CN1976720A

CN1976720A - 用于治疗严重急性呼吸道综合征(sars)的组合物和方法

Info

Publication number: CN1976720A
Application number: CNA200480013748XA
Authority: CN
Inventors: G·R·锡伯
Original assignee: Wyeth Holdings LLC
Current assignee: Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC
Priority date: 2003-05-20
Filing date: 2004-05-20
Publication date: 2007-06-06
Also published as: MXPA05012497A; AU2004266111B8; BRPI0410467A; IL171972A0; AU2004266111B2; WO2005018535A2; RU2411042C2; US7722886B2; AU2004266111A1; KR20060023968A; NO20056073L; NZ543655A; US20060263847A1; US20040235047A1; EP1624850A2; US7892563B2; WO2005018535A3; JP2007525465A; CA2526431A1; EP1624850A4

Abstract

本文公开了用于治疗严重急性呼吸道综合征(SARS)的组合物和方法。本文提供了SARS相关炎性细胞因子的抑制剂以用于治疗SARS，包括SARS相关冠状病毒(SARS－CoV)的感染。本文公开了TNF抑制剂，以及所述抑制剂用于治疗SARS(包括SARS－CoV)的用途。还提供了鉴定和筛选所述抑制剂的方法。

Description

用于治疗严重急性呼吸道综合征(SARS)的组合物和方法

技术领域

本发明涉及用于治疗严重急性呼吸道综合征(SARS)的组合物和方法。另外，本发明涉及包含肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂的组合物，包括重组TNF受体，小分子和抗体，用于SARS治疗。

发明背景

严重急性呼吸道综合征(SARS)是一种最近在很多国家都有报道的呼吸道疾病。2002年末SARS首次发生，成为对人类健康的潜在威胁。它已被公认为一种新出现的传染病，传染性很高，具有很高的发病率和死亡率。在东南亚最先发生后，至2003年4月30日，该病毒已感染了全世界26个国家中大约5,663个个体。M.M.W.R.，52(17)：388-90(2003年5月2日)。在这些感染中，372个(约6.6％)致死。同上。SARS是对全世界人群的健康和社会安宁的重大威胁，现在人们正努力开发该病的治疗(方法)。

SARS的一般特征是，潜伏期长度通常为2-7天，受感染个体通常表现为高烧，有时伴有寒战、头痛、不适感和肌痛。随着无痰干咳或呼吸困难的出现，疾病发展，伴随或进展为血氧不足。10-20％的病例需要插管和机械透气。此外，在呼吸道疾病的顶峰期，约50％的受感染个体出现白血球减少和血小板减少。M.M.W.R.，52(12)：255-256(2003年3月28日)。

SARS传播的方式提示为病毒病原体的飞沫或接触传染。Poutanen等，NewEngland Journal of Medicine，2003年3月31日在线发表，www.nejm.org。最近，病原学上将SARS与一种新型病毒——SARS相关冠状病毒(SARS-CoV)相关联，该病毒是包膜病毒的冠状病毒家族的成员，包膜病毒在受感染动物宿主细胞的细胞质中复制。冠状病毒的一般特征是单链RNA病毒，基因组约有30,000个核苷酸。Rota，P.A.，等，Scienceexpress，2003年5月1日在线发表；10.1126/science.1085952。冠状病毒分为三个已知的组：头两组引起哺乳动物冠状病毒感染，第三组引起禽类冠状病毒感染。同上。相信冠状病毒是很多动物中几种严重疾病的病原体，例如，传染性支气管炎病毒、猫传染性腹膜炎病毒和传染性肠胃炎病毒是重要的兽病原体。同上(Id)。这些已知的冠状病毒在人类中只引起轻度症状。

SARS-CoV基因组长度为29,727个核苷酸，有11个开放阅读框，基因组DNA的G-C含量为41％。同上(Id、)。系统发生分析表明SARS-CoV代表一组新的冠状病毒，与以前已知的三组冠状病毒不同。同上。分离自世界上其它地方的受感染患者的SARS-CoV测序确证了这一独立的组别。Marra，M.A.，等，Sciencexpress，2003年5月1日在线发表；10.1126/science.1085953。与三个已知组不同，SARS-CoV在人类中引起如上所述的严重疾病。

最近的研究已研究了SARS-CoV的毒力。根据世界卫生组织报道，室温下SARS-CoV在粪便中至少稳定1-2天，在痢疾病人的大便中稳定大约4天。另外，在4℃和-80℃条件下21天后，SARS-CoV在细胞培养上清液中的病毒浓度只有很少量的降低，而在稳定的室温条件下2天，SARS-CoV在细胞培养上清液中只损失一个对数级的病毒浓度。SARS-CoV对常规使用的消毒剂和固定剂的确表现出易感性。WHO关于SARS稳定性和抗性的数据。然而，数据强烈提示，SARS-CoV可在长时间内在人宿主外保持其毒力。

除SARS-CoV外，怀疑SARS中还牵涉其它传染原。例如，已从患有SARS的患者中分离到人类肺炎后病毒(human metapneumovirus)。Poutanen等，NewEngland Journal of Medicine，2003年3月31日在线发表，www.nejm.org。有可能是这些病原体的组合造成了SARS。SARS也可能涉及二级病原体或多种二级病原体的机会感染。

到2003年3月25日，美国疾病控制和预防中心宣布“此时可做出无([n]o)特异性治疗的建议”CDC SARS治疗，www.cdc.gov/ncidod/sars/treatment。当前在香港给予的一种疗法——类固醇和抗病毒剂病毒唑组合，已被批评为没有效果甚至对接受者有危险性。D.Cyranoski，Nature，423：4(2003)。其它尝试的疗法包括给予抗生素oseltamivir.Poutanen等，New England Journal ofMedicine，2003年3月21日在线发表，www.nejm.Org。在缺乏有效治疗的情况下，医疗工作者被限制于使用支持性措施，如静脉(IV)补液、氧气和必要时使用机械透气和插管，以治疗患有SARS的患者。

已尝试了各种措施试图控制SARS的传播。这些措施包括旅行限制/劝告、隔离、医疗设置中的SARS特异性筛选以及增加对公众关于正确的传染控制方法的教育。也将防范装备例如呼吸器、手套、护目镜和大褂推荐给临床医生和医疗工作者以帮助限制SARS的传播。虽然少数几个国家已报道该病传播达到顶峰，但在其它国家如中国，SARS继续在难以控制地传播。

专家预测在多年内不可能有用于该病的疫苗。实际上，根据美国政府的顶级传染病科学家(所言)，在疫苗普遍可用之前需要“几年”的加速研究。Nesmith，New York Times Syndicate；2003年4月7日在线发表；www.nlm.nih.gov/medlineplus/print/news/full story-12280.html。此外，冠状病毒迅速变异的能力对开发有效疫苗造成了重大障碍。而且，即使开发了疫苗，该疫苗可能包括了患者的免疫性，实际上更恶化了对SARS的免疫反应。因此，该病仍然是对全世界人群的重大威胁，并且似乎可能在很长时间内还是如此。

因此，需要一种有效治疗，用于诊断为SARS的患者、受SARS相关传染原感染的患者(如受SARS-CoV感染的患者)、或有接触SARS的紧迫危险的患者(如接触或在近期可能将接触SARS相关传染原的个体)。

发明概述

本文提供用于治疗严重急性呼吸道综合征(SARS)的组合物和方法。

本发明的一个实施方式提供的组合物包括：在药学上可接受的运载体内含有治疗有效量的SARS相关炎性细胞因子抑制剂。

本发明的另一个实施方式提供的组合物包括：可溶性重组SARS相关炎性细胞因子受体，SARS相关炎性细胞因子的抗体，影响SARS相关炎性细胞因子活性的小分子，SARS相关的反义寡核苷酸或这些的组合。

本发明的另一个实施方式提供的组合物包括：选自以下的第一物质：可溶性重组TNF受体，TNF的抗体，影响TNF活性的小分子，TNF反义寡核苷酸及其这些的组合；和选自以下的第二物质：病毒RNA依赖性RNA多聚酶的抑制剂，病毒编码蛋白酶的抑制剂(它影响病毒RNA依赖性RNA多聚酶的加工)，冠状病毒从受感染细胞出芽或释放的抑制剂(它影响红血球凝聚素-酯酶的活性)，病毒结合到特异性细胞表面受体的抑制剂，受体诱导的病毒刺突糖蛋白构象改变的抑制剂，它与病毒进入有关，以及这些的组合。

本发明的另一个实施方式提供组合物，该组合物的制备方法包括：在随机安慰剂对照研究中，将候选的SARS相关炎性细胞因子抑制剂给予一组受SARS相关传染原感染的患者；监测该候选SARS相关炎性细胞因子抑制剂的效力；和将治疗有效量的如此鉴定的SARS相关炎性细胞因子抑制剂与药学上可接受的运载体包括在组合物中。

本发明的另一个实施方式提供组合物，该组合物的制备方法包括：在随机安慰剂对照研究中，将候选的肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂给予一组受严重急性呼吸道综合征(SARS)相关传染原感染的患者；监测该候选TNF抑制剂的效力；和将治疗有效量的如此鉴定的TNF抑制剂与药学上可接受的运载体包括在组合物中。

本发明的另一个实施方式提供用于治疗患有严重急性呼吸道综合征(SARS)的患者的方法，该方法包括：给予该患者治疗有效量的SARS相关炎性细胞因子抑制剂。

本发明的另一个实施方式提供用于治疗患有严重急性呼吸道综合征(SARS)的患者的方法，该方法包括：给予该患者治疗有效量的TNF抑制剂。

本发明的另一个实施方式提供用于筛选SARS相关炎性细胞因子抑制剂的方法，该方法包括：在随机安慰剂对照研究中，将候选的SARS相关炎性细胞因子抑制剂给予一组受SARS相关传染原感染的患者；和监测该候选SARS相关炎性细胞因子抑制剂的效力以鉴定治疗上有效的SARS相关炎性细胞因子。

本发明的另一个实施方式提供用于筛选可有效治疗SARS患者的组合物的方法，该方法包括：在随机安慰剂对照研究中，将候选的肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂给予一组受SARS相关传染原感染的患者；和监测该候选TNF抑制剂的效力以鉴定治疗上有效的TNF抑制剂。

发明详述

本发明提供用于治疗SARS相关病原物感染患者(包括人)的化合物、组合物和方法，这些患者包括疑似、可能和确证的SARS病例。出于本公开的目的，术语“病”、“疾病”“医学症状”、“异常症状”等可与术语和呼吸窘迫(distress)相关的“医学病症”互换使用，特别是当该窘迫是由冠状病毒引起的。

术语″TNF受体″和″TNFR″指所具有的氨基酸序列与天然哺乳动物TNF受体或TNF结合蛋白氨基酸序列基本相似的蛋白，它可结合TNF分子并抑制TNF结合到细胞膜结合的TNFR上。

如本申请书文中所用以限定TNFR蛋白或蛋白组合物的纯度，术语“分离的”或“纯化的”意指蛋白或蛋白组合物基本上不含天然或内源的其它蛋白，其所含的生产过程中产生的蛋白污染残留物的质量低于1％。然而，这些组合物可含有加入的作为稳定剂、carders、赋形剂或共治疗剂的其它蛋白。如果TNFR在聚丙烯酰胺凝胶中用银染可检测到单一蛋白条带，则认为TNFR是分离的。

本文所用“重组”意指蛋白获自重组(如微生物的或哺乳动物的)表达系统。“微生物的”指在细菌或真菌(例如酵母)表达系统中生产的重组蛋白。作为一种产品，“重组微生物的”定义为在微生物表达系统中生产的蛋白，该蛋白基本不含天然内源物质。在大多数细菌培养物，例如大肠杆菌中表达的蛋白将不含有多糖。在酵母中表达的蛋白可具有与哺乳动物细胞中表达的蛋白不同的糖基化模式。

如本说明书全文使用的作为TNF受体特性的“具备生物学活性的”，意指一种特殊的分子与此处公开的本发明实施方式具有充分的氨基酸序列相似性，从而能够结合可检测量的TNF、将TNF刺激传送到细胞(例如，作为杂交受体构建物的组分)、或与从自然(即，非重组)来源中抗TNFR而产生的抗-TNFR抗体发生交叉反应。优选地，在标准结合试验中，本发明范围内具备生物学活性的TNF受体可结合大于0.1nmol TNF/nmol受体，最优选地，大于0.5nmolTNF/nmol受体。

如本文所用，术语“抗原结合区”指抗体分子的一部分，该部分所包含的氨基酸残基与抗原相互作用并赋予抗体对抗原的特异性和亲和性。抗体区包含保持抗原结合残基正确构象所需的氨基酸残基“框架”(“framework”)。

如本文所用，术语“嵌合抗体”包括单价、双价或多价免疫球蛋白。单价嵌合抗体是由嵌合H链通过二硫桥与嵌合L链相连形成的二聚体(HL)。双价嵌合抗体是由两个HL二聚体通过至少一个二硫桥相连形成的四聚体(H₂L₂)。多价嵌合抗体也可产生，例如，通过利用聚合的C_H区(例如，来自IgM的H链，或μ链)。

如本文所用，短语“SARS患者”指哺乳动物患者，如人，该患者被确证患有SARS，或基于流行病学因素该患者属于可能的或怀疑的SARS病例之类。SARS患者包括以下患者：诊断为SARS(其SARS相关传染原(病原)(SARS-CoV)的感染检查为阳性)、基于流行病学因素疑似患有SARS、或有接触SARS的紧迫危险的患者(如接触或在近期可能将接触SARS的个体)。本文术语“SARS患者”与短语“具有SARS的患者”、“被SARS感染的患者”、“有SARS的患者”、“患有SARS的患者”以及其它此类短语可以互换使用。

本文所用短语“治疗有效剂量”指给哺乳动物宿主(优选人)施用的各单次剂量(作为一系列剂量的部分)中的量，其至少能使治疗的患者产生反应而降低感染的临床影响。其范围可从对病原体负荷的最小减少一直到阻止感染。理想地，治疗的病人将不再表现出更严重的感染临床表现。剂量可根据个体的具体情况而变化。基于本文提供的指导，给予的具体的量可在常规试验中确定或通过本领域技术人员已知的方法来确定。

如本文所用，短语“给予治疗有效剂量”的治疗剂意指给病人施用一定量的治疗剂一段时间而足以在至少一种反应该病症严重性的指标上引起高于基线的持续改善。如果患者在分开一或多周的至少两个时间表现出改善，则认为改善是“持续的”。改善的程度是基于迹象或症状来确定的，确定时也可用给予患者调查问卷，如生活质量调查问卷。如本文所用，术语“肿瘤坏死因子”或“TNF”指TNF-α和/或TNF-β。

细胞因子是当细胞被抗原激活时释放的蛋白分子，相信其参与细胞-至-细胞的通信，它们通过与白细胞上的特异性细胞表面受体相互作用而作为免疫反应的增强因子发挥功能。有各种不同类型的细胞因子，包括白细胞介素、淋巴因子、干扰素和肿瘤坏死因子(TNF)。

单核细胞和巨噬细胞响应内毒素或其它刺激而分泌称为肿瘤坏死因子-α(TNFα)和肿瘤坏死因子-β(TNFβ)的细胞因子。TNFα是17KD蛋白亚基的可溶性同型三聚体(Smith，等，J.Biol.Chem.262：6951-6954(1987))。TNF还存在26KD的膜结合前体形式(Kriegler，等，Cell 53：45-53(1988))。TNF的综述见Beutler，等，Nature 320：584(1986)，Old，Science 230：630(1986)，以及Le，等，Lab.invest.56：234。

除单核细胞或巨噬细胞之外的细胞也产生TNF-α，例如，人非单核肿瘤细胞系产生TNF(Rubin，等，J.Exp.Med.164：1350(1986)；Spriggs，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：6563(1987))，CD⁴⁺和CD⁸⁺外周血T淋巴细胞和一些培养的T和B细胞系(Cuturi，等，J.Exp.Med.165：1581(1987)；Sung，等，J.Exp.Med.168：1539(1988))也产生TNF-α。

TNF引起促炎性作用，从而造成组织损伤，如诱导血管内皮细胞上的促凝血活性(Pober，等，J.Immunol.136：1680(1988))，增加嗜中性粒细胞和淋巴细胞的粘附力(Pober，等，J.Immunol.138：3319(1987))，和刺激血小板活化因子从巨噬细胞、嗜中性粒细胞和血管内皮细胞中释放(Camussi等，J.Exp.Med.166：1390(1987))。

最近的证据将TNF与感染(Cerami，等，Immunol.Today 9：28(1988))、免疫疾病、肿瘤病理学(Oliff，等，Cell 50：555(1987))、自身免疫病理学和移植物-对抗宿主病理学(Piguet，等，J.Exp.Med.166：1280(1987))联系到一起。TNF与癌症和感染病理学的联系经常与宿主的分解代谢状态有关。

TNF还在革兰氏阴性脓毒病和内毒性休克中起主要作用(Michie，等，Br.J.Surg.76：670-671(1989)；Debets，等，Second Vienna Shock Forum，463-466页(1989)；Simpson，等，Crit.Care Clin.5：27-47(1989))，包括高烧、不适、食欲减退和萎靡不振。内毒素强烈激活单核细胞/巨噬细胞产生和分泌TNF和其它细胞因子(Kornbluth，等，J.Immunol.137：2585-2591(1986))。TNF和其它单核衍生的细胞因子介导对内毒素的代谢和神经激素反应(Michie，等，New.Engl.J.Med.318：1481-1486(1988))。将内毒素给予人志愿者产生具有类似流感症状的急性病，这些症状包括发烧、心跳过速、代谢率提高和压力激素的分泌(Revhaug，等，Arch.Surg.123：162-170(1988))。在患有革兰氏阴性脓毒病的患者中循环的TNF数目有所增加(Waage等，Lancet 1：355-357(1987)；Hammerle等，SecondVienna Shock Forum 715-718页(1989)；Debets等，Crit.Care Med.17：489-497(1989)；Calandra，等，J.Infect.Dis.161：982-987(1990))。

Eck和Sprang(J.Biol.Chem.264(29)，17595-17605(1989)已公开了推测的hTNF受体结合位点，他们鉴定了TNF-α的受体结合位点由氨基酸11-13、37-42、49-57和155-157组成。PCT出版物WO91/02078(1991)公开了TNF配体，它可结合具有以下表位的单克隆抗体：1-20，56-77和108-127的至少一个；1-20，56-77，108-127和138-149的至少两个；1-18，58-65，115-125和138-149的所有；1-18，和108-128的所有；56-79，110-127和135-或136-155的所有；1-30.117-128和141-153的所有；1-26.117-128和141-153的所有；22-40，49-96或49-97，11.0-127和136-153的所有；12-22，36-45，96-105和132-157的所有；1-20和76-90两者；22-40，69-97，105-128和135-155的所有；22-31和146-157的所有；22-40和49-98的所有；22-40，49-98和69-97的至少一个，22-40和70-87两者。

TNF-α和紧密相关的细胞因子，TNF-β(淋巴毒素)的很多生物学功能是由两种TNF跨膜受体介导的，这两种跨膜受体已被克隆。p55受体(也称为TNF-R55，TNF-RI或TNFR-α)是一种55kd的糖蛋白，显示其可进行信号转导产生TNF-α的细胞毒、抗病毒和增殖活性。p75受体(也称为TNF-R75，TNF-RII，或TNFR-α)是一种75kD的糖蛋白，已显示其可转导细胞毒和增殖信号以及转导引起GM-CSF分泌的信号。进一步的描述见Aderka，等，lsrl.J.Med，Sci.28：126-130(1992)(Seckinger，等，J.Exp.Med.167：1511-1516(1988)；Engelmann，等，J.Biol.Chem.264：11974-11980(1989))；Loetscher，等，Cell 61：351-359(Apr.20，1990)；Schall等，Cell 6l：361-370(Apr.20，1990)；Nophar，等，EMBO J.9(10)：3269-3278(1990)；Engelmann等，J.Biol.Chem.265{3}：1531-1536(1990)Engelmann，等，J.Biol.Chem.264(20)：11974-11980(1989)；欧洲专利公开号0 433 900 AI；PCT公开号WO92/13095；欧洲专利公开号0 526 905 A2；PCT公开WO 92/07076；欧洲专利公开号0 412 486 A1；欧洲专利公开号0 398327Al；欧洲专利公开0 308 378 A2；U.S.Reissue 36,755；和美国专利号.5,395,760以及5,605,690.

已公开了TNF抑制剂用于治疗多种疾病的用途。具体地，在传染病领域，人们试图用TNF抑制剂来治疗脓毒病。这些治疗脓毒病的尝试没有成功。然而，TNF抑制剂在治疗新出现的传染病SARS中出乎意料地有效。

本发明涉及在治疗SARS中有效的组合物。具体地，本发明涉及用于治疗SARS的化合物和组合物、鉴定对治疗SARS有效的化合物和组合物的方法以及本发明化合物在治疗SARS的方法中的应用。

按照本发明的实施方式，本发明包括：在药学上可接受的运载体中的治疗有效剂量的SARS相关炎性细胞因子抑制剂。优选地，该SARS相关炎性细胞因子抑制剂是可溶性重组SARS相关炎性细胞因子受体、SARS相关炎性细胞因子的抗体、影响SARS相关炎性细胞因子活性的小分子、SARS相关反义寡核苷酸或这些的组合。更优选地，该SARS相关炎性细胞因子抑制剂是可溶性重组受体。SARS相关炎性细胞因子抑制剂优选根据本发明的筛选方法来鉴定，如下所述。基于本文提供的指导，根据本发明的实施方式，本领域技术人员将可容易地鉴定这类化合物或组合物。

根据本发明的实施方式，本发明组合物包括含有下列物质的组合物：在药学上可接受的运载体中的治疗有效剂量的炎性细胞因子抑制剂，和在药学上可接受的运载体中的治疗有效剂量的抗病毒化合物。

根据本发明的另一个实施方式，本发明的组合物包括选自以下的第一物质：可溶性重组TNF受体，TNF的抗体，影响TNF活性的小分子，和TNF反义寡核苷酸及其组合。第一物质可任选与选自下列的第二物质组合：病毒RNA依赖性RNA多聚酶抑制剂，病毒编码蛋白酶的抑制剂，它影响病毒RNA依赖性RNA多聚酶的加工；冠状病毒从受感染细胞出芽或释放的抑制剂，它影响红血球凝聚素-酯酶的活性；病毒结合到特异性细胞表面受体的抑制剂；受体诱导的病毒刺突糖蛋白中构象改变的抑制剂，它与病毒进入有关；以及这些的组合。

本发明的组合物还考虑用包括以下步骤的方法制备的组合物：在随机安慰剂对照研究中，将候选SARS相关炎性细胞因子抑制剂给予一组受SARS相关传染原感染的患者；和监测该候选SARS相关炎性细胞因子抑制剂的效力。优选该随机安慰剂对照研究是盲法安慰剂对照研究或双盲安慰剂对照研究。本发明还考虑用包括以下步骤的方法制备的组合物：在随机安慰剂对照研究中将候选肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂给予一组受严重急性呼吸道综合征(SARS)相关传染原感染的患者；和监测该候选TNF抑制剂的效力。

可溶性重组TNF受体

根据本发明实施方式，本发明的组合物包括可溶性TNF受体和优选的TNFR-Ig。已知存在两种不同类型的TNFR：I型(TNFRI)和II型TNFR(TNFRII)。成熟的全长人TNFRII是分子量约75-80千道尔顿(kDa)的糖蛋白。成熟的全长人TNFRH是分子量约55-60千道尔顿(kDa)的糖蛋白。本发明优选的TNFR是TNFRI和TNFRII的可溶性形式以及可溶性的TNF结合蛋白。

可溶性TNFR分子包括，例如，具有至少20个氨基酸并且与TNFRITNFRII或TNF结合蛋白至少有一些共同的生物学活性的天然蛋白的类似物或亚基。可溶性TNFR构建物缺乏跨膜区(从细胞中分泌)但保留了结合TNF的能力。各种生物等价蛋白和氨基酸类似物具有与天然TNFR的所有或部分细胞外区域相对应的氨基酸序列。

等价可溶性TNFRs包括与这些序列相差一个或多个替代、删除或增加的多肽，其保留了通过细胞表面结合的TNF受体蛋白而与TNF结合的能力或保留了抑制TNF信号转导活性的能力。可对突变型TNFR(muTNFR)进行类似删除。可用重组TNFR DNA转染细胞以获得重组受体表达来确定TNF信号转导活性的抑制情况。然后将这些细胞与TNF接触，并检查所产生的代谢效果。如果所产生的效果可归因于配体的作用，那么该重组受体具有信号转导活性。Idzerda等，J.Exp.Med.171：861(1990)；Curtis等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：3045(1989)；Prywes等.EMBO J.5：2179(1986)和Chou等，J.Biol.Chem.262：1842(1987)公开了用于确定多肽是否具有信号转导活性的示例性程序。或者，也可利用表达内源性TNF受体并对“INF具有可检测到的生物学反应的原代细胞系。

本文所用TNFR类似物的命名按照蛋白质(例如TNFR)命名的惯例，前面标以hu(人)或mu(鼠)，后面标以Δ(指明删除)和C末端氨基酸的号码，例如，huTNFRΔ235指C末端氨基酸为Asp235的人TNFR。在未指明任何人或鼠物种时，TNFR一般指哺乳动物TNFR。类似地，未具体指明删除突变体时，术语TNFR意指所有形式的TNFR，包括具有TNFR生物学活性的突变体和类似物。

在一个优选的实施方式中，TNFR-Ig是TNFR:Fc，可如本文所述以药学上可接受的组合物形式给药。可通过每周一次或多次皮下注射TNFR:Fc来治疗本文所述疾病，但如果需要可采用其它给药途径。在一个用于治疗成人患者的示例性方案中，每周两次或三次，皮下注射给予25mgTNFR:Fc一周或多周，优选四周或更多周。或者每周一次或两次皮下注射5-12mg/m²剂量或50mg flat剂量，持续一周或多周。在其它实施方式中，用缓释形式的TNFR:Fc治疗SARS，如将TNFR:Fc包裹于生物相容性聚合物中，将TNFR:Fc与生物相容性聚合物混合(如局部应用的水凝胶)，和将TNFR:Fc包裹在半渗透性植入物中。

用于治疗本文所述疾病的各种其它药物也可与包含TNF-α抑制剂(如TNFR:Fc)的组合物同时给予。这些药物包括：NSAID；DMARD；止痛剂；局部类固醇；系统类固醇(例如，强的松)；其它细胞因子；炎性细胞因子拮抗剂；抗T细胞表面蛋白的抗体；口服类维生素A；水杨酸；和羟基脲。用于此类组合的合适的止痛剂包括：对乙酰氨基酚，可待因，复方丙氧氨酚(propoxphenenapsylate)，盐酸氢羟可待酮，二酒石酸氢可酮和反胺苯环醇。适用于此类组合的DMARD包括：咪唑硫嘌凌，环磷酰胺，环孢霉素，羟化氯喹硫化物，氨甲蝶呤，来氟米特(leflunomide)，二甲胺四环素，青霉胺，硫氮磺吡啶，口服金，硫代苹果酸金钠恶化和金硫葡糖。适用于对象组合治疗的NSAID包括：水杨酸(阿司匹林)和水杨酸盐衍生物；布洛芬；消炎痛；塞来昔布(celecoxib)(CELEBREX，Pharmacia和Pfizer)；罗非昔布(rofecoxib)(VIOXX，Merck & Co.Inc.)；酮咯酸(ketorolac)；萘普酮(nambumetone)；吡罗昔康(piroxicam)；萘普生；恶丙嗪；苏灵大；酮洛芬(ketoprofen)；双氯芬酸(diclofenac)；以及其它COX-1和COX-2抑制剂，丙酸衍生物，乙酸衍生物，羧酸衍生物，羧酸衍生物，丁酸衍生物，oxicams，吡唑和吡唑啉酮，包括新开发的抗炎药物。

如果将抗炎性细胞因子的拮抗剂和TNFR:Fc同时给予，此类拮抗剂的合适目标包括TGFβ，II-6和II-8。

此外，TNFR:Fc可与局部类固醇、系统类固醇、炎性细胞因子拮抗剂、抗T细胞表面蛋白抗体、氨甲蝶呤、环孢霉素、羟基脲和水杨酸偶氮磺胺吡啶(sulfasalazine)组合使用。

可根据动物体重确定合适的剂量。例如，可采用0.2-1mg/kg的剂量。或者，可根据动物表面积确定剂量，示范性剂量范围为0.1-20mg/m²，或更优选地，5-12mg/m²。对于小动物，如狗或猫，合适的剂量是0.4mg/kg，在一个优选实施方式中，每周一次或多次通过注射或其它合适的途径给予TNFR:Fc(优选从来自和患者同一物种的基因构建)或其它可溶性TNFR模拟物，直到动物的症状得到改善。

将TNF拮抗剂蛋白给予哺乳动物，优选人，目的是治疗SARS。由于白细胞介素，例如IL-1，IL-2和IL-6在TNF生产中所起的重要作用，用TNFR与IL-1R和/或IL-2R组合的组合疗法在TNF相关临床适应症的治疗中可能是优选的。在人类的治疗中，优选可溶性人TNFR。根据本发明，可采用I型IL-1R或II型IL-1R或其组合来治疗TNF依赖性的炎性疾病，例如关节炎。可类似地使用其它类型的TNF结合蛋白。

对象方法包括给予患者可溶性TNF拮抗剂，该拮抗剂可降低内源具备生物学活性的TNF的有效剂量，如通过降低产生的TNF的量，或阻止TNF与其细胞表面受体的结合。可阻止这种结合的拮抗剂包括TNF受体结合多肽片段、抑制TNF产生的反义寡核苷酸或核酶、指向TNF的抗体以及包含TNF或其修饰性变体(包括遗传修饰性突变体、多聚体形式和缓释剂型)的所有或部分或受体的重组蛋白。

本发明优选的实施方式采用可溶性TNRF作为TNF拮抗剂。TNR的可溶性形式可包括单体，融合蛋白(也称为″嵌合蛋白″)，二聚体，三聚体或更高级的多聚体.在本发明某些实施方式中，可溶性TNFR衍生物是模拟75 kDa TNFR或55kDa TNFR的TNF衍生物，其在患者体内与TNF相结合。可溶性TNFR模拟物可衍生自TNFR p55或p75或其片段。除p55和p75外的TNFR对于衍生可溶性化合物用于治疗本文所述的医学病症也是有用的，例如WO 99/04001中描述的TNFR。用于构建TNFR模拟物的可溶性TNFR分子包括，例如，至少具有20个氨基酸、缺少天然TNFR跨膜区、可结合TNF的天然TNFR的类似物或片段。衍生自TNFR的拮抗剂与细胞表面的受体竞争TNF，因此抑制TNF与细胞的结合，从而使之不能表现其生物学活性。可用ELISA或其它方便的试验来测定可溶性TNFR与TNF或LT(淋巴毒素-α，可与TNF-β互换使用)的结合。本发明提供可溶性TNF受体在制备治疗疾病的药物中的应用。

本发明的可溶性TNFR多肽或片段可与第二多肽融合以形成嵌合蛋白。第二多肽可促进嵌合蛋白自发形成二聚体、三聚体或更高级的多聚体，它们可结合TNF-α或LT-α分子并组织这些分子结合到细胞结合的受体上。用作拮抗剂的嵌合蛋白包括，例如，衍生自抗体分子恒定区的分子和TNFR的细胞外部分。本文中将这些分子称为TNFR-Ig融合蛋白。适合于治疗人类及其它哺乳动物疾病的优选的TNFR-Ig融合蛋白是重组的TNFR:Fc，该术语在本文中指“etanercept”，它是p75TNF-α受体细胞外部分的两个分子的二聚体，每个分子由人IgG₁的235个氨基酸的Fc部分组成。目前Immunex公司出售etanercept，商品名为ENBREL^TM。由于其含有的p75受体蛋白不仅结合TNF-α还结合炎性细胞因子LT-α，所以etanercept不仅可作为TNF-α的竞争性抑制剂还可作为炎性细胞因子LT-α的竞争性抑制剂。这与指向TNF-α的抗体不同，它不可抑制LT-α。

本发明还包括用含有55KDa TNFR的细胞外部分与IgG的Fc部分融合的化合物来治疗，以及用含有该分子的组合物及组合来治疗。还包括治疗方法，这些方法包括给予衍生自TNF-α受体分子细胞外区域的可溶性TNFR，而非p55和p75TNFR，例如WO 99/04001所述的TNFR，包括衍生自该TNFR的TNFR-Ig。其它合适的TNF-α抑制剂包括人化的抗-TNF-α抗体，阿达木单抗(adalimumab)，可得自Abbott Laboratories，商品名为HUMIRA(以前由KnollPharmacutical/BASF出售，商品名为D2E7)。本发明的组合物可包含一种或多种以下药物：英利昔单抗(infliximab)(也称为Remicade(Centocor Inc.))，Trocade(Hoffmann-La Roche，RO-32-3555)。来氟米特(Leflunomide)(也称为Arava，来自Hoechst Marion Roussel)，Kineret(IL-1受体拮抗剂，也称为Anakinra，来自Amgen，Inc.)

在本发明的一个优选实施方式中，采用可溶性TNFR的缓释形式，包括缓释形式的TNFR:Fc。适用于本公开方法的缓释形式包括但不限于，包裹在缓慢溶解的生物相容性聚合物中(例如美国专利No.6,036,978所述的藻酸盐微粒或美国专利No.6,083,534中所述的聚乙烯乙酸乙酯和聚(乳酸-葡糖酸)组合物)的TNFR，与此类聚合物(包括局部应用的水凝胶)混合的TNFR，和/或包裹在生物相容性半渗透性植入物中的TNFR。此外，用于本文所述治疗的可溶性I型或II型TNFR可与聚乙二醇(PEG化)偶联以延长其血清半衰期或增强蛋白运输。

小分子

适于治疗本文所述疾病的其它化合物包括小分子，如酞咪哌啶酮或酞咪哌啶酮类似物，己酮可可碱(pentoxifylline)，或基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂或其它小分子。合适的MMP抑制剂包括，例如，美国专利Nos.5,883,131，5,863,949和5,861,510所述以及美国专利No.5,872,146所述的巯基烷基肽类(mercapto alkyl peptidyl)化合物。可降低TNF产生的其它小分子包括，例如例如，美国专利Nos.5,508,300,5,596,013和5,563,143所述的分子，均可与TNF抑制剂，如可溶性TNFR或抗TNF的抗体组合给药。可用于治疗本文所述TNF介导疾病的其它小分子包括美国专利No,5,747,514，美国专利No.5,691,382所述的MMP抑制剂，以及美国专利No.5,821,262所述的衍生物。本文所述的疾病也可用抑制磷酸二酯酶IV和抑制TNF产生的小分子来治疗，如取代的肟衍生物(WO 96/00215)，磺胺喹啉(美国专利No.5,834,485)，芳基呋喃衍生物(WO 99/18095)和异二环衍生物(WO 96/01825；GB 2 291 422 A)。也可用抑制TNF和IFN8的噻唑衍生物(WO 99/15524)，以及抑制TNF和其它促炎性细胞因子的黄嘌呤衍生物(见，例如，美国专利No.5.118,500，美国专利No.5,096,906和美国专利No.5,196430)。可用于治疗本文所述病症的其它小分子包括美国专利No.5,547,979中所公开的那些。

反义寡核苷酸

本发明的TNF抑制剂还包括可通过与靶向的mRNA杂交并阻止多肽翻译来直接阻断mRNA翻译的反义寡核苷酸。反义寡核苷酸适用于治疗本文所述的任何医学病症，单独或与其它TNF抑制剂组合或与治疗相同病症的其它药剂组合。本发明的反义分子可干扰TNF、TNF受体或TNF的合成代谢途径中酶的翻译。虽然完全互补是优选的，但并不是必须的。如本文所指，与核酸的一部分“互补”的序列意指具有充分的互补性以可与该核酸杂交形成稳定双链(或三链，如果合适的话)的序列。杂交的能力将取决于互补的程度和反义核酸的长度。与信息(message)的5’端(例如AUG起始密码子之上包括AUG的5′非翻译序列)互补的寡核苷酸应该可以最有效地抑制翻译。然而，也可采用与靶向的转录本5′-或3′-非翻译、非编码区互补的寡核苷酸。与mRNA的5′非翻译区互补的寡核苷酸应该包括AUG起始密码子的互补序列。

反义核酸长度至少应为6个核苷酸，优选长度为6-50的寡核苷酸。在具体方面，寡核苷酸至少是10个核苷酸，至少17个核苷酸，至少25个核苷酸或至少50个核苷酸。最优选地，它们含有18-21个核苷酸。

反义寡核苷酸的主链可经化学修饰以延长该寡核苷酸在体内的半衰期。用于此目的的合适的修饰是本领域已知的，例如美国专利No.114,517中所述，其描述了用于此目的的硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，phospholriesters，氨基烷基磷酸三酯，甲基和其它烷基磷酸酯，各种磷酸盐，亚磷酸盐和氨基磷酸酯等的用途。

寡核苷酸可以是DNA或RNA，或其嵌合混合物、衍生物或修饰形式，单链或双链。寡核苷酸可在碱基部分、糖部分或磷酸主链被修饰，例如，以提高该分子的稳定性、杂交等。寡核苷酸可包括其它附加基团，如肽(例如用于靶向体内的宿主细胞受体)，或有助于跨膜运输的物质(见，例如Letsinger等，1989，Proc，Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：6553-6556；Lemaitre等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.84：648-652；PCT出版No.WO88/09810，1988年12月15日出版)，或杂交引发切割的物质或插入物质(见，例如，Zon，1988，Phann.Res.5：539-549)。反义分子应该被输送到表达靶向的转录本的细胞。

反义寡核苷酸可肠胃外给药，包括通过静脉或皮下注射，或可将它们掺入到适于口服给药的剂型中。已开发了用于将反义DNA或RNA输送到细胞中的多种方法，例如，可将反义分子直接注射入组织或细胞衍生位点，或将设计用于靶向所需细胞的修饰过的反义分子(例如与受体或靶细胞表面表达的抗原特异性结合的肽或抗体相连的反义分子)进行系统性地给药。然而，要使反义寡核苷酸在细胞内的浓度达到足够抑制内源mRNA的翻译常常是很困难的。因此，优选的方法是利用重组DNA构建物，其中反义寡核苷酸被置于pol III或pol II强启动子控制之下。采用这样一种构建物来转染患者中的靶细胞将导致足够量的单链RNA的转录，这些RNA将与内源靶基因转录本形成互补碱基对，从而阻止靶mRNA的翻译。例如，载体可被导入体内从而被细胞吸收并指导反义RNA的转录。这样的载体可以仍为游离型或整合到染色体上，只要它可被转录以产生所需的反义RNA。可用本领域的标准重组DNA技术方法来构建这类载体。载体可以是质粒、病毒或本领域已知的用于在哺乳动物细胞内复制和表达的其它载体。适用于治疗与TNF升高相关的疾病的反义寡核苷酸包括，例如，美国专利No.6,080,580所述的反义-TNF寡核苷酸，该专利提出利用这样的反义寡核苷酸作为候选物用在具有糖尿病、类风湿性关节炎、接触敏感、Crohn氏病、多发性硬化、胰腺炎、肝炎和心脏移植的动物模型试验中。

也可用设计用于催化性切割mRNA转录本的核酶分子来阻止编码TNF、TNF受体或参与TNF或TNFR合成的酶的翻译(见，例如，PCT WO/90,11,364；美国专利No.5,824,519)。可用于此目的的核酶包括锤头状核酶(Haseloff和Gerlach，1988，Nature，334：585-591)，RNA核酸内切酶(以下称为“Cech型核酶”)如在嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)中天然存在的(称为IVS或L-19 IVSRNA)(见，例如，WO 88/04300；Been和Cech，1986，Cell，47：207-216)。核酶可由经修饰的寡核苷酸组成(例如为改善稳定性、靶向等)并且应该运输到体内表达靶多肽的细胞。优选的运输方法包括利用将编码的核酶置于pol III或polII组成型强启动子控制下的DNA构建物，这样受转染的细胞将产生足够量的核酶以破坏内源靶mRNA，从而抑制其翻译。

根据本发明的实施方式，反义分子含有与靶病毒内的基因序列互补的寡脱氧核苷酸结构。与病毒RNA互补的硫代磷酸酯寡核苷酸已证明可在细胞培养中抑制病毒复制。ISIS 2922是一种具有强力抗CMV抗病毒活性的硫代磷酸酯寡核苷酸；它与CMV的最早期转录单位2区的RNA互补，抑制蛋白合成。正在研究把它用作CMV视网膜炎的玻璃体内治疗。不良作用包括玻璃体炎和视网膜色素上皮斑点。

或者，可使脱氧核糖核酸序列与靶基因的调控区(即，靶基因启动子和/或增强子)靶向互补，以形成抑制靶基因转录的三螺旋结构，来降低参与产生TNF或TNFR的基因的表达。(见，例如，Helene，1991，Anticancer Drug Des.，6(6)，569-584；Helene，等，1992，Ann.N.Y.Acad.Sci.，660，27-36；和Maher，1992，Bioassays 14(12)，807-815)。

本发明的反义RNA和DNA、核酶、三螺旋分子等可用本领域已知的用于DNA和RNA分子合成的任何方法来制备，包括，例如固相phosphoramidite化学合成。寡核苷酸可通过本领域已知的标准方法来合成，例如，通过用自动DNA合成仪(如可从Biosearch、Applied Biosystems等购得)。作为例子，硫代磷酸酯寡核苷酸可用Stein等1988，Nucl.Acids Res.16：3209的方法合成，甲基磷酸酯寡核苷酸可如Sarin等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：7448-7451所述来制备。或者，可通过编码反义RNA分子的DNA序列的体外或体内转录来产生RNA分子。可将这些DNA序列掺入到多种载体中，这些载体掺有合适的RNA多聚酶启动子如T7或SP6多聚酶启动子。或者，可将组成型或诱导型-取决于所用启动子-合成反义RNA的反义cDNA构建物稳定导入细胞系中。

也可用定向同源重组通过失活或“敲除”靶基因或其启动子来降低内源靶基因的表达(例如，见Smithies，等，1985，Nature 317，230-234；Thomas和Capeechi，1987，Cell 51，503-512；Thompson等，1989，Cell 5，313-321)。例如，可使用突变的、非功能性靶基因(或完全不相关的DNA序列)，两侧连接与内源靶基因(靶基因的编码区或调控区)同源的DNA，含有或没有选择性标记和/或负向选择标记，体内转染表达靶基因的细胞。通过定向同源重组，DNA构建物插入导致靶基因的失活。这种方法在农业领域尤其适用，可利用对ES(胚胎干)细胞的修饰来产生具有失活靶基因的动物后代(例如，见Thomas和Capecchi，1987以及Thompson，1989，见上)；或者在模式生物如线虫中，利用RNA干扰(″RNAi″)技术(Grishok A，Tabara H和Mello C C，2000，Science 287(5462)：2494-2497)，或转基因的导入(Dernburg等，2000，Genes Dev.14(13)：1578-1583)来抑制特定靶基因的表达。倘若用合适的载体如病毒载体将重组DNA构建物直接给药或靶向到体内所需的位点，那么该方法也可适用于人类。

抗-TNF抗体

由任何已知技术，例如但不限于，酶切割、肽合成或重组技术所提供的多克隆抗体、单克隆抗体(mAbs)、嵌合抗体、能以可溶性或结合形式标记的抗体的抗个体基因型(抗-Id)抗体，及其片段、区域或衍生物也在本发明的考虑范围内。本发明的这些抗-TNF抗体能够结合TNF的某些部分，抑制TNF与TNF受体结合。

多克隆抗体是来自用抗原免疫的动物血清的抗体分子非均质抗体群。单克隆抗体含有基本上均质的抗原特异性抗体群，该群体含有基本上类似的表位结合区。可用本领域技术人员已知的方法来获得mAb。见，例如Kohler和Milstein.Nature 256：495-497(1975)；美国专利No.4,376,110；Ausubel等主编，“分子生物学现有方法”，Greene Publishing Assoc.和Wiley Interscience，N.Y.，(1987，1992)；以及Harlow和Lane“抗体”：实验室指南，Cold SpringHarbor Laboratory(1988)；Colligan等主编，“免疫学现有方法”，GreenePublishing Assoc.和Wiley Interscience，N.Y.，(1992，1993)，其内容被完整纳入作为参考。这些抗体可以是任何免疫球蛋白类，包括IgG，IgM，IgE，IgA，GILD，及其任何亚类。产生本发明mAb的杂交瘤可在体外、原位或体内进行培养。体内或原位培养产生高滴度的mAb使之成为当前优选的生产方法。

嵌合抗体是其不同部分来源于不同动物物种的分子，如具有来自鼠mAb可变区和人免疫球蛋白恒定区的部分，嵌合抗体主要用于降低给药时的免疫原性以及增加产量，例如，当杂交瘤可高产率地产生鼠mAb，但该抗体在人中免疫原性也较高时，则采用人鼠嵌合mAb。嵌合抗体及其生产方法是本领域已知的(Cabilly等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3273-3277(1984)；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(194)，Boulianne等，Nature 312：643-646(1984)；Cabilly等，欧洲专利申请125023(1984年11月14日发表)；Neuberger等，Nature 314：268-270(1985)；Taniguchi等，欧洲专利申请17/496(1985年2月19日发表)；Morrison等，欧洲专利申请173494(1986年3月5日发表)；Neuberger等，PCT申请WO 86/01533，(1986年3月13日发表)；Kudo等，欧洲专利申请184187(1986年6月11日发表)；Morrison等，欧洲专利申请[73494(1986年3月5日发表)；Sahagan等，J.Immunol.137：1066-1074(1986)：Robinson等，国际专利公布号PCT/US86/02269(1987年5月7日发表)；Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439-3443(1987)；Sun等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：214-218(1987)；Better等，Science 240：1041-1043(1988)；以及Harlow和Lane“抗体”：实验室指南，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))。

Cerami等(EPO专利公布0212489，1987年3月4日)公开了鼠多克隆TNF抗体。

Rubin等(EPO专利公布0218868，1987年4月22日)公开了鼠单克隆人TNF抗体，分泌该抗体的杂交瘤，生产这些鼠抗体的方法，以及这些鼠抗体在TNF免疫测定中的应用。

Yone等(EPO专利公布0288088，1988年10月26日)公开了鼠抗TNF抗体，包括mAb，及其在病原学(尤其是在Kawasaki氏病原学和细菌感染)的免疫测定诊断中的应用。

其它研究者已描述了人重组TNF特异性的啮齿类或常规mAb，它们在体外具有中和活性(Liang，等，(Biochem.Biophys.Res.Comm.137：847-854(1986)；Meager等，Hybridoma 6：305-311(1987)；Fendly等，Hybridoma 6：359-369(1987)；Bringman，等.Hybridoma 6：489-507(1987)；Hirai，等，J，Immunol.Metlz.96：57-62.(1987)Moiler，等，(Cytokine 2：162-169(1990))。

已显示，TNF的中和性抗血清或mAb能在非人哺乳动物中终止实验性内毒素血症和菌血症中致命威胁后(出现)的不良生理学改变并防止死亡。这种作用已被证明，例如，在啮齿类致命性试验中和在灵长类病理学模型系统中(Mathison等，J.Clin.Invest.81：1925-1937(1988)；Beutler，等，Science 229：869-871(1985)；Tracey等，Nature 330：662-664(1987)；Shimamoto等，Immunol.Lett.17：311-318(1988)；Silva等，J.Infect.Dis.162：421-427(1990)；Opal等，J.Infect.Dis.161：1148-1152(1990)；Hinshaw等，Circ.Shock 30：279-292(1990))。

本发明的抗-TNF抗体可包括至少一个重链恒定区(H_c)，一个重链可变区(H_v)，一个轻链可变区(L_v)，一个轻链恒定区(L_c)，其中多克隆Ab、单克隆Ab，及其片段和/或区域，包括至少一个重链可变区(H_v)或轻链可变区(L_v)，重链可变区或轻链可变区结合TNF的一部分并抑制和/或中和TNF的至少一种生物学活性。

抗原是可被抗体结合的分子或分子的部分，它还可诱导动物产生与该抗原表位结合的抗体。抗原具有一个或多个表位。

上述特异性反应意于表示该抗原将以高度选择性方式与其对应抗体反应，而不与大量的或可被其它抗原激发的其它抗体反应。优选地，与本发明抗体、抗TNF抗体的片段和区域结合的抗原包括至少5个氨基酸，这5个氨基酸至少包含hTNF-α(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基87-108中的一个或59-80和8-108两者。结合本发明抗体、抗TNF抗体的片段和区域的优选的抗原不包括hTNF-α(SEQ ID NO：1)的氨基酸11-13，37-42，49-57或155-157中的氨基酸。

表位是任何分子中可在一个或多个抗体结合区被抗体识别和结合的部分。表位通常由分子的化学活性表面组如氨基酸或糖侧链组成，并且具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。“抑制性和/或中和性表位”意指一种表位，当其被抗体(在体内、体外或原位)结合时，导致含有该表位的分子或生物体生物学活性的丧失，优选为体内结合，包括，例如TNF和TNF受体的结合。例如，这样的表位包括美国6,277,969所述的抗体，全文引入本文作为参考。

如本文所用，术语“嵌合抗体”包括单价、双价或多价免疫球蛋白。单价嵌合抗体是由嵌合H链通过二硫桥与嵌合L链相连形成的二聚体(HL)。双价嵌合抗体是由两个HL二聚体通过至少一个二硫桥相连形成的四聚体(H₂L₂)。也可产生多价嵌合抗体，例如，通过利用聚合的C_H区(例如，来自IgM的H链，或μ链)。

本发明的鼠抗体和嵌合抗体、片段和区域包含单独的重(H)和/或轻(L)免疫球蛋白链。嵌合H链包括由TNF特异性非人抗体H链衍生而来的抗原结合区，它与人H链C区(C_H)的至少一部分相连，如CH₁或CH₂。

本发明的嵌合L链包含由TNF特异性的ram-人抗体L链衍生而来的抗原结合区，它与人L链C区(C_L)的至少一部分相连。

也可根据已知的方法步骤，如根据Ausubel(见下)，Harlow(见下)和Colligan(见下)，通过将单独的多肽链进行合适的连接，来制备具有相同或不同可变区结合特异性的嵌合H链和L链的抗体、片段或衍生物。

抗TNF免疫受体肽

本发明的免疫受体肽可结合TNF-α和/或TNF-β。免疫受体包括共价结合到至少一部分TNF受体的至少一个免疫球蛋白重或氢链。在某些优选的实施方式中，重链恒定区至少包括CH₁的一个部分。具体地，当免疫受体肽包括轻链时，重链必须包括负责结合轻链恒定区的CH₁区域。

本发明的免疫受体肽可优选地至少包括一个重链恒定区，在某些实施方式中，至少一个轻链恒定区，受体分子与免疫球蛋白的至少一条链共价连接。在某些实施方式中包括轻链或重链可变区。因为受体分子可连接在免疫球蛋白链内部，所以单独一条链可具有可变区和与受体分子的融合。

与免疫球蛋白分子相连的TNF受体部分可结合TNF-α和/或TNF-β。因为TNF受体的细胞外区域结合TNF，所以与免疫受体的免疫球蛋白分子相连的部分至少含有TNF受体细胞外区域的一部分。

免疫球蛋白基因可以来自任何脊椎动物，如小鼠，但优选地，它编码的免疫球蛋白与该免疫受体肽的最终接受者具有基本上来源相同的序列。例如，如果用本发明的分子治疗人，免疫球蛋白优选是人源的。

可以合成用于连接到重链的TNF受体构建物，例如，所用的DNA编码存在于受体的细胞结构域中的氨基酸。Eck和Sprange，J.Biol.Chem.264(29)，17595-17605(1989)提出了推测的hTNF受体结合位点，他们鉴定出TNF-α的受体结合位点由氨基酸11-13，37-42，49-57和155-157组成。PCT申请WO91/02078(优先权日1989年8月7日)公开了TNF配体，它可结合具有以下表位的单克隆抗体：1-20，56-77和108-127的至少一个；1-20，56-77，108-127和138-149的至少两个；1-18，58-65，115-125和138-149的所有；1-18，和108-128的所有；56-79，110-127和135-或136-155的所有；1-30和117-128和141-153的所有；1-26，117-128和141-153的所有；22-40，49-96或-97，11-127和136-153的所有；12-22，36-45，96-105和132-157的所有；1-20和76-90两者；22-40，69-97，105-128和135-155的所有；22-31和146-157的所有；22-40和49-98的所有；22-40，9-98和69-97的至少一个，22-40和70-87两者。因此，一旦有了本发明，本领域技术人员将能够用已知的与TNF结合的受体部分来创建TNF受体融合蛋白。

采用本发明的免疫球蛋白融合蛋白(免疫受体肽)的优点包括以下一种或多种：(1)因为产生了二价二聚体融合蛋白，多价配体亲和性可能增加，(2)更长的血清半衰期，(3)通过Fc结构域激活效应细胞的能力，(4)方便纯化(例如，通过蛋白A层析)，(5)对TNF-α和TNF-β的亲和性，以及(6)阻抑TNF-α或TNF-β细胞毒性的能力。

虽然这使得不存在Ig轻链时一般可分泌融合蛋白，但本发明的主要实施方式提供了包括CH₁结构域，它可带来如下优点(1)两分子间距离增加和/或柔韧性增加，导致对TNF亲和力的增加(2)可创建重链融合蛋白和轻链融合蛋白，它们可互相装配并二聚化以形成四价(双融合)受体分子，和(3)与二价(单融合)分子相比，四价融合蛋白对TNF具有更高的亲和力和/或中和能力。

抗个体基因型Ab

除单克隆或嵌合抗TNF抗体外，本发明还涉及对本发明的抗TNF抗体具有特异性的抗个体基因型(抗-Id)抗体。抗-Id抗体是一种能够识别与另一抗体的抗原结合区通常相关的独特决定簇的抗体。TNF特异性的抗体称为个体基因型或Id抗体。可通过用Id抗体或其抗原结合区来免疫与Id抗体的来源同种和相同遗传型(例如，小鼠品系)的动物来制备抗-Id。被免疫动物将识别免疫抗体的个体基因型决定簇并对其产生免疫应答，而形成抗-Id抗体。抗-Id抗体也可用作“免疫原”而在另一动物中诱导免疫反应，产生所谓的抗-抗-Id抗体。抗-抗-Id抗体在表位上可与最初的诱导抗-Id的抗体相同。因此，通过利用mAb个体基因型决定簇的抗体，有可能鉴定表达相同特异性抗体的其它克隆。见例如，美国专利No.4,699,880，全文纳入本文作为参考。

抗-Id抗体是一种能够识别与另一抗体的抗原结合区通常相关的独特决定簇的抗体。可通过用Id抗体或其抗原结合区来免疫与Id抗体的来源同种和相同遗传型(例如，小鼠品系)的动物来制备抗-Id。被免疫动物将识别免疫抗体的个体基因型决定簇并对其产生免疫应答，而形成这些个体基因型决定簇的抗体(抗-Id抗体)。因此，依照本发明所生产的抗TNF的mAbs可以被用于在合适的动物，如BALB/c小鼠中，诱导抗Id抗体。从这些免疫过的小鼠得到的脾细胞可以用于生产分泌抗Id mAb的抗Id杂交瘤细胞。进而，抗Id mAb能与运载体如锁眼界限血蓝蛋白(KLH)偶联，并且用于免疫其它BALB/c小鼠。从这些小鼠得到的血清含有抗-抗-Id抗体，这些抗体具有与TNF表位特异性的原初mAb结合的特性。

因而，任何合适的TNF中和性化合物均能被用于本发明的方法。这些TNF中和性化合物的例子可选自以下物质组成的组：TNF中和性表位特异性的抗体或其部分，p55受体、p75受体或其复合物，TNF受体中结合TNF的部分，结合TNF的肽，结合TNF的may肽葡聚糖模拟药物以及任何阻抑TNF的有机金属模拟药物。

相关领域技术人员基于本文提供的教导和指导，可通过常规实验确定这些TNF中和性化合物。

抗-TNF抗体和抗-TNF肽的结构类似物

基于本文提供的教导和指导，可用已知的方法步骤提供本发明的抗-TNFAb(包括其片段和区域)和产生所述Ab的抗原(本文也称为“肽”)的结构类似物

蛋白三维结构的知识对于理解它们如何发挥功能是很重要的。目前在蛋白结构数据库中可得到400多种蛋白的三维结构(与此相比，序列数据库中有约15,000种已知的蛋白序列)。这些结构的分析显示，它们分为不同的基序可识别类型。因此，可以根据蛋白与已知结构的相关蛋白的同源性来模拟蛋白的三维结构。已知许多实例，两种具有相对低序列同源性的蛋白可具有非常相似的三维结构或基序。

近年来，已经可以通过核磁共振(NMR)来确定分子量高达约15Kda的蛋白的三维结构。该技术只需要纯蛋白的浓缩溶液。不需要晶体或同形衍生物。已通过该方法确定了多种蛋白的结构。NMR结构测定的细节是本领域已知的(见，例如，Wuthrich.，蛋白和核酸的NMR，Wiley，New York，1986；Wuthrich，K.Science 243：45-50(1989)；Clore等，Crit，Rev.Bioch，Molec.Biol.24：479-564(1989)；Cooke等，Bioassays 8：52-56(1988))。

在应用该方法时，收集本发明抗-TNF Ab和/或抗-TNF肽的多种′H NMR 2D数据组。有两种主要的类型。一种类型，COSY(圆锥光谱学)鉴定通过化学键相连的质子共振。这些光谱提供关于通过三个或更少共价键相连的质子的信息。NOESY(核奥佛好塞增强型光谱学)(nuclear Overhauser enhancementspectroscopy)鉴定在空间上接近(少与0.5nm)的质子。指定完全旋转系统之后，用NOESY来定义二级结构。可在肽的一级序列中相邻的残基之间发现交叉峰(核奥佛好塞效应或NOE′s)，对于距离少于0.5nm的质子可看到该交叉峰。由连续NOE’s与氨基质子耦合常量的组合以及来自非相邻但在二级结构中相邻的氨基酸的NOE’s所收集的数据用于鉴定该多肽的二级结构。除预测二级结构外，NOE’s表明一级氨基酸序列和二级结构中质子的空间距离。在考虑所有数据后，通过“最适”“best fit”推断法来确定三级结构预测。

先用通过键的连接来鉴定氨基酸类型。第二步是用通过空间与邻近残基的连接以及已知的氨基酸序列来指定具体的氨基酸。然后将结构信息列表，其分为三个主要类别：NOE鉴定空间上接近的质子对，偶联常数给出二面角的信息，缓慢交换的氨基质子给出氢键位置的信息。利用距离几何类型计算用这些限制条件来计算结构，然后用限制的分子动力学进行优化。这些计算机程序输出的是与实验数据(即，设置为配对＜0.5nm距离限量)一致的结构家族。数据把结构限定得越好，这个结构家族就可被叠加得越好，(即结构的分辨率越高)。在用NMR限定较好的结构中，那些埋在分子核心的氨基酸的大多数主链(即，氨基、C-α和羰基原子)和侧链的位置都可被清楚地限定，就像在结晶学中获得的结构一样。然而，暴露于表面的氨基酸残基的侧链经常被限定得不太好。这可能反应了一个事实，即这些表面残基移动性更大，可能没有固定的位置。(在晶体结构中，这可被看做漫射光密度)。

因此，根据本发明，基于对拓扑图的结构了解，利用NMR光谱数据与计算机模拟相结合以得到抗-TNF Ab和肽的至少一部分结构类似物。利用这些信息，本领域一般技术人员将知道如何获得抗-TNF Ab和/或肽的结构类似物，如通过合理的氨基酸替代以产生肽，根据该分子期望的治疗或诊断用途的要求来调整这些肽的TNF结合性亲和力，优选地，得到的肽对TNF结合的特异性更大。

或者，所具有的结构和化学特征适用于抗-TNF治疗或诊断的化合物提供具有选择性TNF亲和力的结构类似物。利用程序如MACROMODEL(StrodingerLLC)，INSIGHT(Accelrys Inc.)和DISCOVER(Accelrys Inc.)进行TNF结合化合物，如TNF受体、抗-TNF抗体、或其它TNF结合分子的分子模型研究来提供根据本发明抗-TNF Ab和/或肽的此类空间要求和方向。因此本发明这样的结构类似物在体外、原位和/或体内提供选择性定性和定量的抗-TNF活性。

抗病毒化合物

在另一个实施方式中，本发明的组合物包含抗病毒化合物。优选地，该抗病毒化合物是抗冠状病毒化合物。抗冠状病毒化合物优选是抗体(例如，单克隆、多克隆、嵌合等)，病毒RNA依赖性RNA多聚酶的抑制剂，病毒编码蛋白酶的抑制剂，它影响病毒RNA依赖性RNA多聚酶的加工，冠状病毒从受感染细胞出芽或释放的抑制剂，它影响红血球凝聚素-酯酶的活性，病毒结合特异性细胞表面受体的抑制剂(例如，hAPN结合到HCoV-229E的抑制剂)，受体诱导的病毒刺突糖蛋白中构象改变的抑制剂，它与病毒进入有关，或这些的组合。更优选地，抗病毒化合物是抗SARS相关病毒如SARS-CoV的单克隆抗体。根据本发明的实施方式，将本发明的单克隆抗体(半衰期约为20天)作为SARS感染的预防药给予对象。

抗病毒化合物包括例如，核苷/核苷酸反转录酶抑制剂(NRTD，非核苷反转录酶抑制剂(NNRTI)和/或蛋白酶抑制剂(PI)，可与本发明组合物联合给药的NRTI，包括但不限于，RETROVIR(Glaxo Smith Kline Inc.，齐多夫定(zidovudine)/AZT)，VIDEX(Bristol-Myers Squibb Inc.)，去羟肌苷/ddI)，HIVID(Hoffmann-La Roche)(扎西他滨/ddC)，ZERIT(Bristol-Myers Squibb，司他呋啶/d4T)，EPIVIR(Glaxo Smith Kline，拉米夫定/3TC)和COMBIVIR(Glaxo SmithKline，齐多夫定/拉米夫定)。可与本发明组合物联合给药的NNRTI，包括但不限于，VIRAMUNE(Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc.，奈韦拉平(nevirapine)，RESCRIPTOR(Pharmacia/Upjohn，地拉韦定(delavirdine))和SUSTIVA(Dupont Pharma Co.，依发韦仑(efavirenz))。可与本发明组合物联合给药的蛋白酶抑制剂，包括但不限于，CRIXIVAN(Merck & Co.，印地那韦(indinavir))，NORVIR(Abbott Labs.，利托那韦(ritonavir))，INVIRASE(Hoffmann-La Roche，沙奎那维(saquinavir))和VIRACEPT(Agouron PharmaInc.，奈非那韦(nelfinavir))。在一个具体的实施方式中，抗逆转录病毒剂、核苷逆转录酶抑制剂、非核苷逆转录酶抑制剂和/或蛋白酶抑制剂可与本发明的组合物联用以治疗AIDS和/或预防或治疗HIV感染。

NRTI包括LODENOSINE(F-ddA；酸稳定性腺苷NRTI，Triangle/Abbott)；COVIRACIL(恩曲他滨(emtricitabine)/FTC)；结构上与拉米夫定(3TC)相关但体外活性大3-10倍，Triangle/Abbott)；dOTC(BCH-10652，结构上也与拉米夫定相关但对很大比例的抗拉米夫定抗性分离物仍保留其活性；BiochemPharma)；Adefovir(FDA未批准用于抗HIV治疗；Gilead Sciences)；PREVEON(Gilead Sciences Inc.)(Adefovir Dipivoxil，阿德福韦(adefovir)的活性前体药物；其活性形式是PMEA-pp)；TENOFOVIR，(双-POC PMPA，PMPA前体药物；Gilead)；DAPD/DXG(DAPD的活性代谢物；Triangle/Abbott)；DD4FC(与3TC相关，对AZT/3TC-抗性病毒具有活性)；GW420867X(GlaxoWellcome)；ZIAGEN(阿巴卡韦(abacavir)/159U89：Glaxo Wellcome Inc.)；CS-87(3′叠氮-2′，3′-双脱氧尿嘧啶：WO99/66936)；以及带有S-乙酰(acyt)-2-硫代乙烯基(SATE)的β-L-FD4C和β-L-FddC的前体药物形式(WO 98/17281)。

其它NNRTI包括COACTINON(Emivirine/MKC-442，HEPT类的强力NNRTI；Triangle/Abbott)；CAPRAVIRINE，(AG-1549/S-1153，下一代NNRTI，对含有K103N突变的病毒具有活性；Agouron)；PNU-142721(具有比其前一代地拉韦定高20-50倍的活性，而且具有抗K103N突变体的活性；Pharmacia &Upijohn)；DPC-961 and DPC-963(efavirenz的第二代衍生物，设计其对具有K103N突变的病毒有活性；DuPont)；GW-420867X(比HBY097的活性高25倍，且具有抗K103N突变体的活性；Glaxo Wellcome)；CALANOL1DE A(来自橡胶树的天然产生的制剂；对含有Y1 IC和K103N突变之一或二者的病毒具有活性；和Propolis(WO 99/49830)。

其它的蛋白酶抑制剂包括LOPINAVIR(ABT378/r；(Abbott Laboratories)；BMS-232632(一种azapeptide；Bristol-Myers Squibb)；TIPRANAVIR(PNU-140690，非肽二氢吡喃；Pharmacia & Upjohn)；PD-178390(非肽二氢吡喃；Parke-Davis)；BMS 232-632(一种azapeptide；Bristol-Myers Squibb)；L-756，423(印地那韦(indinavir)类似物；Merck)；DMP-450(环状尿素化合物；Avid &DuPont 7：AG-1776(一种对抗蛋白酶抑制剂抗性病毒具有体外活性的肽模拟物；Agouron)；VX-175/GW-433908(安普那韦(amprenavir)的磷酸盐前体药物；Vertex & Glaxo Welcome)；CGP61755(Ciba)；以及AGENERASE(安普那韦；Glaxo Wellcome Inc，)。

其它的抗反转录病毒制剂包括融合抑制剂/gp41结合剂，融合抑制剂g/gp41结合剂包括T-20t(一种来自HIV gp41跨膜蛋白细胞表面结构域643-678残基的肽，该结构域结合静止状态的gp41并阻止其转变成融合(fusogenic)状态：Trimeris))以及T-1249(第二代融合抑制剂；Trimeris)。

其它的抗逆转录病毒制剂包括融合抑制剂/化学因子受体拮抗剂。融合抑制剂/化学因子受体拮抗剂包括CXCR4拮抗剂如AMD3100(一种bicyclam)，SDF-1及其类似物和ALX40-4C(一种阳离子肽)，T22(18个氨基酸的肽；Trimeris)和T22类似物T134和TI40；CCR5拮抗剂如RANTES(9-68)，AOP-RANTES，NNY-RANTES和TAK-779；以及CCR5/CXCR4拮抗剂如NSC 651016(一种偏端霉素(distamycin)类似物)还包括FUZEON(通用名eufuvirtide；可购自Hoffmann-La Roche；其阻抑HIV感染健康CD4细胞的能力)。还包括CCR2B，CCR3，和CCR6拮抗剂。化学因子受体拮抗剂如RANTES，SDF-1，MIP-1α，MIP-1β等，也可抑制融合。

其它的抗逆转录病毒制剂包括整合酶抑制剂。整合酶抑制剂包括二咖啡酰鸡纳(dicaffeoylquinic)(DFQA)酸：L-菊聚酸(chicoric acid)(一种dieaffeoyltartaric(DCTA)酸)；醌茜素(quinalizarin)(QLC)以及相关的蒽醌；ZINTEVIR(Aronex Pharmaceuticals Inc.)(AR 177，一种可能在细胞表面作用而非真正整合酶抑制剂的寡核苷酸：Arondex)；以及萘酚如WO 98/50347中所述。

其它抗逆转录病毒制剂包括类羟尿化合物如BCX-34(Biocryst Pharma.Inc.，嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂、)；核糖核苷酸还原酶抑制剂如D1DOX(Molecules for Health Inc.)：肌苷单磷酸酯脱氢酶(IMPDH)抑制剂如VX-497(Vertex Pharmaceutical Inc.)；以及霉酚酸(mycopholic acid)如CellCept(Hoffmann-La Roche，霉酚酸吗啉乙酯(mycophenolate mofetil))。

其它的抗逆转录病毒制剂包括病毒整合酶抑制剂，病毒基因组核移位抑制剂如亚芳香基双(甲基酮)化合物：HIV进入的抑制剂如AOP-RANTES，NNY-RANTES，RANTES-IgG融合蛋白，RANTES和粘多糖(GAG)的可溶性复合物，以及AMD-3100(AnorMed Inc.)；核壳体锌指蛋白抑制剂如二噻烷化合物HIV Tat和Rev的靶标；中度药物增强剂(mid pharmacoenhancers)如ABT-378。

根据实施方式，本发明的组合物可包含其它抗逆转录病毒化合物，包括细胞因子和淋巴因子如MIP-1.α，MIP-I β，SDF-1.α，IL-2，PROLEUKIN(ChironCorp.)(阿地白介素(aldesleukin)/L2-7001；Chiron)，IL-4，IL-10.IL-12和IL-13；干扰素如IFN-α2a；TNF拮抗剂.NF.κ B.GM-CSF，M-CSF和IL-10；调剂免疫活性的制剂如环孢霉素(cyclosporin)和强的松；疫苗如Remune(HIV免疫原)，重组gp120及其片段，二价(B/E)重组包膜糖蛋白，rgp120CM235，MNrgp120，SF-2rgp120，gp120/可溶性CD4复合物，ΔJR-FL蛋白，来自不连续gp120 C3/C4结构域的分支合成肽，可融合性的免疫原以及Gag，Pol，Nef和Tat疫苗；基于基因的治疗如遗传抑制元件(GSEs；WO 98/54366)，和内部因子(intrakine)(遗传修饰的CC化学因子，靶向于ER以阻断新合成的CCR5的表面表达(Yang等，PNAS94：11567-72(1997)；Chen等，Nat.Med.3：111-16(1997))；抗体如抗-CXCR4抗体12G5，抗-CCR5抗体2D7，5C7，PA8，PA9，PA10，PA11，PA12和PA14，抗-CD4抗体Q4120和RPA-T4，抗CCR3抗体7B 11，抗-gp120抗体17b，48d，447-52D，257-D，268-D和50-1，抗-Tat抗体，抗-TNF-α抗体，和单克隆抗体33A；芳基碳氢(AH)受体激动剂和拮抗剂如TCDD，3，3′，4，4′，5-五氯二苯，3，3′，4，4′-四氯二苯，和α-萘黄酮(WO 98/30213)；以及抗氧化剂如γ-L-谷氨酰-L-半光氨酸乙酯(y-GCE；WO 99/56764)。

在其它的实施方式中，本发明的组合物还包括抗机会感染药物。抗机会感染药物包括但不限于，TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLE(Hoffmann-La Roche)DAPSON(Jacobus Pharmaceuticals)，PENTAMIDINE(American Pharmaceuticals Partners)，ATOVAQUONE(GlaxoSmithKkline)，ISONIAZID(BectonDickinson Microbiology System)，RIFAMPIN(Bedford Labs)，PYRAZINAMIDE(Pharmascience Inc.)，ETHAMBUTOL(CadilaPharma Inc.)，RIFABUTIN(Adria Labs Inc.)，CLARITHROMYCIN(Ind-SwiftLabs，Ltd)，AZITHROMYCIN(Pfizer，Inc.)，GANCICLOVIR，FOSCARNET(Astra Pharmaceuticals Inc.)，CIDOFOVIR(Gilead SciencesInc.)，FLUCONAZOLE(Pfizer Inc.)ITRACONAZOLE (Jansseen Pharmaantica)KETOCONAZOLE(Novopharm Ltd.)，ACYCLOVIR(Glaxo-Wellcome).FAMCICOLVIR，PYRIMETHAMINE(Glaxo Wellcome Inc.)，LEUCOVORIN(Immunex/Amgen Inc.)，NEUPOGEN(Amgen Inc.)(非格司亭(filgrastim)/G-CSF)，和LEUKINE(Berlex Labs Inc.)(sargramostim/GM-CSF)。

根据实施方式，本发明的组合物包括TRIMETHOPRIM-SULFAMETHO-XAZOLE(Hoffmann-La Roche)，DAPSON(Jacobus Pharmaceuticals)，PENTAMIDJNE(American Pharmaceuticals Partners)和/或ATOVAQUONE(Glaxo SmithKline)用于预防性治疗或预防机会性感染卡氏肺囊虫性肺炎(Pneumocystis carinii pneumonia)。在另一个具体实施方式中，本发明的组合物用于与下列物质的任意组合：ISONIAZID(Becton Dickinson MicrobiologySystem)，RIFAMPIN(Bedford Labs)，PYRAZINAMIDE(PharmascienceInc.)和/或ETHAMBUTOL(Cadila Pharma Inc.)用于预防性治疗或预防机会性感染鸟分枝杆菌复症(Mycobacterium avium complex)。在另一个具体的实施方式中，本发明的组合物用于与下列物质的任意组合：RIFABUTIN(Adria LabsInc.)，CLARITHROMYCIN(Ind-Swift Labs，Ltd.)，和/或AZIRTHROMYCIN(Pfizer Inc.)用于预防性治疗或预防机会性感染肺结核分枝杆菌。在另一个具体的实施方式中，本发明的组合物用于与下列物质的任意组合：GANCICLOVIR，FOSCARNET(Astra Pharmaceuticals Inc.)，和/或CIDOFOVIR(GillheadSciences Inc.)用于预防性治疗或预防机会性感染巨细胞病毒。在另一个具体的实施方式中，本发明的组合物用于与下列物质的任意组合：FLUCONAZOLE(Pfizer Inc.)，ITRACONAZOLE(Janssen Pharmaantica)，和/或KETOCONAZOLE(Novopharm Ltd.)用于预防性治疗或预防机会性真菌感染。在另一个具体的实施方式中，本发明的组合物用于与下列物质的任意组合：ACYCLOVIR(Glaxo-Wellcome)和/或FAMCICOLVIR用于预防性治疗或预防机会性感染单纯疱疹病毒I型和/或II型。在另一个具体的实施方式中，本发明的组合物用于与下列物质的任意组合：PYRIMETHAMNE和/或LEUCOVORIN(Immunex/Amgen Inc.)用于预防性治疗或预防机会性感染鼠弓形虫(Toxoplasma gondii)。在另一个具体的实施方式中，本发明的组合物用于与下列物质的任意组合：LEUCOVORIN(Immunex/Amgen Inc.)和/或NEUPOGEN(Amgen Inc.)用于预防性治疗或预防机会性细菌感染。

在另一个实施方式中，本发明的组合物包含抗生素制剂。可给予的抗生素制剂包括但不限于，阿莫西林，β-内酰胺酶，氨基糖苷类，β内先胺(糖肽)，β内酰胺酶，氯洁霉素，氯霉素，头孢霉素，环丙沙星，红霉素，氟喹诺酮(fluoroquinolones)，大环内酯物，甲硝哒唑，盘尼西林，喹诺酮(quinolone)，雷帕霉素，利福平，链霉素，sultonamide，四环素，甲氧苄啶(trimtethoprim)，甲氧苄啶-磺胺甲基异恶唑(sulfamethoxazole)，以及万古霉素。

根据实施方式，本发明的组合物包括免疫刺激物。可与本发明的治疗剂联用的免疫刺激物包括但不限于左旋咪唑(例如ERGAMISOL)，异丙肌苷(例如OSIPLEX)，干扰素(例如，干扰素α)和白细胞介素(例如IL-2)。

根据实施方式，本发明的组合物包含免疫抑制剂。可与本发明的组合物联用的免疫抑制物包括但不限于，类固醇，环孢霉素，环孢霉素类似物，环磷酰胺甲基强的松，强的松，硝基咪唑硫嘌呤，FK-506，15-脱氧精胍菌素(deoxyspergualin)，以及通过抑制应答性T细胞而发挥作用的其它免疫抑制剂。可与本发明的组合物联用的其它免疫抑制剂包括但不限于，氢化波尼松，氨甲蝶呤，肽咪哌啶酮，甲氧补骨脂素，雷帕霉素，来氟米特(leflunomide)，咪唑立宾(mizoribine)(BREDNIN)(Boehringer-IngelheimInc.)，布喹那(brequinar)，脱氧精胍菌素，和azaspirane(SKF105685)，ORTHOCLONEOKT(OrthoBiotech Products L.P.)3(莫罗莫那(muromonab)-CD3)，SANDIMMUNE，NEORAL(Novartis Inc.)，SANGDYA(Sangstat MedicalCorp.)环孢霉素)，PROGRAF(Fujisawa Healthcare Inc.)(FK506，他克莫司(tacrolimus))，CELLCEPT(Hoffmann-La Roche)(霉酚酸吗啉乙酯(mycophenolate motefil)，其活性代谢物是霉酚酸(mycophenolicacid))，IMURAN(Glaxo SmithKline)(硝基咪唑硫嘌呤)，肾上腺糖皮质激素(glucocorticosteroids)，肾上腺皮质激素如DELTASONE(UpJohn/Pharmacia)(强的松)和HYDELTRASOL(DuPont，Merck & Co.Inc.)(氢化波尼松)，FOLEX(Adria Laboratories，Inc.)和MEXATE(Lederle Laboratories Inc.)氨甲蝶呤(methotrxate))，OXSORALEN-ULTRA(ICN Pharmaceuticals，Inc.)(甲氧沙林(methoxsalen))和RAPAMUNE(Wyeth Inc.)(西罗莫司(sirolimus))。在一个具体的实施方式中，免疫抑制剂可用于防止器官或骨髓移植的排斥。

根据实施方式，本发明的组合物包括静脉内免疫球蛋白制剂。可给予的静脉内免疫球蛋白制剂包括但不限于，GAMMAR，IVEEGAM(Baxter Inc.)，SANDOGLOBULIN(Novartis，Inc.)GAMMAGARD(Baxter Corp.)S/D，ATGAM(Pharmacia/Upjohn/Pfizer)，(抗胸腺细胞免疫球蛋白)和GAMIMUNE(Bayer Inc.)。一个具体的实施方式中，在移植治疗(如骨髓移植)中将本发明的组合物与静脉内免疫球蛋白制剂联合给药。

在选择的患有毛细胞白血病、卡巴氏(Kaposi′s)肉瘤、人乳头瘤病毒、和呼吸道病毒的患者中正在进行重组形式的内源干扰素-α的研究。它主要用于乙型肝炎和丙型肝炎。带有可检测病毒负荷及肝功能检测异常的活性HBV或丙型肝炎病毒(HCV)患者可能从这项治疗中受益。

在带有HBV的符合合适指标的患者中，2.5-5百万U sc或IM，持续4-6mo给药，可在25-40％的患者中从血清中清除HBV DNA和乙型肝炎e抗原(HBeAg)，并且改善肝功能检查异常和肝组织学。对于慢性丁型肝炎，需要更高的剂量，即在9-10百万U 3次/周的范围内，并且仍旧常常复发。对于HCV，3-6百万U，持续3-6mo，3次/周持续6-12mo给药通常在10-25％的患者中降低HCV的RNA水平，中度改善肝功能检查和肝组织学。不良作用包括通常在第一次注射后7-12小时开始的并持续可长达12小时的发烧、冷战、虚弱和肌痛。在HCV中所用的较低剂量可降低不良作用的严重性，但是曾经报道肝炎的加重。病毒唑加干扰素用于HCV显示具有前景。

治疗性给药

主题方法包括给予患者本发明的组合物。根据本发明的实施方式，将SARS相关炎性细胞因子给予SARS患者。根据另一个实施方式，将TNF抑制剂给予SARS患者。如本文所述，本发明的抗TNF重组受体，mAb，反义寡核苷酸肽，其片段和衍生物，以及小分子可作为单独的治疗剂给药或与其它治疗剂联合给药。它们可单独给药，但一般与药学上可接受的运载体一起给药，这些运载体是基于所选的给药途径和标准的药学操作来选择的。

当然，施用的剂量将根据已知的因素而变化，这些因素如具体制剂的药效学特征以及其给药的方式和途径；接受者的年龄、健康情况和体重；症状的性质和程度，同时施用的治疗种类，治疗的频度以及所追求的效果。通常活性成分的日剂量可为约0.01-100毫克每千克体重。一般为1.0-5，优选为1-10毫克每千克体重每天，分为每天1-6次剂量给药或以缓释形式，对于获得所需的结果是有效的。

作为非限制性的例子，可以以日剂量的形式用本发明抗-TNF肽、单克隆嵌合和/或常规抗体来提供SARS治疗，日剂量为0.1-100mg/kg，如0.5，0.9，1.0，1.1，1.5，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，40，45，50，60，70，80，90或100毫克/千克/每天，在以下至少一天给药：1，2，3，4，5，6，7.8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38.39，或40，或者，在以下至少一周给药：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20，或其任何组合，用单剂量或每24，12，8，6，4或2小时的分剂量，或其任何组合。

因为TNF的循环浓度倾向于极低，在非脓毒个体中约在10pg/ml的范围，在脓毒患者中达到约50pg/ml，在脓毒综合征中超过100pg/ml(Hammerle，A.F.等，1989，见下)或者只在TNF介导的病理学区域可检测到，因此，优选使用高亲和力和/或强力的体内TNF抑制性和/或中和性抗体，其片段或区域，用于TNF免疫检测和TNF介导的病理的治疗。优选地，这些抗体，片段或区域，对hTNF-α的亲和力(表示为Ka)至少为10⁸M^-1，更优选地至少为10⁹M^-1-，如10⁸-10¹⁰M^-1，5×10⁸M^-1，8×10⁸M^-1，2×10⁹M^-1，4×10⁹M-¹，6×10⁹M-¹，8×10⁹M-¹，或在这之中的任何范围或数值。

对于人类治疗性用途，优选的是本发明的具有强力体内TNF-α抑制性和/或中和性活性的高亲和力鼠和嵌合抗体，片段，区域和衍生物，它们可阻断TNF诱导的IL-6的分泌。对于人类治疗性应用，还优选体内、原位和体外阻断TNF诱导的促凝血活性(包括阻断TNF诱导的细胞粘附分子如ELAM-I和ICAM-I的表达以及阻断TNF促有丝分裂活性)的高亲和力鼠和嵌合抗-TNFα抗体其片段、区域和衍生物。

本发明组合物优选包括药学上可接受的运载体。合适的药学上可接受的运载体和/或稀释剂包括任何和所有的常规溶剂、分散介质、填料、固体运载体、液体溶液、包衣、抗细菌和抗真菌制剂、等渗和吸收延迟剂等。合适的药学上可接受的运载体包括，例如，以下物质的一种或多种：水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，及其组合。药学上可接受的运载体还可含有少量的辅助物质如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，它们可增加组合物的保存期或增强其效力。药学上可接受的运载体的制备和使用是本领域所熟知的。除非任何常规的介质或制剂与活性成分不相容，否则均可考虑这些物质在本发明组合物中的应用。

本发明的组合物可通过常规途径给药，包括，肠胃外，例如，通过皮下或肌肉内注射，例如，以及口服或鼻内给药。Wolff等和Sedegah等描述了用于肌肉内注射的方法。其它给药方式采用口服剂型、肺部剂型、栓剂和透皮施用，例如，但不限于，口服剂型，例如，包括那些通常采用的赋形剂，例如，药学级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬酯酸镁、糖精钠、纤维素、镁、碳酸盐等，不限于此。

适于内部给药的剂量形式(组合物)一般含有约0.1-500毫克活性成分每单位。在这些药物组合物中，基于组合物的总重量，活性成分的通常存在量约为0.5-95％的重量百分比。

对于肠胃外给药，抗-TNF肽或抗体可以和药学上可接受的肠胃外载体一起配成溶液、悬浮液、乳液或冻干粉的形式。这些载体的例子是水、盐水、Ringer氏溶液、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。也可使用脂质体和非液体载体如固化油。载体或冻干粉可含有维持等渗透压的添加剂(如氯化钠、甘露醇)和维持化学稳定性的添加剂(如缓冲液和防腐剂)。用常规使用的技术给配方物灭菌。

合适的药学运载体在最新版的雷明顿药物科学(Remington′sPharmaceutical Sciences)A.Osol中有描述，雷明顿药物科学是本领域的标准参考文献。本发明的组合物和方法可与其它疗法如支持性疗法联合使用，例如，根据本发明的实施方式。

根据本发明的实施方式，本发明的组合物可与静脉内(IV)补液一起施用给患者。例如，本发明的组合物可包含在静脉内(IV)包中或注射入静脉内(IV)线的锁(lock)中。

在另一个实施方式中，本发明的组合物可与氧或其它此类治疗一起施用。例如，本发明的组合物可通过喷雾器给药。

例如，通过将1.5％(重量百分比)的活性成分溶解在0.9％的氯化钠溶液中来制备适于注射给药的肠胃外组合物。

任何有效的给药途径都可用于治疗性给予TNF抑制剂。如果注射给药，该抑制剂可通过以下途径给药，例如，通过关节内，静脉内，肌肉内，病灶内，腹膜内或皮下途径，通过丸剂注射或连续灌注。其它合适的给药方法包括从植入物缓释、气溶胶吸入、滴眼液、口服制剂，包括丸剂、糖浆、止咳糖或口香糖，以及局部制剂如洗液、凝胶、喷雾、药膏或其它合适的技术。或者，蛋白质类的TNF抑制剂，如可溶性TNFR，可通过植入表达该蛋白的培养的细胞来给予。当该抑制剂与一种或多种其它生物学活性化合物联合给予时，这些可通过相同或不同的途径给予，可同时、分开或连续给予。

TNFR:Fc或其它可溶性TNFR或其它TNF抑制剂优选以生理上可接受的组合物形式来给药，该组合物含有与生理上可接受的运载体、赋形剂或稀释剂配合的纯化的重组蛋白。这类运载体在其使用的剂量和浓度上对接受者无毒性。通常，制备这些组合物必须将TNF-α拮抗剂与缓冲液，抗氧化剂如抗坏血酸、低分子量多肽(如具有少于10个氨基酸的多肽)、蛋白、氨基酸、碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖或糊精)、螯合剂如EDTA、谷胱甘肽以及其它稳定剂和赋形剂相组合。中性缓冲的盐水或与同种血清白蛋白混合的盐水是示例性的合适的稀释剂。根据合适的工业标准，也可添加防腐剂，如苯甲醇。TNFR:Fc优选用合适的赋形剂溶液(如蔗糖)作为稀释剂配方成冻干物。合适的组分在其使用的剂量和浓度上对接受者无毒性。在药物配方中可用组分的其它例子参见雷明顿药物科学，第16版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，1980。

可在标准剂量试验中确定合适的剂量，并且根据所选的给药途径而变化。给药的量和频率将取决于这样一些因素，如被治疗的适应症的性质和严重性，所需的反应，患者的年龄和状况等。

在本发明的一个实施方式中，每周一次给予TNFR:Fc来治疗各种本文所述的各种医学疾病，在另一个实施方式中，每周至少给药两次，在另一个实施方式中，每周至少给药三次。成年患者是18岁或年龄更大的人。如果注射给药，每个成人剂量的TNFR:Fc有效量范围为1-20mg/m²，优选约5-12mg/m²。或者，可给予flat剂量，其量的范围为5-100毫克/剂量。通过皮下给药的Flat剂量的示例性剂量范围是5-25毫克/剂量，25-50毫克/剂量，50-100毫克/剂量。在本发明的一个实施方式中，通过给予含有25毫克/剂量或含有50毫克/剂量的可接受用于注射的制剂来治疗下述各种适应症。可反复施用20毫克或50毫克的剂量。如果不用注射给药途径，则根据标准的医学操作对剂量进行合适的调整。在很多情况下，通过在至少3周的时间内每周1-3次注射约25毫克剂量的TNFR:Fc，或每周1-2次注射50毫克剂量的TNFR:Fc至少3周，患者状况可得到改善，虽然可能需更长时间的治疗才能引起诱导所需程度的改善。

对于儿科患者(4-17岁)，可用任何合适的治疗方案。优选地，治疗方案包括皮下注射0.4mg/kg，最大剂量可达25mgTNFR:Fc，每周一次或多次皮下注射给药。

本发明还包括给予可溶性TNFR(如TNFR:Fc)的同时，向同一患者联合给予一种或多种其它药物，各药物根据适合于该药物的方案来给药。“同时给予”包括用组合中的组分同时或连续治疗，以及交替给予药物的方案，或者一种药物长期给予而其它药物则间歇性地给药。可在同一或分开的组合物中、用相同或不同的给药途径给予。可同时给予的药物的例子包括但不限于，抗病毒药、抗生素、止痛剂、皮质类固醇、炎性细胞因子拮抗剂、DMARD和非类固醇消炎药。可与对象TNF-α抑制剂如TNFR:Fc联用的DMARD包括硝基咪唑硫嘌呤，环磷酰胺，环孢霉素，羟化氯喹硫化物，氨甲蝶呤，来氟米特，二甲胺四环素，青霉胺，水杨酸偶氮磺胺吡啶，金化合物如口服金，硫代苹果酸金钠和金硫葡糖。此外，TNFR:Fc可与第二TNF-α拮抗剂组合，包括抗TNF-α抗体或TNFR，TNF衍生的作为TNF-α竞争性抑制剂的肽(如美国专利No.5,795,859或美国专利No.6,107,273中所述)，非etanercept的TNFR-IgG融合蛋白(如含有p55TNF-α受体细胞外部分的蛋白)，非IgG融合蛋白的可溶性TNFR，或降低内源TNF-α水平的其它分子如TNF-α转化酶抑制剂(见例如，美国专利No.5,594,106)，或如上所述的任何小分子或TNF-α抑制剂，包括己酮可可碱或肽咪哌啶酮。

如果抗TNF-α抗体用作TNF-α抑制剂，优选的剂量范围是0.1-20mg/kg，更优选地是1-10mg/kg。另外的对于抗-TNF-TNF-α抗体放入优选剂量是0.75-7.5mg/kg体重。优选人化的抗体，即，只有抗体分子的抗原结合区来自非人来源。用于治疗本文所述疾病的示例性人化抗体是英利昔单抗(infliximab)(Centocor以REMICADE出售(Centocor Inc.)，它是嵌合IgGlκ单克隆抗体，分子量约为149,100道尔顿，英利昔单抗由人恒定区和鼠可变区组成，特异性结合人TNFα。其它合适的抗-TNF-α抗体包括人化的抗体D2E7和CDP571，以及EP0 516 785 B1，美国专利No.5,656,72，EP 0492 448 A1中描述的抗体。这些抗体可注射施用或静脉内给药。

在本发明一个优选的实施方式中，用其它细胞因子或细胞因子抑制剂来联合治疗本文所述的可用TNF-α抑制剂治疗的各种医学疾病。例如，所施用的含有可溶性TNFR如TNFR:Fc的组合物还可含有抑制其它炎性细胞因子与其受体相互作用的化合物。与TNFR:Fc联用的细胞因子抑制剂的例子包括，例如TGF-β，II-6或II-8的拮抗剂。TNF-α抑制剂如TNFR:Fc也可与细胞因子GM-CSF，IL2和蛋白激酶A I型联合给药以在接受抗反转录病毒治疗的HIV感染患者中增强T细胞增殖。此外，TNF-α抑制剂可与IL-13抑制剂联合施用以治疗霍奇金氏(Hodgkin′s)病。

用于治疗本文所述疾病的其它组合包括TNFR:Fc与抗病毒的化合物同时给予。

此外，该主题发明提供用于需要治疗的人类患者的方法，该方法包括给予病人治疗有效量的TNF-α抑制剂和IL-6抑制剂。

本发明还涉及所公开的TNF-α抑制剂如TNFR:Fc在制备用于SARS预防性或治疗性治疗中的用途。

本发明还提供抗-TNF化合物和包含抗-TNF抗体(Ab)和/或抗-TNF肽的组合物，它们在体外、原位和/或体内抑制和/或中和TNF的生物学活性，能特异得结合对人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)和/或人肿瘤坏死因子β(hTNF，β)的中和性表位。这些抗-TNF Ab或肽在用于治疗SARS中有用处。

本发明的抗-TNF化合物和组合物，因其具备可对表面结合有TNF的细胞介导产生抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒(CDC)的优点，因此可将其用于治疗性功效。关于这些活性，可利用内源来源或外源来源的效应细胞(对于ADCC)或补体成分(对于CDC)。本发明的鼠和嵌合抗体、片段和区域，它们的片段和衍生物可作为免疫耦合物进行治疗性应用(综述见Dillman，R.O.，Aun.Int.Med.111：592-603(1989))。可将肽或Ab与细胞毒蛋白耦合，包括但不限于，蓖麻毒素-A，假单胞菌毒素和白喉毒素。与抗体或其它配体或肽耦合的毒素是本领域所熟知的(见，例如，Olsnes，S.等，Immunol.Today 10：291-295(1989))。植物和细菌毒素通常通过破坏蛋白合成机器来杀伤细胞。

可将本发明的抗-TNF化合物和组合物与其它类型的治疗配体耦合，包括但不限于，放射性核、治疗剂、细胞毒制剂和药物。可与抗体耦合并在体内输送到抗原位点的放射性核的例子包括²¹²Bi，¹³²I，¹⁸⁶Re和⁹⁰Y，并不作为彻底详尽的列举。放射性核通过局部照射细胞来实现其细胞毒作用，造成各种细胞内损伤；如放射治疗领域所知。

可与抗-TNF肽和/或抗体耦合从而用于体内治疗的细胞毒药物包括但不限于，道诺霉素、阿霉素、氨甲蝶呤和丝裂霉素C。细胞毒药物干扰关键的细胞内过程，包括DNA、RNA和蛋白质的合成。对于此类本领域熟知的药物及其作用机制的描述，参见Goodman等，Goodman和Gilman，疗法的药理学基础(THEPHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS)，第8版，MacmillanPublishing Co.，1990。

抗-TNF化合物和组合物，如本发明的肽和/或抗体，可与其它单克隆或常规制备的嵌合抗体、片段和区域，或与淋巴因子或造血生长因子等有利地联用，用于增加与抗体相互作用的效应细胞的数目或活性。

抗-TNF化合物和组合物，如本发明的肽和/或抗体、片段或衍生物也可与TNF治疗联用以阻止不希望出现的TNF的副作用。进来的癌症治疗方法已包括直接将TNF给予癌症患者，或用淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞对癌症患者进行免疫治疗(Rosenberg等，New Eng.J.Med.313：1485-1492(1985))或肿瘤渗透性淋巴细胞(TIL)进行免疫治疗(Kurnick等(Clin.Immunol Immunopath.38：367-380(1986)；Kradin等，Cancer Immunol.lmmunother.24：76-85(1987)；Kradin等，Transplant.Proc.20：336-338(1988))。正在用已被TNF基因转染以产生大量TNF的修饰过的LAK细胞或TIL进行试验。这些治疗方法可能伴随有本文所述的以及相关领域已知的由于TNF的多效性作用而引起的多种不希望产生的副作用。根据本发明，可通过用本发明的抗体、片段或衍生物对接受TNF或产生大量TIL细胞的对象进行同时治疗来降低这些副作用。有效剂量如上所述。剂量水平需要根据给予的TNF或生产TNF细胞的剂量加以调整，从而在不阻抑TNF主要抗肿瘤效果的前提下阻止副作用的产生。本领域的一般技术人员不需要过多的试验即可知道如何确定这样的剂量。

筛选方法

本发明考虑用于鉴定SARS相关炎性细胞因子抑制剂的筛选方法。根据实施方式，筛选方法包括：在随机安慰剂对照研究中，将候选的SARS相关炎性细胞因子抑制剂给予一组受SARS相关传染原感染的患者；并监测该候选SARS相关炎性细胞因子抑制剂的效力。优选地，候选SARS相关炎性细胞因子抑制剂是可溶性重组SARS相关炎性细胞因子受体，SARS相关炎性细胞因子的抗体，影响SARS相关炎性细胞因子活性的小分子，SARS相关的反义寡核苷酸或这些的组合。基于本文提供的指导，本领域的技术人员将能以这种方式容易地常规鉴定这样的化合物。

根据本发明另一个实施方式，用于筛选治疗SARS患者的有效组合物的方法包括：在随机安慰剂对照研究中，将候选的TNF抑制剂给予一组受SARS相关传染原感染的患者；并监测该候选TNF抑制剂的效力。优选地，候选TNF抑制剂是可溶性重组TNF受体，TNF的抗体，影响TNF活性的小分子，TNF反义寡核苷酸或这些的组合。基于本文提供的指导，本领域技术人员将能以这种方式容易地常规鉴定这样的化合物。

根据本发明的另一个实施方式，用于筛选治疗SARS患者的有效组合物的方法包括：在随机安慰剂对照研究中，将候选的抗病毒化合物给予一组受SARS相关传染原感染的患者；并监测该候选抗病毒化合物的效力。优选地，该候选的抗病毒化合物是候选的抗冠状病毒化合物。该候选的抗冠状病毒化合物优选是抗病毒的抗体(如单克隆、多克隆、嵌合等)，病毒RNA依赖性RNA多聚酶抑制剂，病毒编码蛋白酶的抑制剂，它影响病毒RNA依赖性RNA多聚酶的加工，冠状病毒从受感染细胞出芽或释放的抑制剂，如影响红血球凝聚素-酯酶活性的抑制剂，病毒结合特异性细胞表面受体的抑制剂(如hAPN结合到HcoV-229E的抑制剂)，受体诱导的病毒刺突糖蛋白中构象改变的抑制剂，它与病毒进入有关，或这些的组合。更优选地，该候选的抗病毒化合物是抗SARS相关病毒(如SARS-CoV)的单克隆抗体。基于本文提供的指导，本领域技术人员将能以这种方式容易地常规鉴定治疗SARS有效的抗病毒化合物。

具体实施方式的描述将完全地揭示本发明的一般性质，使其他人通过利用本领域技术的知识(包括本文引用的参考文献的内容)，不需要过多的试验，就可以容易地修改和/或改造这些具体的实施方式将其用于各种用途，而不脱离本发明的总体构思。因此，基于本文提供的教导和指导，这些改造和修改都应在公开的实施方式的等价物的意义和范围之内。还应理解的是，本文的措辞和术语是用于描述目的而非限制目的，这样本领域技术人员应根据本文的教导和指导，结合本领域一般技术人员的知识来解释本说明书的术语和措辞。

仅用常规的试验，基于本文提供的指导，本领域一般技术人员将会知道，或能够确定，本文描述的本发明具体实施方式的许多等价物。将下面的实施例纳入本文以说明本发明的优选实施方式。本领域技术人员应理解，下面实施例中公开的技术代表本发明人发现的在本发明实施中可很好发挥功能的技术，因此可认为其组成了实施本发明的优选模式。然而，本领域技术人员应理解，根据本公开的内容，可在公开的具体实施方式中进行很多变化而在不脱离本发明的精神和范围的前提下仍然获得相似或类似的结果。以阐释而非限制的方式，提供下面的实施例。

实施例

实施例1：可溶性重组TNFR治疗SARS的体内功效

在随机对照研究中检测了可溶性重组TNFR。将1、5、12或20mg/m²单剂量的TNFR:Fc给予实验室确证为受SARS-CoV感染的50个成年患者(即18岁或年龄更大)。另外60个患者将接受100毫克TNFR:Fc，然后接受安慰剂或1、5、12或20毫克TNFR:Fc。TNFR:Fc作为单剂量注射给药。在灌输前、灌输中、和灌输后28天内定期对患者进行临床评估、检测生命特征和实验室参数。

临床监测

灌输后监测患者24小时，监测其血液动力学变化、发烧或其它不良情况。临床反应研究包括以下参数：

在灌输期间和灌输后的间歇，每15-30分钟记录生命特征。在筛选时以及疗程结束时进行完全的身体检查。此外，用标准实验室检查监测患者，包括完全血计数，补体的C3和C4成分，IgG，IgM和IgA，血清电解质，肌氨酸酐，尿素，碱性磷酸酶，天冬氨酸转氨酶和总胆红素。在各评价点还进行尿分析和培养以确定存在的TNF和/或SARS-CoV的水平。

反应评价

在试验的1，2，3，4，6和8周评价患者对治疗的反应。该评价由同一观察者在0700和13小时之间进行。后续的临床评价包括：体温，呼吸窘迫的主观感觉，呼吸状态的客观分析(即肺部评估)，一段固定时间内的咳嗽频度，放射线学检查和血清检查。此外，以5-分评分尺度(更坏、无反应、轻度反应、反应良好、反应优良)来记录患者反应的总体评估情况。对免疫荧光呈阳性的血清筛选的抗体。

细胞因子试验

用WEHI 164克隆13细胞毒试验检测血清中的生物活性TNF(Espevik等，J.Imm.Methods95：99-105(1986)。用商业的免疫试验(Medgenix Diagnostics，SA，比利时)和单抗夹心ELISA来检测血清中的总IL-6。在4℃用3ug/ml浓度的单克隆抗体LNI 314-14包被微孔滴定板18小时，用溶于0.1M磷酸缓冲盐水(pH 7.2)的3％牛血清白蛋白封闭。一式两份将未稀释的血清或标准品(重组hIL6，0-8.1ug/ml)加入孔中，4℃呼育18小时。37℃条件下与单克隆抗体LNI 110-14孵育90分钟，然后在37℃条件下与生物素标记的山羊抗-鼠IgG2b孵育90分钟后，应该可检测到结合的IL-6。(Southern Biotechnology，Birmingham，Ala.。该试验用链菌素碱性磷酸酶(Southena Biotechnology)显影，对硝基苯磷酸酯作为底物，在405nm处对光学密度进行读数。

疾病活性

根据典型的SARS临床评估来评价对疾病活性各临床评估的反应模式。治疗后，临床评估表现出有所改善。呼吸窘迫从开始时的中数值为2天减少到6周。类似地，在24小时到3周时间内，体温和其它流感类似综合征都有改善。

分析各单独患者的反应数据。虽然该研究主要设计用于评价TNF抑制性治疗的短期效果，但对于那些跟踪时间足够长的患者也取得了后续临床和实验室数据。在这些患者中，将反应的持续时间定义为在所选择的活性检测中，20％(或更高的)平均改善的持续时间。将TNFR:Fc灌输治疗(每次10m/kg)的患者的临床和实验室数据与用4次灌输(每次5mg/kg)治疗的患者进行比较，比较结果用于说明反应的速度或程度的差异。在给予合适剂量TNF抑制剂的患者中，观察到成人呼吸窘迫综合征(ARDS)至少降低约20％，包括慢性肺功能，扩散能力和肺部依从性各项指标，而且患者的奈受性也很合适。还观察到死亡率约有20％的降低。

免疫研究和细胞因子

用WEHI 164克隆13细胞毒性试验(Espevik等，J.Imm.Methods 95：99-105(1986))检测来自患者的血清中生物活性TNF的存在情况。此外，因为CRP和SAA的产生被认为很大部分是受IL-6调控的，所以还用2个不同的试验，Medgenix试验和ELISA(这两个试验检测总IL-6)来检测该细胞因子的血清水平，。

实施例II-小分子抑制剂治疗SARS的体内功效

在随机对照研究中，患有SARS(实验室确证为受SARS-CoV感染)的患者按下面提出的治疗来给药。将100、200、300或400毫克肽咪哌啶酮单剂量给予50个带有SARS-CoV的患者。另外60个患者接受100毫克肽咪哌啶酮，然后接受安慰剂或肽咪哌啶酮100、200、300或400毫克/千克体重。肽咪哌啶酮口服给药。在灌输前、灌输中、和灌输后28天内定期对患者进行临床评估、检测生命特征和实验室参数。

临床监测

在灌输期间和灌输后24小时内监测患者，监测其血液动力学变化、发烧或其它不良情况。临床反应研究包括以下参数：在给药期间和给药后的间歇，每15-30分钟记录生命特征。在筛选时以及疗程结束时进行完全的身体检查。此外，用标准实验室检查监测患者，包括完全血计数，补体的C3和C4成分，IgG，IgM和IgA，血清电解质，肌氨酸酐，尿素，碱性磷酸酶，天冬氨酸转氨酶和总胆红素。在各评估点还进行尿分析和培养以确定存在的TNF和/或冠状病毒的水平。

反应评价

在试验的1，2，3，4，6和8周评估患者对治疗的反应。该评估由同一观察者在0700和1300小时之间进行。后续进行的临床评估包括：体温，呼吸窘迫的主观感觉，呼吸状态的客观分析(即肺部评估)，一段固定时间内的咳嗽频度，放射线学检查和血清检查。此外，以5-分评分尺度(更坏、无反应、轻度反应、反应良好、反应优良)来记录患者反应的总体评估情况。对免疫荧光呈阳性的血清筛选抗体。

细胞因子试验

疾病活性

根据典型的SARS临床评估来评价对疾病活性各临床评估的反应模式。用酞咪哌啶酮治疗后，临床评估表现出有所改善。呼吸窘迫从开始时的中数值为2天减少到6周。类似地，在24小时到3周时间内，体温和其它流感类似综合征都有改善。

分析各单独患者的反应数据。虽然该研究主要设计用于评价TNF抑制性治疗的短期效果，但对于那些跟踪时间足够长的患者也取得了后续临床和实验室数据。在这些患者中，将反应的持续时间定义为在所选择的活性检测中，20％(或更高的)平均改善的持续时间。将酞咪哌啶酮灌输治疗(每次10m/kg)的患者的临床和实验室数据与用4次灌输(每次5mg/kg)治疗的患者进行比较，比较结果用于说明反应的速度或程度的差异。在施用合适剂量TNF抑制剂的患者中，观察到成人呼吸窘迫综合征(ARDS)至少降低约20％，包括慢性肺功能，扩散能力和肺部依从性各项指标，而且患者的奈受性也很合适。还观察到死亡率约有20％的降低。

免疫研究和细胞因子

现在已充分描述了本发明，对本领域的普通技术人员显而易见的是，可对其进行很多改变和修改而不脱离本文所述的本发明的精神或范围。前面描述了本发明的优选实施方式以及多种可能的替换。然而，这些实施方式只是为了举例，本发明并不局限于此。

Claims

1.一种组合物，该组合物包含：在药学上可接受的运载体中的治疗有效剂量的SARS相关炎性细胞因子抑制剂。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述SARS相关炎性细胞因子抑制剂是可溶性重组SARS相关炎性细胞因子受体，SARS相关炎性细胞因子的抗体，影响SARS相关炎性细胞因子活性的小分子，SARS相关的反义寡核苷酸或这些的组合。

3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述SARS相关炎性细胞因子抑制剂是TNF抑制剂。

4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂是TNF重组受体(TNFR)。

5.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂是TNF抗体。

6.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂是TNF-α抑制剂。

7.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂是TNF-β抑制剂。

8.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述SARS相关炎性细胞因子抑制剂是可溶性重组受体。

9.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述抑制剂是SARS相关炎性细胞因子的抗体。

10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述抗体是单克隆抗体。

11.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述抗体是多克隆抗体。

12.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述抗体是嵌合抗体。

13.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述肿瘤坏死因子抑制剂是影响TNF活性的小分子。

14.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述小分子通过干扰TNF结合到TNFR来影响肿瘤坏死因子(TNF)的活性。

15.如权利要求1所述的组合物，在所述药学上可接受的运载体中还包括抗病毒化合物。

16.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述抗病毒化合物是抗冠状病毒化合物。

17.如权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述抗冠状病毒化合物是病毒RNA依赖性RNA多聚酶抑制剂，病毒编码蛋白酶的抑制剂，它影响病毒RNA依赖性RNA多聚酶的加工，冠状病毒从受感染细胞出芽或释放的抑制剂，它影响红血球凝聚素-酯酶的活性，病毒结合特异性细胞表面受体的抑制剂，受体诱导的病毒刺突糖蛋白中的构象改变抑制剂，它与病毒进入有关，或这些的组合。

18.如权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述抗冠状病毒化合物是病毒RNA依赖性RNA多聚酶抑制剂。

19.如权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述抗冠状病毒化合物是病毒编码蛋白酶的抑制剂，它影响病毒RNA依赖性RNA多聚酶的加工。

20.如权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述抗冠状病毒化合物是冠状病毒从受感染细胞出芽或释放的抑制剂。

21.如权利要求20所述的组合物，其特征在于，所述冠状病毒从受感染细胞出芽或释放的抑制剂影响红血球凝聚素-酯酶的活性。

22.如权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述抗冠状病毒化合物作为病毒结合特异性细胞表面受体的抑制剂而发挥作用。

23.如权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述抗冠状病毒化合物抑制hAPN结合到HCoV-229E。

24.如权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述抗冠状病毒化合物作为受体诱导的病毒刺突糖蛋白构象改变的抑制剂而发挥作用，其与病毒进入有关。

25.一种组合物，该组合物包含：可溶性重组SARS相关炎性细胞因子受体，SARS相关炎性细胞因子的抗体，影响SARS相关炎性细胞因子活性的小分子，SARS相关的反义寡核苷酸或这些的组合。

26.如权利要求25所述的组合物，还包含病毒RNA依赖性RNA多聚酶抑制剂，病毒编码蛋白酶的抑制剂，它影响病毒RNA依赖性RNA多聚酶的加工，冠状病毒从受感染细胞出芽或释放的抑制剂，冠状病毒从受感染细胞出芽或释放的抑制剂影响红血球凝聚素-酯酶的活性，病毒结合特异性细胞表面受体的抑制剂，受体诱导的病毒刺突糖蛋白构象改变的抑制剂，它与病毒进入有关，或这些的组合。

27.一种组合物，该组合物包含：选自以下的第一物质：可溶性重组TNF受体，TNF的抗体，影响TNF活性的小分子，TNF的反义寡核苷酸及其组合；和选自以下的第二物质：病毒RNA依赖性RNA多聚酶抑制剂，病毒编码蛋白酶的抑制剂，它影响病毒RNA依赖性RNA多聚酶的加工，冠状病毒从受感染细胞出芽或释放的抑制剂，冠状病毒从受感染细胞出芽或释放的抑制剂影响红血球凝聚素-酯酶的活性，病毒结合特异性细胞表面受体的抑制剂，受体诱导的病毒刺突糖蛋白构象改变的抑制剂，它与病毒进入有关，以及这些的组合。

28.一种组合物，该组合物的制备方法包括：在随机安慰剂对照研究中，将候选的SARS相关炎性细胞因子抑制剂给予一组受SARS相关传染原感染的患者；监测该候选SARS相关炎性细胞因子抑制剂的效力；和将治疗有效量的如此鉴定的SARS相关炎性细胞因子抑制剂与药学上可接受的运载体包括在组合物中。

29.如权利要求28所述的组合物，其特征在于，所述随机安慰剂对照研究是盲法安慰剂对照研究。

30.如权利要求28所述的组合物，其特征在于，所述随机安慰剂对照研究是双盲法安慰剂对照研究。

31.如权利要求28所述的组合物，其特征在于，所述候选SARS相关炎性细胞因子抑制剂是可溶性重组SARS相关炎性细胞因子受体，SARS相关炎性细胞因子的抗体，影响SARS相关炎性细胞因子活性的小分子，SARS相关的反义寡核苷酸或这些的组合。

32.一种组合物，该组合物的制备方法包括：在随机安慰剂对照研究中，将候选的肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂给予一组受严重急性呼吸道综合征(SARS)相关传染原感染的患者；监测该候选TNF抑制剂的效力；和将治疗有效量的如此鉴定的TNF抑制剂与药学上可接受的运载体包括在组合物中。

33.如权利要求32所述的组合物，其特征在于，所述随机安慰剂对照研究是盲法安慰剂对照研究。

34.如权利要求32所述的组合物，其特征在于，所述随机安慰剂对照研究是双盲法安慰剂对照研究。

35.如权利要求32所述的组合物，其特征在于，所述候选TNF抑制剂是可溶性重组TNF因子受体，TNF的抗体，影响TNF因子活性的小分子，TNF的反义寡核苷酸或这些的组合。

36.权利要求1-35任一项所述的组合物在药物中的应用，该药物能有效地对抗严重急性呼吸道综合征(SARS)。

37.权利要求1-35任一项所述的组合物在药物中的应用，该药物能有效地对抗SARS相关冠状病毒(SARS-CoV)。

38.一种治疗患有严重急性呼吸道综合征(SARS)的患者的方法，该方法包括：给予该患者治疗有效剂量的SARS相关炎性细胞因子抑制剂。

39.如权利要求38所述的组合物，其特征在于，所述SARS相关炎性细胞因子抑制剂是可溶性重组SARS相关炎性细胞因子受体，SARS相关炎性细胞因子的抗体，影响SARS相关炎性细胞因子活性的小分子，SARS相关的反义寡核苷酸或这些的组合。

40.一种治疗患有严重急性呼吸道综合征(SARS)的患者的方法，该方法包括：给予该患者治疗有效剂量的TNF抑制剂。

41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述TNF抑制剂是可溶性重组TNF受体，TNF的抗体，影响TNF活性的小分子，TNF的反义寡核苷酸或这些的组合。

42.一种筛选SARS相关炎性细胞因子抑制剂的方法，该方法包括：在随机安慰剂对照研究中，将候选的SARS相关炎性细胞因子抑制剂给予一组受严重急性呼吸道综合征(SARS)相关传染原感染的患者；并监测该候选SARS相关炎性细胞因子抑制剂的效力以鉴定治疗上有效的SARS相关炎性细胞因子。

43.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述候选SARS相关炎性细胞因子抑制剂是可溶性重组SARS相关炎性细胞因子受体，SARS相关炎性细胞因子的抗体，影响SARS相关炎性细胞因子活性的小分子，SARS相关的反义寡核苷酸或这些的组合。

44.一种筛选可有效治疗SARS患者的组合物的方法，该方法包括：在随机安慰剂对照研究中，将候选的肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂给予一组受SARS相关传染原感染的患者；并监测该候选TNF抑制剂的效力以鉴定治疗上有效的TNF。

45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述候选肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂是可溶性重组TNF受体，TNF的抗体，影响TNF活性的小分子，TNF的反义寡核苷酸或这些的组合。

46.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述随机安慰剂对照研究是盲法安慰剂对照研究。

47.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述随机安慰剂对照研究是双盲法安慰剂对照研究。