂易感性来评定(数据未显示)，所述RTV含有良好表征的亚型1a(H77)和1b(Con1)参照序列和通过定点诱变(SDM)改造而含有赋予对HCVRdRp的抑制剂的减小的易感性的突变的亚型1a和1b参照序列的NS5B区。分析抑制剂易感性数据(IC50-FC和IC95-FC)与科学文献中报道的表型数据的一致性。含有NS5B突变的复制子呈现对核苷(核苷酸)(NI；S282T突变体)和靶向位点A(NNI-A；L392I和P495A/L突变体)、位点B(NNI-B；M423T)、位点C(NNI-C；C316Y和Y448H)和位点D(NNI-D；C316Y)的非核苷聚合酶抑制剂的易感性有预期的减小，证实了测定准确度(数据未显示)。
根据抑制剂易感性测量的批内变化的分析，在532个配对比较中，95％的重复IC50FC和IC95FC值分别在1.32和1.4倍之内。基于108个配对比较，95％的重复RC值改变≤0.22log10(图3)。根据抑制剂易感性测量的批间变化的分析，在285和260个配对比较中，95％的重复IC50FC和IC95FC值分别在1.75和1.7倍之内。基于55个配对比较，95％的重复RC值改变≤0.27log10(图3和4)。根据243个配对比较，病毒载量中3log10范围内测定线性度的评估证实了95％的IC50FC和IC95FC值分别呈现≤1.62和1.75倍变化。基于连续稀释的血浆样品的56个配对比较，95％的RC值改变≤0.3log10(图3和4)。
实施例3
测量IC50和IC95FC以检测对RBV和NI的易感性
为了评价HCVNS5B测定的敏感性以检测对利巴韦林和核苷(核苷酸)抑制剂的敏感性，产生了一组包含来自GT1(a/b)、GT2(a/b/k)、GT3(a/未知)和GT4(a/b/n/未知)病毒的患者来源NS5B区的复制子。将各种复制子用于本文所述的表型易感性测定法中。大多数复制子表现出足以用于评价抑制剂易感性的复制能力(数据未显示)。测试了对干扰素、RBV和NI的易感性以评价生物学变化。原始数据显示在图5的表中，并且该数据图示于图6中。在图6中，抑制剂及其IC值标示在x轴上，并且相对于参照病毒(Con1GT1b)的IC倍数变化是在y轴上。
GT1、GT2、GT3和GT4嵌合复制子具有类似的对IFN的易感性(图6A和6B中最左边的两组)。虽然干扰素易感性是相似的，但仍存在微小但显著的差异，如在图6C、6D和8中所显示的(讨论于下文)。GT1复制子具有类似的对RBV和NI的易感性(图6A中右边的四组点)。类似地，虽然GT1a和1b病毒之间的RBV和NI差异是相似的，但仍存在微小但显著的差异，如在图6C、6D和8中所显示的。整体上，GT2、GT3和GT4复制子表现出RBV和/或NI易感性的变化，其中许多病毒表现出对RBV和/或NI的易感性增加(多至约10倍)(图6B中右边的四组点)。还关于基因型亚型对数据进行了进一步的研究，如图6C和6D中所显示的。所述IC50或IC95倍数变化分别标绘在y轴上，并且抑制剂和HCV基因型标绘在x轴上。
一组含有来自GT1-4病毒的患者来源NS5B序列的HCV复制子被用来记录HCV抑制剂易感性的变化。IFN易感性在基因型之内和之间是相似的。RBV和NI易感性在具有GT1a/bNS5B区的复制子之间是相似的，但在基因型之间更为不同。许多非-GT1病毒表现出对RBV和/或NI的相对增加的易感性。此观察可促成相较于GT1病毒感染了非-GT1病毒的患者之间含RBV和/或NI方案的改善的SVR速率。因此，这样的信息对于确定针对给定个体的合适的治疗方案会是有用的。
这些数据还可用于告知临床试验设计、治疗前决策(例如，待使用的药物，待组合的药物的数量，治疗持续时间)以及用于评价抗性。特别地，表型数据结合临床结果数据可进一步加强所述测定的效用，例如用于开发临床临界值。
实施例4
测量IC50FC以检测抑制剂易感性
为了测定不同基因型病毒对各种抑制剂的易感性，使用了HCVNS5B测定。产生了一组包含来自GT1(a/b)、GT2(a/b/k)、GT3(a/未知)和GT4(a/b/n/未知)病毒的患者来源NS5B区的复制子。将各种嵌合复制子用在本文所述的表型易感性测定中。测试了对干扰素(IFN)、利巴韦林(RBV)、核苷抑制剂-1(NI-1)、2’C-甲基腺苷(2’CMeA)、索非布韦(SOF)的易感性以评价生物学变化。原始数据显示在图9中，数据的分析显示在图7的表中，并且统计学显著性显示于图8中。在图7中，标示了抑制剂和病毒的基因型以及被测试的具有所标示的基因型的病毒的数量(“值的数量”)。显示了各病毒基因型针对各抑制剂的IC50倍数变化的中位数、最大值、最小值和范围(相较于参照病毒的IC50)。所有测试的基因型之间的IC50倍数变化的范围显示在表的底部。图8使用Wilcoxon秩和检验显示如所标示的不同基因型的病毒之间对抑制剂的易感性变化的显著性。抑制剂显示在第一列中，进行比较的两种病毒的基因型显示在第二和第三列中。这两种病毒之间表现出统计学显著性的易感性差异(IC50倍数变化)显示在第四列中。
用于产生图7中的分析的数据图示于图9中。数据的分析示于图7和8中，并且该数据图示于图8中。该图显示了不同基因型GT1(a/b)、GT2(a/b/k)、GT3(a未知)和GT4(a/d/n/未知)的病毒对IFN、RBV、NI-1、2’CMeA和SOF的易感性变化。相较于参照病毒值的IC50倍数变化标绘在y轴上，并且抑制剂和所测试病毒的基因型标示在x轴上。
如上图所示，GT1、GT2、GT3和GT4嵌合复制子具有类似的对IFN的易感性(图9中最左边的8组)。GT1嵌合复制子具有类似的对RBV、NI、2’CMeA和SOF的易感性。总体上，GT2、GT3和GT4嵌合复制子表现出对RBV的易感性的统计学显著增加(多至15倍)，其中包含GT3和GT4NS5B的复制子是特别易感的。GT3和GT4嵌合复制子还显示出相较于GT1嵌合复制子显著减小的SOF易感性，而GT2嵌合复制子具有增加的易感性(GT2a嵌合复制子相较于GT2b嵌合复制子显示更多增加的易感性(图8和图9)。针对其它核苷(核苷酸)抑制剂(NI)的易感性根据抑制剂和基因型而不同，其中GT2和GT3病毒表现出对一些NI的易感性增加(图6C，6D，8和9)。虽然IFN易感性是相似的，但仍存在微小但显著的差异，如在图6C、6D和8中所显示的。类似地，虽然GT1a和1b病毒之间的RBV和NI差异是相似的，但仍存在微小但显著的差异，如在图6C、6D和8中所显示的。
RBV和SOF易感性在具有GT1a/bNS5B的复制子之间是相似的，但在基因型之间更为不同。许多非-GT1病毒表现出对RBV的相对增加的易感性。此观察可部分解释具有非-GT1病毒的患者之间含RBV方案的更高的SVR。整体上，GT3病毒相较于GT2表现出对SOF的易感性减小，这可有助于进一步解释这些基因型之间的不同的SOF/RBV治疗应答。这些数据可促成具有非-GT1病毒的患者之间含RBV、NI、2’CMeA和SOF方案的改善的SVR速率。因此，这样的信息会有助于医疗服务人员确定针对给定个体的合适的治疗方案和/或治疗持续时间。这些数据还可用于告知临床试验设计、治疗前决策(例如，待使用的药物，待组合的药物的数量，治疗持续时间)以及用于评价抗性。特别地，表型数据结合临床结果数据可进一步加强所述测定的效用，例如用于开发临床临界值。
实施例5
测量IC50FC和IC95FC以检测非核苷抑制剂易感性
为了测定不同基因型病毒对各种非核苷抑制剂的易感性，使用了HCVNS5B测定。产生了一组包含来自GT1、GT2、GT3和GT4病毒的患者来源NS5B区的复制子。将各种嵌合复制子用于本文所述的表型易感性测定法中。测试了对IFN、NNI-A、NNI-B和NNI-D的易感性以评价生物学变化。结果显示在图10中。相较于参照Con1病毒值的IC50倍数变化标绘在图10A的y轴上，并且抑制剂和所测试病毒的基因型标示在x轴上。类似地，相较于参照Con1病毒值的IC95倍数变化标绘在图10B的y轴上，并且抑制剂和所测试病毒的基因型标示在x轴上。
不同基因型的病毒对三种不同NNI的易感性比使用其它抑制剂所观察到的更为可变。GT2嵌合复制子显示出相较于GT1嵌合复制子和/或Con1参照显著减小的对NNI-A、NNI-B和NNI-D抑制剂的易感性。GT3嵌合复制子显示出相较于GT1嵌合复制子和/或Con1参照显著减小的对NNI-B抑制剂的易感性和增加的对NNI-A和NNI-D抑制剂的易感性。GT4嵌合复制子相较于GT1嵌合复制子和/或Con1参照具有减小的对NNI-B和NNI-D抑制剂的易感性。NNI-D抑制剂可在所显示的测试基因型之间表现出全-基因型活性。这些数据会有助于医疗服务人员确定针对给定个体的合适的治疗方案。这些数据还可用于告知临床试验设计、治疗前决策(例如，待使用的药物，待组合的药物的数量，治疗持续时间)以及用于评价抗性。特别地，表型数据结合临床结果数据可进一步加强所述测定的效用，例如用于开发临床临界值。
尽管已参照其某些实施方式描述及举例说明了本发明，本领域技术人员能够理解，可对其进行各种变化、修饰和取代，而不背离本发明的精神和范围。全部专利、公开的专利申请及其他非专利文献通过引用以它们的整体并入本文。

Claims (22)

1.选择用于患有丙型肝炎病毒(HCV)感染的患者的治疗的方法，包括：
(a)获得来自所述患者的生物样品，其中所述生物样品包含来自所述患者的HCV或HCV群；
(b)测定所述HCV或HCV群的基因型；和
(c)如下治疗所述患者：
i.如果所述HCV或HCV群包含基因型2(GT2)HCV、基因型3(GT3)HCV、基因型4(GT4)HCV或其组合，则使用含有利巴韦林或核苷(核苷酸)抑制剂(NI)的治疗方案；或
ii.如果所述HCV或HCV群包含GT2HCV，则使用含有索非布韦的治疗方案。
2.权利要求1的方法，其中所述HCV或HCV群包含GT2HCV。
3.权利要求1的方法，其中所述HCV或HCV群包含GT2aHCV。
4.权利要求1的方法，其中所述HCV或HCV群包含GT3HCV。
5.权利要求1的方法，其中所述HCV或HCV群包含GT4HCV。
6.用于测定丙型肝炎病毒(HCV)或HCV病毒群对HCV抑制剂的易感性的方法，其中所述HCV抑制剂是干扰素(IFN)、利巴韦林(RBV)、核苷抑制剂-1(NI-1)、2’C-甲基腺苷(2’CMeA)、索非布韦(SOF)或非核苷抑制剂A或B(NNI-A或NNI-B)，所述方法包括：
(a)测定所述HCV或HCV群的基因型；和
(b)如果所述HCV或HCV群包含基因型2(GT2)HCV、基因型3(GT3)HCV、基因型4(GT4)HCV或其组合，则测定所述HCV或HCV群相较于参照病毒可能具有对利巴韦林的增加的易感性；如果所述HCV或HCV群包含GT2HCV，则测定所述HCV或HCV群可能具有对索非布韦的增加的易感性；如果所述HCV或HCV群包含GT3HCV、GT4HCV或其组合，则测定所述HCV或HCV群可能具有对索非布韦的降低的易感性；如果所述HCV或HCV群包含GT2HCV、GT3HCV或其组合，则测定所述HCV或HCV群可能具有对非核苷抑制剂B(NNI-B)的降低的易感性；或者如果所述HCV或HCV群包含GT2HCV，则测定所述HCV或HCV群可能具有对非核苷抑制剂A(NNI-A)的降低的易感性。
7.权利要求6的方法，其中所述HCV抑制剂是核苷抑制剂(NI)。
8.权利要求6的方法，其中所述HCV抑制剂是RBV。
9.权利要求6的方法，其中所述HCV抑制剂是SOF。
10.权利要求6的方法，其中所述HCV抑制剂是非核苷抑制剂靶向位点A或B(NNI-A或NNI-B)。
11.用于测定丙型肝炎病毒(HCV)群对HCV聚合酶抑制剂的易感性的方法，包括：
(a)向细胞导入包含来自所述HCV病毒群的患者来源片段的抗性测试载体，其中所述细胞或抗性测试载体包含产生依赖于所述HCV的可检测信号的指示物核酸；
(b)在不存在或存在增加浓度的HCV聚合酶抑制剂的情况下测量细胞中指示物基因的表达；
(c)建立针对所述HCV聚合酶抑制剂的药物易感性的标准曲线，其中在所述标准曲线中检测IC50倍数变化值、IC95倍数变化值或两者，或者检测斜率；
(d)将所述HCV群的IC50倍数变化值、IC95倍数变化值或两者与对照HCV群的IC50倍数变化值、IC95倍数变化值或两者进行比较，或者将所述HCV群的标准曲线的斜率与对照HCV群的标准曲线的斜率进行比较；以及
(e)当所述HCV群的IC50倍数变化值、IC95倍数变化值或两者相较于对照HCV群的IC50倍数变化值、IC95倍数变化值或两者更高时，测定所述HCV群包含对所述HCV聚合酶抑制剂具有增加的易感性的HCV颗粒，或者当所述HCV群的标准曲线的斜率相较于对照群的标准曲线降低时，测定所述HCV群包含对所述HCV聚合酶抑制剂具有减小的易感性的HCV颗粒。
12.权利要求11的方法，其中所述HCV抑制剂是干扰素(IFN)、利巴韦林(RBV)、核苷(核苷酸)抑制剂、2’C-甲基腺苷(2’CMeA)、索非布韦(SOF)或非核苷抑制剂靶向位点A、B、C或D(NNI-A、NNI-B、NNI-C或NNI-D)。
13.权利要求11的方法，其中所述HCV抑制剂是核苷(核苷酸)抑制剂(NI)。
14.权利要求11的方法，其中所述HCV抑制剂是干扰素。
15.权利要求11的方法，其中所述HCV抑制剂是RBV。
16.权利要求11的方法，其中所述HCV抑制剂是SOF。
17.权利要求11的方法，其中所述HCV抑制剂是非核苷抑制剂靶向位点A或B(NNI-A或NNI-B)。
18.权利要求11的方法，其中所述对照HCV群包含Con1HCV、H77HCV或用所述HCV抑制剂处理之前的患者HCV群。
19.权利要求11的方法，其中所述抗性测试载体包含患者来源片段和指示物基因。
20.权利要求11的方法，其中所述患者来源片段包含HCV的NS5B区。
21.权利要求11的方法，其中所述指示物基因包括萤光素酶基因。
22.权利要求11的方法，其还包括基于步骤(e)的易感性测定来确定用于患者的适当治疗方案。
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