CN1962658B - 一种四氢吡啶并[3,2-d]嘧啶类化合物及制备抗肿瘤药物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通式I的8位去氮杂、N⁵位烷基取代的四氢叶酸衍生物、其光学纯异构体或非对映异构体混合物、其可药用盐、含有所述化合物的药物组合物，式中各个基团的定义如权利要求书所述。本发明还涉及此类化合物在制备具有抗叶酸类蛋白酶作用、诱导肿瘤细胞凋亡的抗肿瘤药物中的用途。

Description

一种四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶类化合物及制备抗肿瘤药物的用途

技术领域

本专利涉及新的8位去氮杂、N⁵位烷基取代的四氢叶酸衍生物、其光学纯异构体或非对映异构体混合物、其可药用盐、含有所述化合物的药物组合物。本发明还涉及此类化合物在制备具有抗叶酸类蛋白酶作用、诱导肿瘤细胞凋亡的抗肿瘤药物中的用途。

背景技术

癌症是危害人类生命和健康的重大疾病，全世界因患癌症死亡人数每年在500万以上，已成为仅次于心血管疾病的第二大杀手。我国每年新发现癌症患者有170多万，死亡约在140万，成为致死率最高的疾病。多年来由于对不同癌症的发病机理缺乏深入的了解，目前尚无有效的预防、早期诊断和治疗方法。化学治疗(以下称化疗)是临床三种主要治疗方法的一种，现代的化疗起始于20世纪40年代，经过50多年的发展，目前临床上应用的抗癌药物已有相当数量，新药尚在不断出现，然而疗效好、毒副作用小、不产生交叉耐药性，特别是治疗实体瘤的药物不多，与根治癌症的目标相差甚远。因此，需要寻找新的选择性高、毒副作用小、没有耐药性的抗肿瘤药物。

1.叶酸与细胞增殖

叶酸在细胞的增殖过程中起着很重要的作用，其活性体形式四氢叶酸在N⁵和(或)N¹⁰位结合一碳单位，参与嘌呤和嘧啶等核酸碱基的生物合成。

叶酸拮抗剂与叶酸或叶酸衍生物结构相似，利用人体细胞和其它细胞中叶酸循环圈中的酶对药物敏感性不同，干扰叶酸代谢有关的酶，潜在地阻断嘌呤和嘧啶前体的生物合成，抑制肿瘤细胞的增长，用于癌症化疗。已知的抗叶酸化合物其作用靶点主要为二氢叶酸还原酶、甘氨酰胺核苷酸甲酰基转移酶、多聚谷氨酸合成酶，但是都有选择性差，毒副作用大的缺点，其毒副作用例如骨髓抑制(白细胞、血小板减少)、肝毒性、肾毒性、胃肠道反应(腹泻粘膜炎)，而且会产生耐药性。例如已知抗肿瘤药甲氨蝶蛉(MTX)为二氢叶酸还原酶抑制剂，已为广泛应用的抗叶酸化疗药物，由于抑制二氢叶酸还原酶就会造成一碳代谢的完全阻断，并伴随对快速繁殖的正常组织如骨髓和胃肠粘膜的生长抑制，产生较高毒性。

近十年来，随着分子生物学、分子肿瘤学和分子药理学等多学科知识和研究手段的快速发展，特别是随着人类基因谱的完成，科学家发现了正常细胞转变成癌细胞或防止细胞癌变的一些新机制和新靶点。目前国内外学者正利用这些新发现，将肿瘤药物研究的注意力由传统方式转向肿瘤病因学和病理学过程中起作用的特异分子及生物靶点上，探索抗肿瘤药物研究的新途径，发现作用靶点新、类型新的抗肿瘤药物，以克服现有的治疗药物在发挥抗肿瘤活性的同时对人体正常细胞造成的一定损害这一缺点。

2.蛋氨酸合成酶抑制剂

提高抗叶酸类化合物的一个有效途径是寻找正常细胞和肿瘤细胞敏感性差别更大的靶酶，并进行有效的结构设计。蛋氨酸合成酶(MS)作为这样一个靶点，催化如下的反应：以甲基四氢叶酸(CH₃-THF)为底物，通过S_N2反应将甲基四氢叶酸分子中的甲基转移到酶分子中，然后再将甲基转移到高半胱氨酸(Hcy)分子中，生成蛋氨酸(Met)，即(1)CH₃-THF+MS→CH₃-MS+THF(2)CH₃-MS+Hcy→Met+MS。即通过两次亲核取代反应，将甲基四氢叶酸的甲基转移到高半胱氨酸中，生成蛋氨酸，同时恢复四氢叶酸的活性体形式，重新参与叶酸循环。

过去数年的研究证明：①MS是人类细胞中唯一以甲基四氢叶酸为底物的蛋白酶，在催化形成蛋氨酸过程中，同时提供叶酸进入细胞的代谢途径，也为嘌呤及嘧啶的合成提供单碳单位；②快速裂分的癌细胞所需的蛋氨酸是正常细胞所需要的5～6倍；③癌细胞中蛋氨酸合成酶的活性要比正常细胞中该酶的活性高21倍左右；④抑制蛋氨酸合成酶可能会使癌细胞的快速生长受到抑制，而对正常细胞无大的影响。从研究结果可以看出，蛋氨酸合成酶是肿瘤细胞生长的重要催化启动因子，抑制其活性，可干扰癌细胞的生长、代谢和增殖过程，诱导肿瘤细胞调亡，达到治疗目的。以MS作为新靶点发展抗肿瘤药物，也是符合目前抗肿瘤药物研究正在从传统的细胞毒药物转向针对机制的多环节作用的新型抗肿瘤药物方向发展。因此蛋氨酸合成酶是抗癌药物设计的优秀新靶点。可以预测该酶的抑制剂应该是抗癌谱广、疗效高、选择性好、毒副作用低的抗癌新药。但是到迄今为止，尚无以蛋氨酸合成酶为靶点的抑制剂的文献报道，因此以蛋氨酸合成酶为新靶点，研发其抑制剂，有可能克服目前临床上使用的抗肿瘤药物的缺点。

已经合成的叶酸类似物在喋啶环、对氨苯甲酸、谷氨酸酯部分均做过结构修饰，但对五位氮取代的四氢叶酸较少报道，原因之一是无论在合成过程中还是在体内四氢叶酸都容易氧化(如文献J.Chem.Soc.Perk II，1974，80-88页所述)，因此我们设计了去8位氮杂的化合物，以增加稳定性，提高在体内的溶解度及增加运输到细胞中的速度。在五位氮上连接一个烃基是为了获得与N⁵-甲基四氢叶酸类似结构的化合物，但其能提供比N⁵-甲基四氢叶酸更强的亲核中心，能够优先与蛋氨酸合成酶作用，阻断转移甲基的作用，抑制蛋氨酸的合成抑制肿瘤生长。并且选择了对HL-60人白血病、PC-3MIE8人前列腺癌、BGC-823人胃癌、MDA-MB-435人乳腺癌、Bel-7402人肝癌、Hela人宫颈癌六种肿瘤细胞，在三种不同浓度下进行抗肿瘤活性测试，其结果显示此类化合物具有较好的抗肿瘤活性。根据此类化合物的电性性质、构象特征、与蛋氨酸合成酶的作用机理和此类化合物的活性测试，其分子中谷氨酸酯的水解产物应该具有类似或更好的抗肿瘤活性。

专利US5786358A中N-(N-{4-[2-(2-氨基-4-羟基-5，6，7 8-四氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-)乙基]-苯甲酰基}-L-γ-谷氨酰基)-D-天冬氨酸，该化合物的作用靶点为苷氨酰胺核糖核苷酸甲酰基转移酶(GARFT)，只是推测该类化合物具有抗肿瘤作用，但没有生物学或细胞学实验证实，因此本领域人员不能推测产生作用的方式及对不同肿瘤的选择性和作用效果强弱，无法在产业上应用。本发明作为蛋氨酸合成酶的抑制剂，从机理上比较有较大区别，其结构与蛋氨酸合成酶的底物N⁵-甲基四氢叶酸的结构具有相似性，首先一点是去掉8位氮杂而保留5位氮，N⁵-甲基四氢叶酸与蛋氨酸合成酶的反应位点是在5位氮的甲基上，US5786358A中的化合物不含有5位氮，因此从反应机理推断不可能与蛋氨酸合酶作用而产生抗肿瘤作用。其次本发明具有N⁵和N¹⁰，可以通过连接N⁵和N¹⁰形成五元环或六元环，从而固定化合物的空间构象，使其更有利于与蛋氨酸合酶作用，而US5786358A中的化合物不存在10位氮.因此基于蛋氨酸合成酶作用基理设计的本发明中的化合物，与US5786358A中的不含有5位与10位氮的化合物结构有本质区别.对本发明中的部分化合物分别进行了HL-60人白血病、PC-3MIE8人前列腺癌、BGC-823人胃癌、MDA-MB-435人乳腺癌、Bel-7402人肝癌、Hela人宫颈癌六种肿瘤细胞的抑制率测试，对四个化合物测定了IC₅₀值，活性测试证明此类化合物具有较好的抗肿瘤作用。

发明内容

本发明的目的是提供一类新型的去八位氮杂，且五位氮被烃基取代的四氢叶酸类似物的抗肿瘤药物。

本发明已经发现通式I四氢叶酸衍生物可以诱导肿瘤细胞的凋亡，因此通式I可以用于治疗和/或预防肿瘤的药物，包括白血病、前列腺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、宫颈癌。

根据本发明的一个实施方案，本发明涉及通式I新型四氢叶酸类衍生物、其光学纯异构体、其非对映体混合物或其药学上可接受的盐：

其中：

R₁为羟基或氨基，

R₂为氢或氨基保护基；所述氨基保护基通常指一步或多步反应中具有保护氨基功能的官能团，可为选自甲酰基、乙酰基、三苯甲基、苯二酰亚胺基、新戊酰基、三氯乙酰基、氯乙酰基、溴乙酰基、碘乙酰基、甲基苯磺酰基、硝基苯磺酰基、二苯磷氧基等，

R₃和R₄独立选自氢、甲酰基、乙酰基、丙酰基、三氟乙酰基、芳烃基、杂环基、1-4个碳的支链或直链饱和或不饱和烃基；所述烃基可任选地被氟、氯、溴、碘、环氧乙烷、羟基、烷氧基、对甲苯磺酰氧基、甲基磺酰氧基、环状烷基取代；所述环状烷基包括3-7个碳的环烷基；所述环烷基例如环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷、环庚烷、多环烷基；所述多环烷基指两个或多个环，每个环分别含有3-15个碳原子；所述环烷基可任选地被氟、氯、溴、碘、环氧乙烷、羟基、烷氧基、对甲苯磺酰氧基、甲基磺酰氧基取代；或者R₃和R₄由烃基连接形成四氢咪唑环或六氢嘧啶环，任选地被氟、氯、溴、碘、环氧乙烷、羟基、对甲苯磺酰氧基或甲基磺酰氧基取代，

E为包括含有N、O、S三种杂原子的五元或六元芳香环；所述芳香环选自1，4-次苯基、1，3-次苯基、2，4-呋喃基、2，5-呋喃基、2，4-噻吩基、2，5-噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、吡啶基、哒嗪基、吡嗪基、吲哚、苯并呋喃或喹啉的杂芳香基；所述芳香基可以是未被取代的或任选地被1-4个选自溴、氯、氟、碘或1-4个碳的烷基、烷氧基、烷氧酰基、烯氧基、苯氧基、苄氧基、羧基、氨基或硝基的取代基取代，

F为-CO-或-SO₂-，

R₅，R₆独立选自羟基、烷氧基、氨基、氨基酸或羧酸保护基；所选羟基、烷氧基指不同时满足为R₁羟基、R₂为氢、R₃为氢、R₄为氢、E为苯环、F为-CO-。

谷氨酸部分*标记为L构型手性碳，该化合物中的另一个手性中心为6位碳原子，该类化合物包含两个非对映体。两个非对映异构体的混合物可以用于药物，作为相关酶的底物，分离开非对映异构体中的任何一个纯化合物也都可以用于药物，作为相关酶的底物。

异构体的混合物可以分离开，例如可以通过柱层析，或是与手性酸形成盐通过重结

分子中的四氢吡啶[3，2-d]并嘧啶会互变异构生成3-H-4-氧代或3-H-4-亚氨基。为描述简单此专利中简写为4-羟基或4-氨基化合物，相对应的互变异构体酮基和亚氨基结构分别与此等同。例如：

为了进一步阐述本发明，下面给出一些实施例。值得指出的是这些实施例应理解为对本发明的解释，而不应作为对本发明有任何意义上的限制。

根据本发明的一个优选实施方案，本发明涉及R₃、R₄为同一亚甲基或同一取代亚甲基的通式I化合物，其光学异构体及可药用的盐：

其中：

R₁为氨基，

R₂为氢，

R为选自氢、甲酰基、三氟乙酰基、乙酰基、1-4个碳的烷基、烯基、炔基、或任选地被烷氧基、氟、氯、溴、碘、环氧乙烷、羟基、烷氧基、对甲苯磺酰氧基或甲基磺酰氧基取代的1-4个碳的烷基、烯基、炔基，

E为含有或不含有N、O、S三种杂原子的五元或六元芳香环；所述芳香环选自1，4-次苯基、1，3-次苯基、2，4-呋喃基、2，5-呋喃基、2，4-噻吩基、2，5-噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、吡啶基、哒嗪基、吡嗪基、吲哚基、苯并呋喃或喹啉的杂芳香基；所述芳香基未被取代或任选地被1-4个选自溴、氯、氟、碘或1-4个碳的烷基、烷氧基、烷氧酰基、烯氧基、苯氧基、苄氧基、羧基或氨基的取代基取代，

F为-CO-或-SO₂-，

R₅，R₆分别独立为羟基。

另一个优选实施方案为下列通式I化合物，其中

R₁为氨基；

R₂为氢；

R₃选自氢、甲酰基、乙酰基、三氟乙酰基、芳烃基、杂环基、1-4个碳的支链或直链饱或不饱和烃基；所述烃基任选地被氟、氯、溴、碘、环氧乙烷、羟基、烷氧基、对甲苯磺酰氧基、甲基磺酰氧基取代或不取代；

R₄为氢；

E为苯环或取代苯环；

F为-CO-；

R₅，R₆独立地为羟基或乙氧基。

列表中非限定性的列出本发明的一些优选化合物

表1.通式I化合物中优选的化合物

本发明最优选的化合物为N-[4-[[(2，4-二氨基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-5，6-)二亚甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸

另一方面，本发明还涉及药物组合物，其包括至少一种通式I类化合物或其光学异构体或其药学上可接受的盐以及药用载体或赋形剂。

本发明化合物的药物组合物可采用下面的任意方式施用：口服、喷雾吸入、直肠用药、鼻腔用药、颊部用药、局部用药、非肠道用药，如皮下、静脉、肌内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内或静脉内给药方式。本发明的药物组合物可单独给药也可与其它抗肿瘤药物或甾体类药物联合用药。被治疗动物包括哺乳动物、爬行动物、甲壳动物、两栖类、鱼类、家禽类。主要范围为哺乳动物特别是人。

当口服用药时，本发明化合物可制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊、水溶液或水悬浮液。其中，片剂使用的载体可包括填充剂、润滑剂、崩解剂、粘合剂。填充剂可包括但不限于淀粉、预胶化淀粉、糊精、糖粉、乳糖、甘露醇、微晶纤维素。润滑剂包括但不限于硬脂酸、硬脂酸钙、硬脂酸镁、滑石粉、氧化植物油、聚乙二醇、十二烷基硫酸镁、十二烷基硫酸钠、微粉硅胶、滑石粉。崩解剂可包括但不限于交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、淀粉及其衍生物、低取代羟丙基纤维素、泡腾崩解剂。粘合剂可包括但不限于羟丙甲纤维素、聚维酮、淀粉浆、糊精、糖粉、糖浆、胶浆、纤维素及其衍生物。胶囊制剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水悬浮液制剂则是将活性成分与适宜的悬浮剂混合使用，悬浮剂可包括但不限于润湿剂、絮凝剂、反絮凝剂。任选地，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。

当局部用药时，特别是治疗局部外敷容易达到的患面或器官，如眼睛、皮肤或下肠道神经性疾病时，可根据不同的患面或器官将本发明化合物制成不同的局部用药制剂形式，具体说明如下：

当眼部局部施用时，本发明化合物可配制成一种微粉化悬浮液或溶液的制剂形式，所使用载体为等渗的具有一定PH的无菌盐水，其中可加入也可不加防腐剂如氯化苄基烷醇盐。对于眼用，也可将化合物制成膏形式如凡士林膏。

当皮肤局部施用时，本发明化合物可制成适当的软膏、洗剂或霜剂制剂形式，其中将活性成分悬浮或溶解于一种或多种载体中。软膏制剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯、乳化蜡和水；洗剂或霜剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、吐温60、十六烷酯蜡、十六碳烯芳醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。

本发明化合物还可以无菌注射制剂形式用药，包括无菌注射水或油悬浮液或无菌注射溶液。其中，可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。

另外需要指出，本发明化合物的使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、化合物的活性强度、服用时间、代谢速率、病症的严重程度，具体剂量和使用方法由主治医师根据患者的具体病情判断。

制备方法通式

本发明化合物可选择多种反应路线制备，通过下述实施例将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容：

R₁为羟基或氨基，

R₂为氢或氨基保护基；所述氨基保护基通常指一步或多步反应中具有保护氨基功能的官能团，可为选自甲酰基、乙酰基、三苯甲基、苯二酰亚胺基、新戊酰基、三氯乙酰基、氯乙酰基、溴乙酰基、碘乙酰基、甲基苯磺酰基、硝基苯磺酰基、二苯磷氧基等，

R₃和R₄独立选自氢、甲酰基、乙酰基、丙酰基、三氟乙酰基、芳烃基、杂环基、1-4个碳的支链或直链饱和或不饱和烃基，所述烃基可任选地被氟、氯、溴、碘、环氧乙烷、羟基、烷氧基、对甲苯磺酰氧基、甲基磺酰氧基、环状烷基取代；所述环状烷基包括3-7个碳的环烷基；所述环烷基例如环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷、环庚烷、多环烷基，所述多环烷基指两个或多个环，每个环分别含有3-15个碳原子；所述环烷基可任选地被氟、氯、溴、碘、环氧乙烷、羟基、烷氧基、对甲苯磺酰氧基、甲基磺酰氧基取代；或者R₃和R₄由烃基连接形成四氢咪唑环或六氢嘧啶环，任选地被氟、氯、溴、碘、环氧乙烷、羟基、对甲苯磺酰氧基或甲基磺酰氧基取代，

R为选自氢、甲酰基、三氟乙酰基、乙酰基、1-4个碳的烷基、1-4个碳的烯基、1-4个碳的炔基，或任选地被烷氧基、氟、氯、溴、碘、环氧乙烷、羟基、烷氧基、对甲苯磺酰氧基或甲基磺酰氧基取代的1-4个碳的烷基、烯基、炔基，

E为包括含有N、O、S三种杂原子的五元或六元芳香环；所述芳香环选自1，4-次苯基、1，3-次苯基、2，4-呋喃基、2，5-呋喃基、2，4-噻吩基、2，5-噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、吡啶基、哒嗪基、吡嗪基、吲哚、苯并呋喃或喹啉的杂芳香基；所述芳香基可以是未被取代的或任选地被1-4个选自溴、氯、氟、碘啉的杂芳香基；所述芳香基是未被取代的或任选地被1-4个选自溴、氯、氟、碘或1-4个碳的烷基、烷氧基、烷氧酰基、烯氧基、苯氧基、苄氧基、羧基或氨基的取代基取代，

F为-CO-或-SO₂-，

R₅和R₆独立地选自羟基、乙氧基、氨基、氨基酸或羧酸保护基；所选羟基、烷氧基指不同时满足R₁为羟基、R₂为氢、R₃为氢、R₄为氢、E为苯环、F为-CO-。在不脱离此发明主要思想的情况下，一些具体操作步骤可做一些改变或修正。

具体实施方式

本发明可以通过下面的实施例进一步说明，但这些实施例不意味着对本发明有任何限制。如无特殊说明，下述实施例中“减压蒸干溶剂”或“减压蒸出溶剂”一般指“水泵减压条件下用旋转蒸发器蒸干溶剂”。

实施例1：N-[4-[[(2，4-二氨基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-)亚甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯

将N-[4-[[(2，4-二氨基吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-)亚甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯(600mg，1.2mmol)和PtO₂(60mg)置于反应瓶中，加入90ml乙醇，12ml醋酸(0.5N)，在40℃、0.3Kpa压力下催化氢化48-96h，抽滤，滤液用5％NaHCO₃调pH值为7～8，减压蒸干溶剂，得淡黄色固体，抽真空至完全干燥。加入10ml氯仿，充分搅拌后过滤，滤液浓缩呈粘稠液体，硅胶柱层析分离，得409mg标题化合物，白色固体，收率68％。

¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ1.15～1.20(m，6H)，1.59～1.64(m，1H)，1.97～2.01(m，2H)，2.05～2.11(m，1H)，2.41～2.44(t，2H，J＝9.0Hz)，2.55～2.63(m，2H)，3.18～3.21(m，2H)，3.30～3.31(m，1H)，4.03～4.12(m，4H)，4.37～4.41(m，1H)，6.38～6.40(t，1H，J＝6.6Hz)，6.50(s，2H)，6.66，(d，4H，J＝10.2Hz)，7.69(d，4H，J＝10.2Hz)，7.33(s，2H)，8.27～8.25(d，1H，J＝9.0Hz)。

¹³C NMR(125MHz，DMSO-d₆)：δ14.1，23.8，24.2，25.9，30.2，46.8，49.9，51.8，59.9，60.4，110.8，115.8，120.4，129.0，134.6，151.5，152.2，157.0，166.5，172.4，172.6。

FAB-MS：[M+H]⁺m/z 500。

实施例2：N-[4-[[(2，4-二氨基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-5，6-)二亚甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯

将N-[4-[[(2，4-二氨基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-)亚甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯(400mg，0.8mmol)置于反应瓶中，加入1.2ml水，滴加THF使固体溶解，加入120mg高聚甲醛，常温超声4h，减压蒸干反应液，向剩余物中加10ml水，用氯仿萃取，合并氯仿层，硅胶柱层析，得到317mg标题化合物，淡黄色固体，收率77.4％。

¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ1.15～1.24(m，6H)，1.72～1.87(m，2H)，1.97～2.11(m，2H)，2.41～2.46(m，2H)，2.58～2.60(m，2H)，3.33～3.34(m，1H)，3.63～3.69(m，2H)，3.78～3.79(d，1H)，4.03～4.13(m，4H)，4.38～4.43(m，1H)，4.91～4.92(d，1H)，6.24(s，2H)，5.64(s，2H)，6.547.80(d，4H，J＝10.8Hz)，7.80(d，4H，J＝10.8Hz)，8.33～8.35(d，1H，J＝8.4Hz)。

¹³C NMR(125MHz，DMSO-d₆)：δ14.1，21.9，25.8，28.2，30.2，51.2，51.9，56.3，59.9，60.4，65.8，110.5，113.7，120.6，129.0，148.2，153.7，158.8，159.5，166.5，172.2，172.2。

ESI-TOP-MS：[M+H]⁺m/z 512，[M+Na]⁺m/z 534。

实施例3：N-[4-[[(2，4-二氨基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-5，6-)二亚甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸

将N-[4-[[(2，4-二氨基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-5，6-)二亚甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯(23mg，0.05mmol)置于圆底烧瓶中，加入1.15ml THF，0.79ml NaOH水溶液(0.3N)，常温搅拌2h，减压蒸出THF，剩余液体用0.5N盐酸调pH值为5，有大量白色固体出现，过滤，滤饼用少量水清洗两次，充分干燥，得到14mg标题化合物，白色固体，收率68％。

¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ1.76～2.1(m，4H)，2.29～2.34(m，2H)，2.49～2.73(m，2H)，3.33～3.90(m，1H)，3.66～3.70(m，2H)，3.79～3.80(d，1H，J＝3.9Hz)，4.43～4.36(m，1H)，4.92～4.93(d，1H，J＝3.9Hz)，6.48(bs，2H)，6.54(d，4H，J＝8.7Hz)，7.75(d，4H，J＝8.7Hz)，6.77(bs，2H)，8.13～8.16(d，1H，J＝7.5Hz)，13.0(bs)。

¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆)：δ21.5，26.6，30.9，51.2，52.2，56.7，65.8，110.6，113.9，121.2，128.9，148.1，150.1，157.1，160.1，166.1，174.4。

ESI-TOF-MS：[M+H]⁺m/z 456.1954。

IR(KBr)υ 3330.64，2928.96，1607.55，1505.89，1392.01，1275.19，1201.58。

实施例4：N-[4-[[(2，4-二氨基-5-烯丙基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-)亚甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯

将干燥后N-[4-[[(2，4-二氨基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-)亚甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯(280mg，0.5mmol)置于圆底烧瓶中，加入11.2ml无水DMF，1.4ml溴丙烯，112mg研细的NaHCO₃粉未，常温搅拌12小时，将反应液减压旋蒸至小体积，加入水约20ml，用氯仿萃取，氯仿层浓缩蒸干，硅胶柱层析，得到120mg标题化合物，淡黄色固体，收率40％。

¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ1.14～1.18(m，6H)，1.62～1.66(m，1H)，1.94～1.99(m，1H)，2.03～2.09(m，2H)，2.82～2.44(m，4H)，2.81～2.85(m，1H)，2.95～3.01(m，1H)，3.12～3.18(m，2H)，3.36～3.41(m，1H)，4.01～4.10(m，4H)，4.34～4.38(m，1H)，5.09～5.11(d，1H，J＝17.5Hz)，5.23～5.27(d，1H，J＝10Hz)，5.57(s，2H)，5.97～6.03(m，1H)，6.03～6.11(m，3H)，6.57(d，4H)，7.64(d，4H)，8.21～8.23(m，1H).

¹³C NMR(125MHz，DMSO-d₆)：δ14.1，17.8，24.4，25.8，30.2，43.3，51.7，51.8，59.9，60.4，110.9，115.2，116.9，120.2，128.9，136.9，151.5，153.2，158.3，160.0，166.5，172.2，172.3。

Space-ESI：C₂₇H₃₈N₇O₅[M+H]⁺m/z理论值：540.2928691，实测值：540.2934010。

IR(KBr)υ 3341.05，2930.63，1732.12，1607.45，1507.99，1449.34，1201.84。

实施例5：N-[4-[[(2，4-二氨基-5-烯丙基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-)亚甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸

将N-[4-[[(2，4-二氨基-5-烯丙基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-)亚甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯(26mg)溶于圆底烧瓶中，加入1.63ml四氢呋喃，1ml NaOH水溶液(0.3N)，常温搅拌2h，真空旋蒸掉THF，剩余液体用0.5N HCl调pH值约为6，有固体析出，抽滤，滤饼用少量水冲洗，充分干燥后得19mg标题化合物，类白色固体，收率81.5％。

¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ1.65～1.67(m，1H)，1.90～1.94(m，1H)，2.01～2.06(m，2H)，2.29～2.32(m，2H)，2.41～2.47(m，2H)，2.83～2.87(m，1H)，2.97～3.02(m，1H)，3.141～3.187(m，2H)，3.40～3.42(m，1H)，4.29～4.34(m，1H)，5.12～5.14(d，1H，J＝10Hz)，5.24～5.28(d，1H，J＝17Hz)，5.95～5.95(m，1H)，6.06～6.11(m，1H)，6.20(bs，2H)，6.50～6.59(m，4H)，7.64～7.65(d，2H)。

¹³C NMR(125MHz，DMSO-d₆)：δ17.3，22.4，26.7，30.9，43.2，51.7，52.2，55.6，111.0，115.2，117.4，120.8，128.8，136.5，151.3，156.2，160.8，166.1，173.8，174.4，174.5。

ESI-TOF-MS：[M+H]⁺m/z 484.1848，ESI-TOF-MS：[M+H]⁺m/z 482.4691。

实施例6：N-[4-[[(2，4-二氨基-5-烯丙基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-)亚甲基]烯丙基氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯

试验过程同实施例4，收率42％，黄色固体。

¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ1.14～1.18(m，6H)，1.65～1.68(m，1H)，1.95～2.01(m，1H)，2.05～2.09(m，2H)，2.36～2.44(m，4H，CH₂-8)，3.09～3.13(m，1H)，3.16～3.21(m，1H，CH-6)，3.25～3.38(m，3H)，3.85～3.88(m，1H)，4.01～4.09(m，5H)，4.35～4.39(m，1H)，4.93～4.97(m，2H)，5.04～5.06(d，1H，J＝10Hz)，5.17～5.20(d，1H，J＝17.0Hz)，5.70～5.77(m，1H)，5.82～5.88(m，1H)，6.59(d，4H，J＝8.5Hz)，7.67(d，4H，J＝8.5Hz)，8.27～8.28(m，1H)。

¹³C NMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ14.1，17.7，24.0，25.8，30.2，51.3，51.6，51.8，53.2，55.5，59.9，60.4，110.6，115.3，115.8，116.4，119.9，128.9，133.6，136.6，150.4，152.5，157.9，159.7，166.5，172.2，172.3。

Space-ESI：C₃₀H₄₁N₇O₅[M+H]⁺m/z计算值：580.3241675，实测值：580.3245750。.

实施例7：N-[4-[[(2，4-二氨基-5-烯丙基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-)亚甲基]烯丙基氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸

将N-[4-[[(2，4-二氨基-5-烯丙基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-)亚甲基]烯丙基氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯(23mg，0.05mmol)置于圆底烧瓶中，加入1.2mlTHF，0.8ml NaOH水溶液(0.3N)，常温搅拌2h，减压蒸出THF，剩余液体用0.5N盐酸调pH值为5，有大量白色固体出现，过滤，滤饼用少量水清洗两次，充分干燥，得到14mg标题化合物，白色固体，收率68％。

¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ1.76～2.11(m，4H)，2.29～2.34(m，2H)，2.49～2.73(m，2H)，3.33～3.90(m，1H)，3.66～3.69(m，2H)，3.79～3.80(d，1H，J＝3.9Hz)，4.43～4.36(m，1H)，4.92～4.93(d，1H，J＝3.9Hz)，6.48(bs，2H)，6.54(d，4H，J＝8.7Hz)，7.75(d，4H，J＝8.7Hz)，6.78(bs，2H)，8.13～8.16(d，1H，J＝7.5Hz)，13.0(bs，)。

¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆)：δ21.5，26.6，30.9，51.2，52.2，56.7，65.8，110.6，113.9，121.2，128.9，148.1，150.1，157.1，160.1，166.1，174.4。

ESI-TOF-MS：[M+H]⁺m/z 456。

IR(KBr)υ 3330.64，2928.96，1607.55，1505.89，1392.01，1275.19，1201.58。

实施例8：N-[4-[[(2，4-二氨基-5-烯丙基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-)亚甲基]氨基]-3-溴苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯

N-[4-[[(2，4-二氨基-5-烯丙基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-)亚甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯(10mg，0.02mmol)置于冰浴至0℃的圆底烧瓶中，加入0.2ml无水THF，滴加溴水1μl，常温搅拌2小时，制备薄层，得8mg标题化合物，淡黄色固体，收率69.7％。

¹HNMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ1.15～1.19(m，6H)，1.63～1.68(m，1H)，1.96～2.09(m，2H)，2.10～2.15(m，1H)，2.37～2.44(m，3H)，2.48～2.55(m，1H)，2.92～2.97(m，1H)，3.14～3.22(m，2H)，3.28(m，1)，3.36～3.40(m，1H)，4.02～4.11(m，4H)，4.36～4.40(m，1H)，5.16～5.18(d，1H，J＝10.0Hz)，5.30～5.33(d，1H，J＝17.0Hz)，5.61～5.63(m，1H)，5.74(bs，2H)，5.99～6.06(m，3H)，6.63～6.64(m，H，J＝9Hz)，7.73～7.75(d，1H，J＝8.5Hz)，8.03～8.03(d，1H，J＝1.5Hz)，8.48～8.50(d，1H)。

¹³C NMR(125MHz，DMSO-d₆)：δ14.1，17.7，24.1，25.7，30.2，43.1，51.6，51.9，55.6，59.9，60.4，107.6，110.2，114.8，117.5，121.7，128.6，131.5，136.4，147.3，152.8，158.1，159.7，165.2，172.0，172.2。

ESI-TOF-MS：[M+H]⁺m/z 618.3293，620.3293。

实施例9：N-[4-[[[2，4-二氨基-5-(2，3-二溴丙烷基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-]亚甲基]氨基]-3-溴苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯

将N-[4-[[(2，4-二氨基-5-烯丙基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-)亚甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯(10mg，0.02mmol)置于冰盐浴至0℃的圆底烧瓶中，加入0.2ml无水THF，滴入溴水2μl，在冰盐浴条件下搅拌3分钟，常温搅拌2小时，反应液真空抽干后加入2ml水，氯仿萃取，氯仿层浓缩后制备薄层，得9mg标题化合物，淡黄色固体，收率62.3％。

¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ1.15～1.19(m，6H)，1.63～1.70(m，1H)，1.91～2.11(m，2H)，2.16～2.23(m，1H)，2.40～2.40(m，3H)，2.468～2.511(1H)，2.892～2.986(m，1H)，3.16～3.22(m，2H)，3.25～3.39(m，1H)，3.49～3.51(m，1H)，3.97～4.11(m，6H)，4.36～4.40(m，1H)，4.76～4.82(m，1H)，5.55～5.56(m，1H)，5.61～5.71(m，2H)，5.93(bs)，6.68(d，2H，J＝8.8Hz)，7.74(d，2H，J＝8.8Hz)，7.73～7.75(d，1H，J＝8.5Hz)，8.03～8.03(m，1H)，8.45～8.47(d，1H，J＝7.5Hz).

ESI-TOF-MS：[M+H]⁺m/z 776.2620，778.2552，780.25，782.2574。

实施例10：N-[4-[[(2，4-二氨基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-)亚甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸

将N-[4-[[(2，4-二氨基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-)亚甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨二乙酯(85mg，0.2mmol)置于圆底烧瓶中，加入4.25ml THF，3ml NaOH水溶液(0.3N)，常温搅拌1h，用0.5N HCl调pH值至6～7，有白色固体析出，过滤，白色固体用少量水洗涤，干燥后得到69.7mg标题化合物，类白色固体，收率82％，。

¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ1.59(m，1H)，1.90～2.06(m，3H)，2.26～2.29(t，2H，J＝9Hz)，2.53～2.59(m，2H)，3.134～3.77(m，2H)，3.29(m，1H)，4.24～4.28(m，1H)，6.26～6.28(m，1H)，6.62(d，4H，J＝10.8Hz)，7.64(d，4H，J＝10.8Hz)，6.93(bs，2H)，7.10(bs，2H)，7.87～7.91(m，1H)。

¹³C NMR(125MHz，DMSO-d₆)：δ23.9，24.3，27.2，31.4，46.9，50.0，52.7，110.9，115.4，121.1，128.7，136.1，151.3，153.1，157.0，165.8，174.9(COOH)，175.1。

ESI-Tof-MS：[M+H]⁺m/z 444.1597。

实施例11：N-[4-[[(2，4-二氨基-5-烯丙基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-)亚甲基]三氟乙酰基氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯

基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯(44mg，0.08mmol)置于圆底烧瓶中，加入1ml三氟乙酸酐，常温搅拌2h，减压蒸去溶剂，向粘稠状剩余物中加入水2ml，充分研磨，将水用滴管吸出，再重复洗涤-遍，剩余粘稠物用油泵抽真空干燥可得42mg标题化合物，收率80.5％。

FAB-MS：[M]⁺m/z 635.6。

实施例12：N-[4-[[[2，4-二氨基-5-(2，3-二溴丙烷基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-]亚甲基]三氟乙酰基氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯

N-[4-[[(2，4-二氨基-5-烯丙基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-)亚甲基]三氟乙酰基氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯(42mg，0.07mmol)置于冰浴至0℃的圆底烧瓶中，加入1ml无水THF，滴入液溴12ul，5min后移开冰浴恢复至常温，继续搅拌3h，减压蒸干溶剂，向反应瓶中加入2ml水，用氯仿萃取，合并氯仿层，用无水NaSO₄干燥后减压蒸干得21mg标题化合物，收率37.8％。

FAB-MS：[M]⁺，[M+2]⁺，[M+4]⁺m/z 793.5，795.5，797.5。

实施例13：N-[4-[[(2，4-二氨基-5-甲酰基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-)亚甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯

将N-[4-[[(2，4-二氨基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-)亚甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯(10mg，0.02mmol)置于圆底烧瓶中，加入0.2ml甲酸(＞88％)，加热回流10小时，或加入0.15ml甲酸(＞88％)，0.15ml甲酸甲酯，常温搅拌48h，减压蒸去溶剂，加入少量氯仿溶，制备薄层层析，得到3mg标题化合物，收率30％。

ESI-TOF-MS[M+H]⁺：m/z 528.4329。

实施例14：N-[4-[[(2，4-二氨基-5-甲酰基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-)亚甲基]甲酰基氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯

按与实施例13相同的制备方法制备标题化合物，产率为25％。

ES I-TOF-MS：m/z[M+H]⁺m/z 556.4426。

实施例15：取处于生长对数期的细胞接种于96孔板中，每孔3-4×10³个细胞/100μL，24h后，吸取培养液，每孔加入含不同药物的完全培养液。继续培养48h，弃去培养液，每孔加入四甲基偶氮唑蓝(MTT)孵育4h，吸取四甲基偶氮唑蓝液，每孔加入二甲基亚砜，轻轻震摇，用读板机于490nm波长下测定96孔板每一孔的光密度OD值，每一化合物在10^-6-10^-4间设定5-6个浓度，每一测试设3-4个平等孔，重复3次。

药物对细胞的生长抑制率(％)＝(溶剂对照组平均OD值-用药组平均OD值)/对照组平均OD值。

实施例16：生理活性测试(抑制率％)

生理活性测试方法如表1所示：

表1

细胞株：Bel-7402人肝癌筛选方法：磺酰罗丹明B(sulforhodamine B，SRB)蛋白染色法作用时间：48h	细胞株：HL-60人白血病筛选方法：四氮唑盐(microcultoretetrozolium，MTT)还原法作用时间：48h
		细胞株：PC-3MIE8人前列腺癌筛选方法：磺酰罗丹明B(sulforhodamine B，SRB)蛋白染色法作用时间：48h	细胞株：BGE-823人胃癌筛选方法：磺酰罗丹明B(sulforhodamineB，SRB)蛋白染色法作用时间：48h

生理活性测试结果如表2、表3所示：

表2

表3

由图表中数据可以看出，此类化合物对HL-60人白血病细胞、PC-3MIE8人前列腺癌细胞、BGE-823人胃癌细胞、MDA-MB-435人乳腺癌细胞、Bel-7402人肝癌细胞或HL-60人白血病细胞的增殖具有抑制作用；其中部分化合物对某类肿瘤细胞显示较好的抑制作用。

实施例17：生理活性测试(IC₅₀)

生理活性测试方法如表1所示：

表1

细胞株：Bel-7402人肝癌筛选方法：磺酰罗丹明B(sulforhodamine B，SRB)蛋白染色法作用时间：48h

细胞株：HL-60人白血病筛选方法：四氮唑盐(microcultoretetrozol ium，MTT)还原法作用时间：48h

五种化合物对Bel-7402人肝癌细胞和HL-60人白血病细胞增殖的影响如表2所示：

表2

	化合物	IC<sub>50</sub>值(μmol.L<sup>-1</sup>)(Bel-7402人肝癌细胞)	IC<sub>50</sub>值(μmol.L<sup>-1</sup>)(HL-60人白血病细胞)
				1	N-[4-[[(2，4-二氨基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-)亚甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯	4	2
2	N-[4-[[(2，4-二氨基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-)亚甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸	0.1	0.3
				3	N-[4-[[(2，4-二氨基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-5，6-)二亚甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯	4	5
4	N-[4-[[(2，4-二氨基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-5，6-)二亚甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸	0.1	0.1

由图表中数据可以看出，所试化合物1、2、3、4、5对Bel-7402人肝癌细胞和HL-60人白血病细胞的增殖具有较好抑制作用；其中化合物2和化合物3的抑制作用最好.

Claims (7)

1.通式I化合物或其可药用盐，

其中：

R₁为氨基，

R₂为氢，

R₃和R₄独立选自氢、1-4个碳的支链或直链饱和或不饱和烃基，

E为1，4-次苯基，

F为-CO-，

R₅和R₆独立地选自羟基、乙氧基。

2.通式II化合物或其可药用盐，

其中，

R₁为氨基，

R₂为氢，

R为氢，

E为1，4-次苯基，

F为-CO-，

R₅＝R₆＝羟基或R₅＝R₆＝乙氧基。

3.权利要求1所述的通式I化合物，其具体为化合物：

N-[4-[[(2，4-二氨基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-)亚甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯，

N-[4-[[(2，4-二氨基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-)亚甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸，

N-[4-[[(2，4-二氨基-5-烯丙基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-)亚甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯，

N-[4-[[(2，4-二氨基-5-烯丙基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-)亚甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸，

N-[4-[[(2，4-二氨基-5-烯丙基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-)亚甲基]烯丙基氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯，

N-[4-[[(2，4-二氨基-5-烯丙基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-)亚甲基]烯丙基氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸。

4.药物组合物，其含有权利要求1-3中任一项所述的化合物以及至少一种可药用载体.

5.如权利要求1-3中任一项所述的化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

6.如权利要求5的用途，其中所述的抗肿瘤药物为抑制叶酸循环中的蛋白酶的药物。

7.权利要求6所述的用途，其中所述的抗肿瘤药物为用于治疗人白血病、人前列腺癌、人胃癌、人乳腺癌、人肝癌、人宫颈癌的药物。