CN1979133A - 一种荔枝多糖含量的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种荔枝多糖含量的测定方法。本发明提供了一种在用苯酚-硫酸法测定荔枝多糖时解决蛋白质干扰的方法，其主要内容包括：(1)粗多糖的制备；(2)精制荔枝多糖的制备；(3)样品液制备和测定；(4)荔枝粗多糖中净多糖含量确定；(5)多糖含有的蛋白质在苯酚-硫酸法测定多糖时产生的吸光度与其含量之间函数关系的建立；(6)样品液蛋白质产生的吸光度计算；(7)样品多糖含量计算。本发明对荔枝多糖产品生产工艺优化、质量监测、标准制定等方面是必不可少的。本发明的原理也可以用在其它含蛋白质多糖产品的测定上，在目前多糖的研究、开发及应用异常活跃的形势下，具有重要的理论和实践意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种荔枝多糖含量的测定方法。
背景技术
多糖是由许多单糖以α-或β-糖苷键所组成的化合物，普遍存在于自然界植物体中，其相对分子质量在几千至几百万之间。大量研究表明活性多糖具有抗肿瘤、增强免疫力、降血糖等多种生理功能，因而近年来多糖研究异军突起，国际科学界视多糖的研究为生命科学前沿的领域，甚至提出二十一世纪是多糖的世纪。
多糖的测定方法有很多种，如水杨酸法、斐林法、苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、高效毛细管电泳法、高效液相色谱法和酶法等，各测定方法有各自的特点和缺点，如高效毛细管电泳法、高效液相色谱法精确度较高但需要多糖纯品，而且使用成本高，许多实验室也没有这些设备，而苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法等方法测定多糖时杂蛋白的干扰比较明显。目前由于苯酚-硫酸法具有操作方便、有良好的精确度而被广大多糖研究者所接受，是在多糖测定中使用较广泛的一种方法，而目前还没有解决杂蛋白的干扰的相关研究报道。
对荔枝多糖的测定目前已有报道(参见唐小俊等，华南师范大学学报，2005，108(2)：27-31)，但此文中用苯酚-硫酸法对荔枝多糖的测定时没有考虑到蛋白质的影响。本发明旨在解决苯酚-硫酸法测定荔枝多糖时蛋白质产生的干扰，从而为精确测定荔枝多糖含量提供了保证。。
发明内容
本发明的目的在于提供一种荔枝多糖的测定方法。
为实现上述目的，本发明包括以下步骤：
(1)粗多糖的制备：荔枝干肉加6-8倍蒸馏水，60℃水浴保温30分钟，打浆，95℃水浴浸提4-5h，趁热过滤，用高速冷冻离心机以20000-30000r/min离心10-15min，去渣，真空浓缩至1/4体积，加入4倍体积无水乙醇，静置12h，3000-5000r/min离心10-15min，收集沉淀即得荔枝粗多糖；
(2)精制荔枝多糖的制备：荔枝粗多糖依次用石油醚、丙酮回流脱脂，挥干溶剂，用80％乙醇回流去其它可溶性糖类物质，置80℃烘箱中5h挥干溶剂后溶于50倍蒸馏水中，加入10-15％(V/V)H2O2脱色，然后加4倍体积的无水乙醇，静置12h，3000-5000r/min离心10-15min，收集沉淀，置80℃烘箱中5h挥干溶剂。沉淀加入30倍蒸馏水，并加入0.05-0.1％(W/V)NaOH，90℃热水浴中保温1h使其溶解，然后加入0.5％木瓜蛋白酶，60℃恒温处理10b，用高速冷冻离心机以10000-20000r/min离心10-15min。上清液加入1/5体积氯仿，1/25体积正丁醇振荡20min，用分液漏斗分出水相，此步骤重复5次，然后用蒸馏水透析48h，然后透析液加入4倍体积的无水乙醇，静置12h，3000-5000r/min离心10-15min取沉淀，真空干燥至恒重，即得精制荔枝多糖；
(3)样品液制备和测定：荔枝干肉剪碎，精密秤取10g，加500mL80％酒精浸泡过夜，然后于索氏提取器中回流4h，残渣挥去溶剂后，用蒸馏水回流提取4h，然后用蒸馏水反复洗至250-300mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀备用。样品液多糖用苯酚-硫酸法测定，步骤如下：精密吸取样品液0.2mL于带塞试管中，加蒸馏水至2mL，再依次加入6％苯酚溶液1.0mL，浓硫酸5.0mL，置沸水浴中15分钟，然后快速冷却至室温，以蒸馏水做参比，在490nm下用1cm比色杯测其吸光度，得到吸光度A样品总；样品中蛋白质含量测定用Bradford法，步骤如下：取样品液0.1mL加至5.0mL考马斯亮蓝试剂中，5min钟后于595nm处测吸光度，再根据蛋白质的标准曲线得出样品中蛋白质含量；
(4)荔枝粗多糖中净多糖含量确定：称取600mg的荔枝粗多糖，溶解于200-300mL的蒸馏水中，配成多糖浓度为2-3mg/mL的母液，然后分别吸取母液0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5mL于试管中，用蒸馏水补充至10mL，混匀，得到一系列粗多糖溶液。用Bradford法测出各粗多糖溶液的蛋白质含量并计算出总量；由于粗多糖中最主要杂质为杂蛋白，那么用粗多糖溶液中粗多糖总量减掉蛋白质总量即可得出各粗多糖溶液中净多糖的总量，由此可算出各粗多糖溶液中净多糖的含量；
(5)多糖含有的蛋白质在苯酚-硫酸法测定多糖时产生的吸光度与其含量之间函数关系的建立：根据步骤(4)得到的各粗多糖溶液中净多糖含量，用精制荔枝多糖配成与其一一对应的同样浓度，得到系列精制多糖溶液。分别精密吸取相同多糖浓度的粗多糖溶液及精制多糖溶液0.1mL于带塞试管中，余下步骤按苯酚-硫酸法测定出各多糖溶液的吸光度，可以分别得到粗多糖溶液的吸光度A粗及精制多糖溶液的吸光度A精，那么A粗与A精的差值即为蛋白质产生的吸光度A蛋白。以蛋白质产生的吸光度(A蛋白)对各粗多糖溶液中蛋白质含量(C)作回归处理，可以得到一个回归方程；
(6)样品液蛋白质产生的吸光度A蛋白计算：根据步骤(3)测得的样品液中蛋白质含量，和步骤(5)所得回归方程就可以计算出此浓度的蛋白质在苯酚-硫酸法测定多糖时产生的吸光度A蛋白；
(7)样品多糖含量计算：根据步骤(3)测得的样品液吸光度A样品总和步骤(6)所得的蛋白质产生的吸光度A蛋白，可以按如下公式算出样品多糖在490nm处真正的吸光度A样品：
A样品＝A样品总-A蛋白
最后由A样品根据步骤(4)葡萄糖标准曲线回归方程可以计算出样品液中葡萄糖浓度(C)，然后按下面公式可以计算出荔枝多糖的含量：
多糖含量(％)＝C*D/W/106*100
式中：多糖含量以葡萄糖计
C-为供试液中葡萄糖浓度，μg/mL；
D-多糖稀释倍数；
W为供试样品的重量，g。
荔枝是华南地区栽培面积最大的果树。长期以来，荔枝因具有较高的营养价值和多种滋补养颜效果一直被视为“果中珍品”。近年的研究发现从荔枝果肉中提取出的多糖具有明显的抗氧化、清除自由基功能，可以预防人类衰老，另外荔枝多糖还具有抗肿瘤、增强免疫力、降血糖等多种生理功能，因而荔枝多糖产品的开发具有广阔的应用前景。而对产品中多糖进行精确测定则在荔枝多糖产品开发过程中生产工艺优化、产品标准制定、产品质量监测等方面是必不可少的。本发明可以解决苯酚-硫酸法测定荔枝多糖时蛋白质产生的干扰，从而为精确测定荔枝多糖含量提供了保证。本发明的原理也可以用在其它含蛋白质的多糖产品的的测定上，在目前多糖研究、开发、应用领域异常活跃的形式下，具有重要的理论和实践意义。
具体实施方式
实施例一
(1)粗多糖的制备：取黑叶荔枝干肉500g，加入3000mL蒸馏水，60℃水浴保温30分钟，用高速组织捣碎机打浆，在95℃热水浴中浸提4h，200目尼龙布过滤，用高速冷冻离心机以20000r/min离心15min去渣，真空浓缩至1/4体积，加入4倍体积的无水乙醇，静置12h，5000r/min离心10min，收集沉淀即得荔枝粗多糖；
(2)精制荔枝多糖的制备：取10g荔枝粗多糖，依次用500mL石油醚、500mL丙酮回流脱脂，置80℃烘箱中5h挥干溶剂，用500mL 80％乙醇回流去其它可溶性糖类物质，置80℃烘箱中5h挥干溶剂后溶于500mL蒸馏水中，加入15％(V/V)H2O2脱色，然后加4倍体积的无水乙醇，静置12h，3000r/min离心15min，收集沉淀。沉淀加入300mL蒸馏水，并加入0.15gNaOH，90℃热水浴中保温1h使其溶解，然后加入0.5％木瓜蛋白酶，60℃恒温处理10h，用高速冷冻离心机以10000r/min离心15min。上清液加入1/5体积氯仿，1/25体积正丁醇振荡20min，用分液漏斗分出水相，此步骤重复5次。用蒸馏水透析48h，然后透析液加入4倍体积的无水乙醇，静置12h，5000r/min离心10min取沉淀，真空干燥至恒重，即得精制荔枝多糖；
(3)葡萄糖标准曲线的制作：用苯酚-硫酸法测定，步骤如下：精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品40mg，置于500mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，配成0.08mg/mL的标准溶液。然后精密移取标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL，置于带塞试管中，各以蒸馏水补充至2.0mL，然后加入6％重蒸苯酚1.0mL及浓硫酸5.0mL，置沸水浴中15分钟，然后快速冷却至室温，于490nm测吸光度，以2.0mL水按同样显色操作作为空白，以吸光度(A)对葡萄糖浓度[C(μg/mL)]作回归处理，得回归方程：
A＝0.0517C+0.0191， r＝0.9996；
(4)蛋白质标准曲线的制作：用Bradford法，取牛血清白蛋白200mg溶于200mL蒸馏水中，得到牛血清白蛋白溶液，测定时分别取牛血清白蛋白溶液10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μl于试管中，不够100μl的补加水至100μl，再在上述试管中各加入考马斯亮蓝试剂5mL，5min钟后于595nm处测吸光度，以100μl蒸馏水按同样显色操作作为空白，以吸光度(A)对牛血清白蛋白浓度[C(mg/mL)]作回归处理，得回归方程：
A＝0.0266C+0.0443， r＝0.9994；
(5)样品液制备和测定：荔枝干肉剪碎，精密秤取10g，用80％酒精浸泡过夜，于索氏提取器中用80％酒精回流4h，残渣置80℃烘箱中5h挥去溶剂后，用蒸馏水回流提取4h，然后用蒸馏水反复洗至250mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀备用；样品液多糖用苯酚-硫酸法测定，精密吸取样品液0.1mL于带塞试管中，加蒸馏水至2mL，按步骤(3)葡萄糖标准曲线的制作方法测其吸光度(A样品总)，重复三次，得到的吸光度值分别为0.533、0.543、0.538；样品中蛋白质含量测定用Bradford法，取样品液100μl按步骤(4)蛋白质标准曲线的制作方法测其吸光度，再根据蛋白质的标准曲线回归方程计算出样品液中蛋白质含量为0.43mg/mL；
(6)荔枝粗多糖中净多糖含量确定：称取600mg的荔枝粗多糖，溶解于200mL的蒸馏水中配成粗多糖浓度为3mg/mL的母液，然后分别吸取母液0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5mL于试管中，用蒸馏水补充至10mL，混匀，得到一系列粗多糖溶液。测定时取各粗多糖溶液100μl按步骤(4)蛋白质标准曲线的制作方法测其吸光度，再根据蛋白质的标准曲线回归方程计算出各粗多糖溶液中蛋白质含量及总量；由于粗多糖中最主要杂质为杂蛋白，那么用粗多糖溶液中粗多糖总量减掉蛋白质总量即可得出各粗多糖溶液中净多糖的总量，把它再除以各粗多糖溶液体积即可得到粗多糖溶液中净多糖的含量(结果见表1)；
(7)多糖含有的蛋白质在苯酚-硫酸法测定多糖时产生的吸光度与其含量之间函数关系的建立：根据系列粗多糖溶液中各净多糖含量，用精制荔枝多糖配成与其一一对应的同样浓度，即取精制荔枝多糖400mg溶解于200mL的蒸馏水中配成多糖浓度为2mg/mL的母液，然后分别吸取母液0.51、0.965、1.55、1.97、2.495、3.05、3.51、3.97、4.49、5.01mL于试管中，用蒸馏水补充至10mL，混匀，得到系列精制多糖溶液。分别精密吸取各粗多糖溶液及各精制多糖溶液0.1mL于带塞试管中，余下步骤按苯酚-硫酸法测定出各多糖溶液的吸光度，可
表1 系列粗多糖溶液中净多糖含量测定
| 取母液量(mL) | 0.5 | 1 | 1.5 | 2 | 2.5 | 3 | 3.5 | 4 | 4.5 | 5 |
| 粗多糖总量(mg) | 1.5 | 3 | 4.5 | 6 | 7.5 | 9 | 10.5 | 12 | 13.5 | 15 |
| 蛋白质含量(mg/mL) | 0.048 | 0.107 | 0.149 | 0.206 | 0.251 | 0.299 | 0.348 | 0.406 | 0.452 | 0.498 |
| 蛋白质总量(mg) | 0.48 | 1.07 | 1.49 | 2.06 | 2.51 | 2.99 | 3.48 | 4.06 | 4.52 | 4.98 |
| 净多糖含量(mg/mL) | 0.102 | 0.193 | 0.301 | 0.394 | 0.499 | 0.601 | 0.702 | 0.794 | 0.898 | 1.002 |
以分别得到各粗多糖溶液的系列吸光度A粗及各精制荔枝多糖溶液的系列吸光度A精(结果见表2)，那么A粗与A精的差值即为蛋白质产生的吸光度A蛋白。以蛋白质产生的吸光度(A蛋白)对系列粗多糖溶液中蛋白质含量[C(μg/mL)](表1)作回归处理，可以得到回归方程：
A＝0.2717C-0.0014， r＝0.9991
表2粗多糖溶液中蛋白质产生的吸光度测定
| 取母液量(mL) | 0.5 | 1 | 1.5 | 2 | 2.5 | 3 | 3.5 | 4 | 4.5 | 5 |
| 精制多糖溶液吸光度(A精) | 0.074 | 0.132 | 0.201 | 0.261 | 0.326 | 0.384 | 0.451 | 0.506 | 0.561 | 0.638 |
| 粗多糖溶液吸光度(A粗) | 0.086 | 0.158 | 0.242 | 0.314 | 0.394 | 0.465 | 0.545 | 0.615 | 0.683 | 0.771 |
| 蛋白质产生的吸光度(A蛋白) | 0.012 | 0.026 | 0.041 | 0.053 | 0.068 | 0.079 | 0.094 | 0.109 | 0.122 | 0.133 |
(8)样品液蛋白质产生的吸光度A蛋白计算：根据步骤(5)测得的样品液中蛋白质含量为0.43mg/mL，和步骤(7)以蛋白质产生的吸光度对蛋白质含量所得回归方程可以计算出此浓度的蛋白质在苯酚-硫酸法测定多糖时产生的吸光度A蛋白为0.118；
(9)样品多糖含量计算：根据步骤(5)测得的样品液吸光度A样品总和步骤(8)测得的蛋白质产生的吸光度A蛋白可以按如下公式算出样品多糖在490nm处真正的吸光度A样品：
A样品＝A样品总-A蛋白
最后由A样品根据步骤(3)葡萄糖标准曲线回归方程可以计算出样品液中葡萄糖浓度(C)，然后按下面公式计算荔枝多糖的含量(结果见表3)：
多糖含量(％)＝C*D/W/106*100
式中：多糖含量以葡萄糖计
C-为供试液中葡萄糖浓度，μg/mL；
D-多糖稀释倍数，实施例中为D＝8/0.1*250＝20000；
W为供试样品的重量，g。
表3黑叶荔枝中多糖含量测定
| 样品号 | A样品总 | A蛋白 | A样品 | 多糖含量(％) | 多糖含量平均(％) | RSD％ |
| 1 | 0.533 | 0.118 | 0.415 | 1.531 | 1.550 | 1.90 |
| 2 | 0.543 | 0.118 | 0.425 | 1.569 | ||
| 3 | 0.538 | 0.118 | 0.420 | 1.550 |
实施例二
(1)粗多糖的制备：取糯米糍荔枝干肉500g，加入4000mL蒸馏水，60℃水浴保温30分钟，用高速组织捣碎机打浆，在95℃热水浴中浸提5h，200目尼龙布过滤，用高速冷冻离心机以30000r/min离心10min去渣，真空浓缩至1/4体积，加入4倍体积的无水乙醇，静置12h，3000r/min离心15min，收集沉淀即得荔枝粗多糖；
(2)精制荔枝多糖的制备：取10g荔枝粗多糖，依次用500mL石油醚、500mL丙酮回流脱脂，置80℃烘箱中5h挥干溶剂，用500mL 80％乙醇回流去其它可溶性糖类物质，置80℃烘箱中5h挥干溶剂后溶于500mL蒸馏水中，加入10％(V/V)H2O2脱色，然后加4倍体积的无水乙醇，静置12h，5000r/min离心10min，收集沉淀。沉淀加入300mL蒸馏水，并加入0.3gNaOH，90℃热水浴中保温1h使其溶解，然后加入0.5％木瓜蛋白酶，60℃恒温处理10h，用高速冷冻离心机以20000r/min离心10min。上清液加入1/5体积氯仿，1/25体积正丁醇振荡20min，用分液漏斗分出水相，此步骤重复5次。用蒸馏水透析48h，然后透析液加入4倍体积的无水乙醇，静置12h，3000r/min离心15min取沉淀，真空干燥至恒重，即得精制荔枝多糖；
(3)葡萄糖标准曲线的制作：用苯酚-硫酸法测定，步骤如下：精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品40mg，置于500mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，配成0.08mg/mL的标准溶液。然后精密移取标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL，置于带塞试管中，各以蒸馏水补充至2.0mL，然后加入6％重蒸苯酚1.0mL及浓硫酸5.0mL，置沸水浴中15分钟，然后快速冷却至室温，于490nm测吸光度，以2.0mL水按同样显色操作作为空白，以吸光度(A)对葡萄糖浓度[C(μg/mL)]作回归处理，得回归方程：
A＝0.0508C+0.0133， r＝0.9995
(4)蛋白质标准曲线的制作：用Bradford法，取牛血清白蛋白200mg溶于200mL蒸馏水中，得到牛血清白蛋白溶液，测定时分别取牛血清白蛋白溶液10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μl于试管中，不够100μl的补加水至100μl，再在上述试管中各加入考马斯亮蓝试剂5mL，5min钟后于595nm处测吸光度，以100μl蒸馏水按同样显色操作作为空白，以吸光度(A)对牛血清白蛋白浓度[C(mg/mL)]作回归处理，得回归方程：
A＝0.0266C+0.0443， r＝0.9994：
(5)样品液制备和测定：荔枝干肉剪碎，精密秤取10g，用80％酒精浸泡过夜，于索氏提取器中用80％酒精回流4h，残渣置80℃烘箱中5h挥去溶剂后，用蒸馏水回流提取4h，然后用蒸馏水反复洗至300mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀备用；样品液多糖用苯酚-硫酸法测定，精密吸取样品液0.1mL于带塞试管中，加蒸馏水至2mL，按步骤(3)葡萄糖标准曲线的制作方法测其吸光度(A样品总)，重复三次，得到的吸光度值分别为0.555、0.561、0.558；样品中蛋白质含量测定用Bradford法，取样品液100μl按步骤(4)蛋白质标准曲线的制作方法测其吸光度，再根据蛋白质的标准曲线回归方程计算出样品液中蛋白质含量为0.41mg/mL；
(6)荔枝粗多糖中净多糖含量测定：称取600mg的荔枝粗多糖，溶解于250mL的蒸馏水中配成粗多糖浓度为2.4mg/mL的母液，然后分别吸取母液0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5mL于试管中，用蒸馏水补充至10mL，混匀，得到一系列粗多糖溶液。测定时取各粗多糖溶液100μl按步骤(4)蛋白质标准曲线的制作方法测其吸光度，再根据蛋白质的标准曲线回归方程计算出各粗多糖溶液中蛋白质含量及总量；由于粗多糖中最主要杂质为杂蛋白，那么用粗多糖溶液中粗多糖总量减掉蛋白质总量即可得出各粗多糖溶液中净多糖的总量，把它再除以各粗多糖溶液体积即可得到粗多糖溶液中净多糖的含量(结果见表1)；
表1 系列粗多糖溶液中净多糖含量测定
| 取母液量(mL) | 0.5 | 1 | 1.5 | 2 | 2.5 | 3 | 3.5 | 4 | 4.5 | 5 |
| 粗多糖总量(mg) | 1.2 | 2.4 | 3.6 | 4.8 | 6.0 | 7.2 | 8.4 | 9.6 | 10.8 | 12.0 |
| 蛋白质含量(mg/mL) | 0.035 | 0.073 | 0.105 | 0.146 | 0.175 | 0.213 | 0.257 | 0.288 | 0.325 | 0.367 |
| 蛋白质总量(mg) | 0.35 | 0.73 | 1.05 | 1.46 | 1.75 | 2.13 | 2.57 | 2.88 | 3.25 | 3.67 |
| 净多糖含量(mg/mL) | 0.085 | 0.167 | 0.255 | 0.334 | 0.429 | 0.507 | 0.583 | 0.672 | 0.755 | 0.833 |
(7)多糖含有的蛋白质在苯酚-硫酸法测定多糖时产生的吸光度与其含量之间函数关系的建立：根据系列粗多糖溶液中各净多糖含量，用精制荔枝多糖配成与其一一对应的同样浓度，即取精制荔枝多糖400mg溶解于200mL的蒸馏水中配成多糖浓度为2mg/mL的母液，然后分别吸取母液0.425、0.835、1.275、1.67、2.125、2.535、2.915、3.36、3.775、4.165mL于试管中，用蒸馏水补充至10mL，混匀，得到系列精制多糖溶液。分别精密吸取各粗多糖溶液及各精制多糖溶液0.1mL于带塞试管中，余下步骤按苯酚-硫酸法测定出各多糖溶液的吸光度，可以分别得到各粗多糖溶液的系列吸光度A粗及各精制荔枝多糖溶液的系列吸光度A精(结果见表2)，那么A粗与A精的差值即为蛋白质产生的吸光度A蛋白。以蛋白质产生的吸光度(A蛋白)对系列粗多糖溶液中蛋白质含量[C(μg/mL)](表1)作回归处理，可以得到回归方程：
A＝0.2792C-0.0027， r＝0.9995
(8)样品液蛋白质产生的吸光度A蛋白计算：根据步骤(5)测得的样品液中蛋白质含量为0.41mg/mL，和步骤(7)以蛋白质产生的吸光度对蛋白质含量所得回归方程可以计算出此浓度的蛋白质在苯酚-硫酸法测定多糖时产生的吸光度A蛋白为0.112；
表2粗多糖溶液中蛋白质产生的吸光度测定
| 取母液量(mL) | 0.5 | 1 | 1.5 | 2 | 2.5 | 3 | 3.5 | 4 | 4.5 | 5 |
| 精制多糖溶液吸光度(A精) | 0.062 | 0.109 | 0.168 | 0.223 | 0.286 | 0.328 | 0.389 | 0.435 | 0.495 | 0.536 |
| 粗多糖溶液吸光度(A粗) | 0.070 | 0.127 | 0.194 | 0.261 | 0.332 | 0.384 | 0.458 | 0.512 | 0.583 | 0.637 |
| 蛋白质产生的吸光度(A蛋白) | 0.008 | 0.018 | 0.026 | 0.038 | 0.046 | 0.056 | 0.069 | 0.077 | 0.088 | 0.101 |
(9)样品多糖含量计算：根据步骤(5)测得的样品液吸光度A样品总和步骤(8)测得的蛋白质产生的吸光度A蛋白可以按如下公式算出样品多糖在490nm处真正的吸光度A样品：
A样品＝A样品总-A蛋白
最后由A样品根据步骤(3)葡萄糖标准曲线回归方程可以计算出样品液中葡萄糖浓度(C)，然后按下面公式计算荔枝多糖的含量(结果见表三)：
多糖含量(％)＝C*D/W/106*100
式中：多糖含量以葡萄糖计
C-为供试液中葡萄糖浓度，μg/mL；
D-多糖稀释倍数，实施例中为D＝8/0.1*250＝20000；
W为供试样品的重量，g。
表3糯米糍荔枝中多糖含量测定
| 样品号 | A样品总 | A蛋白 | A样品 | 多糖含量(％) | 多糖含量平均(％) | RSD％ |
| 1 | 0.555 | 0.112 | 0.443 | 1.692 | 1.704 | 1.181 |
| 2 | 0.561 | 0.112 | 0.449 | 1.715 | ||
| 3 | 0.558 | 0.112 | 0.446 | 1.704 |
Claims (9)
1、一种荔枝多糖含量的测定方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)粗多糖的制备：荔枝干肉加6-8倍蒸馏水，60℃水浴保温30分钟，打浆，95℃水浴浸提4-5h，趁热过滤，用高速冷冻离心机以20000-30000r/min离心10-15min，去渣，真空浓缩至1/4体积，加入4倍体积无水乙醇，静置12h，3000-5000r/min离心10-15min，收集沉淀即得荔枝粗多糖；
(2)精制荔枝多糖的制备：荔枝粗多糖依次用石油醚、丙酮回流脱脂，挥干溶剂，用80％乙醇回流去其它可溶性糖类物质，置80℃烘箱中5h挥干溶剂后溶于50倍蒸馏水中，加入10-15％(V/V)H2O2脱色，然后加4倍体积的无水乙醇，静置12h，3000-5000r/min离心10-15min，收集沉淀，置80℃烘箱中5h挥干溶剂。沉淀加入30倍蒸馏水，并加入0.05-0.1％(W/V)NaOH，90℃热水浴中保温1h使其溶解，然后加入0.5％木瓜蛋白酶，60℃恒温处理10h，用高速冷冻离心机以10000-20000r/min离心10-15min。上清液加入1/5体积氯仿，1/25体积正丁醇振荡20min，用分液漏斗分出水相，此步骤重复5次，然后用蒸馏水透析48h，然后透析液加入4倍体积的无水乙醇，静置12h，3000-5000r/min离心10-15min取沉淀，真空干燥至恒重，即得精制荔枝多糖；
(3)样品液制备和测定：荔枝干肉剪碎，精密秤取10g，加500mL80％酒精浸泡过夜，然后于索氏提取器中回流4h，残渣挥去溶剂后，用蒸馏水回流提取4h，然后用蒸馏水反复洗至250-300mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀备用。样品液多糖用苯酚-硫酸法测定，步骤如下：精密吸取样品液0.2mL于带塞试管中，加蒸馏水至2mL，再依次加入6％苯酚溶液1.0mL，浓硫酸5.0mL，置沸水浴中15分钟，然后快速冷却至室温，以蒸馏水做参比，在490nm下用1cm比色杯测其吸光度，得到吸光度A样品总；样品中蛋白质含量测定用Bradford法，步骤如下：取样品液0.1mL加至5.0mL考马斯亮蓝试剂中，5min钟后于595nm处测吸光度，再根据蛋白质的标准曲线得出样品中蛋白质含量；
(4)荔枝粗多糖中净多糖含量确定：称取600mg的荔枝粗多糖，溶解于200-300mL的蒸馏水中，配成多糖浓度为2-3mg/mL的母液，然后分别吸取母液0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5mL于试管中，用蒸馏水补充至10mL，混匀，得到一系列粗多糖溶液。用Bradford法测出各粗多糖溶液的蛋白质含量并计算出总量；由于粗多糖中最主要杂质为杂蛋白，那么用粗多糖溶液中粗多糖总量减掉蛋白质总量即可得出各粗多糖溶液中净多糖的总量，由此可算出各粗多糖溶液中净多糖的含量；
(5)多糖含有的蛋白质在苯酚-硫酸法测定多糖时产生的吸光度与其含量之间函数关系的建立：根据步骤(4)得到的各粗多糖溶液中净多糖含量，用精制荔枝多糖配成与其一一对应的同样浓度，得到系列精制多糖溶液。分别精密吸取相同多糖浓度的粗多糖溶液及精制多糖溶液0.1mL于带塞试管中，余下步骤按苯酚—硫酸法测定出各多糖溶液的吸光度，可以分别得到粗多糖溶液的吸光度A粗及精制多糖溶液的吸光度A精，那么A粗与A精的差值即为蛋白质产生的吸光度A蛋白。以蛋白质产生的吸光度(A蛋白)对各粗多糖溶液中蛋白质浓度(C)作回归处理，可以得到一个回归方程；
(6)样品液蛋白质产生的吸光度A蛋白计算：根据步骤(3)测得的样品液中蛋白质含量，和步骤(5)所得回归方程就可以计算出此浓度的蛋白质在苯酚-硫酸法测定多糖时产生的吸光度A蛋白；
(7)样品多糖含量计算：根据步骤(3)测得的样品液吸光度A样品总和步骤(6)所得的蛋白质产生的吸光度A蛋白，可以按如下公式算出样品多糖在490nm处真正的吸光度A样品：
A样品＝A样品总-A蛋白
最后由A样品根据步骤(4)葡萄糖标准曲线回归方程可以计算出样品液中葡萄糖浓度(C)，然后按下面公式可以计算出荔枝多糖的含量：
多糖含量(％)＝C*D/W/106*100
式中：多糖含量以葡萄糖计
C—为供试液中葡萄糖浓度，μg/mL；
D—多糖稀释倍数；
W为供试样品的重量，g。
2、根据权利要求1所述的一种荔枝多糖含量的测定方法，其特征在于步骤(1)中以20000-30000r/min离心10-15min。
3、根据权利要求1所述的一种荔枝多糖含量的测定方法，其特征在于步骤(2)中加入0.05-0.1％(W/V)的NaOH。
4、根据权利要求1所述的一种荔枝多糖含量的测定方法，其特征在于步骤(4)中称取600mg的荔枝粗多糖，溶解于200ml-300ml的蒸馏水中，配成多糖浓度为2-3mg/ml的母液，然后分别吸取母液0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5ml于试管中，用蒸馏水补充至10ml，混匀，得到一系列粗多糖溶液。
5、根据权利要求1所述的一种荔枝多糖含量的测定方法，其特征在于步骤(4)中用粗多糖溶液中粗多糖总量减掉蛋白质总量即可得出各粗多糖溶液中净多糖的总量，由此可算出各粗多糖溶液中净多糖的含量。
6、根据权利要求1所述的一种荔枝多糖含量的测定方法，其特征在于步骤(5)中根据各粗多糖溶液中净多糖含量，用精制荔枝多糖配成与其一一对应的同样浓度，得到系列精制多糖溶液。
7、根据权利要求1所述的一种荔枝多糖含量的测定方法，其特征在于步骤(5)中用各粗多糖溶液中蛋白质产生的吸光度对各粗多糖溶液中蛋白质浓度作回归处理，可以得到一个回归方程。
8、根据权利要求1所述的一种荔枝多糖含量的测定方法，其特征在于步骤(6)中样品液蛋白质产生的吸光度的计算：先测出蛋白质浓度，再根据蛋白质浓度对多糖测定产生的吸光度作出的回归方程计算出在此浓度时蛋白质在苯酚-硫酸法测定多糖时产生的吸光度。
9、根据权利要求1所述的一种荔枝多糖含量的测定方法，其特征在于步骤(7)中样品多糖在测定时真正的吸光度算法为：样品液吸光度减去蛋白质产生的吸光度即为多糖真正的吸光度。
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