CN1961066B - 包括干微生物的组合物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种制备包括干微生物的组合物的方法，其包括：培养一种或多种微生物；将培养的微生物与一种或多种载体混合；用脉冲电磁场处理微生物；培育培养物：载体混合物至少约6小时；和干燥微生物以便将水分水平降低到约1wt％至约6wt％。将培养的微生物与一种或多种载体混合与处理组合物中的微生物的组合显著提高了初始存活率和/或保存期限。

Description

包括干微生物的组合物的制备方法
发明领域
本发明涉及制备包括干微生物的组合物的改进方法，该方法产生提高的微生物生存力，并涉及通过改进方法制备的干微生物组合物的用途。
技术背景
在农业中，接种物(innoculant)包括特定类型的微生物的使用是已知的。接种物通常被涂在种子或其它植物繁殖材料上，从而一旦播种或种植，就可建立支持种子发芽、刺激植物生长或生物保护种子和所得植物的增强环境。
例如，可使用能在豆科植物中起固氮作用的共生细菌如来自根瘤菌属和慢生型根瘤菌属的那些来接种豆科植物以帮助节(nodule)形成。可通过包覆种子、在农场对种子或庄稼喷粉或在种植时在犁沟中放置接种物来实现接种。
产生接种物的前述方法包括将活性的活微生物培养物如根瘤菌属细菌培养物与载体如腐殖质或泥炭混合。水分载体保持微生物在活的状态。但是，由于环境中养料和水分的消耗，这种活细菌培养物的保存期限短。
制备接种物的另一方法是通过将细菌转化到休眠状态如通过冻干细菌。为了防止细胞破裂，必须快速进行这种方法。
US 5,695,541中教导了制备干的休眠接种物的另一方法，该方法包括在生长培养基中培养微生物菌种，并将培养物和泥土载体混合，然后将混合物缓慢地空气干燥至少约1天，从而微生物中的水分水平被逐渐降低以形成干组合物。与制备干的休眠接种物的其它方法相比，干组合物被认为具有优良的生存力。
脉冲电磁场(PEMP)已被教导能刺激生物组织，包括微生物(参见US6,561,968)。US 6,561,968中表明，在干燥过程中微生物如细菌的存活率可通过用PEMF处理得到提高。但是，US 6,561,968中表明PEMF处理只对部分干燥的微生物有用，即只对部分干燥但仍包含约20％水含量的微生物有用。也就是说，US 6,561,968只公开了PEMF处理用于将被保持在存活状态的微生物(例如在20％水含量时，水分活性(water activity)(Aw)仍处在细菌群落为与休眠状态相对的存活状态的水平(在约1和0.95之间)的用途。另外，US 6,561,968教导PEMF处理只能使细菌更好地承受干燥过程(即细菌的初始存活率)。报道了对部分干燥微生物的长期保存期限没有影响。
干微生物降低的存活率尤其是降低的保存期限是相当大的问题，尤其当干微生物的水含量在约1％至约6％w/w时。
发明概述
本发明基于将微生物培养物和载体混合与用脉冲电磁场(PEMF)处理的组合显著了增加干微生物保存期限的惊人发现。换句话说，与仅仅在载体上干燥的微生物相比或与单独用PEMF处理的微生物相比，按照本发明处理的微生物在干燥阶段能保持存活明显较长的时间。观察到的差异有协同性。
因此，在广泛的方面，本发明提供使微生物培养物和载体混合与用脉冲电磁场(PEMF)处理的组合在制备包括干微生物的组合物中的用途。得到的微生物具有明显增加的保存期限。
详细方面
在一个方面，本发明提供一种制备包括干微生物的组合物的方法，其包括：培养一种或多种微生物；将培养的微生物与一种或多种载体混合；用脉冲电磁场处理微生物；将培养物：载体混合物培育至少约6小时；和干燥微生物，以便将水分水平降低到约1wt％至约6wt％。
在另一个方面，本发明提供一种通过本发明的方法制备的包括干微生物的组合物。
在又一方面，本发明涉及干微生物在制备包覆的植物种子或其它植物繁殖材料中的用途，包括用通过本发明的方法制备的包括干微生物的组合物包覆植物种子或其它植物繁殖材料。
在本发明的另一方面中，提供了干微生物在生长介质制备中的用途，其包括将通过本发明的方法制备的包括干微生物的组合物和土壤混合。
在又一方面，本发明提供干微生物在废水处理中的用途，包括使通过本发明的方法制备的包括干微生物的组合物与废水接触并分离处理的水和组合物。
通过本发明的方法制备的干微生物具有下列性质中的一种或多种：与单独用载体制备的微生物和/或单独用PEMF处理制备的微生物相比，更好的初始存活率和增加的保存期限。
在其它实施方案中，本发明提供一种与单独用载体制备的微生物和/或单独用PEMF处理制备的微生物相比具有提高的初始存活率和/或保存期限的干微生物；包括所述干微生物的组合物；和其用途，包括例如在制备包覆的植物种子和/或其它繁殖材料中，在制备生长培养基中，和在废水处理中的用途。
优选方面
合适地，本发明可用于干燥能在干状态下存活的任何微生物。
优选地，微生物处于休眠状态。合适地，微生物可处于干燥或脱水状态。
优选地，本发明用于干燥在农业中使用的有益微生物。尤其感兴趣的是具有杀生物性质如杀真菌或杀虫和其它性质的微生物，和例如能在将被保护植物存在下在土壤中存活的生长促进微生物。
合适地，根据本发明的微生物可为真菌，包括酵母，细菌，藻类或原生动物(protozoans)中的一种或多种。
合适地，微生物可为已知的杀生物微生物，  包括真菌木霉属(Trichoderma)和粘帚霉属(Gliocladium)。
优选地，微生物为细菌、真菌或酵母。
在一个方面，优选微生物为细菌。
在一种实施方案中，优选微生物为来自以下属的一种或多种的酵母：假丝酵母属(Candida)、隐球酵母属(Cryptococcus)、Cystofilobasidium、汉森酵母属(Hansenula)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、白冬孢酵母属(Leucosporidium)、梅奇酵母属(Metschnikowia)、毕赤酵母属(Pichia)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、Rodotorula、糖酵母属(Saccharomyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、Richosporon。
在另一实施方案中，优选微生物为来自以下属中一种或多种的真菌：Acrophialospora、Ampelomyces、短梗霉属(Aureobasidium)、双极菌属(Bipolaris)、毛壳属(Chaetomium)、Cladorrhinum、Clonostachys、盾壳霉属(Coniothyrium)、附球菌属(Epicoccum)、粘帚霉属(Gliocladium)、Glomus、镰孢属(Fusarium)、Laetisaria、小球壳孢属(Microsphaeropsis)、Mycothecium、Muscador、Mycoleptodiscus、新赤壳属(Neocosmospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、隔孢伏革菌属(Peniophora)、Phlebiopsis、瓶霉属(Phialophora)、腐霉属(Pythium)、丝核菌属(Rhizoctonia)、根霉属(Rhizopus)、喙孢属(Rhynchosporium)、葚孢属(Sporidesmium)、Stephanonectria、篮状菌属(Talaromyces)、Tilletiopsis、木霉属(Trichoderma)、单隔孢属(Ulocladium)、轮枝孢属(Verticillium)、被毛孢属(Hirsutella)、漆斑菌属(Myrothecium)、Nematophthora、指隔孢属(Dactylella)、枝顶孢霉属(Acremonium)、链枝菌属(Catenaria)、柱孢属(Cylindrocapon)、指隔孢属(Dactylella)、单顶孢属(Monacrosporium)、Pochania。
合适地，真菌可为以下中的一种或多种：局限枝顶孢霉(Acremoniumstrictum)、Caternaria auxiliaris、毁灭柱孢菌(Cylindrocarpondestructans)、Dactylella oviparasitica、Hirsutella rhossiliensis、Monacrosporiumellipsosporum、柱捕单顶孢菌(Monacrosporium cionopagum)、Nematophthoragynophila、马昆德拟青霉(Paecilomycesmarquandii)、普可尼亚厚垣菌(Pochoniachlamydosporium)、粉红螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea)、Coniothyriumminitans、黑附球菌(Epicoccumnigrum)、紫附球菌(Eppicoccumpurpurascens)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、烟草镰刀霉(Fusariumtabacinum)、腐皮镰孢(Fusarium solani)、Gliocladiumatrum、链孢粘帚霉(Gliocladium catenulatum)、粉红粘帚霉(Gliocladiumroseum)、绿粘帚霉(Gliocladium virens)、Glomusclaroideum、Glomusfasciculatum、Glomusintraradices、Glomusmossae、Laetisaria arvalis、Microsphaeropsis ochracea、Muscadoralbus、Mycoleptodiscus terrestris、Mycothecium verrucaria、Necosmospora vasinfecta、玫烟色拟青霉(Paecilomycesfumosoroseus)、淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)、常现青霉(Penicilliumfrequentans)、蓝绿边青霉(Penicillium godlewskii)、黑青霉(Penicilliumnigricans)、草酸青霉(Penicillium oxalicum)、大隔孢伏革菌(Peniophora gigantea)、瓶霉属菌种(Phialophora sp.)I-52、Phlebiopsisgigantea、棘腐霉(Pythium acanthicum)、刺器腐霉(Pythium acanthophoron)、Pythium mycoparasiticum、Pythium nunn、寡雄腐霉(Pythium oligandrum)、缠器腐霉(Pythium periplocum)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、Rhynchosporium alismatis、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、Sporidesmiumsclerotivorum、Stephanonectria keitii、Talaromycesflavus、Tilletiopsis sp.、Trichoderma asperellum、Trichoderma atroviride、Trichoderma hamatum、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、Trichoderma inhatum、康氏木霉(Trichoderma koningii)、木素木霉(Trichodermalignorum)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、Trichoderma stromaticum、绿色木霉(Trichoderma viride)、Ulocladium atrum、Verticilium chlamydosporium、大丽花轮枝孢(Verticillium dahliae)、Verticillium suchlasporium。
在又一实施方案中，优选微生物为以下属中的一种或多种的细菌：游动放线菌属(Actinoplanes)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)、芽胞杆菌属(Bacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、伯克霍尔氏德菌属(Burkholderia)、金色单胞菌属(Chryseomonas)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、肠杆菌属(Enterobacter)、肠球菌属(Enterococcus)、欧文氏菌属(Erwinia)、黄杆菌属(Flavobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、泛菌属(Pantoea)、巴斯德氏芽菌属(Pasteuria)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、拉恩氏菌属(Rahnella)、Raoultella、沙雷氏菌属(Serratia)、Sporotrix、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、慢生型根瘤菌属(Bradyrhizobium)、Mezorhizobium、Sinorhizobium Seratia、欧文氏菌属、链霉菌属(Streptomycetes)和诺卡氏菌属(Nocardia)。
优选细菌为选自以下的非孢子形成细菌：游动放线菌属、土壤杆菌属、节杆菌属、双歧杆菌属、短芽孢杆菌属、伯克霍尔氏德菌属、金色单胞菌属、丛毛单胞菌属、肠杆菌属、肠球菌属、欧文氏菌属、黄杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属、泛菌属、片球菌属(Pediococcus)、假单胞菌属、拉恩氏菌属、Raoultella、沙雷氏菌属、Sporotrix、寡养单胞菌属、链球菌属、链霉菌属、根瘤菌属、慢生型根瘤菌属、Mezorhizobium、SinorhizobiumSeratia、欧文氏菌属、链霉菌属和诺卡氏菌属。
合适地，细菌可为以下中的一种或多种：放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、简单节杆菌(Arthrobactersimplex)、Bacillus chitinosporus、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、Bacillus amylofaciens、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、缓病芽孢杆菌(Bacillus lentimorbus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)、日本甲虫芽孢杆菌(Bacilluspopilliae)、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、双歧双歧杆菌(Bifidbacteriumbifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、Bifidobacterium lactis、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)、短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、浅黄金色单胞菌(Chryseomonasluteola)、食酸丛毛单胞菌(Comamonas acidovorans)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、大比目鱼黄杆菌(Flavobacterium balustinum)、肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)、Flavobacterium psycrophilium、Flavobacterium columnae、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbruekii)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、Lactobacillus grayii、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、Pantoea ananatis、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)、甜菜疫病假单胞菌(Pseudomonas aptata)、致金色假单胞菌(Pseudomonas aureofaciens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、pseudomonas brassicacearum、洋葱假单胞菌(Pseudomonascepacia)、绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugata)、脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、托拉氏假单胞杆菌(Pseudomonastolaasii)、Rahnella aqualis、Raoultellaterrigena、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcesscens)、普城沙雷菌(Serratiaplymuthica)、Sporotrixflocculosa、嗜麦芽糖寡养单孢菌(Stenotrophomonas malthophilia)、乳链球菌(Streptoccuslactis)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、灰绿链霉菌(Streptomyces griseoviridis)。
合适地，微生物可为来自假单胞菌属的细菌。合适地，微生物可为荧光假单胞菌。合适地，微生物可为产生环脂肽的荧光假单胞菌。
优选地，在合适的培养基中培养微生物。合适地，可在常规发酵罐或摇瓶内在生长培养基中培养微生物。合适地，发酵罐可为固定、半连续或连续发酵罐。优选地，培养微生物直到培养达到稳定期。
合适地，培养物和培养基可与载体混合。在与载体混合前，可用新鲜的或过滤的培养基和/或蒸馏水稀释微生物培养物和/或培养基。优选恰好在使培养基与载体混合前用新鲜的或过滤的培养基稀释微生物培养物。
合适地，可以以连续方式或分批方式进行混合。
优选地，载体可为粉状形式或被造粒。载体为粉状形式还是粒状形式可取决于预定用途。
合适地，粉状载体可具有例如约1μm-约0.5mm的平均颗粒直径。合适地，粒状载体可具有例如约0.5mm-约3mm的平均颗粒直径。
在一种实施方案中，优选的载体为具有大的表面积的那些，优选表面积大于200m2/克、优选大于300m2/克的那些。
在另一实施方案中，优选的载体为具有低天然水含量(WC)的那些。低天然水含量为保持细菌处于休眠状态的含量。优选地，低天然水含量为8.0％WC或以下，优选7.5％WC或以下，优选低于约7％WC。
合适地，优选的载体可为天然水含量在3％-7.5％范围内的那些。这在例如使用混合物包覆种子或其它繁殖材料的应用中尤其有效。
在一种实施方案中，优选的载体为具有非常高的天然水含量的那种。非常高的天然水含量为能维持细菌处于新陈代谢阶段的含量。通常，非常高的天然水含量可为例如>20％。
载体的天然水含量为结合到阳离子的水量或在天然沸石或粘土的孔内携带的水量。不希望受理论约束，沸石为水合铝硅酸盐，意味着它们在它们的基本结构中包含水，  即一种斜发沸石的结构式为(Na，K，Ca)2-3A13(Al，Si)2Si13O36-12H2O，其为水合钠钾钙铝硅酸盐。
本文中使用的术语“天然水含量”是指在105℃的烘箱中保持4小时可从样品载体中除去的水量。为了避免疑虑，该方法没有必要从载体中除去全部水分子。
优选地，根据本发明的载体将在一段时间内(over time)具有相对稳定的水含量。载体水含量在一段时间内的稳定性将决定载体最适合的应用。例如，斜发沸石和膨润土在一段时间内的水分含量是相对稳定的。因此，这些载体可特别好地适用于其中培养物：载体混合物可在长期贮存后被再使用的应用，例如这可使这些载体特别好地适用于例如包覆种子或其它繁殖材料。另一方面，部分载体可能具有相对较不稳定的水含量。这可使这些载体特别好地适用于只在短期贮存而没有长期贮存后就使用培养物：载体混合物的应用。
确定载体水分含量的相对稳定性的一种方法是干燥载体得到％MC，然后在将载体放在控制环境(即控制温度和/或相对湿度)中30天后测量载体的％MC。水分损失或增加指示载体的不稳定性。在30天时间内保持相同％MC的载体被认为非常稳定。载体吸收或损失的水分量与正对照载体(如膨润土或斜发沸石)吸收或损失的水分量相比确定载体的“相对”稳定性。根据本发明，膨润土和斜发沸石被认为是稳定载体。比膨润土或斜发沸石吸收更多水分或失去更多水分的载体被认为是相对较不稳定的载体。
换句话说，在一段时间内具有较稳定的水分含量的载体可被认为是能充分“缓冲”水分变化的载体。相反，在一段时间内具有较不稳定的水分含量的载体可被认为是不能缓冲水分变化的载体。适当地，根据本发明的载体为能缓冲水分变化的载体。
合适地，载体可为下列载体中的一种或多种：沸石载体；粘土载体；其它土质硅化合物。
沸石为具有明确结构的微孔结晶固体。通常它们在它们的框架内包含硅、铝和氧，在它们的孔内包含阳离子、水和/或其它分子(如氨、碳酸盐离子和硝酸盐离子)。许多作为矿物天然存在。其它一些为合成的和商业制备的。在本发明中，可使用天然沸石和/或合成沸石。
沸石的定义特征在于它们具有连接的(Si，Al)O4四面体的三维框架结构，(Si，Al)和O以1∶2的比例存在。沸石由于这种三维结构而不同于粘土矿物，其中氧原子在化学上用阳离子平衡。
合适地，沸石载体可为下列沸石中的一种或多种：方沸石(analcite)，钙霞石(cancrinite)，菱沸石(chabazite)，斜发沸石(clinoptilolite)，堇青石(cordierite)，钡沸石(edingtonite)，毛沸石(erionite)，八面沸石(faujasite)，镁碱沸石(ferrierite)，钠菱沸石(gmelinite)，  片沸石(heulandite)，浊沸石(laumontite)，插晶菱沸石(levynite)，中沸石(mesolite)，丝光沸石(mordenite)，钠沸石(natrolite)，钾沸石(offretite)，方碱沸石(paulingite)，钙十字沸石(phillipsite)，发光沸石(ptilolite)，钙沸石(scolecite)，杆沸石(thomsonite)，ZSM和ZK。
在一些方面中，优选沸石载体为斜发沸石。适当地，本文中使用的斜发沸石可为斜发沸石-K、斜发沸石-Ca或斜发沸石-Na。优选地，本文中使用的斜发沸石为斜发沸石-Na。合适地，本文中使用的斜发沸石可具有4.7-5.4％的天然水含量，优选约5％。在一个实施方案中，优选斜发沸石为可从丹麦NorNatur得到的产品名为KlinominTM的斜发沸石-Na。合适地，按照本发明使用的斜发沸石由大于80％的斜发沸石组成。合适地，载体可具有6.9-7.1的pH值和/或260-290m2/g的表面积。
粘土为最初从至少部分因为胶质颗粒的尺寸和分布而具有物理性质的土中得到的天然存在的水合铝硅酸盐，并且性质包括塑性。通常，粘土中30％或更多颗粒的直径在0.002mm以下。
合适地，粘土载体可为下列粘土中的一种或多种：凹凸棒石(attapulgite)，膨润土(bentonite)，漂白土(fuller’s earth)，埃洛石(halloysite)，伊利石(illite)，高岭土(kaolin)，叶蜡石(pyrophyllite)，蛭石(vermiculite)，海泡石(sepiolite)，蒙脱石(montmorillonite)和莫来石(mulite)。
在一种实施方案中，优选载体可为膨润土。膨润土表示具有良好膨胀能力和可变蒙脱石含量的粘土。优选地，膨润土的主要组分为蒙脱石，优选Na-蒙脱石。按照本发明使用的一种合适的膨润土包含约50％蒙脱石、10％高岭石、10％伊利石和20％蛭石。这种膨润土可从丹麦Tierra Products ApS作为OB-lergranulate得到。为了避免疑虑，这在下面的实验部分中称为膨润土。
在另一实施方案中，优选载体为蛭石。
本领域的普通技术人员将理解的是，天然粘土或沸石材料不必是纯的。因此，在一些实施方案中，当通过名称提到粘土或沸石，如斜发沸石时，它指主要由这种粘土或沸石组成的载体(即主要由例如斜发沸石组成)。优选地，粘土或沸石包括超过50％的指定粘土或沸石(例如斜发沸石)，优选超过60％，更优选超过70％，更优选超过80％指定的粘土或沸石。合适地，粘土或沸石可包括超过90％的指定粘土或沸石或者甚至100％的指定粘土或沸石。
一些土质硅化合物不被归类为粘土或沸石。这种土质硅化合物包括例如以下中的一种或多种：石棉，硬水铝石，硅藻土，硅藻土，长石，硅藻土，硅藻土，云母，石英，砂和二氧化硅。
在一个方面，载体可适当地为一种或多种粘土载体与一种或多种沸石载体的组合。
不希望受理论约束，能预见到某些种类的微生物可具有优选的载体，即可在某些载体中存活得更好。一旦本领域的普通技术人员受到本发明教导，则在他们的常规技能内就能很好地确定任何给定微生物的优选载体。实现它的一种方法是进行以下试验：
1.通过在105℃下培育载体4小时测定载体的天然水含量。
2.按1∶5比例混合液体微生物培养物和不同的载体。
3.培育1-2天以使细菌生长。
4.将MicxCarriers干燥至(1)中测定的天然水含量的1.5x、1x、0.75x(或更多点)，然后研磨成细粉末。
5.在室温下培育>7天。
6.通过平板培养计数CFU。优选的载体为在给定范围内载有大量微生物的载体。
7.任选地-一旦确定一组优选的载体，就可确定WC和Aw之间的关系。优选的载体为在一段时间内在给定储存条件下Aw不会改变(或只稍微变化，即变化可被携载的微生物忍受)的载体。
特别地，优选的粘土/沸石载体为天然水含量类似于干燥后培养物：载体混合物中的最终水分含量的那些载体，对于种子应用目的，通常在3％-7.5％(w/w)范围内，和/或为在一段时间内具有相对稳定水分含量的那些载体。
在又一实施方案中，微生物在载体中的分布优选是均匀的。微生物在载体中的分布均匀性可通过将载体喷涂(spray coating)到表面上并测定每面积单位的微生物数目来确定。
优选地，将培养的微生物和载体混合使得培养物对载体的比例在约1∶2至约1∶6(w/w)之间，优选约1∶3至约1∶5(w/w)，更优选小于1∶4(w/w)，例如1∶4.1、1∶4.2、1∶4.5、1∶4.75或约1∶5。
在一种实施方案中，优选将培养的微生物和载体混合使得培养物对载体的比例小于1.5(w/w)。
不希望受理论约束，已经令人惊讶地发现，微生物培养物对载体的比例越低，存活的可培养细胞数(干载体中的菌落形成单位(CFU))就越多。发现优选将培养的微生物和载体混合使得培养物对载体的比例小于1∶4(w/w)，合适地小于例如1∶4.1、1∶4.2、1∶4.5、1∶4.75或1∶5。
为了制备标准载体配方，可适当地采取以下方法步骤：以小于1.4(w/w)、适当地小于例如1∶4.1、1∶4.2、1∶4.5、1∶4.75或1∶5的微生物细胞：载体比例将微生物细胞和载体混合；在10℃下放置混合物7天，然后可在3-4天的时间内在32.5-35％湿度的控制气氛中将混合物干燥至5％水含量或更少。
合适地，在与载体即将混合前，微生物培养物中微生物(例如细菌)的浓度为大约107-109个微生物/ml培养基，优选大约108个微生物/ml培养基。
合适地，如果载体为干的(即具有0％水含量)，例如在烘箱杀菌后，可在将培养的微生物和载体混合前加入少量等分试样的水和/或培养基。合适地，直到载体中的水分含量为被视为该载体的天然含量时才加入水和/或培养基。水和/或培养基的加入防止由于混合过程中产生的热造成的细胞破坏。如果认为需要，可通过真空除去载体中积存的空气。
优选地，在混合培养物：载体混合物后，培育混合物约6小时以上，优选约8小时以上，优选12小时以上，优选约18小时以上，优选0.5-14天。更优选将培养物：载体混合物培育约12小时以上。合适地，将培养物：载体混合物培育约12小时至约14天。
合适地，在混合后，可在5℃-30℃下、优选10℃-15℃下将培养物：载体混合物培育约0至约14天，优选0.5-约14天。在培育过程中，允许微生物生长并增殖。优选地，如果培育培养物：载体混合物超过1天，则在该培育期间不发生除湿。
合适地，可在过程中的任何时刻进行脉冲电磁场(PEMF)-处理。例如，可在以下阶段中的一个或多个中进行PEMF处理：在微生物的培养过程中；在将培养的微生物和载体混合的过程中；在将培养的微生物和载体混合后；在培养物：载体混合物(任选的)培育过程中；在培养物：载体混合物的干燥过程中；在干燥的培养物：载体混合物的储存过程中；在施加到种子或种子成分上后；在将培养物：载体混合物干燥后的任何时刻；在将干燥的培养物：载体混合物再水化(re-hydration)后的任意时刻。
在一种实施方案中，优选在微生物的培养过程中进行PEMF处理。
在另一种实施方案中，合适地，可在微生物的培养过程中进行PEMF处理，并任选地在培养物：载体混合物的培育过程中再次进行。
合适地，可有一次以上的PEMF处理。在一种实施方案中，可有二次以上的PEMF处理。
在一种实施方案中，可在连续发酵罐中培养微生物，并在全部或部分培养物被进一步处理前将微生物在发酵罐的一个区域中暴露于PEMF处理，任选地，部分培养物被再循环回到发酵罐中。通常，当从发酵罐通过管道(如管，合适地为盘管(wound tube))时，微生物可被暴露于PEMF。
合适地，每次PEMF处理可从约0.5h至约48h，优选在约4h至约24h，优选在约8h至约16h。
在一个方面中，优选恰好在将细菌培养物与载体混合前用PEMF处理细菌培养物1-16小时。
但是，可以预见，每次PEMF处理可包括大量PEMF处理，每次处理持续几分钟(即1-20分钟，优选1-10分钟，更优选1-5分钟)。合适地，可将微生物暴露于一次以上处理，优选二次以上，优选三次以上，优选四次以上，优选五次以上，优选六次以上，优选七次以上，优选八次以上，优选九次以上，或优选10次以上处理。
如本领域的技术人员所理解的，在本发明的方法中可使用产生脉冲电磁场(PEMF)的任何装置。
US 6,561,968中教导了一种这样的装置(该参考文献并入本文作为参考)。US 6,5619,68中的装置包括多个各自具有中心轴的导电线圈，每个中心轴定向于微生物；和操作上连接到每个线圈用于供应在每个线圈内传导的一系列电流脉冲的脉冲产生器，系列脉冲适合从感应电场的每个线圈中产生周期性变化磁场。在US 6,561,968的装置中，存在大量成对线圈，每对线圈包括第一线圈和相邻的第二线圈。对于脉冲产生器提供的给定脉冲，第一线圈中心处的磁场定向于微生物上，第二线圈中心处的磁场定向远离微生物。
线圈的中心轴为沿管状线圈的中心轴对称轴垂直定向或垂直(位于中心)于扁绕线圈(flat coil)的平面。
由于PEMF装置可产生热，因此可预见装置可另外包括冷却装置。
脉冲型电磁场(PEMF)为最常用的电磁治疗类型，尤其用于骨愈合、关节炎治疗和运动以及重复性应激损伤。许多不同的商业型PEMF装置已被报道用于保健。仅仅作为例子，一种这种PEMF装置为Curatron 2000-系列；Wavetek；Bi Osteogen装置。技术人员将容易地知道其它PEMF装置。可以预知，根据本发明，可使用这些装置中的任何一个。
优选地，将微生物干燥到接近载体天然水分含量的水分含量，一般其在约3至约6％(w/w)之间。
优选地，干燥微生物培养物：载体混合物。合适地，将微生物培养物：载体混合物干燥到接近载体天然水分含量的水分含量，其在约1wt％至约7wt％之间，优选约3wt％至约6wt％之间。
不希望受理论约束，已经令人惊讶地发现，具有少于6wt％水的载体中细胞的PEMF处理能大大增加微生物(尤其是细菌)的保存期限，少于6wt％水即其中Aw(水分活性)小于约0.7，合适地小于约0.5。发现可提高保存期限例如到1年以上。
水分活性(Aw)表示混合物中水对细菌的相对可用性。1或接近1的水分活性表示细菌不处于休眠状态，而处于活的状态；而小于0.9、优选小于约0.7的水分活性意味着微生物将处于休眠状态。同样，约0.4-0.6的水分活性意味着细菌将处于休眠状态。优选地。根据本发明，干的培养物：载体混合物的水分活性小于0.9，优选小于约0.7，优选约0.4-0.7，优选约0.6。
在本发明中，第一次显示PEMF处理可用于延长干的休眠微生物的保存期限。
优选地，空气干燥微生物和/或微生物培养物：载体混合物。合适地，可使用强制通风干燥。例如，可将培养物：载体混合物放置在出口栅格上方的空气层流试验台上。在这种情况下，干燥可在小于1天内发生，优选在约16小时内。或者，可使用在盘中或类似容器中的简单室内空气干燥。优选在约10℃-30℃、一般约20℃-24℃的温度下和小于75％、优选约30-60％、更优选约32.5-35％的相对湿度下进行室内空气干燥。对于室内空气干燥，干燥可能需要1至5天，优选1至4天，合适地为3-4天。合适地，在室内空气干燥过程中，在气氛中有Ca2+离子对微生物存活可为有利的。作为又一种替代方案，可通过将培养物：载体混合物放在袋中进行干燥，所述的袋例如Milli-WrapRTM袋，该袋允许水分蒸发。
将水分水平逐渐降低到约1％至约6％(w/w)之间。
可在非无菌条件下进行干燥步骤。
根据本发明的方法可包括研磨微生物培养物：载体混合物的组合物和/或用该组合物包覆种子或其它繁殖材料的更多步骤。
例如，可使用空气分级磨(classifier mill)将干燥的产物磨碎到约0.1-约150微米的最终粒度。
在一种实施方案中，合适地，可在约10-15℃和约18-33％(湿重)的水分含量下培育培养物：载体混合物，然后在饱和氯化钙上在20℃下干燥3-4天，提供大约32.5％的相对水分，或然后在少于24小时内快速干燥。可将培养物：载体混合物的水分含量减少到约4-约7％。
在一种实施方案中，载体的pH或微生物培养物：载体混合物的pH为约6-约9，优选约7-约9，更优选约8-约9，更优选约8.2-约8.8，更优选约8.6。
在一种实施方案中，优选向载体中加入尽可能少的液体。通常在一些情况下，过多的培养基可能意味着干载体中细菌存活率的降低。
优点和令人惊讶的发现
发现根据本发明的方法处理的微生物能明显更好地在干燥后存活，即比如果仅使用载体和/或如果单独进行PEMF处理具有更好的初始存活率。但是，特别发现，载体与PEMF处理的组合能使微生物在干燥阶段存活明显更长的时间且存活得更好，即增加了干微生物的保存期限。令人惊讶和意想不到地，与任何一种单独处理相比，这些处理尤其对干微生物保存期限的组合效果是协同性的。
本文使用的术语“初始存活率”是指微生物在干燥例如0-约14天、合适地为1-约5天、合适地为2天后立即试验时承受实际干燥过程的能力，在干燥后且不管干燥的微生物或干燥的培养物：载体混合物是否被包覆到例如种子或其它繁殖材料上。
本文使用的术语干燥微生物的“保存期限”是指微生物在长时间储存后一旦再水化时生长和/或增殖的能力，即微生物在干燥状态下长时间(例如至少24小时，至少48小时，至少6个月，或至少12个月)储存后存活、被再水化重新激活和成为活的可培养细胞的能力。
为了再进一步提高初始存活率和/或保存期限，可向培养物中加入渗透保护剂(osmoprotectant)或细胞稳定剂(cell stabiliser)。例如，向培养物中加入10-100mM蔗糖可使存活微生物如假单胞菌属菌种的数目增加大约10倍。其它已知的保护剂和细胞稳定剂包括氨基酸和它们的衍生物、胆碱、ectoine、二价阳离子、碳水化合物、甘油、树胶、抗氧化剂、非脂肪乳固体、结晶纤维素、羧甲基纤维素(CMC)和CMC衍生物。
根据本发明，使用本发明的方法干燥并被包覆到粒状(pelleted)甜菜种子上的根移植的对抗性(root colonising antagonistic)假单胞菌可在种子上以足够高的数量存活1.5年以上，并仍恢复它们对病原体的生物对抗性和它们的根移植特性。
用途
可将包括通过本发明的方法制备的干微生物的组合物用于将以下中的一种或多种施用到种子或其它植物繁殖材料上：生物控制剂；生长刺激剂；杀真菌剂；杀虫剂。
可将包括通过本发明的方法制备的干微生物的组合物直接施加到温室和土壤中的生长培养基中。
另外，可将包括通过本发明的方法制备的干微生物的组合物用于污水清洁和/或化学/生物溢出物(spills)如农场溢出物的清除。或者，当组合物包括有生物补救能力的微生物时，可将组合物用于清洁污染的固体，例如PCB污染的固体。有生物补救能力的微生物是众所周知的，并可为能降解有毒化合物的任何微生物，包括但不限于基因修饰的微生物。
或者，可将包括通过本发明的方法制备的干微生物的组合物用于将微生物施加到食品和/或动物饲料上。用于食品工业的合适微生物是众所周知的，并可为例如乳酸菌。
另外，可将包括通过本发明的方法制备的干微生物的组合物用于医疗应用，例如用于乳酸菌的供应。
协同效应
在包括干微生物的组合物的制备中，使将微生物培养物和载体混合与用脉冲电磁场(PEMF)处理的组合产生对初始存活率和/或微生物保存期限的协同效应。
可通过观察下列处理后活的可培养微生物细胞的数目来确定协同作用：a)将微生物培养物和载体混合；b)用PEMF处理；或c)a)和(b)的组合。当组合(c)比单独处理(a)或(b)的任何一个产生更好的效果(即当评价初始存活率和/或当评价微生物的保存期限时更多的活的可培养细胞)时显示了协同作用。优选地，当评价初始存活率和/或当评价微生物的保存期限时，与通过处理(a)产生的活的可培养微生物细胞数加上通过处理(b)产生的活的可培养微生物细胞数相比，组合处理(c)产生更多的活的可培养微生物细胞。
食品
本文使用的术语“食品”具有宽泛意义--并覆盖了人的食品以及动物的食品(即饲料)。在优选的方面中，食品用于人食用。
食品可为溶液或固体形式—这取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。
食品成分
本发明的组合物可用作食品成分。
本文使用的术语“食品成分”包括加入或可加入到功能食品或食品中的配方，并包括可在要求例如酸化或乳化的各种产品中以低水平使用的配方。
食品成分可为溶液或固体形式--取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。
食品补充剂
本发明的组合物可为--或可被加入到--食品补充剂。
功能食品
本发明的组合物可为--或可被加入到--功能食品。
本文使用的术语“功能食品”是指不仅能提供营养效果和/或味觉满足，而且能为消费者带来更多有益效果的食品。
尽管没有功能食品的法定定义，但关注该领域的大多数团体都认为它们是作为具有特定保健作用而销售的食品。
食品产品
本发明的组合物可用于制备食品产品，如以下中的一种或多种：糖果产品，乳制品，肉制品，家禽制品，鱼制品，和面包制品。
例如，本发明的组合物可用作以下的成分：软饮料、果汁或包括乳清蛋白的饮料、保健茶、可可饮料、牛奶饮料和乳酸菌饮料、酸乳(yoghurt)、饮用酸乳和酒。
本发明还提供制备食品或食品成分的方法，该方法包括将通过本发明的方法产生的组合物或根据本发明的组合物与另外的食品成分混合。制备食品成分的方法也是本发明的另一方面。
药物
通过本发明的方法产生的组合物和/或根据本发明的组合物也可用作-或-用于制备-药物。本文中，在广泛的意义上使用术语“药物”，并包括人的药物以及动物的药物(即兽医应用)。在优选的方面中，药物用于人应用和/或畜牧业(animal husbandry)。
药物可用于治疗目的--在性质上其可为治疗性的或姑息性的(palli ative)或预防性的。药物甚至可用于诊断目的。
当用作--或用于制备--药物时，可将本发明的组合物与以下中的一种或多种一起使用：可药用的载体，可药用的稀释剂，可药用的赋形剂，可药用的佐剂，药物活性成分。
药物可为溶液或固体形式--取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。
药物成分
通过本发明的方法产生的组合物和/或本发明的组合物可用作药物成分。本文中，本发明的产品和/或组合物可为单一活性组分或它可为多种(即2种或以上)活性组分中的至少一种。
药物成分可为溶液或固体形式--取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。
药物成分可为泡腾剂(effervescent)产品形式以改善药物的溶解性能。
化学工业
通过本发明的方法产生的组合物和/或本发明的组合物也可用作生物补救剂，即消耗和分解环境污染物。
形式(Forms)
通过本发明的方法产生的组合物和/或本发明的组合物可以以任何合适的形式使用。
形式的合适例子包括以下中的一种或多种：片剂，丸剂，胶囊，胚珠(ovulcs)，溶液或悬浮液，它们可包含调味剂或着色剂，用于即时释放、延时释放、改进释放、持续释放、脉冲释放或控制释放应用。
例如，如果产品和/或组合物以片剂形式使用--如用作食品成分--片剂还可包含以下中的一种或多种：赋形剂，崩解剂(disintegrant)，造粒粘合剂(granulation binder)或润滑剂。
用于制备形式的营养学可接受载体的例子包括例如水、盐溶液、醇、硅酮(silicone)、蜡、凡士林(petroleumjelly)等。
用于形式的优选赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、奶糖或高分子量聚乙二醇。
对于含水悬浮液和/或酏剂(elixirs)，通过本发明的方法产生的组合物和/或本发明的组合物可结合各种甜味剂或调味剂、着色物质或染料、乳化剂和/或悬浮剂、和稀释剂如水、乙醇、丙二醇和甘油，及其组合。
形式还可包括明胶胶囊、纤维胶囊、纤维片剂等。
实施例
现在将仅通过实施例描述本发明，其中参考以下图：
图1显示了在4天内缓慢干燥前用PEMF(55V)处理0、8、16或48小时并与沸石载体混合后，包覆到粒状甜菜种子上的干燥的荧光假单胞菌(处理后0-544天)的初始存活率和保存期限；
图2显示了快速干燥前用PEMF(55V)处理0、8、16或48小时并与沸石载体混合后，包覆到粒状甜菜种子上的干燥的荧光假单胞菌(处理后0-544天)的初始存活率和保存期限；
图3显示了与载体水分含量相比的荧光假单胞菌的平均存活百分比。
实施例1-PEMF处理与载体组合对干微生物的初始存活率和保存期限的影响
在液体LB中培养荧光假单胞菌株DS96.578过夜至接近静止期(stationary phase)，用新鲜LB稀释10倍，并按1∶2比例混合到斜发沸石载体内(斜发沸石-Na，可从丹麦NorNatur作为KlinominTM得到)。然后通过在层流气流试验台中进行空气干燥以将混合物干燥至大约22％水分含量，装袋，并在10℃在大约22％(w/w)水分水平下培育10天。在该阶段结束时，将载体在55伏(55V)下暴露于脉动电磁场处理(PEMF处理-2mV/cm，50Hz下)不同的时间(8、16、24和48小时)或不暴露于PEMF处理(0小时)。PEMF装置为US 6,561,968中教导的装置。在培育期间，细菌菌落增加到2x108至7.1 x 108个细菌/克沸石。然后在包覆到粒状甜菜种子上前将培养物：沸石混合物干燥到3％-6％(w/w)水分含量。在16小时内通过强制空气干燥或通过将混合物放置在相对湿度约35％的室中缓慢干燥4天完成将培养物：沸石混合物干燥到3％-6％(w/w)。
在处理后第2、71和544天(基于菌落形成单位(CFU)/种子)评价甜菜种子上细菌的存活(包括初始存活率和保存期限)。
结果提供在下面的表中和图示在图1(慢干燥)和图2(快干燥)中。
Figure S05817665220061205D000201
从图可看出，PEMF处理(2mV/cm，50Hz下，55V)与载体组合增加了干燥种子包覆细菌在一段时间内的初始存活率和保存期限。与用PEMF处理的载体包覆的种子相比，在544天储存后没有从以未经PEMF处理的培养物：载体混合物包覆的种子中分离出菌落形成细菌。
实施例2-PEMF处理与载体组合对干微生物初始存活率和保存期限的影响
在液体LB中培养荧光假单胞菌菌株DS96.578过夜。在液体培养后，用新鲜LB培养基将细菌培养物稀释10倍，并按50ml细菌培养物对100g斜发沸石(1∶2)比例与灭菌的斜发沸石混合。在轻轻混合后，将1∶2培养物：斜发沸石混合物缓慢空气干燥到123g。然后在10℃下培育细菌培养物：斜发沸石混合物10天。在培育期结束时，将培养物：斜发沸石混合物分成两等份，其中一份暴露于50V PEMF处理(2mV/cm，50Hz下，55V)16小时，而另一份按相同方式处理，除了不暴露于PEMF。在这种处理后，通过将混合物放置在盘中在35％湿度的气氛中保持4天将细菌培养物：斜发沸石混合物干燥至4-6％水分含量(w/w)。在10℃培育干燥的载体。通过将1g 混合物溶解在10ml 0.9％NaCl中并在固体LB平板上涂布(plating)100微升这种溶液来测定能在固体LB-培养基上形成菌落的细菌数目。
0、73、121、182和408天后载体中菌落形成细菌的数目提供在下面的表中。
Figure S05817665220061205D000211
从表可看出，细菌在干燥的载体中能很好地存活许多个月。约半年后，未用PEMF(2mV/cm，50Hz下，55V)处理的载体中细菌数目开始减少，而菌落形成细菌的数目停留在大致同样高的水平一年以上。显然，对混入到载体内的细菌进行PEMF处理然后将混合物干燥到水分活性低于允许细菌活性生长的水平的水平，导致再水化后能形成菌落的细菌的可储存性增强。
实施例3：两种载体的比较：斜发沸石和海泡石
在液体Luria-Bertoni(LB)培养基中培养荧光假单胞菌菌株DS96.788(Rif抗性)过夜，用新鲜的LB-培养基稀释10倍，按大约1∶1(w/w)培养物：载体混合物将稀释的培养物混入到以下载体(斜发沸石和海泡石)中。然后将载体干燥至大约25％水分含量(w/w)并在10℃培育10天。然后，将载体干燥至10％和25％之间不同的水分水平，并在10℃再培育23天。在固化琼脂上平板培养测定CFU/g载体：
载体中的水分含量(w/w)排列的大约相同的水平斜发沸石-海泡石 斜发沸石 海泡石
24.7％-23.6％ 1.6x10<sup>8</sup> 8.9x10<sup>7</sup>
20.6％-19.0％ 5.6x10<sup>7</sup> 1.1x10<sup>8</sup>
16.9％-17.2％ 2.9x10<sup>8</sup> 8.2x10<sup>7</sup>
15.0％-15.0％ 1.1x10<sup>8</sup> 5.6x10<sup>3</sup>
14.4％-13.7％ 1.6x10<sup>8</sup> 1.8x10<sup>6</sup>
11.6％-11.6％ 1.6x10<sup>8</sup> 4.4x10<sup>4</sup>
[0175]从上面的实施例可看出，每克载体的菌落形成细菌的数目在载体中不同的水分含量下相对稳定，为大约108个细菌/g斜发沸石，而在具有较低水分含量的载体中，海泡石载体中菌落形成细菌的数目则减少。
实施例4：不同载体中的细菌存活率
在三种不同的载体：蛭石、膨润土和斜发沸石中以菌落形成单位研究细菌存活率。膨润土和蛭石都是粘土的代表。斜发沸石(斜发沸石-Na)为沸石。在用50mM蔗糖补充的LB中过夜培养荧光假单胞菌菌株DS96.578的两份培养物。在培养的最后8小时，将培养物中的一份暴露于50V PEMF处理(2mV/cm，50Hz下，55V)。在培养结束时，用新鲜培养基将细菌培养物稀释10倍，并将23ml培养物与100g预先灭菌的载体混合。然后在10℃培育载体6天。在第6天，将带有未经PEMF处理的细菌的载体分成两等份，一份用PEMF处理(16小时，50V)，另一份不用。在第7天时，再将所有载体分成两份，其中一部分在滤袋(filterbag)中空气干燥过夜，而另一部分载体通过在相对湿度约35％的室中放置4天来缓慢干燥。干燥过程产生水分含量稍微高于它们的天然水分含量的载体。干燥后，将载体包覆到粒状甜菜种子上：每100,000个种子使用60g载体。对于单个步骤，下面的表中给出了通过复制的平板培养测定的菌落形成单位的数目。关于CFU/种子的数据来自用缓慢干燥的载体包覆种子。
细菌培养物在与载体混合时的CFU对于未处理的培养物为7.55x107CFU/ml，对于PEMF处理的培养物为6.65x107CFU/ml。
在没有载体材料的处理中，在细菌培养物中存在相同的细菌浓度。在这些处理中，将未与载体混合的细菌培养物包覆到种子上，按照处理的剩余物来评价包覆后2天的CFU/种子，并据此计算存活率％。
1.WC1：所用载体材料中的天然水含量(WC)
2.％surv：通过下式计算的菌落形成单位期望数目的百分比：
(CFU/种子)x100,000个种子/(CFU/g载体x60)。
3.用配备设为0628 0024的Aw值的Testo 650测量的Aw。
4.通过在105℃下干燥4小时测量的％WC。
N/A＝不适用
对于所用的全部载体材料，菌落形成单位(CFU)的数目在干燥载体中是高的，与所用的载体材料和干燥过程无关，虽然在大多数情况下，CFU数目在缓慢干燥的载体中更高。对于PEMF处理的细菌，可从包覆种子中重新分离出的菌落形成单位的百分比始终高于未处理的细菌。
如果不使用载体材料，不能从包覆的种子中分离出细菌或分离出数目非常少(1-100)的细菌。
因此，显然单独PEMF处理将不会增加包覆到种子上后细菌的存活率。另一方面，将细菌培养物加载到载体中(具有低的天然水保留能力)和PEMF处理(将培养物混合入载体材料之前或之后)的组合提高了可从种子中再分离的细菌的直接存活率(immediate survival)。
下面显示脱水至水分活性低于细菌活性生长水平的状态(休眠状态)后，在PEMF处理的细胞中发现增强的活力(vigour)，这可从施加到种子上之后菌落形成单位更高的存活率看出。
在10℃下储存缓慢干燥的载体322天，测定每克载体能形成菌落(CFU)的细菌数：可在下面的表中看到该结果。
Figure S05817665220061205D000241
从上面可看出，在平板培养后能形成菌落的细菌的存活率在斜发沸石和膨润土中是高的，在PEMF处理(2mV/cm，50Hz下，55V)后尤其高。与斜发沸石和膨润土相比，蛭石中的存活率下降，但与未处理的对照相比，仍通过PEMF处理得到提高。
在15℃下储存包覆的甜菜种子6个月。按如前所述测定每个种子的细菌数目(CFU/种子)。下面的表中给出了包覆后储存2天、28天和182天的结果。
1.％surv：通过下式计算的菌落形成单位期望数目的百分比：
(CFU/种子)x100,000个种子/(CFU/g载体x60g)。
从上图可看出，相对于未经PEMF处理的对照，在与载体混合前的细菌培养过程中用PEMF处理(2mV/cm，50Hz下，55V)或在混入到载体后用PEMF处理(2mV/cm，50Hz下，55V)的细菌的存活率在一段时间内增加。对于斜发沸石中的细菌，所述的增加在包覆后第182天时超过10倍，在蛭石和膨润土中增加为2-5倍。
实施例5：细菌培养物：载体的初始比例的影响
细菌通常对酸性刺激非常敏感。将细菌暴露于低pH一段给定的时间然后平板计数给出细菌培养物刺激耐受性的量度(measure)。进行试验以研究刺激耐受性作为细菌培养物与载体材料混合的初始比例的函数。
在20℃下在LB和补充有100mM蔗糖的LB中过夜培养荧光假单胞菌菌株96.578的液体培养物。按细菌培养物对干载体的不同比例(从大约1∶5到大约1∶2)将培养物混合入灭菌的斜发沸石载体内。在混合培养物：载体混合物超过20.4％后，通过在层流气流试验台中用空气将细菌悬浮液干燥到20.4％。包含20.4％细菌培养物的载体不再进一步干燥。此后，将载体装袋并在10℃培育7天。然后通过在盘中在32.5％相对水分水平下培育载体4天将载体干燥到大约5％水分。在干燥到5％水分水平后，将载体储存在密封的塑料袋中14天，然后通过将1克载体与10ml水或与10ml的pH为4.5的100mM柠檬酸缓冲液混合来测定每克载体的菌落形成单位。在这些介质中30分钟后，将细菌涂布到LB-板上并计数菌落形成单位。计算暴露于酸性刺激后菌落形成细菌相对于暴露于纯水的相同培养物的比例。
在LB培养基或补充有100mM蔗糖的LB中培养的细菌DS96.578：干燥至5％后14天时干燥载体中的CFU/g载体：
从上面表可看出，载体中可培养细菌的绝对数以及能承受暴露于低pH30分钟的细菌比例随细菌悬浮液对斜发沸石载体混合时比例的降低而增加。微生物对暴露到低pH的耐受性增加表明，细菌培养物对载体的比低于大约1∶4的比例时，混合物中的细菌群落处于承受刺激的较好条件，如在低水分水平下的长期储存，或物理刺激，如载体的处理，即把载体施加到种子上。
实施例6：细菌培养物和载体初始混合时混合比例的重要性
在液体LB中培养7个假单胞菌菌株和1个黄杆菌菌株(DS00.135)过夜。在液体培养后，用新鲜LB-培养基将细菌稀释10倍，并按50ml细菌培养物对100g斜发沸石(1∶2)或23ml细菌培养物对100g斜发沸石(1∶4)的比例与灭菌的斜发沸石混合。在轻轻混合后，将1∶2培养物：斜发沸石混合物缓慢地空气干燥到123g，而1∶4培养物：斜发沸石混合物未被干燥。因此，在这个阶段，所有的载体都保持有相同量的水分。然后在10℃培育细菌培养物：斜发沸石混合物10天。没有进行PEMF处理。在培育10天后，通过将混合物放在盘中在35％湿度的气氛中保持4天将细菌培养物：斜发沸石混合物干燥到4-6％水分含量(w/w)。干燥后，将干燥的培养物：斜发沸石混合物包覆到粒状甜菜种子上，并通过在将培养溶解的甜菜粒的平板复制到固体LB-培养基上后计数菌落来确定每个种子的可培养细菌数(CFU/种子)。结果显示在下面的表中。其清楚地表明了当与载体混合时不使用过多细菌培养物的重要性。
Figure S05817665220061205D000271
实施例7：细菌培养物和载体初始混合时非常低的混合比
下面给出的实施例说明，细菌培养物与载体初始混合时非常低的混合比将导致用干燥的细菌培养物：载体混合物包覆种子后大量细菌的均匀分布。
在补充有50mM蔗糖的液体LB培养基中培养假单胞菌菌株DS00.103过夜。在培养的最后8小时，将培养物暴露于PEMF(2mV/cm，50Hz下，55V)。在液体培养物中的PEMF处理后，用新鲜LB培养基将细菌培养物稀释10倍至1.15x 108CFU/ml。将7ml、8ml、9ml或10ml稀释的细菌培养物混入到50g膨润土载体中(这分别相当于培养物：载体比为1∶7.1、1∶6.25、1∶5.5和1∶5)，装袋并在10℃下培育7天。在培育期间，细菌群落增长到5x108至1.3x109个细菌/克细菌载体。培育后，通过将混合物放置在35％相对湿度的室中3天将培养物：载体混合物干燥至约5％水分含量。将这样干燥的细菌培养物：载体混合物磨碎成细粉，并将8ml/50g和10ml/50g混合物包覆到甜菜种子粒上(60g混合物/100,000个种子粒)。通过在0.9％NaCl-溶液中溶解25个种子粒30分钟然后将100微升此溶液涂布在固体LB-培养基平板上来测定每个种子的菌落形成单位的平均数。为了测定每个单个种子的菌落形成单位的数目，将来自每次处理的单个种子粒溶解在0.9％NaCl-溶液中并在固体LB-培养基上平板培养。
对于每次初始混合变量，下面的表中给出了每克载体的菌落形成细菌数、干载体中的水分含量和每个种子的菌落形成细菌的平均数。
  M1每  50g   载体   CFU/g  干载体   干载体中的  水分含量   包覆编码   CFU/种子
  7   5,25x10<sup>8</sup>   5,2
  8   8,70x10<sup>8</sup>   5,2   /657   2,0x10<sup>5</sup>
  9   1,29x10<sup>9</sup>   5,4
  10   1,12x10<sup>9</sup>   4,8   /658   1,4x10<sup>5</sup>
在下面的表中以增加顺序给出了在20个随机选择的单个粒中每个种子粒的菌落形成细菌数。
  种子粒号   包覆/657   CFU/种子   包覆/658   CFU/种子
  1   475x10<sup>4</sup>   150x10<sup>4</sup>
  2   5.10x10<sup>4</sup>   2.50x10<sup>4</sup>
  3   6.00x10<sup>4</sup>   3.40x10<sup>4</sup>
  4   8.00x10<sup>4</sup>   4.35x10<sup>4</sup>
  5   8.50x10<sup>4</sup>   4.90x10<sup>4</sup>
  6   9.50x10<sup>4</sup>   6.05x10<sup>4</sup>
  7   1.05x10<sup>5</sup>   8.00x10<sup>4</sup>
  8   1.20x10<sup>5</sup>   9.00x10<sup>4</sup>
  9   1.25x10<sup>5</sup>   1.00x10<sup>5</sup>
  10   1.30x10<sup>5</sup>   1.05x10<sup>5</sup>
  11   1.35x10<sup>5</sup>   1.25x10<sup>5</sup>
  12   1.80x10<sup>5</sup>   1.35x10<sup>5</sup>
  13   1.95x10<sup>5</sup>   1.45x10<sup>5</sup>
  14   1.95x10<sup>5</sup>   1.55x10<sup>5</sup>
  15   1.95x10<sup>5</sup>   1.70x10<sup>5</sup>
  16   2.00x10<sup>5</sup>   1.90x10<sup>5</sup>
  17   3.55x10<sup>5</sup>   2.05x10<sup>5</sup>
  18   4.40x10<sup>5</sup>   3.20x10<sup>5</sup>
  19   9.35x10<sup>5</sup>   4.60x10<sup>5</sup>
  20   1.18x10<sup>6</sup>   7.55x10<sup>5</sup>
从上面两个表清楚看出，即使在细菌培养物对载体的比例低于1∶5时，每克载体的细菌数也是高的。还清楚的是将来自具有这些低细菌培养物：载体混合物的载体的细菌施加于种子时的精确度足够好以实际用于将细菌包覆到种子上。这个试验中单个种子上的均匀分布强有力地表明，在初始培养物：载体混合比例为1∶5(wt/wt)和低于1∶5(wt/wt)时细菌将被均匀地分布在载体材料中。
实施例8：干燥至不同水分含量的斜发沸石载体
在补充有10mM海藻糖(trehalose)的液体LB-培养基中培养荧光假单胞菌过夜。在液体培养后，用新鲜LB-培养基将细菌悬浮液稀释10倍，将52ml培养物混入到天然水分含量为5.5％的100g斜发沸石载体中。然后将混合物空气干燥至约22％水分含量，装袋并在10℃培育10天。培育期后，通过将混合物在35％相对湿度中放置不同时间(多至4天)将培养物：载体混合物干燥至不同的水分含量。通过在将载体样品加热到105℃保持4小时后测量失重(weight loss)来测定干燥载体的实际水分含量。重复试验三次。在固化培养基上平板培养后测定第0天的每克载体的菌落形成细菌数。在10℃在密封塑料袋中储存载体365天，并测定每克载体菌落形成细菌数。下面的表显示了关于此的结果：
Figure S05817665220061205D000291
将荧光假单胞菌的平均存活百分率对比载体的水分含量示于图3。
从结果可看出，细胞在干载体中的储存产生较少的活(菌落形成单位)细菌的相对损失。细菌在水分含量为7.5％-多至20％的相同载体中的储存产生显著的活细胞相对损失。
上面说明书中提到的所有出版物并入本文作为参考。只要不脱离本发明的范围和精神，本发明所述方法和系统的各种改进和变化对于本领域那些技术人员将是显而易见的。尽管已结合具体优选的实施方案描述了本发明，但应认识到所要求的发明不应不适当地限制于这些具体实施方案。事实上，对于生物化学和生物技术或相关领域的那些技术人员显而易见的实施本发明的所述方式的各种改进应包含在下面权利要求的范围内。

Claims (26)

1.一种制备包括干微生物的组合物的方法，其包括：培养一种或多种微生物；将培养的微生物与一种或多种载体混合，使培养物与载体的比例小于1∶4(w/w)；用脉冲电磁场处理微生物；培育培养物：载体混合物至少6小时；和干燥微生物以便将水分水平降低到1wt％至6wt％。
2.根据权利要求1的方法，其中微生物为真菌、细菌、藻类或原生动物中的一种或多种。
3.根据权利要求2的方法，其中真菌为酵母。
4.根据权利要求3的方法，其中酵母来自以下属中的一种或多种：假丝酵母属、隐球酵母属、Cystofilobasidium、汉森酵母属、克鲁维氏酵母属、白冬孢酵母属、梅奇酵母属、毕赤酵母属、红冬孢酵母属、Rodotorula、糖酵母属、掷孢酵母属、Richosporon。
5.根据权利要求2的方法，其中真菌来自以下属中的一种或多种：Acrophialospora、Ampelomyces、短梗霉属、双极菌属、毛壳属、Cladorrhinum、Clonostachys、盾壳霉属、附球菌属、粘帚霉属、Glomus、镰孢属、Laetisaria、小球壳孢属、Mycothecium、Muscador、Mycoleptodiscus、新赤壳属、拟青霉属、青霉属、隔孢伏革菌属、Phlebiopsis、瓶霉属、腐霉属、丝核菌属、根霉属、喙孢属、葚孢属、Sporothrix、Stephanonectria、篮状菌属、Tilletiopsis、木霉属、单隔孢属、轮枝孢属、被毛孢属、漆斑菌属、Nematophthora、指隔孢属、枝顶孢霉属、链枝菌属、柱孢属、指隔孢属、单顶孢属和Pochonia。
6.根据权利要求2的方法，其中细菌为以下属中的一种或多种：游动放线菌属、土壤杆菌属、节杆菌属、芽胞杆菌属、双歧杆菌属、短芽孢杆菌属、伯克霍尔德氏菌属、金色单胞菌属、丛毛单胞菌属、肠杆菌属、肠球菌属、欧文氏菌属、黄杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属、巴斯德氏芽菌属、泛菌属、类芽孢杆菌属、假单胞菌属、拉恩氏菌属、Raoultella、沙雷氏菌属、寡养单胞菌属、链球菌属、链霉菌属、根瘤菌属、慢生型根瘤菌属、Mezorhizobium、Sinorhizobium、链霉菌属和诺卡氏菌属。
7.根据权利要求2的方法，其中细菌为非孢子形成细菌。
8.根据权利要求7的方法，其中非孢子形成细菌选自游动放线菌属、土壤杆菌属、节杆菌属、双歧杆菌属、短芽孢杆菌属、伯克霍尔德氏菌属、金色单胞菌属、丛毛单胞菌属、肠杆菌属、肠球菌属、欧文氏菌属、黄杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属、泛菌属、片球菌属、假单胞菌属、拉恩氏菌属、Raoultella、沙雷氏菌属、寡养单胞菌属、链球菌属、链霉菌属、根瘤菌属、慢生型根瘤菌属、Mezorhizobium、Sinorhizobium Seratia、欧文氏菌属、链霉菌属和诺卡氏菌属。
9.根据前述权利要求中任意一项的方法，其中载体为以下中的一种或多种：沸石载体，粘土载体，土质硅化合物。
10.根据权利要求9的方法，其中沸石载体选自以下中的一种或多种：方沸石，钙霞石，菱沸石，斜发沸石，堇青石，钡沸石，毛沸石，八面沸石，镁碱沸石，钠菱沸石，片沸石，浊沸石，插晶菱沸石，中沸石，丝光沸石，钠沸石，钾沸石，方碱沸石，钙十字沸石，发光沸石，钙沸石，杆沸石，ZSM和ZK。
11.根据权利要求10的方法，其中沸石载体为斜发沸石。
12.根据权利要求9的方法，其中粘土载体为下列粘土中的一种或多种：凹凸棒石，膨润土，漂白土，埃洛石，伊利石，高岭土，叶蜡石，蛭石，海泡石，蒙脱石和莫来石。
13.根据权利要求9的方法，其中土质硅化合物为下列中的一种或多种：石棉，硬水铝石，硅藻土，长石，云母，石英，砂和二氧化硅。
14.权利要求1的方法，其中将培养的微生物和载体混合使得培养物对载体的比例等于1∶5或小于1∶5。
15.权利要求1的方法，其中在下列阶段的一个或多个中进行脉冲电磁场处理：在微生物的培养过程中；在将培养的微生物和载体混合的过程中；在将培养的微生物和载体混合后；在培养物：载体混合物的培育过程中；在培养物：载体混合物的干燥过程中。
16.根据权利要求15的方法，其中在微生物的培养期间进行脉冲电磁场处理。
17.根据权利要求15的方法，其中在微生物的培养期间和再次在培养物：载体混合物的培育期间进行脉冲电磁场处理。
18.根据权利要求15的方法，其中只有一次脉冲电磁场处理。
19.根据权利要求15的方法，其中有一次以上脉冲电磁场处理。
20.根据权利要求1的方法，其中将培养物：载体混合物培育0-14天。
21.根据前述任一权利要求的方法，包括用所述组合物包覆植物种子或其它繁殖材料。
22.通过根据权利要求1-20中任意一项的方法制备的包括干微生物的组合物，其中载体是沸石载体。
23.根据权利要求1-20中任意一项的方法在延长干的休眠微生物的保存期限中的用途。
24.制备包覆的植物种子或其它植物繁殖材料的方法，包括用通过根据权利要求1-20中任意一项的方法制备的包括干微生物的组合物包覆植物种子或其它植物繁殖材料。
25.制备生长培养基的方法，包括将通过根据权利要求1-20中任意一项的方法制备的包括干微生物的组合物和土壤混合。
26.处理废水的方法，包括将通过根据权利要求1-20中任意一项的方法制备的包括干微生物的组合物与废水接触并分离处理的水和组合物。
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