CN1950502A - 心肌收缩性和心力衰竭倾向的调节 - Google Patents

心肌收缩性和心力衰竭倾向的调节 Download PDF

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Abstract

本发明的方法和组合物用于在转基因动物中改变PKCα的表达。本发明的组合物包括分离的转基因动物细胞、转基因组织、转基因动物和转基因小鼠。本发明的转基因动物显示具有改变的PKCα活性。所述方法可以产生具有改变的PKCα表达的转基因动物。本发明可以进行心肌收缩能力的调节。具体地讲，本发明提供一种改变转基因动物对心肌病易感性的方法。一种本发明的转基因动物用于鉴定抗心肌病化合物。

Description

心肌收缩性和心力衰竭倾向的调节
政府资助信息
本发明是在政府支持下进行的，NIH资助号为HL62927、HL26057、和HL64018。美国政府在本发明中享有某些权利。
发明领域
本发明涉及心肌收缩能力和心肌病显型的调节、对相同症状的预防和治疗以及涉及相同症状的转基因小鼠。
发明背景
心力衰竭使估计为5百万的美国人遭受痛苦，同时每年新增约400,000的患者，年度花费超过二百亿美元(Lloyd-Jones等人(2002)Circulation 106：3068-3072)。在过去二十年里使用的主要治疗方法基于对心肌收缩能力的药理学操纵(Remme，W.J.(2001)Cardiovasc.Drugs Ther.15：375-377；Felker等人(2001)Am.J.Heart 142：393-401；Packer，M.(2001)Am.J.Med.110 Suppl 7A：81S-94S)。心力衰竭的特征在于收缩性的逐步丧失、心室增大、增大的外周血管阻力和/或失调的液体平衡。正性肌力剂最初被用作一种增强心脏泵功能的方法，然而现在仅利用紧急救治患严重心力衰竭的病人，因为它们对病人的长期存活产生危害(Felker等人(2001)Am.J.Heart 142：393-401)。最近，对β-肾上腺素受体的药理学阻塞已经成为受青睐的治疗心力衰竭的方法，虽然仍旧不能确定是否β-阻塞剂通过减少心肌收缩能力(短期)或增加它(长期)对心肌有益(Packer，M.(2001)Am.J.Med.110Suppl 7A：81S-94S；Bristow M.W.(2000)Circulation 101：558-569；Bouzamondo等人。(2001)Fundam.Clin.Pharmacol.15：15：95-109)。与人类心脏衰竭相关的其它两个特征是钙平衡失调和神经内分泌刺激剂增加，信号通过Gαq-和Gαs-联结的受体。
多种人类疾病和由心脏异常或心脏功能不良表明的状况能导致心力衰竭。心力衰竭是一种心脏未能泵出足够的血液以达到身体循环需要的生理状况。在基因不同的人中对这种疾病和状况的研究是困难的和不可预知的。因而，需要一种有利于鉴定心肌病的潜在治疗剂的模型体系。
当受到一组神经体液因子刺激或当遇到心室壁肌张力增加时，心肌出现适应性肥大反应。心脏肥大是一种心脏对多种形式的心脏病的适应性反应，包括那些由高血压、机械载荷、心肌梗塞、心律不齐、内分泌失调和/或心脏收缩蛋白基因的基因突变引起的心脏病。虽然肥大反应最初是一种增加心输出量的补偿机制，但持续的肥大会导致心力衰竭和突然死亡。
心脏肥大的原因和结果已被文献证实，但是将细胞膜处起始的肥大信号与心肌细胞基因表达的重组连接起来的根本机制仍少为人知。对这些机制的阐明是心血管生物学的一个中心课题，并且对设计新的策略来预防或治疗心脏肥大和心力衰竭来说是重要的。
研究已经涉及细胞内Ca2+作为心脏肥大的一种信号。响应肌细胞的拉伸或者在工作心脏制备上增加的载荷，细胞内的Ca2+浓度增加(Marban等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：6005-6009；Bustamante等人(1991)J.Cardovasc.Pharmacol.17：S110-S113；和Hongo等人(1995)Am.J.Physiol.269：C690-C697)，与Ca2+在调节生理反应和提高的心输出量中的作用一致。
肥大刺激导致成人肌细胞中的基因表达的重组，这种编码胎儿蛋白质异构体，如β-肌球蛋白重链(MHC)和α-骨骼肌肌动蛋白的基因是上调的，然而相应的成人异构体α-MHC和α-心肌肌动蛋白是下调的。通过血管舒张和尿钠排泄降低血压的钠尿肽、心房利尿钠因子和b-型钠尿肽，响应肥大信号在心脏中也是迅速下调的。(Komuro和Yazaki(1993)Ann.Rev.Physiol.55：55-75)。在肥大期间协同调节这些心脏基因所涉及的机制是未知的。
许多信号分子的特征在于是这种疾病响应后遗症的重要转导子，包括，但不限于，具体的G-蛋白异构体、低分子量GTPases(Ras、RhoA、Rac)、丝裂原激活的蛋白致活酶(MAPK)、蛋白致活酶C(PKC)、钙调磷酸酶、gp130-STAT、胰岛素样生长因子-I受体、成纤维细胞生长因子和转化生长因子β。例如，AngII、PE和ET-1表面受体的结合导致磷脂酶C的活化、引起甘油二酯和三磷酸肌醇的产生、细胞内Ca2+的动员和蛋白致活酶C的活化。这些信号途径在心脏肥大时期相互作用的程度是未知的(Molkentin等人(2001)Annu.Rev.Physiol.63：391-426)。
钙和/或类脂活化的丝氨酸-苏氨酸致活酶的蛋白致活酶C(PKC)家族在几乎所有的膜关联的信号转导途径的下游发挥作用(Molkentin等人(2001)Annu.Rev.Physiol.63：391-426)。大约12个不同的同工酶组成此PKC家族，它们通过其活化特征被广泛的分类。常规的PKC同工酶(PKCα、βI、βII和γ)是钙和类脂活化的，而新型同工酶(ε、θ、η和δ)和非典型的同工酶(ζ、ι、υ和μ)不依赖于钙，但是被不同的类脂活化(Dempsey等人(2000)Am.J.Physiol.Lung Mol.Physiol.279：247-251)。一旦被活化，PKC同工酶通过直接作用于停泊蛋白或称为RACK(Receptor for Activated C Kinases[活化的C致活酶受体])改变到不连续的亚细胞位置，停泊蛋白允许具体的底物识别和随即进行的信号转导(Mochly-Rosen，D(1995)Science 268：247-251)。
报道已经将PKC活化与肥大、扩张性心肌病、缺血性损伤或丝裂原刺激联系起来(DeWindt等人(2000)J.Biol.Chem.275：13571-13579；Gu & Bishop(1994)Circ.Res.75：926-931；Jalili等人(1999)Am.J.Physiol.277：H2298-H2304；Takeishi等人(1999)Am.J.Physiol.276：H53-H62)。例如，啮齿动物中的血液动力学压力过载刺激促进PKCα、β、γ、ε和θ移位。在多种培养心肌细胞中，激动剂和应力刺激也是有效的PKC同工酶移位激活因子。同工酶特异的肽抑制剂已经被使用于心肌细胞培养和转基因小鼠中以提供更大的PKC抑制的特异性。具体地讲，心肌细胞中的PKCβ C2结构域肽的过表达阻塞了弗波酯调节的钙通道的活性(Zhang等人(1997)Circ.Res.80：720-729)，然而一种PKCε抑制或活化肽影响了收缩变力性和缺血诱导的细胞损伤(Gray等人(1997)J.Biol.Chem.272：30945-30951；Johnson等人(1996)J.Biol.Chem.271：24962-24966；Dorn等人(1999)Proc.Natl.Acad Sci USA 96：12798-12803)。此外，腺病毒调节PKCε的基因转移进入培养的成年兔子心室肌细胞中，增加基础肌细胞收缩力和钙瞬变。肌细胞中的结果说明PKCε发挥提高心肌收缩能力的作用(Baudet等人(2001)Cardiovasc.Res.50：486-494)。
弗波酯在多细胞动物细胞中发挥急性生物学效应，与之最一致的是立即活化多种PKC同工酶。在心肌细胞中，PMA是多种同工酶移位和活化的有效诱导者，同工酶包括，但不限于，PKCα、β、δ和ε(Braz等人(2002)J.Biol.Chem.156：905-919)。因此，急性PMA给药可以被用以检查PKC移位对心脏收缩变力性和收缩力立即的但是非特异性的效果。急性弗波酯施用已经被用于评估PKC同工酶部分地调节全心或分离的肌细胞收缩性能的假说。例如，使用分离的小鸡心室肌细胞，PMA处理产生细胞缩短幅度的浓度和时间依赖性的降低，当在1μM药品时达到降低54％的最大值(Leatherman等人(1987)Am.J.Physiol.253：H205-209)。与这个效果相一致，PMA产生细胞内钙浓度和钙再摄取率的降低。相反，PMA预处理来自心脏的乳头肌加强α1-受体调节的正收缩变力性，证明使用PMA的非选择性的效果(Otani等人(1988)Circ.Res.62：8-17)。一项在成年大鼠分离的心室肌细胞中进行的分析显示PMA有急性负性收缩效果(Capogrossi等人(1990)Circ.Res.66：1143-1155)。这些作者使用1Hz稳定电场刺激钙浓度1mM的成人肌细胞，刺激之后PMA(10-7M)被使用以引起收缩幅度达对照品约60％的降低。在单个心肌细胞中钙响应的肌丝不受PMA的影响，但是负收缩变力的效果是由于减少的钙瞬变幅度。与此报道形成对比的是，一项使用有轻微差异的弗波酯，12-O-四葵酸佛波13-乙酯(TPA)的单独研究，显示了细胞缩短的显著增加和在松弛期间的细胞长度变化率的增加，说明PKC同工酶的活化提高了收缩性(MacLeod等人(1991)J.Physiol.444：481-498)。一项较为精心设计的在分离心肌细胞和完整豚鼠-猪心脏中的研究显示，使用10-12M PMA时发生显著的正收缩变力反应，但是当浓度高于10-10M PMA时发生负收缩变力反应(Ward和Moffat(1992)J.Mol.Cell Cardiol.24：937-948)。上述讨论的结果说明弗波酯调节的心肌收缩能力的变化是复杂的。
转基因小鼠已经被使用改变心脏中的PKC同工酶的表达来产生。小鼠心脏中PKCβ的或者野生型或者组成型活性缺失突变体的过表达据报道诱导了心肌病(Wakasaki等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：9320-9325；Bowman等人(1997)J.Clin.Invest.100：2189-2195)，但是最新的研究表明更低水平的表达或成人发病型PKCβ活化有利于缺血的恢复(Tiang等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.96：13536-13541；Huang等人(2001)Am.J.Physiol.Cell.Physiol.280：C1114-C1120)。三个研究组也报道了心脏中具有改变了的PKCε或PKCδ活性的转基因小鼠。小鼠心脏中PKCε或PKCδ活化肽的表达与每种同工酶的生理活化和轻度肥大反应相联系(Mochly-Rosen等人(2000)supra；Chen等人(2001)Proc.Natl.Acad Sci.98：11114-11119)。同样，小鼠心脏中的活化突变体PKCεcDNA的过表达据报道会诱导显著的心脏肥大(Takeishi等人(2000)Circ.Res.86：1218-1223)，但是这样的结果可能取决于PKCε过表达的绝对水平和活性(Pass等人(2001)Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.280：H946-H955)。然而许多研究已经证明了多种PKC同工酶和心脏肥大或缺血损伤之间的联系，具体的PKC同工酶的必需的和充分的功能仍在讨论中。例如，当小鼠心脏中的PKCβ、δ或ε的转基因过表达能引起心脏肥大时，这三个异构体的靶基因不明显地影响心脏，PKCβ缺失的小鼠也不会缺失肥大反应(Roman等人(2001)Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.280：H2264-H2270)。这些结果共同突出了本领域关于PKC同工酶作为心肌收缩能力调节因子的作用的混乱认识。PKCα基因去除小鼠已经被Legites等人产生Mol.Endocrinol.16，847-858)，显示PKCα通过PI3K增强胰岛素信号。
PKCα是小型和大型哺乳动物心脏中表达的主要PKC异构体，然而关于它在此器官中的功能了解甚少(Pass等人(2001)supra；Ping等人(1997)Circ.Res.81：404-414)。虽然许多相关的研究已经被公布，显示了PKCα活化和心脏肥大或心力衰竭之间的关系，几乎没有原因的或机制的数据被报道。使用培养的表达或者野生型或者主要是负性突变型的PKCα、β、δ和ε初生心肌细胞和重组腺病毒对PKC同工酶功能的增益和损失功能分析已经被进行。据报道，PKCα部分通过ERK1/2调节培养的初生肌细胞的肥大增长，但是它在心肌收缩能力中的作用是未知的(Braz等人(2002)supra)。同样，在培养初生心肌细胞中的对PKCα的反义硫代磷酸低聚核苷酸在激动剂刺激之后减少肥大基因的表达(Kerkela等人(2002)Mol.Pharmacol.62：1482-1491)。然而，这些观察报告都不包括体内PKCα的机制评估。
人们对多种PKC异构体潜在调节心肌收缩能力的作用了解很少。已知PKC异构体直接磷酸化肌蛋白，例如cTnI，它据报道由于肌动蛋白和肌球蛋白的相互作用影响最高ATPase活性的比率(de Tombe & Solaro(2000)Ann.Biomed.Eng.28：991-1001)。然而，仍然不清楚与PKA的良好效果相对照，是否PKC调节的收缩蛋白磷酸化显著地改变了心脏的性能。
因此，需要一种PKCα的体内作用的机制评估。它对发展调节心脏组织中的PKCα活性的方法来说是重要的。它对发展一种模型转基因体系来说也是重要的，这种体系用于鉴定PKCα调节和抗心肌病的化合物和研究心肌病。
人心力衰竭的治疗部分的基于根本的原因(假如已知)，以及其它的因素，包括疾病严重程度、现有的药物和其它的风险因素(例如冠心病、高血压、瓣膜缺损或血脂过多)。病人中的严重心力衰竭可由急性的和慢性的类型组成，它们需要不同的治疗。因此，目前的心力衰竭治疗策略的目标是或者急性的代谢失调心力衰竭(ADHF)或者心力衰竭的慢性重构效果。ADHF的治疗是一种未满足的医疗需要，在美国作为初步诊断每年有约1百万个住院额，作为二级诊断另外有2百万个住院额。ADHF的特点是由于对心脏的急性伤害造成的功能性的不足，例如，心肌梗塞、心律不齐，或可以被慢性心力衰竭的并发症促成，例如，发展的LV重构、心脏扩大症和肌细胞损失。在任一个例子中，病人需要立即的干预以获得成功的结果。目前对ADHF的治疗很大程度上取决于急救室中的症状，但是可以包括强心剂(例如多巴酚丁胺和米力农)、静脉注射利尿剂(例如呋塞米)和/或血管扩张药(例如奈西立肽(RTM)为了改善心肌性能和维持充分的心输出量。使用这些药物的目的是急性地提高或恢复心脏的收缩和松弛，并提供症状地改善。除了ADHF之外，上述提到的药物当被认为是存活的医疗必需品时，还被施用在任何心脏功能不良中(例如作为败血病的后果遗留的心室功能不良)，而不考虑病源学。在慢性心力衰竭中，药物治疗方案是不同的，并且普遍地包括剂如血管紧缩素-转换加工酶抑制剂、血管紧缩素受体阻塞剂、利尿剂和/或β-肾上腺素受体阻塞剂。这些药物不被施用于ADHF，并且事实上在这种情况下达不到预期目的(例如，β-肾上腺素受体阻塞剂)。虽然这些药物对心脏收缩或松弛提供很少的或没有立即的改善，它们已经被证明能改善心力衰竭病人的存活和心脏重构。因此，需要鉴定新的对象和它们的调节子以提供足够的心力衰竭急性和慢性有益效果。
发明概述
本发明基于一种新发现，即PKCα调节心肌收缩性和心肌病，并因此调节急性代谢失调心力衰竭(ADHF)和慢性心力衰竭。因此，据信调节PKCα活性能提供增强心脏收缩变力性和心室性能的治疗方法。本发明的转基因动物可用于鉴定预防和治疗失调的化合物，失调被心脏收缩能力和包括心脏肥大的心肌病调节。这些动物也可用于研究目的，用以检查涉及对肥大信号响应的信号转导途径。本发明还详细说明了测量体内PKCα活性以筛选PKCα活性的药理调节物的过程。
本发明的组合物包括转基因小鼠、转基因细胞和转基因组织。在一个实施方案中，本发明的转基因小鼠、细胞和组织包含一个表达弹夹，该弹夹包含可操作地连接到PKCα核苷酸序列的心脏组织优选的调节序列(序列标识号：1，NCBI访问号X04796)或片段或它们的变异体。变异体在序列标识号：7中被提出，并编码显示具有显性负性作用的多肽(序列标识号：8)。表达表达弹夹的细胞显示具有改变了的PKCα表达或活性。另一方面，本发明的转基因小鼠显示具有改变的心肌收缩能力。另一方面，本发明的小鼠显示具有改变的对心肌病的易感性。
另一方面，转基因小鼠、转基因细胞和转基因组织包含至少一个断裂的PKCα基因。一方面，此断裂足以减少或消除PKCα的表达水平。另一方面，本发明的PKCα缺失的小鼠显示具有改变的心肌收缩能力。另一方面，本发明的小鼠显示具有改变的对心肌病的易感性。
一方面，鉴定调节心肌收缩能力的化合物的方法被公开，包括：提供表达PKCα基因的第一和第二细胞、组织或小鼠；施用需鉴定的化合物到所述第一细胞；孵育第一和第二细胞一段合适的预定时间；测量所述第一和所述第二细胞中PKCα的活性；和鉴定那些与所述第二细胞的活性相比较，调节所述第一细胞中PKCα活性的化合物作为心肌收缩能力的调节物。
另一方面，鉴定调节心肌病的化合物的方法被公开，包括：提供表达PKCα蛋白的第一和第二细胞；施用需鉴定的化合物到所述第一细胞；孵育第一和第二细胞一段合适的预定时间；测量所述第一和所述第二细胞中的PKCα活性；和鉴定那些与所述第二细胞的活性相比较，调节所述第一细胞中PKCα活性的化合物作为心肌收缩能力的调节物。
另一方面，鉴定调节PKCα活性的化合物的方法被公开，包括：提供表达PKCα蛋白的第一和第二细胞；施用需鉴定的化合物到所述第一细胞；孵育第一和第二细胞一段合适的预定时间；测量所述第一和所述第二细胞中的PKCα活性；和鉴定那些与所述第二细胞的活性相比较，调节所述第一细胞中PKCα活性的化合物作为PKCα活性的调节物。
对于上述用以鉴定调节心肌收缩能力、心肌病、和PKCα活性的化合物的检测分析法；任何表达合适水平的PKCα蛋白的细胞可以被使用，例如，标准实验室来源的细胞系、心肌细胞细胞系、或任何动物来源的原代细胞、或组织。来自转基因小鼠或基因去除小鼠的细胞和组织；转基因动物自身；和本发明的显性负性突变型都适用于此目的。
PKCα活性调节物包括多种PKCα活性的抑制剂或激活因子，包括，但不限于，酶活性；移位活性；和与多种RACK的结合。
另一方面，使用上述方法鉴定的化合物还可以使用检测分析法被进一步验证，该分析法利用多种细胞培养、培养组织、或心肌收缩能力的动物模型、或本文所述的心肌病。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种在心脏组织中优先调节PKCα活性的方法。此方法包括提供转基因小鼠，该小鼠在至少一个细胞的基因组内包含稳定结合的表达弹夹。此稳定结合的表达弹夹包含一个心脏优选的调节序列，它可操作的连接到到序列标识号：1中提出的PKCα核苷酸序列、或片段或它们的变异体。感兴趣的变异体包括，但不限于，显性负性突变型例如定点突变型，它具有在序列标识号：7中提出的核苷酸序列。本发明还包括小鼠心脏组织中的PKCα表达水平的测定法。在此方法的一个方面，小鼠显示具有改变的心肌收缩能力。另一方面，小鼠显示具有改变的对心肌病的易感性。
在一个实施方案中，本发明提供了一种调节小鼠的PKCα表达的方法。此方法包括提供转基因小鼠，该小鼠在至少一个细胞的基因组内包含至少一个断裂的PKCα基因。本发明还包括小鼠中的PKCα表达水平的测定法。
在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗或预防动物中由异常心肌收缩能力引起的急性心力衰竭的方法。此方法包括给动物施用PKCα调节化合物的步骤。在此发明的一个方面，PKCα调节化合物被施用到该动物的心脏组织。在此发明的一个方面，PKCα的调节化合物是一种PKCα抑制剂。在此发明的一个方面，此方法增强动物的心肌收缩能力。合适的动物包括，但不限于小鼠、豚鼠、仓鼠、人、兔子、狗、猪、山羊、母牛、大鼠、猴子、黑猩猩、绵羊和斑马鱼。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗或预防动物心肌病的方法。此方法包括给动物施用PKCα调节化合物的步骤。在此发明的一个方面，PKCα调节化合物被施用到该动物的心脏组织。在此发明的一个方面，PKCα的调节化合物是一种PKCα抑制剂或激动剂。在此发明的一个方面，本方法降低动物的对心肌病的易感性。合适的动物包括，但不限于小鼠、豚鼠、仓鼠、人、兔子、狗、猪、山羊、母牛、大鼠、猴子、黑猩猩、绵羊和斑马鱼。
可用于治疗心肌收缩能力或心肌病的PKCα抑制剂包括，但不限于核酸、抗体、小分子、激活因子与抑制剂肽、和Ro-32-0432、LY333531和Ro-31-8220。
本发明也提供了进行PKCα调节化合物的鉴定方法的试剂盒。本发明的一个方面，用来识别PKCα调节化合物的试剂盒包括一个PKCα指示多肽。在此发明的一个方面，用以鉴定PKCα调节化合物的试剂盒包含一个包含PKCα指示多肽的细胞。
                       序列列表描述
  名称   种类   序列识别号：   Genbank访问号
  DNA   蛋白质
  PKCα   家兔   1   2   X04796
  PKCα   小家鼠   3   4   X52685
  PKCα   人类   5   6   X52479
  PKCα显性负性突变型   家兔   7   8
  删除的外显子   小家鼠   9   10
  5’长引物   小家鼠   11
  5’短引物   小家鼠   12
  3’长引物   小家鼠   13
  3’短引物   小家鼠   14
  αMHC启动子序列   小家鼠   15   U71441
附图概述
图1描述鼠PKCα基因断裂转基因小鼠的产生和特征。此试验的细节在本文的其它部分描述。分图A描述鼠PKCα基因组位点和目标载体的示意图，目标载体用以置换具有用新霉素抗性基因(新)的ATP结合外显子(E)。SalI、EcoRV、和ClaI限制酶位点的大致位置被指出。用作基因组探针以鉴定转基因小鼠的核苷酸序列的大致位置也被指出。序列识别号：9和10提供删除的外显子的核苷酸和氨基酸序列，并且序列标识号：11至14是用以产生PCR产物的引物。分图B描述胚胎干细胞的Southern blot分析结果。泳道1包含来自野生型细胞的DNA，而泳道2包含来自转基因细胞的DNA。分图C描述蛋白制备中的PKCα的Western blot分析结果，蛋白来自野生型杂合(PKCα+/-)、和PKCα-/-转基因小鼠的心脏。泳道1至2显示来自野生型小鼠的蛋白；泳道3至4显示来自PKCα+/-小鼠的蛋白；泳道5至6显示来自PKCα-/-小鼠的蛋白。
图2描述蛋白制备中的PKCα、PKCβ、PKCδ和PKCε的Westernblot分析结果，蛋白来自野生型PKCα-/-小鼠的心脏。泳道1至4显示来自野生型小鼠的蛋白质；泳道5至8显示来自PKCα-/-小鼠的蛋白质。泳道1、2、5和6中的蛋白质来自经过假程序的动物心脏。泳道3、4、7和8中的蛋白质来自经过主动脉缩窄(TAC)的动物心脏。蛋白质在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳之前被分成可溶解的(S)(泳道1、3、5和7)和颗粒状的(P)(泳道2、4、6和8)部分。
图3描述来自心室性能的无创血液动力学评估的结果，结果表示为在麻痹的胸腔关闭小鼠中相对于基线的，或响应增加的多巴酚丁胺注射量(β激动剂)的最大dP/dt。最大dP/dt的递增用mmHg/sec表示。多巴酚丁胺剂量用ng多巴酚丁胺/g小鼠/min表示。来自野生型小鼠的结果用圆圈(N＝6)表示。来自PKCα-/-小鼠的结果用三角形表示(N＝6)。试验的细节在本文别处描述。
图4描述在野生型(Wt)和PKCα纯合性缺失(PKCα-/-)小鼠中的心脏心室性能的分析结果。来自野生型小鼠的结果用实体栏表示。来自PKCα-/-小鼠的结果用有交叉影线的栏表示。在每个分图中，首先两栏显示来自2个月大小小鼠的数据，而最后两栏显示来自10个月大小小鼠的数据。(在每一组中N＝4只小鼠)。分图A描述来自体外工作的心脏的最大dP/dt。分图B描述测量的用mmHg表示的左心室压力(LVP)。
图5描述来自野生型(NTG，圆圈)和PKCα纯合性缺失的(PKCα缺失，三角形)小鼠中的结果。分图A响应增加的多巴酚丁胺用每分钟跳动次数(bpm)描的心律(HR)。分图B描述响应增加的多巴酚丁胺用mmHg表示的平均动脉压(MAP)。(响应心得安和重复的多巴酚丁胺剂量的心律和平均动脉压也被评估。)试验的细节在本文别处描述。
图6描述PKCα转基因小鼠的产生和特征。试验的细节在本文别处描述。分图A描述心脏组织优选的α-肌球蛋白重链(α-MHC)启动子(Genbank U71441；序列标识号：15)的示意图，该启动子可操作地连接到兔子PKCα基因(序列标识号：1)。分图B描述蛋白制备中的PKC异构体的Western blot分析结果，蛋白来自野生型和PKCα转基因小鼠的心脏。所感兴趣的异构体(PKCα、PKCβ、PKCδ和PKCε)被表示在左手边的杂交印迹上。泳道1和2包含来自野生型(NTG)小鼠的蛋白质；泳道3和4包含来自PKCα转基因小鼠(PKCαTG)的蛋白质。所述PKCα转基因小鼠也称为PKCα过表达小鼠。分图C描述和PKCα自动磷酸化位点抗体的Western blot分析结果。蛋白质来自非转基因小鼠的心脏(泳道1和2)；PKCα-/-小鼠(泳道3和4)，和PKCα过表达转基因小鼠(泳道5和6)。
图7描述心脏心室性能评估的结果。来自野生型小鼠的结果用空白栏表示；来自PKCα转基因小鼠的结果用实体栏表示。分图A描述超声心动图的片段缩短百分比评估结果。分图B描述来自分离的工作心脏的心室性能分析结果，用最大dP/dt(最大dP/dt)表示。
图8描述来自未经刺激的雄性PKCα转基因小鼠中心脏肥大的心重(HW)对体重(BW)比率的分析结果。四只小鼠在各个时间点(2、4、6和8个月)被评估。
图9描述对野生型成年大鼠肌细胞进行的峰缩短分析结果。细胞被编码β-半乳糖苷酶(Adβgar，空白栏)、野生型PKCα(实体栏)、和显性负性PKCα(dn-PKCα，条纹栏)的腺病毒感染。分析细胞的数目被显示在每个栏的下方。
图10描述来自涉及PKCα活性和受磷蛋白磷酸化状态改变的一系列分析结果。此试验的细节在本文的其它部分描述。分图A描述来自三个野生型(Wt，泳道4至6)和三个PKCα-/-(泳道7至9)心脏的蛋白的Western blot结果，心脏在大小为两个月时用SERCA2、肌钙蛋白(CSQ)和受磷蛋白(PLB)的抗体进行检测。泳道1至3(标准)加入指示量的蛋白。总受磷蛋白(PLB)对SERCA2的相对定量也被描述(分图C)。来自野生型心脏的数据用实体栏表示；来自PKCα-/-的心脏的数据用空白栏表示。分图B描述来自三个野生型(Wt，泳道4至6)和三个PKCα-/-(泳道7至9)心脏的蛋白的Western blot定量结果，心脏用PLB丝氨酸16磷酸特异性抗体检测。泳道1至3(标准)加入指示量的蛋白。总PLB(PLB tot)对磷酸化PLB(phos-PLB)的相对定量也被描述(分图C)。来自野生型心脏的数据用实体栏表示；来自PKCα-/-的心脏的数据用空白栏表示。
图11描述来自野生型成年大鼠心室肌细胞的蛋白的Western blot结果，肌细胞用编码β-半乳糖苷酶(Adβgal)的腺病毒或编码显性负性PKCα(AdPKCα-dn)的腺病毒感染所指示的天数。杂交印迹用PLB丝氨酸16磷酸特异性抗体检测。
图12，分图A描述在指示年龄的野生型(Wt)和PKCα-/-(缺失)小鼠的RNA点杂交分析结果。点杂交用受磷蛋白(PLB)、SERCA2和GAPDH特异性探针进行检测。分图B描述两种野生型和两种PKCα-/-(缺失)小鼠的RT-PCR分析结果。所进行的循环数目被指出。对PLB、SERCA2a和核糖体蛋白L7(L7)特异性的探针被使用。
图13描述来自涉及PKCα水平和受磷蛋白磷酸化状态改变的一系列分析结果。分图A描述来自三个野生型(Wt)和三个PKCα转基因(PKCαTG)心脏的蛋白的Western blot结果，心脏在大小为两个月时用SERCA2、肌钙蛋白(CSQ)和受磷蛋白(PLB)的抗体进行检测。在分图B中总受磷蛋白(PLB)对SERCA2的相对定量被描述。来自野生型心脏的数据用实体栏表示；来自PKCαTG心脏的数据用空白栏表示。分图C描述来自三个野生型(Wt)和三个PKCα转基因(PKCαTG)心脏的蛋白的Western blot结果，心脏用PLB丝氨酸16磷酸特异性抗体检测。最先的三个泳道(标准)加入指示量的蛋白。在分图D中总PLB(PLB tot)对磷酸化PLB(phos-PLB)的相对定量也被描述。来自野生型心脏的数据用实体栏表示；来自PKCαTG心脏的数据用空白栏表示。
图14描述PKCα-/-心肌细胞中的一系列钙瞬变评估分析的结果。此试验的细节在本文的其它部分描述。分图A描述来自成年野生型(WT)和PKCα-/-(KO)心肌细胞(2个月大小)的有代表性的Fura-2(340/380)钙瞬变发射追踪图。分图B描述峰钙释放(左侧)和用秒测量的80％的驰豫时间(T80，右侧)。来自野生型小鼠肌细胞的结果用空白栏表示。来自PKCα-/-小鼠肌细胞的结果用实体栏表示。
图15，分图A描述来自在咖啡因给药之前和之后，野生型(wt)和PKCα-/-(KO)肌细胞的有代表性的Indo-1 AM发射追踪。咖啡因刺激点被指出。分图B描述来自肌细胞中咖啡因诱导的Ca2+瞬变的评估结果。野生型肌细胞(WT)用空白栏表示(n＝19)；PKCα-/-(KO)肌细胞用实体栏表示(n＝37)。
图16描述平均峰钙密度(ICa)的追踪图，它来自-50mV至+40mV的以10mV递增的去极化电压阶跃。来自野生型(NTG)细胞的结果是左侧的追踪图；来自PKCα-/-(PKCα-KO)的结果时右侧的追踪图。
图17描述在野生型(Wt，实体栏)和PKCα-/-(PKCα-/-，空白栏)小鼠中进行的总磷酸酶、PP1特异的和PP2A特异的酶分析的结果。
图18描述来自野生型(Wt，实体栏)或PKCα转基因(过表达)心脏(α-TG，空白栏)的PP1和PP2A特异的酶分析的结果。N＝3分开的分析，各来自3个心脏中的一个。
图19描述来自腺病毒急性感染的初生心肌细胞中的PP1-和PP2A-特异的酶分析结果，腺病毒被指示：编码β-半乳糖苷酶(Adβgal，空白栏)的腺病毒；PKCα过表达腺病毒(AdPKCαwt，实体栏)；和PKCα显性负性腺病毒(AdPKCαdn，条纹栏)。磷酸酶活性以单位每分钟(cpms)每μg蛋白表示。
图20，分图A描述E.coli纯化的抑制剂-1野生型蛋白的SDS-PAGE，该蛋白易被32P-ATP和纯化的蛋白致活酶C磷酸化。每个泳道包含来自指示时间点(10、30、或60分钟)的一份等分试样。结果在凝胶下的图中被概括。所述图描述在指示时间点的磷酸化的抑制剂-1蛋白的量。分图B描述E.coli纯化的I-1野生型(Wt)或S67A突变型蛋白的SDS-PAGE，该蛋白易被32P-ATP和纯化的蛋白致活酶C磷酸化。所述在凝胶下的图指示磷酸化的抑制剂-1野生型或S67A蛋白的相对量。
图21，分图A描述来自腺病毒感染的初生心肌细胞培养物的提取物的Western blot，心肌细胞用抗血清对抑制剂-1(I-1)培养。提取物由用表达β-半乳糖苷酶(βgal)、抑制剂-1(I-1)、PKCα野生型(PKCαwt)、PKCα显性负性突变型(PKCαdn)、抑制剂-1与β-半乳糖苷酶(I-1+β-gal)、抑制剂-1与PKCα野生型(I-1+PKCαwt)、和抑制剂-1与PKCα显性负性(I-1+PKCαdn)的腺病毒感染的培养物制备。提取物与PP1c一起被免疫沉淀。免疫沉淀物被再悬浮、电泳、转膜并与anti-I-1抗血清杂交。包含PP1c蛋白条带的膜带被与PP1c抗血清(显示在I-1处理的Western blot下面)杂交。杂交蛋白被定量并且结果被概括在分图B中。分图B描述沉淀自每一种提取物的I-1的相对量，提取物包括：抑制剂-1和β-半乳糖苷酶(Ad-I-1+Ad-β-gal，实体栏)，抑制剂-1和PKCα野生型(Ad-I-1+Ad PKCαwt，空白栏)，和抑制剂-1和PKCα显性负性(Ad-I-1+AdPKCαdn，条纹栏)。
图22描述来自腺病毒感染的初生心肌细胞培养物的，用I-1磷酸特异性抗体对苏氨酸-35和丝氨酸-67的Western blot。
图23描述来自野生型、PKCα-/-和PKCα转基因心脏的对I-1磷酸-丝氨酸67的独立Western blots定量。典型的Western blots显示在图的下面。
图24，分图A描述“正常”人供体心脏(空白栏，供体)或衰竭的扩张型心肌病心脏(实体栏，HF)中的对总PKCα蛋白质水平的westernblotting定量。分图B描述“正常”供体心脏(空白栏，供体)和衰竭心脏(实体栏，HF)中的在PKCα水平和I-1丝氨酸-67磷酸化之间的western blot定量。
图25描述PKCα蛋白在成年大鼠心肌细胞中定位的共焦显微照片，蛋白定位在基线(PKCα)或在PMA(PKCα，+PMA)刺激后。
图26描述野生型(Wt)和PKCα-/-小鼠经或者TAC程序或者假手术十二周后，心脏功能的评估结果。来自野生型、假手术的小鼠的结果用空白栏表示；来自PKCα-/-、假手术的小鼠的结果用实体栏表示，来自野生型、TAC小鼠的结果用有交叉影线的栏表示，来自PKCα-/-、TAC小鼠的结果用条纹栏表示。图的左侧描述体外工作的心脏制备(最大dP/dt，以mmHg/sec测量)的结果。图的右侧用mmHg描述左心室压力(LVP)。
图27描述野生型(Wt)和PKCα-/-小鼠经或者主动脉缩窄(TAC)程序或者假手术十二周后，心脏功能和肥大的评估结果。来自野生型、假手术的小鼠的结果用空白栏表示；来自PKCα-/-、假手术的小鼠的结果用实体栏表示，来自野生型、TAC小鼠的结果用有交叉影线的栏表示，来自PKCα-/-、TAC小鼠的结果用条纹栏表示。分图A用mm描述左心室末端舒张(LVED)和左心室末端收缩(LVES)的尺寸。分图B描述片段缩短(FS)的超声心动图分析结果。
图28描述野生型(Wt)、MLP-/-、和MLP-/-PKCα-/-小鼠中的心脏功能、肥大和总心脏形态的评估结果。来自野生型小鼠的结果用空白栏表示；来自PKCα-/-小鼠的结果用实体栏表示，来自MLP-/-小鼠的结果用阴影线的栏表示，来自PKCα-/-、MLP-/-小鼠的结果用条纹栏表示。分图A用mm描述左心室末端舒张(LVED)和左心室末端收缩(LVES)的尺寸。分图B描述片段缩短(FS)的超声心动图分析结果。
图29描述野生型(Wt)、MLP-/-、和MLP-/-PKCα-/-小鼠中的心脏功能、肥大和总心脏形态的评估结果。来自野生型小鼠的结果用空白栏表示；来自MLP-/-小鼠的结果用实体栏表示，来自PKCα-/-、MLP-/-小鼠的结果用条纹栏表示。图的左侧描述体外工作的心脏制备(最大dP/dt，以mmHg/sec测量)的结果。图的右侧用mmHg描述左心室压力(LVP)。
图30描述心重(HW)对体重(BW)的比率(对每一组N＝4)。来自野生型小鼠的结果用空白栏表示；来自PKCα-/-小鼠的结果用实体栏表示，来自MLP-/-小鼠的结果用阴影线的栏表示，来自PKCα-/-、MLP-/-小鼠的结果用条纹栏表示。
图31描述野生型(Wt)、PKCα-/-、MLP-/-、和MLP-/-PKCα-/-小鼠中通过苏木素伊红染色的心脏组织切片进行的总心脏形态评估。
图32描述来自成年野生型(Wt，空白栏)、PKCα-/-(α-/-，有交叉影线的栏)、PP1c转基因(实体栏)和PKCα-/-x PP1c(条纹栏)小鼠(在每组中小鼠N＝4)心脏的PP1-和PP2A-特异性的磷酸酶分析结果。
图33描述片段缩短(FS)超声心动图的评估，来自所指示的小鼠的组(每组N＝4)：野生型(Wt，空白栏)；PP1c转基因(PP1c，实体栏)和PKCα-/-X PP1c(PP1-cα-/-，条纹栏)。
图34描述野生型(Wt，空白栏)；PP1c(PP1c，黑栏)；和PKCα-/-X PP1c(PP1cα-/-，条纹栏)中的体外工作心脏的心室性能评估。分图A描述最大dP/dt。分图B描述最小dP/dt。分图C描述用mmHg表示的左心室压力(LVP)。
图35描述两种心力衰竭模式的死亡率分析。分图A描述野生型(Wt，空白栏)和PKCα-/-(PKCα-/-，实体栏)在TAC操作后的所指示的时间点的存活百分比。分图B描述野生型(Wt，空白栏)、PKCα-/-(PKCα-/-，实体栏)、MLP-/-(MLP-/-，阴影线栏)、和PKCα-/-/MLP-/-(双倍，条纹栏)小鼠在所指示的年龄的存活百分比。
图36描述最大(分图A)和最小(分图B)dP/dt值，所述值来自注入豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)的分离心脏。来自野生型心脏的结果用空圆圈表示；来自PKCα-/-心脏的结果用实心圆圈表示。每组中的四个心脏被分析，并且错误栏表示平均值的标准偏差。PMA剂量被指出。
图37描述所指示的正常人心脏中的PKC异构体(PKCα、PKCβI、PKCβII、PKCγ、和PKCε)的Western blot分析。Ca2+调节的同工酶是等同的。分图A中左侧的三个泳道包含细菌(标准)中产生的重组蛋白标准。右侧的六个泳道包含来自六个正常人心脏(人心脏样品)的蛋白。分图B描述每种相对于样品总蛋白含量的同工酶的量的定量。每种同工酶的量以ng/50μg总溶菌液表示。感兴趣的PKC异构体在每栏的下面被指出。错误栏表示平均值的标准偏差。
图38描述来自体外工作心脏制备中的急性心肌收缩能力的评估结果。来自对照组小鼠的结果用空白栏表示；来自Ro-32-0432处理的小鼠的结果用实体栏表示。基线结果被指出。来自注入Ro-32-0432或载体对照的数据被指出(注入)。整个浓缩时间段(7分钟每10不同的递增浓度)的值被求和以用于统计学目的，表示为约1×10-8M的平均剂量。仅仅注入Ro-32-0432的组显示统计意义上的显著性增加(p＜0.05)。
图39描述用DMSO(PKCα-GFP+载体)或PMA(PKCα-GFP+PMA60分钟)处理的培养细胞中的PKCα指示多肽(PKCα-GFP)的共焦显微照片。
图40描述在正常Sprague-Dawley和Lewis大鼠体内以所指示的剂量注入LY333531后，急性心脏收缩变力和正性变舒功能的评估结果，各自以最大dP/dt(图40A)和最小dP/dt(图40B)表示。
图41显示在大鼠心肌梗塞模型中注入Ro-31-8220后最大dP/dt相对于基线(B/L)的百分比增加。
发明详述
本发明为急性心力衰竭中的心肌收缩能力和一般的心力衰竭中的心肌病提供调节。本发明的组合物包括由PKCα核苷酸序列的转基因动物或具有PKCα核苷酸序列断裂的动物。本发明还包括从这些小鼠中分离出来的细胞与组织。本发明提供调节PKCα活性、PKCα表达水平、心肌收缩能力、心肌病易感性、和急性心力衰竭的方法。本发明提供进行PKCα调节化合物的鉴定方法的试剂盒。
本发明涉及关联PKCα基因的组合物和方法(序列标识号：1)。在一个实施方案中，动物被稳定的用表达弹夹转化，该弹夹包含可操作地连接到PKCα核苷酸序列的心脏优选的调节序列。在一个实施方案中，本发明的动物被稳定地用表达弹夹转化，该表达弹夹包含心脏优选的调节因子序列，该序列可操作地连接到PKCα核苷酸序列的片段或变体，例如在序列标识号：7中阐述的显性负性变体。在另一个实施方案中，本发明的动物被稳定地用分离的核苷酸分子转化，该分子破坏原PKCα核苷酸序列，这样PKCα表达水平就被降低了。一方面，心脏优选的调节序列是心脏优选的启动子序列。
在一个实施方案中，转基因动物的种系细胞基因组包含相关的核苷酸序列。转基因细胞是从本发明的包含至少一个表达弹夹或断裂弹夹的转基因动物中分离出来的细胞。转基因组织，例如心脏组织，是包含转基因细胞的组织。
在涉及断裂弹夹的实施方案中，相关的核苷酸序列两侧可能会有自然发生的核酸分子被转化进入的细胞基因组DNA的核苷酸序列。
PKCα核苷酸序列的片段与变体和因此被编码的蛋白质也被包括在本发明中。“片段”是指核苷酸序列或氨基酸序列的一部分，以及因此被编码的蛋白质。核苷酸序列的片段可以编码保持原蛋白质的生物活性的蛋白质片段，因此显示具有PKCα活性。可供选择地，核苷酸序列片段可用于杂交探针。PKCα的生物活性部分可以通过下列方法制备：分离本发明的其中一个核苷酸序列的部分、表达PKCα蛋白质被编码的部分(例如，通过体外重组表达)，评估PKCα蛋白质被编码部分的活性。
本领域的技术人员也将认识到除了那些序列列表中的物种，其它物种尤其是哺乳动物物种的PKCα基因和蛋白质将可用于本发明。本领域的技术人员还将认识到通过使用来自已知物种序列的探针，cDNA或同源于已知序列的基因序列可以从相同的或替代物种中通过已知的克隆方法获得。这种PKCα同系物和直向同源物被包括在本发明PKCα基因和蛋白质的定义中。
因此，蛋白致活酶C-α核苷酸序列的一个片段可以编码一个蛋白致活酶C-α(PKCα)的生物活性部分，或它可以是一个片段，此片段用以下公开的方法可以用作一个杂交探针或PCR引物。PKCα的生物活性部分可以通过下列方法被制备：分离本发明其中一个PKCα核苷酸序列的一部分、表达PKCα蛋白质被编码的部分(例如，通过体外重组表达)，评估PKCα蛋白质被编码部分的活性。作为一个蛋白致活酶C-α核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、2950、3000、3050、3100、3150、3200、3250、3300、3350、3400、3450、3500或3524个核苷酸，或最多达本文公开的全长蛋白致活酶C-α核苷酸序列中存在的核苷酸数目，或者包含单独来自PKCα基因组位点或与上述讨论的序列的组合的额外的序列。
“变体”是指基本上类似的序列。对核苷酸序列而言，保守变体包括那些因为遗传密码退化，编码本发明其中一个PKCα多肽的氨基酸序列的那些序列。天然存在的等位变体例如这些可以用已知的分子生物学技术鉴定的，例如用本领域技术人员所知的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术。为了分离直向同源物和其它变体，一般的严紧杂交条件主要通过规定具体序列、序列长度、GC含量和其它参数被利用。变体核苷酸序列还包括合成来源的核苷酸序列，例如那些通过使用定点诱变生成的核苷酸序列。变体也可包含单独来自基因组位点或与其它序列组合的额外的序列。
变体蛋白质可以通过删减(也叫切断)或增加一个或多个氨基酸衍生自天然蛋白质；删减或增加一个或多个氨基酸；或在天然蛋白质的一个或多个点取代一个或多个氨基酸。本发明包括的蛋白质变体可以保持生物活性，也可以不保持。这种变异体可以由例如基因多态性或人类操纵产生。一个示例性的变体PKCα蛋白被序列标识号：7阐明的核苷酸序列编码。被序列标识号：7阐明的核苷酸序列编码的变体蛋白质显示具有显性负性作用。
可通过多种途径，包括氨基酸取代、删除、切断和插入来改变本发明的蛋白。例如，PKCα蛋白的氨基酸序列变体可以通过DNA突变制备。诱变和核苷酸序列改变的方法为本领域所熟知。参见例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel等人(1987)Methods in Enzymol.154：367-382；美国专利4,873,192；Walker和Gaastra编辑(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillanPublishing Company，New York)和其中所引用的参考文献。关于不影响生相关蛋白的生物活性的合适的氨基酸替代可以在Dayhoff等人的模型中找到参考。(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)。
变体核苷酸序列和蛋白也包括从诱导突变和引起重组的程序如DNA重组中得到的序列与蛋白。用这种程序，一个或多个不同的PKCα编码序列可以被操纵产生一种新的具有所需特性的PKCα。用这种方法，重组的多核苷酸文库可以从一组相关序列的多核苷酸中产生，这组多核苷酸包含有基本的序列同一性而且可以被体外或体内同源重组的序列区域。例如，用这种方法，编码相关结构域的序列基序可以在本发明的PKCα基因和其它已知的PKCα基因之间进行重组以获得一种新基因，新基因编码一种具有改变的相关特性的蛋白质，例如显性负性突变(Ohba等人(1998)Mol.Cell.Biol.18：51199-51207，Matsumoto等人(2001)J.Biol.Chem.276：14400-14406)。这种DNA重组的策略为本领域所熟知。
所述“序列同一性百分比”或“序列同一性”通过比较两种最佳排列的序列或随后在比较窗口或跨度进行测定，其中序列在比较窗口的部分可任选地包括增加或删除(即缺口)，它与参比序列相比较(它不包含增加或删除)以获得两个序列的最佳排列。该百分比如下计算：测定其中相同的残基(例如核酸碱基或氨基酸残基)在两个序列中都存在的位置的数目，以获得匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的总位置数目，将所得结果乘以100，获得了序列同一性百分比。
序列同一性百分比能通过区域同源性运算获得，Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2：482-485(1981)；或通过同源性排列运算获得，Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.48：443-445(1970)；或通过手工或计算机执行这些运算(GAP & BESTFIT in the GCG WisconsinSoftware Package，Genetics Computer Group)。
测定同源性或序列同一性的优选的方法是通过BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool)分析，使用通过程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx进行的运算(Karlin等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，2264-2268，和Altschul，(1993)J.Mol.Evol.36，290-300)，这些程序被定制为序列相似性搜索。通过BLAST程序使用的该方法首先考虑在查询序列与数据库序列之间的类似片段，然后评估所确定的所有匹配的统计学有效性，最后仅总结满足预先选择的有效性阈值的那些匹配。对柱状图、描述、排列、期望值(即对数据库序列报道匹配的统计学有效性阈值)、中止、基质和过滤器的搜索参数一般被设为blastp、blastx、tblastn和tblastx的默认值基质BLOSUM62(Henikoff等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，10915-10919)。
正如本文所述，PKCα基因和蛋白、它们的等位基因和其它变体(例如接合变体)、它们来自其它物种的同系物和直向同源物与多种片段和突变型将显示具有序列变异。典型的，这些序列可显示具有对本发明的基因和蛋白质约75％的序列同一性，优选地至少约80％的序列同一性，更优选地至少约90％的序列同一性和更优选地至少约95％的序列同一性。
本发明的PKCα序列以表达弹夹的形式提供，用于在相关动物中的表达。此弹夹将包括可操作地连接到本发明的PKCα序列的5′和3′调节序列。“可操作地连接”是指在调节序列影响下的异源核苷酸序列的转录和翻译。用这种方法，为本发明的PKCα核苷酸序列的核苷酸序列可以用表达弹夹连同心脏组织优选的启动子的形式提供，以在相关动物，更具体地讲在动物的心脏中表达。
为这样的表达弹夹提供了用于插入核苷酸序列以在调节区域的转录调节下的至少一个限制位点。表达弹夹还可以包含可选择的标记基因。
表达弹夹将包括5′至3′方向的转录、转录与转录起始区域、和相关的异源核苷酸序列。除了包含转录起始和控制位点之外，表达弹夹还包含转录中止所必需的序列，和转录区域中用于翻译的核糖体结合位点。其它用于表达的调节控制元件包括起始和终止密码子以及多聚腺苷酸信号。本领域的普通技术人员将知道很多的用于表达载体的调节序列。这种调节序列被描述在，例如，Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring  Harbor，N.Y.)。
包含本发明可操作地连接到启动子核苷酸序列的PKCα序列的表达弹夹也可以包含至少一个额外的核苷酸序列，用以基因被共转移到生物体中。可供选择地，额外的序列(s)能在另一个表达弹夹上提供。
本文所述的多核苷酸能被可操作地连接到的调节序列包括指导mRNA转录的启动子。这些包括，但不限于，来自噬菌体λ的左侧启动子、lac、TRP、和来自E.coli的TAC启动子，早期和晚期启动子来自SV40、CMV立即早期启动子、腺病毒早期和晚期启动子、和逆转录病毒长末端重复序列。
据认可，本发明的PKCα核苷酸序列可操作地与任何心脏组织优选的启动子连接，并且可以在心脏组织内被表达。“心脏组织”是指任何来自心脏的组织，包括，但不限于，与心脏发展联系的组织，例如肺部心肌层。
据认可，增强子和/或组织优选的元件可以与启动子组合利用，用以增加转录水平或改变组织特异性。例如，来自其它心脏优选启动子的定量的或组织特异性上游元件可以与α-MHC启动子区域相结合，用以产生PKCα过表达小鼠，以增大心脏优选的转录。这些元件的特征在于，例如，鼠TIMP-4启动子、A型和B型钠尿肽启动子、人类心脏肌钙蛋白I启动子、小鼠S100A1启动子、鲑鱼心脏肽启动子、GATA反应元件、可诱导的心脏优选启动子、兔α-肌球蛋白启动子、和小鼠α-肌球蛋白重链启动子(Rahkonen，等人(2002)Biochim Biophys Acta 1577：45-52；Thuerauf和Glembotski(1997)J.Biol.Chem.272：7464-7472；LaPointe等人(1996)Hypertension 27：715-722；Grepin等人(1994)Mol.Cell Biol.14：3115-29；Dellow，等人(2001)Cardiovasc.Res.50：3-6；Kiewitz，等人(2000)Biochim Biophys Acta 1498：207-19；Majalahti-Palviainen，等人(2000)Endocrinology 141：731-740；Charron等人(1999)Molecular & Cellular Biology 19：4355-4365；Genbank U71441；美国临时专利申请号：60/393,525和60/454,947；和美国专利申请号10/613,728)。
多种心脏组织优选的启动子元件已经在文献中被描述，并且可以用在本发明中。这些包括，但不限于，来自以下基因的组织优选的元件：肌球蛋白轻链-2、α-肌球蛋白重链、AE3、心脏肌钙蛋白C、和心脏α肌动蛋白。参见，例如，Franz等人(1997)Cardiovasc.Res.35：560-566；Robbins等人(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.752：492-505；Linn等人(1995)Circ.Res.76：584-591；Parmacek等人(1994)Mol Cell Biol.14：1870-1885；Hunter等人(1993)Hypertension 22：608-617；和Sartorelli等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4047-4051。
在另一个实施方案中，编码区域被可操作地连接到一个可诱导的调节元件或几个元件。多种可诱导启动子体系在文献中被描述并且可以用在本发明中。一种已知的可用的条件体系是二元的、四环素基础的体系，它已被用在细胞和动物中以通过增加或移除四环素或其类似物可逆地诱导表达。另一个这种二元体系的实施例是噬菌体P1的cre/loxP重组酶体系。对于cre/loxP重组酶体系的描述可参见Lakso等人(1992)PNAS89：6232-6236。
另一类启动子元件是那些响应低含氧量的条件，活化可操作地连接的相关核苷酸序列的转录的启动子。这些启动子元件包括至少部分的被低含氧量诱导的因子-1调节的启动子元件。缺氧响应元件包括，但不限于，促红细胞生成素缺氧响应增强子元件(HREE1)、肌丙酮酸致活酶HRE；β-烯醇酶HRE；和内皮素-1 HRE元件、以及包含这些序列的嵌合核苷酸序列。参见Bunn和Poynton(1996)Physiol.Rev.76：839-885；Dachs和Stratford(1996)Br.J.Cancer 74：S126-S132；Guillemon和Krasnow(1997)Cell 89：9-12；Firth等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：6496-6500；Jiang等人(1997)Cancer Res.57：5328-5335；美国专利号5,834,306)。
除了促进转录的控制区域之外，表达载体还包括调节转录的区域，例如阻遏蛋白结合位点和增强子。实施例包括SV40增强子、巨细胞病毒立即早期增强子、多瘤病毒增强子、腺病毒增强子和逆转录病毒LTR增强子。
适当条件下，本发明的PKCα核苷酸序列和任何额外的核苷酸序列(s)都可以在转化动物中被最优化以增加表达。即，这些核苷酸序列能使用物种优选的密码子而被合成以改善表达，例如小鼠优选的密码子用以改善小鼠中的表达。本领域有方法可用于合成物种优选的核苷酸序列。参见Wada等人(1992)Nucleic Acids Res.20(Suppl.)，2111-2118；Butkus等人(1998)Clin Exp Pharmacol Physiol Suppl.25：S28-33；和Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.
已知额外的序列改变能增强细胞宿主的基因表达。这些序列改变包括对编码假多聚腺苷酸信号、外显子-内含子结合位点信号、类转座子重复序列、和其它对基因表达有害的特征明显的序列的序列消除。异源核苷酸序列的G-C含量可以被调节到给定细胞宿主的平均水平，参照宿主细胞中表达的已知基因计算。如果可能，序列被改变以避免预测的mRNA发夹二级结构。
在那些期望有异源PKCα核苷酸序列的表达产物的实施例中，该产物直接到具体的细胞器中，尤其是线粒体、细胞核、内质网或高尔基体中；或分泌到细胞表面或细胞外；表达弹夹还可包含转运肽的编码序列。这种转运肽为本领域的所熟知，并且包括，但不限于，用于酰基载体蛋白、RUBISCO小亚基等的转运肽。
断裂弹夹被用以打断和/或移除来自动物细胞基因组的相关序列以产生“去除”、“删除”、或“缺失”突变型。“目标载体”和“断裂弹夹”是指一种被分离的核酸分子，它包含一个5’侧区、一个断裂区、和一个3’侧区。断裂弹夹和它们的使用方法为本领域所熟知。参见Doetschman等人(1987)Nature 330：576-578；Doetschman等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci 85：8583-87；Schwartz等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.88：10416-20；Oliver等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94：14730-14735；Nagy等人Ed.(2003)Manipulating theMouse Embryo，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY。
报告基因或可选择的标记基因可以被包括在表达弹夹中。本领域所知的合适的报告基因的实施例可见于，例如，Ausubel等人(2002)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NewYork，NY。用于转化细胞或组织选择的可选择的标记基因可包括赋予抗生素抗性的基因。其它能在转基因事件的恢复中发挥效用，但是可能不需要在最后的产品中的基因包括，但不限于，例如GUS(β-葡糖苷酸酶)、荧光蛋白(例如GFP)、CAT；和荧光素酶。
适用于将多核苷酸掺入宿主细胞的递送载体包括，但不限于，病毒载体和非病毒载体(Verma和Somia(1997)Nature 389：239-242)。
递送多核苷酸的多种非病毒载体为本领域所熟知并且被包括在本发明中。分离的核酸分子能以裸DNA(WO 97/40163)的形式被递送到细胞中。可供选择地，多核苷酸能和多种物质(递送形式)一起被递送到通过多种途径联系的细胞中，这些物质包括，但不限于，阳离子类脂；生物适合性聚合物，包括天然的和合成的聚合物；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人造病毒包膜；金属颗粒；蛋白质转导结构域和细菌。递送载体可以是微粒。这些不同物质的混合物或组合物也能被用作递送载体。多核苷酸能与这些递送形式非共价的或共价的连接。脂质体能被用于一种具体的细胞型，例如用于心肌细胞。
病毒载体包括，但不限于，DNA病毒载体例如那些基于腺病毒、单纯疱疹病毒、痘病毒如牛痘病毒、和细小病毒包括腺伴随病毒的病毒载体；和RNA病毒载体，包括，但不限于，逆转录病毒载体。逆转录病毒载体包括鼠白血病病毒和慢病毒，例如人免疫缺陷病毒。参见Naldini等人(1996)Science 272：263-267。
包含一种多核苷酸的非病毒递送载体可以通过本领域所知的任何合适的方法被转入宿主细胞和/或靶细胞，例如通过磷酸钙共沉技术转染；电穿孔；电渗透；脂质体调节的转染；弹道转染；基因枪法包括微粒轰击、射流喷射、和针与注射器注射、或通过显微注射。转染的多种方法为技术人员所熟知。
病毒递送载体能通过感染被引入细胞。可供选择地，病毒载体能被掺入任何上述的非病毒递送载体以递送进细胞。例如，病毒载体能与阳离子类脂(Hodgson和Solaiman(1996)Nature Biotechnol.14：339-342)混和；或与层状脂质体(Wilson等人(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.74：3471-3475；和Faller等人(1984)J.Virol.49：269-272)混和。
对于体内递送，载体能通过技术人员所知的任何方法被引入个体或生物体。
任何用于表达载体的调节的或其它的序列能组成转基因序列的一部分。这包括内含子序列和多聚腺苷酸信号，假如它们还未被包括进去。在一个实施方案中，动物细胞可以是已受精的卵母细胞或胚胎干细胞，它们能被用于产生包含至少一个稳定转化的表达弹夹的转基因动物，该表达弹夹包含相关的核苷酸序列。可供选择地，宿主细胞可以是干细胞或其它早期组织前体细胞，该细胞会产生具体的细胞子集并能被用于在动物中产生转基因组织。也参见Thomas等人，(1987)Cell 51：503对同源重组载体的描述。载体被引入胚胎干细胞系(例如通过电穿孔)，并且其中所引入的基因与基因组发生重组的细胞被选择(参见例如，Li，E.等人(1992)Cell 69：915)。被选择的细胞然后被注入动物(例如小鼠)的胚泡中以形成聚合嵌合体(参见例如Bradley，A.in Teratocarcinomasand Embryonic Stem Cells：A Practical Approach，E.J.Robertson，编辑(IRL，Oxford，1987)，第113至152页)。然后嵌合胚胎能被植入合适的假孕雌性培养动物体内并培育到末期。在其生殖细胞中具有重组DNA的后代能通过转基因的种系传递被用于繁殖所有细胞痘包含重组DNA的动物。构建同源重组载体和同源重组动物的方法还被描述在Bradley，A.(1991)Current Oinion in Biotechnology 2：823-829和PCT WO90/11354；WO 91/01140；和WO 93/04169中。
经由胚胎操纵和显微注射产生转基因动物的方法，尤其是象小鼠这样的动物，在本领域中已经变得常规，并且被描述在，例如，美国专利4,736,866；4,870,009；4,873,191；6,201,165和Nagy等人Ed.(2003)Manipulating the Mouse Embryo，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY)。
本文所述的非人类的转基因动物克隆也能依照下述的方法产生：Wilmut等人(1997)Nature 385：810-813和PCT WO 97/07668和WO97/07669。简而言之，来自转基因动物的细胞(例如体细胞)能被分离并诱导退出生长周期，进入Go阶段。然后通过使用例如电脉冲这样的方法，静止细胞能被融合到去核的卵母细胞，该卵母细胞来自相同物种的动物，从该动物中分离出所述静止细胞。再构建的卵母细胞然后被培养以使得它发育成桑椹胚或胚泡，并且随后转到假孕雌性培养动物体内。雌性培养动物的后代将是所述动物的克隆，细胞，例如体细胞，从所述动物中分离。
其它转基因动物的实施例包括非人类的灵长类动物、绵羊、狗、猪、豚鼠、仓鼠、母牛、山羊、兔子和大鼠。提供转基因兔子的方法被描述在Marian等人(1999)J.Clin.Invest.104：1683-1692和James等人(2000)Circulation 101：1715-1721。
“PKCα活性”是指由本文所述的野生型PKCα显示具有的任何活性。这些活性包括，但不限于，致活酶活性、活化的C致活酶(RACK)受体的结合活性、表达、从胞质部分到颗粒部分的移位、和到肌膜的移位。PKCα活性的调节包括但不限于调节以下PKCα活性：致活酶活性、RACK结合、或调节PKCα表达水平或细胞分布。
分析致活酶活性的方法为本领域所熟知，这些方法包括，但不限于，使用磷酸化肽的抗体的免疫沉淀反应；荧光偏振；使用放射性同位素的过滤结合分析法、闪烁邻近测定法、使用结合抗体的96孔分析法；时间分辨荧光分析法、薄层色谱法；免疫沉淀和免疫复合物分析法；非三氯乙酸磷酸化氨基酸测定法；和蛋白致活酶分析法。参见Braz等人(2002)J.Cell Biol.156：905-919；Ping等人(1999)Am.J.Physiol.276：H1468-H1481；美国专利申请号：20030036106；美国专利号：5447860；Walker，John编辑(2002)Protein Protocols on CD-ROM v.2；和Ausubel等人编辑(1995)Current Protocols in MolecularBiology，(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)。
分析PKCα结合RACK的方法为本领域所熟知，这些方法包括，但不限于，ELISA、蛋白交互式诱捕、X-射线晶体学、NMR、超速离心法、免疫沉淀反应、共免疫沉淀反应、交联、酵母双杂交分析法、亲和色谱法。实施例参见Mochly-Rosen(1995)Biochem Soc.Trans.23(3)：596-600；Walker，John编辑(2002)Protein Protocols on CD-ROM v.2；和Ausubel等人编辑(1995)Current Protocols in Molecular Biology，(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)。
本发明提供检测PKCα指示多肽移位的方法。“指示多肽”是指任何适用于检测亚细胞位置的多肽。适合的指示多肽包括包含上文所述的报告基因的融合多肽，例如，但不限于，荧光蛋白(例如GFP)、β-半乳糖苷酶、c-jun、c-myc；亲和多肽标签(例如His标签)、放射标记的多肽、生物素标记的多肽、抗原标记的多肽和染料标记的多肽。合适的指示多肽包括相关多肽特异性的抗体。
在一个实施方案中，本发明提供了一种改变动物的PKCα表达的方法。在一个实施方案中，PKCα的表达在整个动物中被调节(例如断裂突变型)。在一个实施方案中PKCα表达以一种心脏优选的方式被调节。“心脏优选的”是指异源PKCα的表达在心脏组织中是最丰富的，然而一些表达可能在其它类型的组织中发生，尤其是在与心脏组织发育相关的组织中。
测定表达水平的方法为本领域所熟知，这些方法包括，但不限于，定量Western blot分析、免疫沉淀反应、放射性分析法、多肽纯化、分光光度分析、丙烯酰胺凝胶的考玛斯染色、ELISA、RT-PCR、2-D凝胶电泳、微阵列分析、原位杂交、化学发光法、银染、酶分析法、丽春红S染色、多重RT-PCR、免疫组织化学分析法、放射性免疫测定、比色分析、免疫放射分析法、正电子发射断层摄影术、Northern blotting、荧光测定分析法和SAG。参见例如Ausubel等人编辑(2002)CurrentProtocols in Molecular Biology，Wiley-Interscience，New York，New York；Coligan等人(2002)Current Protocols in ProteinScience，Wiley-Interscience，New York，New York；和Sun等人(2001)Gene Ther.8：1572-1579。
据认定，PKCα核苷酸序列可以与它们的原启动子一起使用以增加或减少由转化动物心脏组织中显型的改变引起的表达。
显示具有改变的心脏优选的PKCα表达的转基因动物被用于进行鉴定化合物的分析，该化合物影响心脏的功能，例如，但不限于心肌收缩能力。测定心肌收缩能力的分析方法为本领域所熟知，这些方法包括，但不限于，缩短分析法、峰缩短、到峰值时间、到最大松弛时间、收缩和松弛率分析法、心脏变时作用改变、心脏变松作用改变、和总心脏收缩分析法。PKCα表达的改变的心脏优选的表达可能导致对心肌病的易感性改变。在本发明的一方面，本发明通过急性调节心肌收缩能力的方法。在本发明的另一方面，本发明提供急性调节心肌病的方法。急性的调节或改变在施用PKCα调节剂后1秒内；10秒；30秒；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60分钟；2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时；2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、或31天开始。调节持续时间的变化从短持续时间例如，但不限于，十亿分之一秒、秒、和分钟递增；中间长度的持续时间例如，但不限于，小时、天和周递增；至长持续时间例如，但不限于，月和年递增，最高达包括接受者的全部寿命。
在本发明的上下文中，“心肌收缩能力”或“心肌收缩性”被定义为心脏功能的量度，该心脏功能可包括，但不限于心输出量、射血分数、片段缩短、心脏作功、心指数、变时作用、变松作用、圆周纤维缩短的速率、做心律校正的圆周纤维缩短速率、每搏输出量、心脏收缩或松弛率、心室内压力的极限值(最大dP/dt和最小dP/dt)、心室体积、心脏功能的临床评估(例如应力超声心动图和跑步机步行)和这些参数的变型或正常型。这些参数可以在人类或动物中被测量，同样用以评估心肌功能并帮助诊断和预后心脏病。
“心肌病””是任何失调或涉及心肌组织或心脏功能不良的情况涉及心肌组织的失调包括，但不限于，心肌疾病，包括但不限于扩张性心肌病、肥大性心肌病、限制性心肌病、心肌顿抑和心肌炎；心力衰竭、急性心力衰竭；风湿热；横纹肌瘤；肉瘤；先天性心脏病，包括但不限于，左至右转流晚型发绀，例如心房间隔缺损、心室间隔缺损、动脉导管未闭和房室隔缺损，右至左转流早型发绀，例如法洛氏四联症、大动脉转位、动脉干、三尖瓣闭锁、和肺静脉完全回流异常、阻塞性先天性异常，例如主动脉缩窄、肺动脉瓣狭窄和闭锁、和主动脉缩窄和闭锁；涉及心脏移植的失调；动脉高血压；围生期心肌病；酒精性心肌病；心动过速；上心室性心动过速；心搏徐缓；心房扑动；胎儿水肿；心律不齐；期外收缩的心律不齐；胎儿心脏心律不齐；心内膜炎；心房颤动；先天扩张性心肌病；Chagas′心脏病；长QT综合症；Brugada综合症；缺血；氧不足；心室颤动；心室过速；再狭窄；充血性心力衰竭；晕厥；心律不整；心包疾病；心肌梗塞；不稳定型心绞痛、稳定型心绞痛；和心绞痛，病毒性心肌炎；和涉及心肌组织的非增殖细胞失调。
“改变的易感性”是指本发明的转基因动物显示具有心肌病显型的程度不同于非转基因的动物。心肌病显型可存在于发育的任何阶段，包括，但不限于，胚胎期的、出生后的、成年的、和接近动物寿命末期的。在一个实施方案中，心肌病显型可被外部刺激诱导，例如，但不限于，饮食、锻炼、化学处理、或外科手术程序。
心肌病显型包括，但不限于，肥大；形态，例如室间间隔肥大；左心室末端心脏收缩最大dP/dt或末端心脏舒张尺寸(τ)；乳头肌尺寸；左心室流出道阻塞；中心室肥大；心尖部肥大；不对称肥大；同心扩大的心室质量；偏心扩大的心室质量；肌小节结构；肌原纤维功能；受体表达；心率；心室收缩压；心室舒张压；主动脉舒张压；收缩性；间质纤维化；心肌细胞混乱；Ca2+敏感性；Ca2+释放；Ca2+摄取；儿茶酚敏感性；α-肾上腺素敏感性；β-肾上腺素敏感性；多巴酚丁胺敏感性；甲状腺素敏感性；血管紧缩素转换加工酶抑制剂敏感性；胺碘酮敏感性；利多卡因敏感性；糖蛋白受体拮抗剂敏感性；合成代谢类固醇敏感性；肉毒碱传送不规则；左心室扩张，减少的左心室射血分数；左心房扩张；利尿剂敏感性；血管容积；缺血；白细胞流体性质；多形核白细胞(PMN)膜流动性；PMN胞质Ca2+含量；高心室间隔缺损，玫瑰花结抑制效果；收缩力传送；心肌纤维混乱；增加的室硬度；减弱的松弛；小血管疾病；呼吸困难；心绞痛；前晕厥；心动过速；晕厥；昏睡；呼吸窘迫；褶皱毛发；背部拱起姿势；周边水肿；腹水；肝肿大；肺水肿；心脏扩大症；组织血栓形成；心重/体重比率；压力发展比率、压力失效比率、细胞收缩测量等等。参见例如Braunwald等人(2002)Circulation 106：1312-1316；Wigle等人(1995)Circulation 92：1680-1692；和Pi & Walker(2000)Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol 279：H26-H34；因此全文引入本文以供参考。
测量心肌病显型的方法为本领域所熟知，这些方法包括，但不限于，经胸壁对比超声心动图、经食管超声心动图、断裂测试、尿/儿茶酚氨分析、EIA、光学显微镜法、心脏导管插入术、动态心电图、Langendorff离体心脏制备、工作心脏制备、MRI、多重RT-PCR、正电子反射断层摄影术、血管照像术、磁共振自旋回波、短轴位MRI扫描、多普勒速度记录、多普勒彩色血流造影、应力铊研究、心脏超声、胸X-射线、氧消耗测试、电生理学研究、听诊、扫描EM、重量分析法、苏木精和曙红染色、皮肤纤维分析、透射电子显微镜、免疫荧光分析、三色染色、Masson三色染色、Von Kossa染色、2-D超声心动图、宫缩描记图、基线M-型超声心动图、和心肌乳酸盐产生分析法。参见例如Braz等人(2002)J.Cell.Biol.156：905-919；Braunwald等人(2002)Circulation106：1312-1316；Sohal等人(2001)Circulation Res.89：20-25；Nagueh等人(2000)Circulation 102：1346-1350；Sanbe等人(2001)J.Biol.Chem.276：32682-32686；Sanbe等人(1999)J.Biol.Chem.274：21085-21094；Wigle等人(1995)Circulation 92：1680-1692；Pi& Walker(2000)Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol 279：H26-H34；和Wang等人(2001)Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.269：H90-H98，因此全文引入本文以供参考。
本文所用术语“治疗”是指，在狭义上，使用本发明化合物可减轻存在于宿主内、优选存在于哺乳动物个体内、更优选存在于人体内的疾病或失调。因此，术语“治疗”包括：预防宿主内感染性疾病的发生，尤其是当宿主倾向于患有该疾病但尚未诊断出该疾病时；抑制感染性疾病；和/或缓和或减轻感染性疾病。在将本发明方法用于预防失调的情况下，应当理解的是，术语“预防”不需完全抑制病状。(参见Webster的NinthCollegiate Dictionary。)相反，本文所用术语“预防”是指本领域技术人员识别易感染疾病群体的能力，这样就可在疾病开始发作之前，使用本发明化合物。该术语并不意味着可完全避免病状。
用于治疗减弱的心脏收缩和松弛的PKCα抑制剂可以用已知的方法鉴定。PKCα抑制剂可以通过评估PKCα酶活性来鉴定。这可以通过使用许多市售试剂盒完成。其中一些试剂盒使用“标记的”底物，包括，但不限于，发光的、荧光的、放射性的或其它可测量的和可定量的终点。可供选择地，例如本发明中阐述的，PKCα蛋白本身可连接到一个可追踪的标记物，包括，但不限于，发光的、荧光的、放射性的离子或分子，以确定分离的或在细胞或组织内的PKCα的分布与活性。因为PKCα细胞中有许多已知的底物，通过测量PKCα细胞中底物的磷酸化或去磷酸化，PKCα活性可以被评估。通过使用标记的或未标记的磷酸化位点特异性抗体，发光的、荧光的、放射性的生物标记或其它对比PKCα的底物评定其活性的方法，PKCα底物的磷酸化/去磷酸化状态可以得到测量。可供选择地，底物的再分布也可用来测量它对PKCα活性变化的响应。当底物是一个致活酶、磷酸酶或其它酶时，底物的活性可以通过使用已确立的技术来测量。
可以通过使用分离的细胞或已测定含有PKCα的分离的组织，完成对有心脏功能不良的人类有益的PKCα抑制剂的鉴定。例如，PKCα抑制剂可以在来自哺乳动物或其它机体的分离的细胞、优选地心肌细胞中得到测试，PKCα抑制剂的作用可以通过测量细胞缩短百分比(％FS)来确定：缩短或重新伸长的比率(±dL/dt)，使用标准技术测定。可供选择地，肌，优选心脏来源的肌，可被分离，并且收缩功能评定可在有或没有PKCα抑制剂的情况下得到测量，使用标准技术测定。如本发明中概括的，可以通过测量急性血液动力，包括心率、血压、收缩率和松弛率(+dP/dt和-dP/dt)、左心室压，以及这些参数的衍生，鉴定PKCα抑制剂。可以通过这些方法鉴定合适的正常动物，包括，但不限于，小鼠的多种遗传品系、大鼠、豚鼠、仓鼠、人、兔子、狗、猪、山羊、母牛、猴子、黑猩猩、绵羊、仓鼠及斑马鱼的PKCα抑制剂。通过这些方法鉴定合适的心力衰竭或心脏功能不良的动物模型的PKCα抑制剂，包括，但不限于，转基因或去除基因小鼠的多种遗传品系，例如MLP(-/-)KO小鼠，1型丝氨酸或苏氨酸磷酸酶过表达小鼠(PP1c)和PKCα过表达转基因小鼠。此外，因为遗传或多重遗传缺陷而产生心力衰竭及心脏功能不良的自发的或天然的模型包括，但不限于，自发的高血压心力衰竭大鼠或Dahl盐敏感大鼠，它们的PKCα抑制剂可以得到鉴定。另外，心脏功能不良外科手术诱导模型包括，但不限于，心肌梗塞模型、冠状微栓子模型、主动脉收缩模型、动静脉瘘模型或其它大鼠、豚鼠、兔子、狗、猪、山羊、母牛、猴子、黑猩猩、绵羊、仓鼠及斑马鱼的压力或容积超负荷模型，它们的PKCα抑制剂可以被鉴定。
在一个实施方案中，本发明的转基因动物、组织或细胞可以被用来鉴定PKCα调节化合物。“PKCα调节化合物”是调节PKCα活性的化合物。PKCα调节化合物包括，但不限于，甘油二酯、磷脂酰丝氨酸、Ca++；PMA、CGP54345、双吲哚亚醯铵、AAP10、星形孢菌素、H-7(SigmaCo.)、二氮嗪、DiC8、花生四烯酸、G-6976(PKC及包括PKCα)、CGP54345、HBDDE(也叫PKCγ)和Ro-32-0432(也叫PKCβ)。检测分析PKCα活性的方法在本文的别处描述。本领域-已知的任何检测分析PKCα活性的方法都可以用来监控相关化合物对本发明中的转基因动物的作用。
PKCα抑制剂包括，但不限于，致活酶抑制剂、蛋白致活酶C抑制剂和PKCα特异性抑制剂。“致活酶抑制剂”是指抑制多种致活酶包括PKCα在内的化合物。“蛋白致活酶C抑制剂”是指一种优选抑制蛋白致活酶C活性的化合物，与它对其它致活酶的作用相比较。“PKCα特异性抑制剂”是指一种与其降低另外一种致活酶活性相比能更多的降低PKCα活性的化合物，其它的致活酶包括其它蛋白致活酶C的同工酶。已知的PKCα抑制剂包括，但不限于，具有反义核苷酸序列和反义分子的核酸分子，市售于Isis Pharmaceuticals，和显性负突变型的PKC，例如赖氨酸368精氨酸突变型(Braz等人(2002)J.Cell.Biol.156：905-919)。
补充到用于PKCα核苷酸序列的信使RNA(mRNA)的至少一个部分的反义构造可以被构建。反义核苷酸被构建以与相应的mRNA杂交。一旦序列杂交到并且干扰了相应mRNA的表达，反义序列可以被改变。用这种方法，可以使用对相应的反义序列具有至少约70％，优选地至少约80％，更优选地至少约85％的序列同一性的反义构造。此外，反义核苷酸的部分可以被用于中断目标基因的表达。通常使用有至少50个核苷酸，100个核苷酸，200个核苷酸或更多核苷酸的序列。因此，反义DNA序列可以被可操作的连接到心脏组织优选的启动子上以减少或抑制心脏组织中天然蛋白质的表达。
除了反义技术之外，基因表达还能通过双链RNA进行抑制，双链RNA包括短发夹结构RNA(shRNA)、干涉RNA(RNAi)、短末端RNA(stRNA)、mikroRNA(miRNA)或短干涉RNA(siRNA)。这些RNA干涉方法能使用不同大小的RNA，但是通常限于15至28个核苷酸，并且以目前仍不清楚的基质发挥功能。这个技术已经被成功的作为抑制基因功能的方法在体外和体内使用。
评估增加的收缩性和心力衰竭进展的标准包括，但不限于，β-受体数、β-受体耦连、腺苷酸环化酶活性、静态cAMP水平、施用福司可林后的cAMP水平、PKA活性、PKA蛋白水平、L-型钙通道电流密度、SERCA2a蛋白水平、和受磷蛋白mRNA水平或蛋白质的受磷蛋白磷酸化。
根据本发明的鉴定可被筛选的化合物包括但不限于已知的化合物库，包括天然产物，例如植物或动物提取物、合成化学制剂、生物活性物质，包括蛋白质、肽，例如可溶解的肽，包括但不限于随机肽库的组分、和由D-或L-构型氨基酸组成的组合化学衍生的分子库、磷酸肽(包括但不限于随机的或部分简并的定向磷酸肽库的组分)、抗体(包括但不限于多克隆的、单克隆、嵌合的、人的、抗独特型或单链的抗体，和Fab、F(ab′)2和Fab表达库片段，及其结合表位的片段)、有机的和无机的分子。
除了测试化合物的较多传统来源外，计算机模拟和查询技术容许利用来自本发明蛋白质的配体结合位点的结构信息来合理搜索测试化合物。对于测试化合物的这些合理搜索可降低为候选治疗化合物必须筛选的试验化合物的数目。了解本发明的蛋白质序列有助于产生结合位点模型，用于筛选可能的配体。这个过程可通过本领域已知的方式来完成。优选的方法包括产生蛋白质序列与模板(衍生自相似蛋白质的晶体结构或基于NMR的模型)的序列对比、氨基酸结构的转化和通过分子力学和表观鉴定来改进模型。如果不能得到强序列对比，那么通过建立疏水螺旋模型也可产生模型。指向残余物-残余物接触的突变数据也可用于定位彼此相对的螺旋，以便实现这些接触。在这个过程中，通过利用稳定配体结合的相互作用，将已知的配体对接至在螺旋内的结合部位空穴也有助于定位该螺旋。此模型可以通过使用分子力学进行精化和使用标准同源建模技术进行套环构建来完成。关于模拟的一般信息参见Schoneberg，T.等人，Molecularand Cellular Endocrinology，151：181-193(1999)、Flower，D.，Biochimica et Biophysica Acta，1422：207-234(1999)和Sexton，P.M.，Current Opinion in Drug Discovery and Development，2(5)：2(5)：440-448(1999)。
一旦模型被完成，它可以与几个现有计算机程序的其中一个一起被用于减少需被筛选的化合物的数目，这些化合物使用本发明的方法进行筛选，象DOCK程序(UCSF Molecular Design Institute，533 ParnassusAve，U-64，Box 0446，San Francisco，California 94143-0446)。在它的几个改进程序中，可以筛选商用的和/或专利的化合物的数据库，用于对结合部位进行空间拟合和粗糙的静电力互补。可使用的另一个程序是FLEXX(Tripos Inc.，1699 South Hanley Rd.，St.Louis，MO)。
本文所用术语“可药用的载体”是指包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌的和抗真菌的试剂、等张的和吸收延迟的试剂等，相容于药物的施用。药物活性物质的介质与试剂的使用为本领域所熟知。除了任何常规的介质与试剂是与活性化合物不相容的，这种介质可以在本发明的组合物中使用。辅助的活性化合物也可被掺入组合物。本发明的药学组合物被配制为与其预期的给药途径相容。给药途径的实施例包括肠胃外给药，例如，静脉注射、皮层内注射、皮下注射、口服(例如，吸入)、透皮注射(局部用药)、经粘膜给药和直肠给药。用于肠胃外给药的溶液或悬浮液、皮层内注射或皮下注射的应用包括以下组分：消毒的稀释剂例如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成的溶剂；抗菌剂例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺酸；缓冲液例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐、和用来调节张力的试剂如氯化钠或右旋糖。pH可以用酸或碱来调节，例如盐酸或氢氧化钠。肠胃外给药制备可以装在一次用量的针剂内、一次性的注射器或玻璃或塑料制的多重剂量小瓶中。
适于注射的药用组合物包括无菌的水溶液(水溶性的)或分散体，和用以无菌可注射溶液或分散体临时制备的无菌粉末。对于静脉注射，合适载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸盐缓冲液(PBS)。在所有这些例子中，组合物必需无菌并且其必须是易于以针剂形式存在的流体。在制造和储存条件下必须稳定并且储存必须避免被微生物污染，例如细菌和真菌。载体可以是溶剂或包含分散体的介质，例如，水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)、以及它们的合适的混合物。合适的流动性可以通过使用包衣例如卵磷脂、在分散体中维持所需的粒度和使用表面活性剂来维持。可以通过多种抗菌的和抗真菌的试剂来预防微生物，例如，对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、酚、抗坏血酸、乙基汞硫代水杨酸钠等等。在许多情况下，优选将等张试剂包括进组合物，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨醇和氯化钠。注射组合物的延长吸收可以通过将能延迟吸收的试剂，例如铝一硬脂酸盐和明胶，包括进入组合物来实现。
无菌注射溶液可以通过将所需的量的活性化合物(例如羧肽酶蛋白或抗羧肽酶抗体)掺入到合适的溶剂中，如必需的话可与上文列举的成分的一种或组合一起掺入，接着通过过滤除菌来制备。通常分散体通过掺入活性化合物到包含基础分散介质和上文列举的那些所需的其它成分的无菌载体中来制备。在用以制备无菌注射溶液的无菌粉末的例子中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，它们产生活性成分加上任何额外的所需成分的粉末，这些成分来自以前它们无菌过滤后的溶液。
口服组合物通常包括一种惰性稀释剂或一种可食用的载体。它们能被包进明胶胶囊或压缩进入片剂。为口服给药，通过已知的方法试剂能被包被以肠衣的形式通过胃，或进一步被包被或混和以被释放在胃肠道的特定区域。为了达到口服治疗剂的目的，活性化合物能被掺入赋形剂并以片剂、药片或胶囊的形式使用。口服组合物也能使用流体载体制备，用作漱口水，其中流体载体中的化合物被口服给药，漱口并吐出或咽下。药物相容的结合剂和/或辅剂物质能作为一部分被包括进组合物。片剂、药丸、胶囊、药片等等能包含任何下述成分或具有相似性质的化合物：粘合剂如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖、崩解剂如藻酸、Primogel(RTM)或谷物淀粉；润滑剂如硬脂酸镁；助流剂如胶态二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或调味剂如薄荷油、甲基水杨酸酯或橙味剂
为了通过吸入给药，化合物被以气溶胶喷雾的形式递送，气溶胶喷雾来自加压的容器或分配器，它们包含合适的推进剂例如象二氧化碳这样的气体，或喷雾器。
系统的给药也可以通过经粘膜的或透皮注射的方法。为了经粘膜的或透皮注射的给药，对想要渗透通过的障碍适用的渗透剂被用于制剂中。这些渗透剂是本领域通常已知的，并且包括，例如为经粘膜的给药，洗涤剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜的给药可以通过使用鼻喷剂或栓剂被成功完成。为了透皮注射的给药，活性化合物被配制成本领域通常已知的油膏剂、药膏、凝胶或霜膏。
化合物也能以栓剂(例如用常规栓剂基质如椰子油和其它甘油酯)或用于直肠递送的保留灌肠的形式制备。
在一个实施方案中，活性化合物和载体一起被制备，载体将保护化合物不被身体迅速的消除，例如一种受控的释放制剂，包括灌输和微胶囊化的递送体系。能使用可生物讲解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚羟基乙酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这些制剂的方法为本领域的技术人员所熟知。材料也能从Alza Corporation and NovaPharmaceuticals，Inc.购得。脂质体悬浮液(包括和病毒抗原单克隆抗体一起用于感染细胞的脂质体)也能被用作可药用的载体。这些能依照本领域技术人员所已知的方法被制备，例如，描述在美国专利4,522,811。
尤其有利的是以剂量单位的形式配制口服的或肠胃外给药的组合物，易于给药和同一化剂量。本文所用的“剂量单位形式”是指适用作被治疗的个体一体剂量的物理离散单元，每个单位包含与所需药物载体联合使用，产生所需治疗效果计算的预定量的活性化合物。本发明的剂量单位形式的规格被指示自并直接取决于活性化合物的独特性质和想要获得的具体治疗效果，以及本领域组合这样一种用于个体治疗的活性化合物所受的内在限制。
本发明的方法鉴定的抗心肌病的化合物可以被用于人类的治疗。
方法
实施例1.转基因小鼠的产生
PKCα基因通过胚胎干细胞中的标准同源重组产生删除，接着产生嵌合小鼠，它被培养并传递目标等位基因进入种系。编码PKCα中ATP结合弹夹的外显子被删除，导致缺失与蛋白表达相关的等位基因。为了产生PKCα过表达转基因小鼠，编码PKCα的cDNA被亚克隆进入包含鼠α-肌球蛋白重链启动子的表达载体并注入新的已受精的卵母细胞。MLP、PP1c和压力超负荷的外科手术模型(TAC)都在其它文献中被描述(Arber等人(1997)Cell 88：393-403；Carr等人(2002)Mol.Cell.Biol.22：4124-4135；和Liang等人(2003)EMBO.J.22：5079-5089)。雄性小鼠被专用于所有研究中以保持一致性。所有的动物试验被Institutional Animal Care and Use Committee批准。
实施例2.超声心动图分析
来自所有基因型或处理组的小鼠被异氟烷麻醉，并且超声心动图使用一台Hewlett Packard 5500仪器和一个15-MHZ的微探针进行。每组四只单独的小鼠在M-模式进行三次超声心动图测量。本研究中使用的离体小鼠心脏的制备以前被详细的描述过(Gulick等人(1997)Circ.Res.80：655-664)，本文所用的闭胸工作心脏模型也是如此(Lorenz等人(1997)Am.J.Physiol.272：H1137-H1146)。
实施例3.组织学肥大标记基因分析
心脏在指示的时间被采集，固定在10％包含PBS的福尔马林中，内部植入石蜡。来自每一组的连续的5-μm心脏切片被分析。样品用苏木精和曙红或Masson三色染色法染色。如以前所述，肥大分子标记的心脏基因表达通过RNA点杂交分析进行评估(Jones等人(1996)J.Clin.Invest 98：1906-1917)。
实施例4.腺病毒感染后单个成年大鼠心肌细胞的收缩性
心室肌细胞被分离自Sprague-Dawley大鼠的心脏(Westfall等人，(1997 Methods Cell Biology 52：307-322)，并置于层粘连蛋白涂敷的盖玻片上，浸于有5％血清的DMEM中2小时。介质然后被无血清的包含一个重组病毒载体的DMEM置换。无血清的DMEM 1小时后被加入，介质每2天更换一次。约70％至85％的分离细胞是杆状的，每个心脏中有1-2×106杆状肌细胞。用于缩短分析的肌细胞在补充有青霉素/链霉素、10mM N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(Hepes)、0.2mg/mL白蛋白、和10mM谷胱甘肽的介质199中被电刺激(Westfall and Borton，(2003)J.Biol.Chem.278：33694-33700)。肌细胞在放置1天后被用铂电极转移到刺激室中，并在使＜25％的肌细胞产生收缩的电压下，以0.2Hz和2.5ms的脉冲被刺激。刺激室中的介质每12小时被置换。对收缩性功能研究，盖玻片被安装在温控的室中，室中包含用于肌小节缩短测量的M199。肌小节长度经由可变场率CCD摄影机(Ionoptix；Milton，MA)测量，并用肌小节长度检测软件记录。肌细胞以0.2Hz的频率被刺激，并记录60秒的肌小节缩短。峰缩短、到峰值时间、到最大松弛一半的时间和收缩与松弛率来自10次收缩的信号平均。来自这些研究的结果通过单因素方差分析和事后Newman-Keuls测试被比较。
实施例5.电生理学记录。
心肌细胞分离自3个月大小的野生型或非转基因(Ntg)和PKCα-KO小鼠，电生理学记录如前所述的方法进行(Petrashevskaya等人(2002)Cardiovasc.Res.54：117-132和Masaki等人(1997)Am.J.Physiol.272：H606-H612)。简而言之，心脏使用无Ca2+的Tyrode溶液经受逆行冠状动脉灌注10分钟，并使用包含胶原酶II型(Worthington；1.0mg/ml)、5mM牛磺酸和10mM BDM(2，3-丁二酮单肟)的Tyrode溶液(250μM Ca2+)在37℃下灌注8至12分钟，用95％O2和5％CO2起泡。在灌注的结尾心脏被移除，心室组织在低Cl-、高K+-KB介质中被机械切碎。然后切碎的心室组织被轻柔地过滤，并储存在4℃直到电生理学研究。仅仅具有清楚地交叉条纹的、无自发性收缩或显著粗糙表面的耐Ca2+细胞被选出用于试验。
试验在20℃至24℃下，在分离的心肌细胞上进行。所有当前的记录都来自整细胞，通过使用1.60OD硅酸硼玻璃电极(Garner GlassCompany)膜片钳技术的电压钳构型。通过在一个来自0mV的钳制电位的由25mV超极化测试脉冲(25ms)引起的非补偿性的瞬变容量下整合此区域，细胞容量能被计算。电阻范围是2MΩ至11MΩ。这些研究中所述的大多数数据用有0.5MΩ至3MΩ电阻的电极获得。在记录电极和肌细胞膜之间形成高电阻的密封后，电极电容在破坏膜片之前被充分的电子补偿。ICa电流被引发，这是通过去极化电压阶跃(380ms)-从50mV至+40mV，从一个钳制电位-60mV以10mV递增。被记录的电流通过一个四极低频Bessel过滤器以2kHz被过滤，并在5kHz被数字化。试验使用pClamp 5.6软件(Axon Instruments)被控制，并使用Clampfit 6.0.3.被分析。Ca2+流使用外部溶液被记录，该溶液包含(用mM计算)：CaCl21.8、氯化四乙铵(TEA-Cl)135、4-氨基吡啶(4-AP)5、葡萄糖10、HEPES 10、MgCl2、(pH 7.3)。吸移管溶液包含(mM)：天冬氨酸铯100、CsCl 20、MgCl2 1、Mg-ATP 2、Na2-GTP 0.5、EGTA 5、HEPES 5、(pH7.3，CsOH)。这些溶液从其它膜电流中分离ICa，例如Na+和K+通道电流，和通过Na+/Ca2+交换器的Ca2+流。
实施例6.钙瞬变测量
分离小鼠左心室肌细胞以评估钙瞬变的测量依照前述的方法进行(Chu等人(1996)Circ.Res.79：1064-1076)。Ca2+瞬变在室温下从心肌细胞中被测量。简而言之，小鼠心脏被切离麻醉的(戊巴比妥钠，70mg/kg，i.p.)成年小鼠，安装在Langendorff灌注设备上，用无Ca2+的Tyrode溶液在37℃下被灌注3分钟。正常Tyrode溶液包含140mM NaCl、4mM KCl、1mM MgCl2、10mM葡萄糖和5mM HEPES、pH 7.4。然后灌注被转换为包含75units/mL 1型胶原酶(Worthington)的相同溶液，并持续灌注直到心脏变得无力(～10至15分钟)。左心室组织被切离、切碎、吸移管分离并通过240μm筛网过滤。然后细胞悬浮液被连续在25、100、200μM和1mM Ca2+-Tyrode中洗涤。为获得胞内Ca2+信号，细胞用fura-2(Fura-2/AM；2μM)型乙酰甲基酯室温培养30分钟，并再悬浮在1.8mM的Ca2+-Tyrode溶液中。肌细胞悬浮液被置于树脂玻璃室中，此室被放置在反向落谢荧光显微镜(Nikon Diaphot 200)上，并用1.8mM的Ca2+-Tyrode溶液在室温下(22℃至23℃)灌注。肌细胞收缩被Grass S5刺激器(0.5Hz，方波)场刺激，并且细胞在340nm和380nm被Delta Scan双电子束荧光分光光度计(PhotonTechnology International)交替刺激5次。Ca2+瞬变以因而发生的510nm发射的340/380nm比率被记录。获得了由340/380nm比率预测的基线和振幅，以及80％衰减的Ca2+信号和tau。所有的数据使用来自FeliX和Ionwizard的软件被分析。
实施例7.I-1的体外PKCα磷酸化
PKC致活酶反应混合物包括10μM抑制剂-1、20mM MOPS、pH 7.2，25mM β-磷酸甘油、1mM MgCl2、1mM原钒酸钠、1mM DTT、1mM CaCl2、0.1mg/mL磷脂酰丝氨酸、0.01mg/mL甘油二酯、100μM ATP和0.6mCi/mL [32P]ATP。PKC从兔心脏肌肉中分离(Woodgett和Hunter，(1987)J.Biol.Chem.262：4836-4843)，重组野生型和Ser-67-Ala抑制剂-1从E.coli中分离(Bibb等人(2001)J.Biol.Chem.276：14490-14497)。反应在30℃下进行，等分试样在具体的时间点被移除，并且通过加入蛋白质样品缓冲液终止。化学计量通过SDS-PAGE和直接的放射能定量被测定。
实施例8.原代心肌细胞培养
初生大鼠心肌细胞的原代培养通过如前所述的酶分离1至2天大小的Sprague-Dawley幼年大鼠获得(De Windt等人(2000)J.Biol.Chem.275：13571-13579)。心肌细胞在补充有青霉素/链霉素(100U/mL)和L-谷氨酰胺(2mmol/L)的无血清M199培养基中培养。
实施例9.复制缺乏的腺病毒
编码心肌细胞中野生型或显性负性突变型的PKCα的腺病毒的特征以前被描述(Braz等人(2002)J.Cell Biol.156：905-919)。显性负性PKCαcDNA由赖氨酸到精氨酸的突变组成，突变发生在氨基酸位置368处的ATP结合区域。每种重组腺病毒被噬斑纯化、展开并在HEK293细胞中测定浓度。典型的试验涉及6个初生大鼠心肌细胞在100个空斑形成单位的moi处感染2个小时，温度37℃，在潮湿的、6％CO2培养箱内。接下来，细胞在分析前在无血清的M199培养基中培养额外的24小时。在这些条件下95％的细胞显示重组蛋白的表达。
实施例10.PKC移位分析和免疫印迹分析
可溶的和颗粒状的片段用前述的方法制备(Braz等人(2002)J.Cell Biol.156：905-919)。蛋白质样品经过SDS-PAGE(10％凝胶)被转移到Hybond-P膜(Amersham Pharmacia Biotech)上，用7％的牛奶封闭，并和PKCα、β、δ、ε、SERCA2、肌钙蛋白、PLB、磷酸丝氨酸-16PLB、抑制剂-1和PP1cα的第一抗体一起培养。磷酸特异性I-1抗体以前被描述(Bibb等人(2001)J.Biol.Chem.276：14490-14497。第一抗体4℃下在3％的牛奶中被培养过夜。第二抗体IgG(碱性磷酸酶缀合的-抗-小鼠、-兔子或-山羊)室温下在0.5％至3％的牛奶中被培养1小时。化学荧光检测用Vistra ECF试剂(RPN 5785；AmershamPharmacia Biotech)直接进行并用PhosphorImager扫描，或化学发光用ECL(Amersham Pharmacia Biotech)进行，并暴露在薄膜上。
实施例11.免疫沉淀反应和蛋白质磷酸酶活性分析
蛋白质提取物产生自用编码β-半乳糖苷酶、I-1、PKCα和PKCα-dn的腺病毒感染的心肌细胞。提取物与结合到琼脂糖微珠的PPIcα免疫沉淀，接着与I-1进行western blotting。磷酸化蛋白底物的制备和蛋白质磷酸酶的放射性分析依照Protein Serine/Threonine Phosphatase(PSP)Assay System(New England BioLabs，Inc.)进行准备。
实施例12.咖啡因诱导的钙瞬变
咖啡因诱导的钙瞬变在来自4只PKCα缺失小鼠的总共37个肌细胞和来自3只野生型小鼠的19个对照肌细胞中被测量。在胶原酶消化后，肌细胞室温下与Indo-1 AM(25μg/2mL)一起被载入12分钟。在以前的静止状态(无电刺激)和在加入20mM咖啡因期间的胞内钙瞬变(通过Indo-1荧光比率测量)被记录。
实施例13.心脏官能度评估
心脏分离自四只野生型和四只PKCα-/-(PKCα缺失)的转基因小鼠。分离的心脏用9个不同浓度的PMA灌输，浓度范围从8×10-11至8×10-7M。每种浓度的急性PMA灌输进行7分钟。心脏在收缩期和舒张期分别被测量最大和最小dP/dt。一个这种试验的结果在图36中被描述。
实施例14.PKC同工酶丰度评估
标准曲线被用以评估健康人心脏中的PKC同工酶的相对丰度。细菌中产生的重组人蛋白PKCα、PKCβI、PKCβII、PKCγ和PKCε购自供应商。制备三份已知浓度的等分试样。
成人心室组织移植自六个无疾病的人。制备全细胞蛋白溶液。三份标准PKC等分试样和心脏蛋白质在相同凝胶上经过聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白质被转移到膜上。膜被封闭并与PKCα、PKCβI、PKCβII、PKCγ和PKCε同工酶特异性的抗体一起培养。来自这样一个试验的数据在图37中被描述。
实施例15.心脏官能度评估
相对选择性的PKCα/β抑制剂化合物Ro-32-0432[2-{8-[(二甲氨基)甲基]-6，7，8，9-四氢吡啶[1，2-a]吲哚-3-yl}-3-(1-甲基吲哚-3-yl)马来酰亚，盐酸盐][3-{8-[(二甲氨基)甲基]-6，7，8，9-四氢吡啶[1，2-a]吲哚-10-yl}-4-(1-甲基吲哚-3-yl)-1H-吡咯-2，5-二酮，盐酸盐]被用作直接检查急性PKCα抑制对心脏功能和收缩性的效果的一种方法，使用体外工作心脏的制备。工作心脏制备分隔心脏的固有泵功能与总血管阻力的潜在改变，此改变如果药物在体内被灌输可能会发生。
工作成年野生型小鼠心脏用载体对照物(10％DMSO)或在10％DMSO中的Ro-32-0432灌输，Ro-32-0432的浓度范围在4×10-10至4×10-6M之间。在Ro-32-0432组中四只动物被分析并与载体对照组中的三只动物作比较。在浓度时间段(7分钟每10个不同的递增浓度)的值被求和以用于统计学目的，表示一个约1×10-8M的平均剂量。载体对照和试验组显示在不进行任何处理之前，心率每分钟分别跳动363+/-15和295+/-26次。载体和药物处理组的平均心率分别是每分钟跳动351+/＝3和292+/-6次。尽管心率较低，Ro-32-0432灌输组显示以最大dP/dt测量的急性收缩功能增加，并且左心室的压力增加。Ro-32-0432处理组中急性收缩性能改变约20％，与PKCα缺失小鼠中观察到的心脏功能的增加相似。来自一个这种试验的数据在图38中被描述。
实施例16.PKCα指示多肽的移位
PKCα指示物通过可操作地连接编码PKCα的核苷酸序列到编码绿色荧光蛋白(GFP)的核苷酸序列被制备。包含PKCα-GFP核苷酸序列的表达弹夹被制备。包含PKCα-GFP表达弹夹的腺病毒被制备。
初生大鼠心肌细胞在塑料盘中培养直到达到合适的密度。心肌细胞用编码PKCα-GFP的腺病毒感染。培养物被孵育24小时。24小时后细胞或者单独与DMSO(载体处理)或者与DMSO和PMA一起孵育60分钟。细胞被固定并通过共焦显微镜检查。PMA刺激的细胞显示具有高度局部化的和点状染色的模式，而载体仅仅刺激细胞显示具有相对分散的PKCα-GFP分布。
实施例17.麻醉大鼠中的体内PKCα抑制剂评估
选择性的PKCα抑制剂在天然大鼠和有心肌梗塞(MI)的大鼠中被评估其对心肌收缩能力和血液动力的效果。
重量在225gm至500gm的雄性Sprague-Dawley或Lewis大鼠用异氟烷进行麻醉，MI被用以下方式诱导。完成第四或第五脉间的胸廓切开术，暴露心脏，打开心包膜。5-0缝合被置于离开原位2至4毫米的左冠状动脉降支周围，并被固定系住。肋、肌肉、皮肤被分别闭合，动物允许恢复。手术后二十至二十三周动物被用来评估PKCα抑制剂对心肌收缩能力和血液动力的效果。
抑制剂对天然的和MI大鼠的心肌收缩能力和血液动力的效果评估如下。动物被用异氟烷进行麻醉。为测量全身血压，股动脉被分离并插入导管。颈静脉被分离和插入导管以静脉注射抑制剂。右颈动脉被分离，一个Millar电导系数导管被插入心脏的左心室(LV)。左心室的心脏收缩压力、心脏舒张末压、+最大值dP/dt、-最小值dP/dt和心率得自LV压力波形。平均动脉血压得自全身血压波形。数据被连续地记录，并使用计算机化的数据采集软件(Notocord或Powerlab)。
经过一段时间地稳定，PKCα抑制剂被以以下剂量注入 大鼠：0.1、0.3、1.0、3.0、10、30、100、300和1000nmol/kg/min。每一剂量的注入被允许持续至少五分钟。对于MI大鼠，注入剂量如下：10、30、100、300、和1000nmol/kg/min，至少五分钟。当量注入体积被施用给分离的载体对照天然的和MI动物。测试注入的最后，5.0μg/kg/min多巴酚丁胺被注入。
实施例18.抗心肌症化合物的鉴定方法
此分析可被用于多种心肌症显型。相关的PKCα核苷酸序列被克隆进一个包含心脏组织优选的启动子的表达载体。包含启动子的表达弹夹，可操作地连接到相关核苷酸序列，被限制酶消化。限制反应产物被放在琼脂糖凝胶上电泳，表达弹夹纯化自由琼脂糖凝胶。表达弹夹依照本领域已知的任何方法被制备用于显微注射。表达弹夹被用于提供转基因小鼠。使用Southern blot分析，证实了转基因的存在。
两组年龄匹配的转基因小鼠被确定。其中一群小鼠的饮食被相关化合物补充。另外一群的饮食被安慰剂补充。两组小鼠被培养适当的时间并终止试验。小鼠被监控是否心肌症显型，例如，使用本文别处描述的左心室/身体重量比率的肥大。两群小鼠显示的心肌症显型被比较。可供选择地，化合物可以用已确立的方法和技术直接施用于动物，包括，但不限于，动脉内注射或静脉注射化合物，通过用注射器或微型渗透泵或其它方法、口服强饲法、腹膜内注射或皮下注射。
试验结果和讨论
在以下图中，除非另外指明，数据用用平均值的标准偏差描述。
图1：PKCα位点(也叫Prkca)是胚胎干细胞中的同源重组靶向的，以便于通过用新霉素抗性标记物替换删除编码催化ATP结合弹夹的外显子(见分图A)。通过用EcoRV消化的DNA和一个载体同源区域以外的5′探针的Southern blotting检查基因组靶向(见分图B)，说明正确的靶向和选择的外显子的删除。使用以前本领域常用的普通技术，正确靶向的胚胎干细胞被用来产生包含种系的PKCα靶向小鼠。PKCα+/-小鼠被杂交，以预知的孟德尔频率，产生PKCα-/-后裔。分图C显示来自野生型、PKCα+/-和PKCα-/-小鼠心脏蛋白提取物的PKCα蛋白水平的western blotting，说明PKCα-/-小鼠的PKCα蛋白被完全消除，并且与非靶向的野生型小鼠相比，PKCα+/-小鼠的蛋白被降低约50％。
图2：为了评估其它PKC同工酶可能补偿心脏内PKCα损失的潜力，来自两个月大小PKCα-/-小鼠，经受通过主动脉缩窄(TAC)而遭受的压力超负荷两周的小鼠或虚假对照动物的心脏，进行western blotting。野生型对照动物也经受TAC或假手术。来自这些心脏的蛋白提取物被分成可溶解的(S)或颗粒的(P)部分，进行western blot以选择PKC同工酶。数据显示PKCα-/-小鼠完全缺乏PKCα蛋白，而PKCβ、δ和ε水平或移位效率未受影响。这些结果指示交替的PKC同工酶不太可能明显地补偿心脏内PKCα的损失。
图3：6个PKCα-/-和6个非靶向的野生型小鼠的闭胸无创血液动力评估显示最大dP/dt从基线增长了15％至20％，伴随着受多巴酚丁胺刺激后的β肾上腺素的受体相应的平行增长。这些结果指示PKCα-/-小鼠体内有高收缩的心脏。
图4：为了评估除了潜在的血液动力学补偿反应的心脏固有功能，体外顺式工作的心脏制备在2至10个月大小的PKCα-/-或野生型小鼠(每组4个心脏)中进行。每个心脏被调速在约每分钟400下，以确保功能容量的相同评估。PKCα-/-心脏显示，与年龄匹配、野生型同窝出生的对照相比较，在2和10个月时，最大dP/dt分别增加15％和32％。(分图A)。左心室压力发展相应的增长也可在PKCα-/-小鼠中被观察到(分图B)。这些结果还表明PKCα-/-小鼠有高收缩的心脏，不足不会被存在于整个动物中的其它机制补偿。
图5：6个PKCα-/-和6个非靶向的野生型小鼠胸腔闭胸无创血液动力评估显示心率(分图A)或平均动脉压(分图B)都没有变化。这些结果表明PKCα-/-中被观察到的心脏的伸缩力的增强不是因为血压或心率的次级改变。
图6：为了评估与心脏中PKCα蛋白去除相关联的功能获得显型，在心脏特异性α肌球蛋白重链启动子控制下过表达野生型PKCαcDNA的转基因小鼠被产生(分图A)。来自野生型小鼠或PKCα过表达转基因小鼠的心脏蛋白提取物的定量western blotting显示转基因心脏内PKCα蛋白的5倍的过表达，PKCβ、δ或ε中没有任何补偿性的改变(分图B，上部)。来自野生型、PKCα转基因或PKCα-/-小鼠的心脏蛋白提取物的Western blotting显示PKCα增强的磷酸化，说明了由转基因引起的更强的活性(分图B，下部)。Western blotting程序中，PKCα-/-心脏提取物被用作迁移对照物。这些结果表明PKCα转基因小鼠心脏内有显著更强的PKCα活性。
图7：PKCα转基因小鼠出现心肌病症状。4个月大小的PKCα转基因小鼠显示减少的片段缩短，此缩短与年龄和品系匹配的野生型对照相比较，通过超声心动图测量，说明增强的PKCα活性减少体内心脏的收缩性能(分图A)。用体外工作心脏制备(分图B)评估的最大dP/dt评估也支持此结论，与野生型对照相比较，PKCα转基因小鼠也显示减少的心脏性能。在以上的试验中，每组(A和B)使用4只动物。
图8：直到6和8个月大小的时候，即在图7说明的减少收缩性能后不久，PKCα转基因小鼠才出现心脏肥大症状。到6和8个月大小时，心脏肥大的逐渐显示是减少的收缩性能的结果，这些共同表明心脏内PKCα活性的增强引起心肌病。每组使用4只动物。
图9：虽然PKCα基因靶向的和转基因小鼠显示对立的心肌收缩能力显型，与慢性的PKCα活性改变相关的次级作用的潜力不能被忽视。为了验证此考虑，PKCα活化或抑制的急性模型被在野生型成年大鼠的心肌细胞内建立，接着是检查单个细胞的收缩反应。野生型或显性负性PKCα的腺病毒介导的基因转移分别降低和增强肌细胞的收缩性，收缩性通过峰缩短进行测量(P＜0.05)。最大缩短速率也同样的被影响，在对照成年肌细胞中的值为4.04±0.23μm/sec。与之相比，野生型和显性负性PKCα腺病毒-感染的肌细胞分别为3.16±0.25μm/sec和5.48±0.36μm/sec(P＜0.05)。这些数据表明PKCα活性急性改变影响肌细胞收缩性，与图1至8中描述的遗传小鼠模型一致。
图10：PKCα-/-心脏显示受磷蛋白(PLB)过度磷酸化，导致使用western blotting的迟缓的迁移和丝氨酸16直接磷酸化的增强，丝氨酸CA2或肌钙蛋白水平没有变化(分图A、B)。为更好的表现迁移中地差别，PLB五聚物形态被显示。有趣的是，观察到的PLB过度磷酸化特征图也与降低的PLB蛋白水平相关，因此导致PLB/SERCA2蛋白比率被降低50％至70％，预计这样可以使SERCA2更具活性(分图A)。已知用来改变PLB收缩效力的位点，与野生型(Wt)对照心脏相比较，位于丝氨酸16的PLB磷酸化的直接测量结果在PKCα-/-小鼠心脏内是增加的(分图C、D)。这些结果表明有一种潜在的机制，通过其PKCα蛋白损失通过消除PLB抑制丝氨酸SERCA2a活性的功效增强心肌收缩能力能。
图11：PKCα和PLB之间的全部的调节范例也在急性感染的成年大鼠心肌细胞中被观察到。具体地讲，腺病毒介导的基因转移的显性负性PKCα表达，也与位于丝氨酸16的PLB增强的磷酸化相关。这些结果共同表明PKCα信号的变化影响PLB磷酸化状态和蛋白水平，说明有一种机制，通过其PKCα的去除或过表达可能影响收缩性。
图12：使用RNA dot blotting(分图A)或半定量的RT-PCR(分图B)，都未发现野生型和PKCα-/-心脏间的PLB或SERCA2 mRNA水平有变化，表示图10描述的PB蛋白被观察到的下调，由转录后机制引起。PLB蛋白水平的降低被假设是由降低的蛋白稳定性导致，SR中的净分裂形态的稳定的SERCA2复合物。
图13：PKCα转基因小鼠具有心脏中更多的PKCα活性和蛋白，它与PKCα-/-小鼠相比显示PLB的反向改变。具体地讲，心脏中的PLB磷酸化被减少了，而总蛋白增加了2.1倍(P＜0.05)(分图A-D)。观察到的PLB去磷酸状态与总蛋白的增加一起会显著抑制SERCA2活性。因此，PKCα的过表达降低心肌收缩能力。为更好地说明蛋白迁移的变化，PLB五聚物形态被显示。
图14：PLB磷酸化的改变将直接改变SERCA2功能，因此影响肌质网中的钙进入和钙瞬变的幅度。分离自PKCα-/-小鼠的成熟心肌细胞显示增强的钙瞬变，说明有更多的钙进入肌质网中(分图A)。装有Fura-2的PKCα-/-细胞显示了钙峰释放52％的增加，以及17％更快的钙再摄入(T80)，相应于时间常数Tau 20％的降低(n＝36个细胞来自6只野生型小鼠，33个细胞来自4只PKCα-/-小鼠)(分图B)。这些数据与增强的SERCA2a功能和更大的肌质网中钙进入相一致，因此反映了心肌的休克状态。
图15：这些结果说明PKCα-/-心肌细胞中观察到的增大的钙瞬变是由于肌质网中增加的钙进入。在Indo-1载入的心肌细胞中被咖啡因给药诱导的钙释放峰值直接测量说明了PKCα-/-小鼠与野生型(Wt)对照相比显著更大的肌质网钙进入(P＜0.05)(分图A显示代表性的钙追踪图，B显示对峰咖啡因诱导的钙释放的定量的数据)。
图16：图14中描述的钙瞬变被观察到的增加也可能是部分由于肌膜中L-型钙电流的增大。然而，平均ICa密度的直接测量值在野生型和PKCα-/-心肌细胞中没有变化。
图17：β-肾上腺素受体信号或蛋白致活酶A活性不发生相应的变化，PLB磷酸化中观察到的改变说明作用于PLB的磷酸酶的潜在作用。为了研究这种潜在的效应器途径，PP1-和PP2A-特异性磷酸酶分析被从野生型心脏和PKCα-/-心脏中进行(每种N＝4个心脏)。在PKCα-/-心脏中的总蛋白磷酸酶活性降低了约18％，而PP1-特异性活性降低了大于30％，而PP2A-特异性活性无显著的不同。这些结果指示PKCα的损失与心脏中的PP1活性的降低相联系。
图18：相应于PKCα-/-小鼠心脏中显示的数据，PKCα过表达转基因小鼠显示了心脏中PP1活性的显著增加，但是PP2A活性未发生变化。这些结果指示心脏中增加的PKCα活性与PP1活性的特异性增加相联系。数据被表示为相对磷酸酶活性。
图19：与图17和18中描述的数据一致，培养心肌细胞的急性腺病毒感染显示随着显性负性PKCα突变型的表达的PP1活性60％的减少，以及随着野生型PKCα过表达的PP1活性30％的增加(来自三重实验)。PKCα的急性改变对应于PP1活性的改变，这说明PKCα可能通过一种在下面的图中详细阐述的机制直接调节PP1活性。
图20：PP1活性被一类蛋白质抑制剂调节，例如抑制蛋白-1(I-1)。I-1直接结合PP1，导致抑制PP1的活性，虽然I-1的PP1结合能力取决于它的来自可诱导信号的磷酸化状态。为了检查PKCα可能直接磷酸化I-1并因此调节它与PP1的结合这一假说，在存在32P-ATP的条件下使用细菌产生的I-1和纯化PKC进行体外磷酸化实验。野生型I-1蛋白被PKC在化学计量水平以时间依赖性的方式体外直接磷酸化。I-1中的假定PKC磷酸化位点分析显示了一个在丝氨酸-67的共有基序。重组S67A突变型I-1蛋白显示与相同量的野生型蛋白相比约50％减少的通过PKC的磷酸化。
图21：为了进一步检查PP1活性被PKCα改变的潜在机制，在腺病毒感染的经受PP1c下调的心肌细胞中进行一系列I-1免疫沉淀反应，接下列进行I-1 western blotting(输入通道不被免疫沉淀)。数据说明，野生型PKCα过表达特异性地减少I-1与PP1c的结合能力约50％，而显性负性PKCα(dn)增加复合物形成大于70％。在每一种免疫沉淀反应中的总PP1c水平没有不同。
图22：I-1结合并抑制PP1的能力也被蛋白致活酶A-调节的I-1中的苏氨酸-35磷酸化调节。在此位点的磷酸化致使I-1成为更有效的PP1抑制剂，因此减少它的活性，这与通过PKCα的丝氨酸-67磷酸化效果相反。我们研究了野生型或显性负性PKCα的表达对I-1的或者苏氨酸-35或者丝氨酸-67位点磷酸化的影响，使用对每个位点的磷酸特异性的抗体。用AdI-1(Ad＝腺病毒)和Adβgal、AdPKCα-wt或AdPKCα-dn一起使用，感染培养的心肌细胞以增加分析的敏感性，相应于PKCα调节在苏氨酸-35磷酸化中没有观察到变化。然而，AdPKCα-dn表达显著地减少I-1丝氨酸-67磷酸化超过70％，而AdPKCα-wt增加磷酸化大于60％。
图23：图20至22中描述的数据使用PKCα转基因靶向基因小鼠被体内提供，在这些小鼠中内源I-1的磷酸化被从心脏提取物中分析。用丝氨酸-67磷酸特异性抗血清进行的Western blotting说明来自PKCα-/-心脏的磷酸化显著地减少(超过50％)，而PKCα转基因心脏具有增加地磷酸化(2倍)(P＜0.05)。
图24：与图20至23中显示的数据一致，用来自扩张型衰竭人类心脏的蛋白质提取物进行的western blotting也显示与正常人供体心脏(分图B)相比较，I-1丝氨酸-67磷酸化的增加。这些数据也与通过相同蛋白提取物的western blotting评估的PKCα蛋白质水平的普遍增加相一致(P＜0.05)(分图A)。这些结果指示衰竭的、患心肌病的人心脏显示PKCα水平和I-1中丝氨酸67磷酸化的增加。
图25：培养的成年大鼠心肌细胞中的PKCα蛋白的共焦免疫组织化学分析显示PMA诱导的到膜移位和Z线。在未受刺激的细胞中，PKCα位于细胞各处，但是PMA的急性刺激引起它迅速的转移到与肌质网中Z线位置的PLB和SERCA2富集区相同的结构上去。这些数据指示PKCα一旦被活化，移位到合适的胞内位置以影响肌质网中的钙处理。
图26：此处我们检验PKCα靶向基因小鼠中观察到的相对温和的高收缩状态可能有益于衰竭心脏这一假说。PKCα-/-小鼠和野生型同胎仔畜对照经受长期的主动脉带诱导的心力衰竭。小鼠8周大小时开始在动脉腔中施用TAC 12周，然后通过工作心脏制备评估心脏功能。来自野生型小鼠的心脏显示与相同年龄的假手术对照小鼠相比最大dP/dt 50％的减少和LVP 35％的减少，而PKCα缺失小鼠的这两个参数不显示显著的减少(每组中N＝4个心脏)。这些结果指示PKCα-/-小鼠对压力过载刺激诱导的心脏补偿不全和收缩性损失是抗性的。
图27：接着如图26所述的长期主动脉带诱导的心力衰竭，心动超声图也被用以进一步检查收缩性影响。PKCα缺失小鼠和野生型同胎仔畜对照当8周大小时开始在动脉腔中施用TAC 12周，然后通过心动超声图评估心脏功能。来自经受12周TAC处理的野生型小鼠的心脏显示与经受相同刺激的PKCα-/-相比更显著地增加的左心室舒张末径(LVED)和左心室收缩末径(LVES)(分图A)。野生型TAC小鼠的心脏左室短轴缩短率(FS)与显示心室性能损失更少的PKCα-/-小鼠相比也更显著的减少了(分图B)。这些结果进一步指示PKCα-/-小鼠对压力过载刺激诱导的心脏补偿不全和体内收缩性损失是抗性的。
图28：由于去除肌肉lim蛋白(MLP)基因而产生扩张型心肌病的小鼠模型作为第二心力衰竭模型也被分析。通过心动超声图，2个月大小的MLP缺失小鼠与野生型对照或PKCα-/-小鼠相比显示减少的功能容量和更大的左心室扩张(分图A、B)。然而，缺失PKCα的MLP缺失小鼠显示心力衰竭症状的显著改善，例如更少的心室扩张(LVED和LVES)和保留的片段缩短(分图A、B)。这些结果指示PKCα损失预防在另一种小鼠心肌病与心力衰竭体内模式中的心脏功能不良和重塑。
图29：收缩性也在MLP-/-小鼠中使用分离的体外工作心脏制备被评估。这些数据显示MLP-/-小鼠中心肌收缩能力的显著减少，在也缺失PKCα(双缺失)的小鼠中这种减少被阻止，收缩性通过最大dP/dt或发展的左心室压力(LVP)的变化进行测量。这些结果进一步指示PKCα损失预防在MLP小鼠心肌病和心力衰竭体外模式中的心脏功能不良。
图30：通过删除MLP-/-背景中的PKCα来预防心力衰竭和心肌收缩能力减少说明心肌病的其它方面可以被减少。与MLP-/-小鼠相比，双缺失小鼠(也缺失PKCα)显示在反应性肥大中的损失，反应性肥大代表MLP缺失显型。因此，通过PKCα删除提高收缩性预防涉及心重(HW)对体重(BW)比率增加的扩张型心肌病显现的增加。
图31：与图30描述的数据一致，单MLP-/-小鼠有与在纵断剖面扩张的和增大的心肌层相关的组织学疾病，而双缺失小鼠(也缺失PKCα)基本上显示无疾病。这些结果进一步支持PKCα删除预防涉及组织病理学和总形态改变的扩张型心肌病显现的论点。
图32：已知在心脏中表达超过3倍PP1催化亚基的转基因小鼠在3个月大小时功能容量减少并有心肌病。我们的已知资料说明PKCα能直接调节心脏中的PP1活性(图18至24)，我们推断PKCα的损失将部分地抑制与PP1适度过表达相联系地增加地活性。与PP1转基因小鼠杂交的PKCα缺失小鼠证明心脏中PP1活性的显著减少。来自PP1转基因小鼠的心脏与来自野生型小鼠的心脏相比显示约2.5倍增加的PP1活性。再一次实验，来自PKCα-/-小鼠的心脏显示显著减少的心脏PP1活性。在PP2A中观察不到变化。这些结果指示PKCα损失减少心脏中的过表达PP1的效果。
图33：通过超声心动图评估，3个月大小的PP1转基因小鼠显示显著减少的心室性能的。然而，在PP1转基因背景下删除PKCα，它在图32中显示能减少PP1活性，能有效地预防心室性能的损失。这些结果指示PKCα能体内预防心肌病效果和在PP1转基因小鼠中观察到的收缩性的不足。
图34：3个月大小的PP1转基因小鼠也有减少的收缩性，收缩性用体外工作心脏制备来测量。然而，在PP1转基因背景下删除PKCα同样预防收缩性的损失，收缩性用最大dP/dt、最小dP/dt和发展的左心室压力(LVP)的改变测量。这些结果进一步支持PKCα能体外反转PP1转基因小鼠中观察到的心肌病效果和收缩性不足的结论。
图35：为了说明PKCα抑制对由心力衰竭和心肌病引起的死亡率的有益效果，死亡作为一个终点也被量化。图26和27中所述的12周的TAC实验也在对照野生型小鼠和PKCα-/-小鼠中进行动物死亡监控。数据显示与经受TAC的PKCα-/-小鼠相比，在经受超过12周时期TAC的野生型小鼠中观察到显著更多的死亡。在两种基因型的假控制小鼠中没有死亡被观察到。这些结果指示PKCα的损失保护小鼠不发生TAC诱导的心力衰竭和最终的过早死亡。此外，死亡率也在MLP-/-小鼠中被评估。图35B指示MLP-/-小鼠与其它描述的组相比有高的死亡率。MLP-/-小鼠中的高死亡率在缺少MLP和PKCα(双缺失)的小鼠中被减轻。数据指示PKCα去除/抑制在MLP去除和心力衰竭情况下提供存活的有益效果。
图36：为了更仔细的评估PKCα作为心肌收缩能力调节因子的潜在作用，我们在体外工作心脏制备中使用PMA急性给药到野生型或PKCα-/-心脏。PKC活化类化合物是弗波酯，它被用以引发心肌收缩能力的急性的、PKC依赖性的改变。此处分离的心脏用9个不同浓度的PMA灌输，浓度范围从8×10-11至8×10-7M(分图A、B)。数据显示浓度为8×10-11至8×10-9M的急性PMA灌输对野生型小鼠心脏的收缩性能基本上无效果，收缩性关于或者最大dP/dt或者最小dP/dt(分图A、B)。然而，高于8×10-9M的浓度产生野生型心脏中功能性能标志性的增长，说明PKC活化能在此制备中减少心肌收缩能力(分图A、B)。然而，经受相同浓度的PMA处理的PKCα缺失心脏显示对低剂量PMA的立即的正收缩变力效果，并且在最高浓度的PMA下功能性能仅有轻度的降低(图36A、B)。这些结果指示PMA诱导的心肌收缩能力降低直接取决于PKCα。这些数据支持PKCα作为收缩性的急性负性调节因子的重要作用，区别于其它也被PMA活化的PKC同工酶。
图37：因为PKCα可以作为一种新型靶用以急性改变心肌收缩能力并因此影响心力衰竭，人们有兴趣检查PKCα对来自心脏的其它类的PKC同工酶的相对丰度。重组人蛋白标准品(细菌中产生)购买自供应商，以便于产生PKCα、βI、βII、γ和ε的蛋白含量对western blotting信号强度的标准曲线。这些蛋白标准品与来自6个正常人心脏的全细胞蛋白样品在相同的凝胶中电泳并经受western blotting抗体检测。(分图A、B)。数据说明PKCα与其它在人类心脏中分析的PKC同工酶相比被以显著更高的水平表达(分图A、B)。这些结果说明PKCα是一种人类心脏中显著的PKC异构体。
图38：相对选择性的PKCα/β抑制剂化合物Ro-32-0432[2-{8-[(二甲氨基)甲基]-6，7，8，9-四氢吡啶[1，2-a]吲哚-3-yl}-3-(1-甲基吲哚-3-yl)马来酰亚，盐酸盐]被用作直接检查急性PKCα抑制对心脏功能和收缩性的效果的一种方法，使用体外工作心脏的制备。成年野生型小鼠心脏用载体对照物(10％DMSO)或在10％DMSO中的Ro-32-0432灌输，Ro-32-0432的浓度范围在4×10-10至4×10-6M之间。在浓度时间段(7分钟每10个不同的递增浓度)的所有值被求和以用于统计学目的，表示一个约1×10-8M的平均剂量。载体对照和试验组显示在不进行任何处理之前，心率每分钟分别跳动363+/-15和295+/-26次。载体和药物处理组的平均心率分别是每分钟跳动351+/-3和292+/-6次。尽管心率更低，Ro-32-0432灌输组显示用最大dP/dt测量的急性收缩功能20％的增加和发展的左心室压力20％的增加(P＜0.05)(分图A、B)。在Ro-32-0432组中四只动物被分析并与载体对照组中的三只动物作比较。Ro-32-0432处理组中急性收缩性能改变约20％，与此申请前面讨论的PKCα缺失小鼠中观察到的心脏功能的增加相似。这些结果共同指示使用Ro-32-0432的PKCα急性抑制有效地增加心脏功能和收缩性。
图39：PKC同工酶移位常常与活化相联系，并且PKC抑制剂能阻止移位。PKCα-绿色荧光蛋白质(GFP)融合表达腺病毒被产生作为一种小心的监控PKCα移位或抑制初生心肌细胞培养中的移位的方法。响应载体处理(DMSO)，PKCα-GFP与未处理的相比不受影响，显示遍及细胞的相当分散的定位，与轻度的肌组织一致。然而，60分钟的PMA刺激引起PKCα-GFP强烈的重新分布，以至于定位分散的背景被替换成高度局部化和点状染色的模式，并且总荧光减少。这种重新分布的净效应是每个细胞中的总荧光特征的改变，这种改变能用大规模筛选分析容易的检测到。因此，合适的PKCα抑制化合物能基于PKCα-GFP细胞重新分布被迅速的鉴定。
图40A和40B：为了说明PKCα抑制剂体内调节收缩性的能力，一种PKC抑制剂，LY333531，(S)-13[(一甲氨基)甲基]-10，11，14，15-四氢-4，9：16，21-二美替诺-1H，13H-二苯[E，K]并-[3，4-H][1，4，13]氧化双氮-环己定-1，3(2H)-二酮，被施用在实验部分描述的正常大鼠中(n＝3)。LY333531被溶解在20％的丁基磺酸钠-B-环糊精钠盐(Captisol)、50mM的乙酸缓冲液中，pH5.0。化合物被以图40的每个浓度灌注5分钟。在1000nmol/kg/min的剂量，LY333531显示了最大dP/dt(图40A)和最小dP/dt(图40B)的显著增加。图40A显示最大dP/dt而图40B显示最小dP/dt，包括无化合物(基线；B/L)和下列的灌注0.1、0.3、1、3、10、30、100、300和1000nmol/kg/min的LY333531，它们被指示在横坐标上。然后药物停止5分钟(P/D)，多巴酚丁胺(Dob)被以5.0μg/kg/min施用5分钟。在图40B中，最小dP/dt值被以绝对的或数字的值表示以实现简化目的。在1000nmol/kg/min剂量下，与基线测量相比最大dP/dt增加28％而最小dP/dt降低17％，与PKCα缺失小鼠和施用Ro-32-0432于分离的工作心脏制备中的数据一致。在图40A和40B中，星号指示与基线值的统计意义上的显著性差异(P＜0.05)，此差异被使用Dunnett’s MultipleComparisons事后检验的单因素方差分析(ANOVA)测定。在1000nmol/kg/min时心脏收缩和舒张的增加对心率(基线：每分钟跳动315±17对1000nmol/kg/min：每分钟跳动294±8，无统计意义上的显著性)或左心室收缩压(基线：12kPa±400Pa(90±3mmHg)对1000nmol/kg/min：每分钟跳动105±6，无统计意义上的显著性)不产生影响。这些数据指示正常大鼠中的PKCα抑制导致正心脏收缩变力性(收缩)和变松作用(松弛)。LY338522，一种LY333531的活性代谢物，也已经显示在抑制PKC异构体中是有效的。
图41：为了说明PKCα在心肌梗塞模型中的体内功效，Ro-31-8220，3-[1-[3-(脒基硫)丙基-1H-吲哚-3-yl]-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-yl)马来酰亚胺，双吲哚亚醯铵IX，甲磺酸，一种已知的PKC抑制剂被灌注进大鼠(n＝4)中，大鼠经受外科手术以诱导心肌梗塞(MI大鼠)。Ro-31-8220被溶解于20％丁基磺酸钠-B-环糊精钠盐(Captisol)，50mM的乙酸缓冲液中，pH5.0。Ro-31-8220如实验部分描述的那样被体内递送。灌注Ro-31-8220导致最大dP/dt百分比增加(21％)剂量依赖性的增强，它在300nmol/kg/min剂量下达到统计意义上的显著性差异(P＜0.05)(图41；单因素ANOVA和Dunnett’s Multiple Comparisons事后检验)。图41显示施用10、30、100、300和1000nmol/kg/min的Ro-81-8220后，最大dP/dt对基线(B/L)的百分比增加，这被指示在横坐标上。然后药物停止5分钟(P/D)，多巴酚丁胺(Dob)被以5.0μg/kg/min施用5分钟。这些数据指示PKCα抑制引起大鼠心力衰竭模型中的正收缩变力效果。灌注Ro-31-8220后观察到的收缩变力有益效果大于施用多巴酚丁胺后所观察到的有意效果，多巴酚丁胺是一种在ADHF中临床施用的正性肌力药。这些数据说明递送PKCα抑制剂到受心肌收缩或松弛功能不良的患者中，例如在ADHF中观察到的结果，将提供对这些患者的一种功能性的有益效果，一种医学治疗理想的结果。
除非另外指明，所有包括数量、百分比、分数和比例的量均被理解成由词“约”所修饰，并且量不旨在表示有效数字。
除非另外说明，术语“一个”和“所述”是指“一个或多个”。
所有引用文献的相关部分均引入本文以供参考，任何文献的引用不可解释为是对其作为本发明的现有技术的认可。
尽管已用具体实施方案来说明和描述了本发明，但对于本领域的技术人员显而易见的是，在不背离本发明的精神和保护范围的情况下可作出许多其它的变化和修改。因此，附录的权利要求书旨在包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
                           序列表
<110>儿童医院医学中心(Children’s Hospital Medical Center)
     辛辛纳提大学(University of Cincinnati)
     J.D.莫尔肯廷(Molkentin，Jeffery D)
     E.G.克拉尼斯(Kranias，Evangelia G)
<120>心肌收缩性和心力衰竭倾向的调节
<130>9761M#L
<140>未知
<141>2004-09-17
<150>US 60/503,853
<151>2003-09-19
<160>15
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>2841
<212>DNA
<213>家兔(Oryctolagus cuniculus)
<220>
<221>CDS
<222>(205)..(2223)
<400>1
gcgagcgaga gagagccagc gagcggctcc ggctccgcgc cgcgccgcgc ccgctcgcct   60
ctccccggcc gccgccgcct ccagcccgcg ccccgcgccg gggtcgcccc tcgccccgcc  120
gcccctcccc cgcccgcccc cgcccacccc ggccctcgcc ggctgccgct ccccggcgga  180
ggcaagaggt ggttgggggg gacc atg gct gac gtt ttc ccg gcc aac gac     231
                           Met Ala Asp Val Phe Pro Ala Asn Asp
                             1             5
tcc acg gcg tct cag gac gtg gcc aac cgc ttc gcc cgc aaa ggg gcg    279
Ser Thr Ala Ser Gln Asp Val Ala Asn Arg Phe Ala Arg Lys Gly Ala
10                  15                  20                  25
ctg agg cag aag aac gtg cac gag gtg aaa gac cac aaa ttc atc gcg    327
Leu Arg Gln Lys Asn Val His Glu Val Lys Asp His Lys Phe Ile Ala
                30                  35                  40
cgc ttc ttc aag cag ccc acc ttc tgc agc cac tgc acc gac ttc atc    375
Arg Phe Phe Lys Gln Pro Thr Phe Cys Ser His Cys Thr Asp Phe Ile
            45                  50                  55
tgg ggg ttt ggg aag caa ggc ttc cag tgc caa gtt tgc tgt ttt gtg    423
Trp Gly Phe Gly Lys Gln Gly Phe Gln Cys Gln Val Cys Cys Phe Val
        60                  65                  70
gtt cac aag agg tgc cat gaa ttt gtt acc ttt tct tgt ccg ggt gcg    471
Val His Lys Arg Cys His Glu Phe Val Thr Phe Ser Cys Pro Gly Ala
    75                  80                  85
gat aag gga cct gac act gat gac ccc agg agc aag cac aag ttt aaa    519
Asp Lys Gly Pro Asp Thr Asp Asp Pro Arg Ser Lys His Lys Phe Lys
90                  95                  100                 105
atc cac acc tac ggg agc ccc acc ttc tgc gat cac tgt ggg tca ctg    567
Ile His Thr Tyr Gly Ser Pro Thr Phe Cys Asp His Cys Gly Ser Leu
                110                 115                 120
ctg tac gga ctc atc cac cag ggg atg aaa tgt gac acc tgc gac atg    615
Leu Tyr Gly Leu Ile His Gln Gly Met Lys Cys Asp Thr Cys Asp Met
            125                 130                 135
aac gtt cac aag cag tgt gtg atc aat gtc ccc agc ctg tgt ggg atg    663
Asn Val His Lys Gln Cys Val Ile Asn Val Pro Ser Leu Cys Gly Met
        140                 145                 150
gac cat acg gag aag agg gga cgg atc tac ctg aag gcc gag gtc acc    711
Asp His Thr Glu Lys Arg Gly Arg Ile Tyr Leu Lys Ala Glu Val Thr
    155                 160                 165
gat gaa aag ctc cac gtc acg gta cga gat gca aaa aac ctg atc ccc    759
Asp Glu Lys Leu His Val Thr Val Arg Asp Ala Lys Asn Leu Ile Pro
170                 175                 180                 185
atg gat ccc aac ggg ctt tca gat ccc tac gtg aag ctg aaa ctc att    807
Met Asp Pro Asn Gly Leu Ser Asp Pro Tyr Val Lys Leu Lys Leu Ile
                190                 195                 200
cct gat ccc aag aat gaa agc aaa caa aaa acc aaa acc atc cgc tcc     855
Pro Asp Pro Lys Asn Glu Ser Lys Gln Lys Thr Lys Thr Ile Arg Ser
            205                 210                 215
acg ctg aac ccg cag tgg aac gaa tcc ttt acc ttc aaa tta aaa ccc     903
Thr Leu Asn Pro Gln Trp Asn Glu Ser Phe Thr Phe Lys Leu Lys Pro
        220                 225                 230
tcc gac aaa gac cga cga ctg tct gta gaa atc tgg gac tgg gac cga     951
Ser Asp Lys Asp Arg Arg Leu Ser Val Glu Ile Trp Asp Trp Asp Arg
    235                 240                 245
aca aca agg aat gac ttc atg ggg tcg ctc tcc ttt ggc gtc tcg gag     999
Thr Thr Arg Asn Asp Phe Met Gly Ser Leu Ser Phe Gly Val Ser Glu
250                 255                 260                 265
ctc atg aag atg cca gcc agt gga tgg tac aag ttg ctg aac caa gaa    1047
Leu Met Lys Met Pro Ala Ser Gly Trp Tyr Lys Leu Leu Asn Gln Glu
                270                 275                 280
gaa ggt gaa tac tac aat gtg ccc att ccg gaa ggg gac gaa gat ggg    1095
Glu Gly Glu Tyr Tyr Asn Val Pro Ile Pro Glu Gly Asp Glu Asp Gly
            285                 290                 295
aac gtg gag ctc agg cag aaa ttc gag aaa gcc aag ctg ggg ccc gct    1143
Asn Val Glu Leu Arg Gln Lys Phe Glu Lys Ala Lys Leu Gly Pro Ala
        300                 305                 310
ggc aac aag gtg atc agt ccc tcg gaa gac agg aag cag ccg tcc aac    1191
Gly Asn Lys Val Ile Ser Pro Ser Glu Asp Arg Lys Gln Pro Ser Asn
    315                 320                 325
aac ctg gac cga gtg aag ctc acc gac ttc aac ttc ctc atg gtc ctg    1239
Asn Leu Asp Arg Val Lys Leu Thr Asp Phe Asn Phe Leu Met Val Leu
330                 335                 340                 345
gga aaa ggc agt ttt ggg aag gtg atg ctg gcg gac agg aag ggc acg    1287
Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys Val Met Leu Ala Asp Arg Lys Gly Thr
                350                 355                 360
gaa gag ctg tac gcc atc aag atc ctg aag aag gac gtg gtg att cag    1335
Glu Glu Leu Tyr Ala Ile Lys Ile Leu Lys Lys Asp Val Val Ile Gln
            365                 370                 375
gat gac gac gtg gag tgc acc atg gtg gag aag cgg gtt ctg gcc ctg    1383
Asp Asp Asp Val Glu Cys Thr Met Val Glu Lys Arg Val Leu Ala Leu
        380                 385                 390
atg gac aag ccg ccc ttc ctg aca cag ctg cac tcc tgc ttc cag acc    1431
Met Asp Lys Pro Pro Phe Leu Thr Gln Leu His Ser Cys Phe Gln Thr
    395                 400                 405
gtg gac cgg ctg tac ttt gtc atg gaa tac gtc aac ggc gga gac ctc    1479
Val Asp Arg Leu Tyr Phe Val Met Glu Tyr Val Asn Gly Gly Asp Leu
410                 415                 420                 425
atg tac cac atc cag caa gtg gga aag ttc aag gag cca caa gca gta    1527
Met Tyr His Ile Gln Gln Val Gly Lys Phe Lys Glu Pro Gln Ala Val
                430                 435                 440
ttc tat gca gca gag att tcc att ggg ctg ttc ttc ctt cac aaa aga    1575
Phe Tyr Ala Ala Glu Ile Ser Ile Gly Leu Phe Phe Leu His Lys Arg
            445                 450                 455
ggg atc atc tat agg gac ctg aag cta gat aac gtc atg ctg gac tcg    1623
Gly Ile Ile Tyr Arg Asp Leu Lys Leu Asp Asn Val Met Leu Asp Ser
        460                 465                 470
gaa gga cac atc aaa atc gct gac ttt ggg atg tgc aag gaa cac atg    1671
Glu Gly His Ile Lys Ile Ala Asp Phe Gly Met Cys Lys Glu His Met
    475                 480                 485
atg gac ggg gtc acc acc agg acc ttc tgt ggg act cca gat tac atc    1719
Met Asp Gly Val Thr Thr Arg Thr Phe Cys Gly Thr Pro Asp Tyr Ile
490                 495                 500                 505
gcc ccg gag atc atc gct tat cag ccg tac ggc aaa tcc gtg gac tgg    1767
Ala Pro Glu Ile Ile Ala Tyr Gln Pro Tyr Gly Lys Ser Val Asp Trp
                510                 515                 520
tgg gcc tac ggc gtc ctg ctg tat gag atg ctg gct ggg cag cct cca    1815
Trp Ala Tyr Gly Val Leu Leu Tyr Glu Met Leu Ala Gly Gln Pro Pro
            525                 530                 535
ttt gat ggc gag gac gaa gac gag ctg ttt cag tcc atc atg gag cac    1863
Phe Asp Gly Glu Asp Glu Asp Glu Leu Phe Gln Ser Ile Met Glu His
        540                 545                 550
aac gtt tcc tac ccc aaa tcc ttg tcc aag gag gcc gtc tcc atc tgc    1911
Asn Val Ser Tyr Pro Lys Ser Leu Ser Lys Glu Ala Val Ser Ile Cys
    555                 560                 565
aag ggg ctg atg acc aaa cac ccg gcc aag cgg ctg ggc tgc ggg ccc    1959
Lys Gly Leu Met Thr Lys His Pro Ala Lys Arg Leu Gly Cys Gly Pro
570                 575                 580                 585
gag gga gag cgg gac gtg agg gaa cac gcc ttc ttc cgg agg atc gac    2007
Glu Gly Glu Arg Asp Val Arg Glu His Ala Phe Phe Arg Arg Ile Asp
                590                 595                 600
tgg gag aaa ctg gag aac agg gag atc cag ccg ccg ttc aag ccc aaa    2055
Trp Glu Lys Leu Glu Asn Arg Glu Ile Gln Pro Pro Phe Lys Pro Lys
            605                 610                 615
gtg tgt ggc aaa gga gca gaa aac ttc gac aag ttc ttc acg cga ggg    2103
Val Cys Gly Lys Gly Ala Glu Asn Phe Asp Lys Phe Phe Thr Arg Gly
        620                 625                 630
cag ccc gtc gtc acg ccg ccg gat caa ctg gtc atc gct aac ata gac    2151
Gln Pro Val Val Thr Pro Pro Asp Gln Leu Val Ile Ala Asn Ile Asp
    635                 640                 645
cag tct gat ttc gaa ggg ttc tcg tat gtc aac ccc cag ttc gtg cac    2199
Gln Ser Asp Phe Glu Gly Phe Ser Tyr Val Asn Pro Gln Phe Val His
650                 655                 660                 665
ccg atc cta cag agc tca gta tga aagtcgccgg cgagacccag cgtgcccacc   2253
Pro Ile Leu Gln Ser Ser Val
                670
cctccagccc ccagcacccc tagcggcggg aagtgatcct taaccctaaa attttaaggc  2313
cacggcctta tgtttttgct ccacatggag gcctgaaaat tgtagggtta tagtcccaag  2373
gcgaccagct atccagggtc tctctcttaa aaccaagaac attatgttag tggatacgca  2433
aatcgtgaac agcggccggt ttgatcatgt gggagtcgca cctggctgta ggccaacccc  2493
tcctaggtag aaagcaggcc ctcgcccctc tttttttttt tttttttttt ggtacgattt  2553
ggtatacttc ccatatcccg tgtctggctg gattctctcc atgaggctcc gcccaagcag  2613
agatgcgaaa gtgaacctgc cccagcctgg tgggccggaa gcacctccaa ccaggaggta  2673
aaggaatggg gagcccggag aggggcgggg gaggtctgcg agctgccgac cacggtctgt  2733
gcctcggtgg aaacgaccga ccccctgggt gtgagaggcc gggacaagac tacttactat  2793
tccccgacat cgacacggcg tcaccaactc tagcccagct tccaaaac               2841
<210>2
<211>672
<212>PRT
<213>家兔(Oryctolagus cuniculus)
<400>2
Met Ala Asp Val Phe Pro Ala Asn Asp Ser Thr Ala Ser Gln Asp Val
1               5                   10                  15
Ala Asn Arg Phe Ala Arg Lys Gly Ala Leu Arg Gln Lys Asn Val His
            20                  25                  30
Glu Val Lys Asp His Lys Phe Ile Ala Arg Phe Phe Lys Gln Pro Thr
        35                  40                  45
Phe Cys Ser His Cys Thr Asp Phe Ile Trp Gly Phe Gly Lys Gln Gly
    50                  55                  60
Phe Gln Cys Gln Val Cys Cys Phe Val Val His Lys Arg Cys His Glu
65                  70                  75                  80
Phe Val Thr Phe Ser Cys Pro Gly Ala Asp Lys Gly Pro Asp Thr Asp
                85                  90                  95
Asp Pro Arg Ser Lys His Lys Phe Lys Ile His Thr Tyr Gly Ser Pro
            100                 105                 110
Thr Phe Cys Asp His Cys Gly Ser Leu Leu Tyr Gly Leu Ile His Gln
        115                 120                 125
Gly Met Lys Cys Asp Thr Cys Asp Met Asn Val His Lys Gln Cys Val
    130                 135                 140
Ile Asn Val Pro Ser Leu Cys Gly Met Asp His Thr Glu Lys Arg Gly
145                 150                 155                 160
Arg Ile Tyr Leu Lys Ala Glu Val Thr Asp Glu Lys Leu His Val Thr
                165                 170                 175
Val Arg Asp Ala Lys Asn Leu Ile Pro Met Asp Pro Asn Gly Leu Ser
            180                 185                 190
Asp Pro Tyr Val Lys Leu Lys Leu Ile Pro Asp Pro Lys Asn Glu Ser
        195                 200                 205
Lys Gln Lys Thr Lys Thr Ile Arg Ser Thr Leu Asn Pro Gln Trp Asn
    210                 215                 220
Glu Ser Phe Thr Phe Lys Leu Lys Pro Ser Asp Lys Asp Arg Arg Leu
225                 230                 235                 240
Ser Val Glu Ile Trp Asp Trp Asp Arg Thr Thr Arg Asn Asp Phe Met
                245                 250                 255
Gly Ser Leu Ser Phe Gly Val Ser Glu Leu Met Lys Met Pro Ala Ser
            260                 265                 270
Gly Trp Tyr Lys Leu Leu Asn Gln Glu Glu Gly Glu Tyr Tyr Asn Val
        275                 280                 285
Pro Ile Pro Glu Gly Asp Glu Asp Gly Asn Val Glu Leu Arg Gln Lys
    290                 295                 300
Phe Glu Lys Ala Lys Leu Gly Pro Ala Gly Asn Lys Val Ile Ser Pro
305                 310                 315                 320
Ser Glu Asp Arg Lys Gln Pro Ser Asn Asn Leu Asp Arg Val Lys Leu
                325                 330                 335
Thr Asp Phe Asn Phe Leu Met Val Leu Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys
            340                 345                 350
Val Met Leu Ala Asp Arg Lys Gly Thr Glu Glu Leu Tyr Ala Ile Lys
        355                 360                 365
Ile Leu Lys Lys Asp Val Val Ile Gln Asp Asp Asp Val Glu Cys Thr
    370                 375                 380
Met Val Glu Lys Arg Val Leu Ala Leu Met Asp Lys Pro Pro Phe Leu
385                 390                 395                 400
Thr Gln Leu His Ser Cys Phe Gln Thr Val Asp Arg Leu Tyr Phe Val
                405                 410                 415
Met Glu Tyr Val Asn Gly Gly Asp Leu Met Tyr His Ile Gln Gln Val
            420                 425                 430
Gly Lys Phe Lys Glu Pro Gln Ala Val Phe Tyr Ala Ala Glu Ile Ser
        435                 440                 445
Ile Gly Leu Phe Phe Leu His Lys Arg Gly Ile Ile Tyr Arg Asp Leu
    450                 455                 460
Lys Leu Asp Asn Val Met Leu Asp Ser Glu Gly His Ile Lys Ile Ala
465                 470                 475                 480
Asp Phe Gly Met Cys Lys Glu His Met Met Asp Gly Val Thr Thr Arg
                485                 490                 495
Thr Phe Cys Gly Thr Pro Asp Tyr Ile Ala Pro Glu Ile Ile Ala Tyr
            500                 505                 510
Gln Pro Tyr Gly Lys Ser Val Asp Trp Trp Ala Tyr Gly Val Leu Leu
        515                 520                 525
Tyr Glu Met Leu Ala Gly Gln Pro Pro Phe Asp Gly Glu Asp Glu Asp
    530                 535                 540
Glu Leu Phe Gln Ser Ile Met Glu His Asn Val Ser Tyr Pro Lys Ser
545                 550                 555                 560
Leu Ser Lys Glu Ala Val Ser Ile Cys Lys Gly Leu Met Thr Lys His
                565                 570                 575
Pro Ala Lys Arg Leu Gly Cys Gly Pro Glu Gly Glu Arg Asp Val Arg
            580                 585                 590
Glu His Ala Phe Phe Arg Arg Ile Asp Trp Glu Lys Leu Glu Asn Arg
        595                 600                 605
Glu Ile Gln Pro Pro Phe Lys Pro Lys Val Cys Gly Lys Gly Ala Glu
    610                 615                 620
Asn Phe Asp Lys Phe Phe Thr Arg Gly Gln Pro Val Val Thr Pro Pro
625                 630                 635                 640
Asp Gln Leu Val Ile Ala Asn Ile Asp Gln Ser Asp Phe Glu Gly Phe
                645                 650                 655
Ser Tyr Val Asn Pro Gln Phe Val His Pro Ile Leu Gln Ser Ser Val
            660                 665                 670
<210>3
<211>2465
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221>CDS
<222>(163)..(2181)
<400>3
gcgagcgaga gagagccagc gagcggctcc ggctccgcgc cgcgccgcgc ccgctcgcct     60
ctccccggcc gccgccgcct ccagcccgcg ccccgcgccg gggtcgcccc tcgccccgcc    120
cgcagcgagc cagagagccg gagagagcag agagagcggc tc ggc tcc cag ctc       174
                                               Gly Ser Gln Leu
                                               1
gag tgg cgc agg ccg ccc ggt ctc cgg ccc gcg cac acg atc tac acg      222
Glu Trp Arg Arg Pro Pro Gly Leu Arg Pro Ala His Thr Ile Tyr Thr
5                   10                  15                  20
cac tgg cgc ggc cgc cac cgc tct gtg tcc ggc gga ggc agg agg tgg      270
His Trp Arg Gly Arg His Arg Ser Val Ser Gly Gly Gly Arg Arg Trp
                25                  30                  35
ttg ggg gga acc atg gct gac gtt tac ccg gcc aac gac tcc acg gcg      318
Leu Gly Gly Thr Met Ala Asp Val Tyr Pro Ala Ash Asp Ser Thr Ala
            40                  45                  50
tct cag gac gtg gcc aac cgc ttc gcc cgc aaa ggg gcg ctg agg cag      366
Ser Gln Asp Val Ala Asn Arg Phe Ala Arg Lys Gly Ala Leu Arg Gln
        55                  60                  65
aag aac gtg cat gag gtg aaa gac cac aaa ttc atc gcc cgc ttc ttc    414
Lys Asn Val His Glu Val Lys Asp His Lys Phe Ile Ala Arg Phe Phe
    70                  75                  80
aag caa ccc acc ttc tgc agc cac tgc acc gac ttc atc tgg ggg ttt    462
Lys Gln Pro Thr Phe Cys Ser His Cys Thr Asp Phe Ile Trp Gly Phe
85                  90                  95                  100
ggg aaa caa ggc ttc cag tgc caa gtt tgc tgt ttt gtg gtt cat aag    510
Gly Lys Gln Gly Phe Gln Cys Gln Val Cys Cys Phe Val Val His Lys
                105                 110                 115
agg tgc cat gag ttc gtt acg ttc tct tgt ccg ggt gcg gat aag gga    558
Arg Cys His Glu Phe Val Thr Phe Ser Cys Pro Gly Ala Asp Lys Gly
            120                 125                 130
cct gac act gac gac ccc agg agc aag cac aag ttc aaa atc cac aca    606
Pro Asp Thr Asp Asp Pro Arg Ser Lys His Lys Phe Lys Ile His Thr
        135                 140                 145
tac gga agc cct acc ttc tgt gat cac tgt ggg tcc ctg ctc tat gga    654
Tyr Gly Ser Pro Thr Phe Cys Asp His Cys Gly Ser Leu Leu Tyr Gly
    150                 155                 160
ctt atc cac caa ggg atg aaa tgt gac acc tgc gac atg aat gtt cac    702
Leu Ile His Gln Gly Met Lys Cys Asp Thr Cys Asp Met Asn Val His
165                 170                 175                 180
aag cag tgt gtg atc aat gtc cct agc ctc tgc gga atg gat cac aca    750
Lys Gln Cys Val Ile Asn Val Pro Ser Leu Cys Gly Met Asp His Thr
                185                 190                 195
gag aag agg ggg cgg att tat ctg aag gct gag gtc act gat gaa aag    798
Glu Lys Arg Gly Arg Ile Tyr Leu Lys Ala Glu Val Thr Asp Glu Lys
            200                 205                 210
ctc cac gtc acg gta cga gat gca aaa aat cta atc cct atg gat cca    846
Leu His Val Thr Val Arg Asp Ala Lys Asn Leu Ile Pro Met Asp Pro
        215                 220                 225
aat ggg ctt tcg gat cct tat gtg aag ctg aaa ctt atc cct gac ccc    894
Asn Gly Leu Ser Asp Pro Tyr Val Lys Leu Lys Leu Ile Pro Asp Pro
    230                 235                 240
aag aat gag agc aaa cag aaa acc aaa acc atc cgc tcc aca ctg aat     942
Lys Asn Glu Ser Lys Gln Lys Thr Lys Thr Ile Arg Ser Thr Leu Asn
245                 250                 255                 260
cct cag tgg aat gag tcc ttc acg ttc aaa tta aaa cct tca gac aaa     990
Pro Gln Trp Asn Glu Ser Phe Thr Phe Lys Leu Lys Pro Ser Asp Lys
                265                 270                 275
gac cgg cga ctg tct gta gaa atc tgg gac tgg gat cgg acg act cgg    1038
Asp Arg Arg Leu Ser Val Glu Ile Trp Asp Trp Asp Arg Thr Thr Arg
            280                 285                 290
aat gac ttc atg gga tcc ctt tcc ttt ggt gtc tca gag cta atg aag    1086
Asn Asp Phe Met Gly Ser Leu Ser Phe Gly Val Ser Glu Leu Met Lys
        295                 300                 305
atg ccg gcc agt gga tgg tat aaa ctg ctc aac caa gaa gag ggc gaa    1134
Met Pro Ala Ser Gly Trp Tyr Lys Leu Leu Asn Gln Glu Glu Gly Glu
    310                 315                 320
tat tac aat gtg ccc att cca gaa gga gat gaa gaa ggc aac atg gaa    1182
Tyr Tyr Asn Val Pro Ile Pro Glu Gly Asp Glu Glu Gly Asn Met Glu
325                 330                 335                 340
ctc agg cag aag ttt gag aaa gcc aag cta ggc cct gct ggt aac aaa    1230
Leu Arg Gln Lys Phe Glu Lys Ala Lys Leu Gly Pro Ala Gly Asn Lys
                345                 350                 355
gtc atc agc cct tca gaa gac aga aag caa cca tcc aac aac ctg gac    1278
Val Ile Ser Pro Ser Glu Asp Arg Lys Gln Pro Ser Asn Asn Leu Asp
            360                 365                 370
aga gtg aaa ctc aca gac ttc aac ttc ctc atg gtg ctg ggg aag ggg    1326
Arg Val Lys Leu Thr Asp Phe Asn Phe Leu Met Val Leu Gly Lys Gly
        375                 380                 385
agt ttt ggg aag gtg atg ctt gct gac agg aag gga acg gag gaa ctg    1374
Ser Phe Gly Lys Val Met Leu Ala Asp Arg Lys Gly Thr Glu Glu Leu
    390                 395                 400
tac gcc atc aag atc ctg aag aag gac gtg gtg atc cag gac gac gac    1422
Tyr Ala Ile Lys Ile Leu Lys Lys Asp Val Val Ile Gln Asp Asp Asp
405                 410                 415                 420
gtg gag tgc acc atg gtg gag aag cgc gtg ctg gcc ctg ctg gac aag    1470
Val Glu Cys Thr Met Val Glu Lys Arg Val Leu Ala Leu Leu Asp Lys
                425                 430                 435
ccg cca ttt ctg aca cag ctg cac tcc tgc ttc cag aca gtg gac cgg    1518
Pro Pro Phe Leu Thr Gln Leu His Ser Cys Phe Gln Thr Val Asp Arg
            440                 445                 450
ctg tac ttc gtc atg gaa tac gtc aac ggc ggg gac ctc atg tac cac    1566
Leu Tyr Phe Val Met Glu Tyr Val Asn Gly Gly Asp Leu Met Tyr His
        455                 460                 465
att cag caa gtc gga aaa ttt aag gag cca caa gca gta ttc tac gca    1614
Ile Gln Gln Val Gly Lys Phe Lys Glu Pro Gln Ala Val Phe Tyr Ala
    470                 475                 480
gcc gag atc tcc atc gga ctg ttc ttc ctt cat aaa aga ggg atc att    1662
Ala Glu Ile Ser Ile Gly Leu Phe Phe Leu His Lys Arg Gly Ile Ile
485                 490                 495                 500
tac agg gat ctg aag ctg gac aat gtc atg ctg gac tca gaa ggg cac    1710
Tyr Arg Asp Leu Lys Leu Asp Asn Val Met Leu Asp Ser Glu Gly His
                505                 510                 515
atc aaa atc gcc gac ttc ggg atg tgc aag gaa cac atg atg gat gga    1758
Ile Lys Ile Ala Asp Phe Gly Met Cys Lys Glu His Met Met Asp Gly
            520                 525                 530
gtc acg acc agg acc ttc tgt ggg act ccg gac tac att gcc cca gag    1806
Val Thr Thr Arg Thr Phe Cys Gly Thr Pro Asp Tyr Ile Ala Pro Glu
        535                 540                 545
ata atc gct tac cag ccg tac ggg aag tct gta gat tgg tgg gcg tac    1854
Ile Ile Ala Tyr Gln Pro Tyr Gly Lys Ser Val Asp Trp Trp Ala Tyr
    550                 555                 560
ggt gtg ctg ctg tac gag atg cta gcc ggg cag cct ccg ttt gat ggt    1902
Gly Val Leu Leu Tyr Glu Met Leu Ala Gly Gln Pro Pro Phe Asp Gly
565                 570                 575                 580
gaa gat gaa gat gaa ctg ttt cag tct ata atg gag cac aac gtg tcc    1950
Glu Asp Glu Asp Glu Leu Phe Gln Ser Ile Met Glu His Asn Val Ser
                585                 590                 595
tac ccc aaa tcc ttg tcc aag gaa gcc gtc tcc atc tgc aaa gga ctt    1998
Tyr Pro Lys Ser Leu Ser Lys Glu Ala Val Ser Ile Cys Lys Gly Leu
            600                 605                 610
atg acc aaa cac cct gcc aag cgg ctg ggc tgc ggg ccc gag gga gag    2046
Met Thr Lys His Pro Ala Lys Arg Leu Gly Cys Gly Pro Glu Gly Glu
        615                 620                 625
agg gat gtc aga gag cat gcc ttc ttc agg agg atc gac tgg gag aaa    2094
Arg Asp Val Arg Glu His Ala Phe Phe Arg Arg Ile Asp Trp Glu Lys
    630                 635                 640
ctg gag aac agg gag atc caa cca cca ttc aag ccc aaa gtg tgt ggc    2142
Leu Glu Asn Arg Glu Ile Gln Pro Pro Phe Lys Pro Lys Val Cys Gly
645                 650                 655                 660
aaa gga gca gaa aac ttt gac aag ttc ttc acg cga gga cagcctgtct     2191
Lys Gly Ala Glu Asn Phe Asp Lys Phe Phe Thr Arg Gly
                665                 670
taacaccacc agatcagctg gtgattgcta acatagacca atctgatttt gaagggttct  2251
cgtatgtcaa cccccagttt gtgcacccaa tcttgcaaag tgcagtatga aactcaaaaa  2311
atgaaagatc aatgctccca gcccccagca tccccagcag tgggaagtga tccttaacca  2371
taaaatttag gctatggctt tgtatttgtt ccacacagag gcctggaatt ctaggggaca  2431
ttagtcaatt acattatcac cttttcctca cccc                              2465
<210>4
<211>673
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>4
Gly Ser Gln Leu Glu Trp Arg Arg Pro Pro Gly Leu Arg Pro Ala His
1               5                   10                  15
Thr Ile Tyr Thr His Trp Arg Gly Arg His Arg Ser Val Ser Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Arg Arg Trp Leu Gly Gly Thr Met Ala Asp Val Tyr Pro Ala Asn
        35                  40                  45
Asp Ser Thr Ala Ser Gln Asp Val Ala Asn Arg Phe Ala Arg Lys Gly
    50                  55                  60
Ala Leu Arg Gln Lys Asn Val His Glu Val Lys Asp His Lys Phe Ile
65                  70                  75                  80
Ala Arg Phe Phe Lys Gln Pro Thr Phe Cys Ser His Cys Thr Asp Phe
                85                  90                  95
Ile Trp Gly Phe Gly Lys Gln Gly Phe Gln Cys Gln Val Cys Cys Phe
            100                 105                 110
Val Val His Lys Arg Cys His Glu Phe Val Thr Phe Ser Cys Pro Gly
        115                 120                 125
Ala Asp Lys Gly Pro Asp Thr Asp Asp Pro Arg Ser Lys His Lys Phe
    130                 135                 140
Lys Ile His Thr Tyr Gly Ser Pro Thr Phe Cys Asp His Cys Gly Ser
145                 150                 155                 160
Leu Leu Tyr Gly Leu Ile His Gln Gly Met Lys Cys Asp Thr Cys Asp
                165                 170                 175
Met Asn Val His Lys Gln Cys Val Ile Asn Val Pro Ser Leu Cys Gly
            180                 185                 190
Met Asp His Thr Glu Lys Arg Gly Arg Ile Tyr Leu Lys Ala Glu Val
        195                 200                 205
Thr Asp Glu Lys Leu His Val Thr Val Arg Asp Ala Lys Asn Leu Ile
    210                 215                 220
Pro Met Asp Pro Asn Gly Leu Ser Asp Pro Tyr Val Lys Leu Lys Leu
225                 230                 235                 240
Ile Pro Asp Pro Lys Asn Glu Ser Lys Gln Lys Thr Lys Thr Ile Arg
                245                 250                 255
Ser Thr Leu Asn Pro Gln Trp Asn Glu Ser Phe Thr Phe Lys Leu Lys
            260                 265                 270
Pro Ser Asp Lys Asp Arg Arg Leu Ser Val Glu Ile Trp Asp Trp Asp
        275                 280                 285
Arg Thr Thr Arg Asn Asp Phe Met Gly Ser Leu Ser Phe Gly Val Ser
    290                 295                 300
Glu Leu Met Lys Met Pro Ala Ser Gly Trp Tyr Lys Leu Leu Asn Gln
305                 310                 315                 320
Glu Glu Gly Glu Tyr Tyr Asn Val Pro Ile Pro Glu Gly Asp Glu Glu
                325                 330                 335
Gly Asn Met Glu Leu Arg Gln Lys Phe Glu Lys Ala Lys Leu Gly Pro
            340                 345                 350
Ala Gly Asn Lys Val Ile Ser Pro Ser Glu Asp Arg Lys Gln Pro Ser
        355                 360                 365
Asn Asn Leu Asp Arg Val Lys Leu Thr Asp Phe Asn Phe Leu Met Val
    370                 375                 380
Leu Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys Val Met Leu Ala Asp Arg Lys Gly
385                 390                 395                 400
Thr Glu Glu Leu Tyr Ala Ile Lys Ile Leu Lys Lys Asp Val Val Ile
                405                 410                 415
Gln Asp Asp Asp Val Glu Cys Thr Met Val Glu Lys Arg Val Leu Ala
            420                 425                 430
Leu Leu Asp Lys Pro Pro Phe Leu Thr Gln Leu His Ser Cys Phe Gln
        435                 440                 445
Thr Val Asp Arg Leu Tyr Phe Val Met Glu Tyr Val Asn Gly Gly Asp
    450                 455                 460
Leu Met Tyr His Ile Gln Gln Val Gly Lys Phe Lys Glu Pro Gln Ala
465                 470                 475                 480
Val Phe Tyr Ala Ala Glu Ile Ser Ile Gly Leu Phe Phe Leu His Lys
                485                 490                 495
Arg Gly Ile Ile Tyr Arg Asp Leu Lys Leu Asp Asn Val Met Leu Asp
            500                 505                 510
Ser Glu Gly His Ile Lys Ile Ala Asp Phe Gly Met Cys Lys Glu His
        515                 520                 525
Met Met Asp Gly Val Thr Thr Arg Thr Phe Cys Gly Thr Pro Asp Tyr
    530                 535                 540
Ile Ala Pro Glu Ile Ile Ala Tyr Gln Pro Tyr Gly Lys Ser Val Asp
545                 550                 555                 560
Trp Trp Ala Tyr Gly Val Leu Leu Tyr Glu Met Leu Ala Gly Gln Pro
                565                 570                 575
Pro Phe Asp Gly Glu Asp Glu Asp Glu Leu Phe Gln Ser Ile Met Glu
            580                 585                 590
His Asn Val Ser Tyr Pro Lys Ser Leu Ser Lys Glu Ala Val Ser Ile
        595                 600                 605
Cys Lys Gly Leu Met Thr Lys His Pro Ala Lys Arg Leu Gly Cys Gly
    610                 615                 620
Pro Glu Gly Glu Arg Asp Val Arg Glu His Ala Phe Phe Arg Arg Ile
625                 630                 635                 640
Asp Trp Glu Lys Leu Glu Asn Arg Glu Ile Gln Pro Pro Phe Lys Pro
                645                 650                 655
Lys Val Cys Gly Lys Gly Ala Glu Asn Phe Asp Lys Phe Phe Thr Arg
            660                 665                 670
Gly
<210>5
<211>2245
<212>DNA
<213>智人(homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(28)..(2046)
<400>5
ggagcaagag gtggttgggg ggggacc atg gct gac gtt ttc ccg ggc aac gac   54
                              Met Ala Asp Val Phe Pro Gly Asn Asp
                              1               5
tcc acg gcg tct cag gac gtg gcc aac cgc ttc gcc cgc aaa ggg gcg    102
Ser Thr Ala Ser Gln Asp Val Ala Asn Arg Phe Ala Arg Lys Gly Ala
10                  15                  20                  25
ctg agg cag aag aac gtg cac gag gtg aag gac cac aaa ttc atc gcg    150
Leu Arg Gln Lys Asn Val His Glu Val Lys Asp His Lys Phe Ile Ala
                30                  35                  40
cgc ttc ttc aag cag ccc acc ttc tgc agc cac tgc acc gac ttc atc    198
Arg Phe Phe Lys Gln Pro Thr Phe Cys Ser His Cys Thr Asp Phe Ile
            45                  50                  55
tgg ggg ttt ggg aaa caa ggc ttc cag tgc caa gtt tgc tgt ttt gtg    246
Trp Gly Phe Gly Lys Gln Gly Phe Gln Cys Gln Val Cys Cys Phe Val
        60                  65                  70
gtc cac aag agg tgc cat gaa ttt gtt act ttt tct tgt ccg ggt gcg    294
Val His Lys Arg Cys His Glu Phe Val Thr Phe Ser Cys Pro Gly Ala
    75                  80                  85
gat aag gga ccc gac act gat gac ccc agg agc aag cac aag ttc aaa    342
Asp Lys Gly Pro Asp Thr Asp Asp Pro Arg Ser Lys His Lys Phe Lys
90                  95                  100                 105
atc cac act tac gga agc ccc acc ttc tgc gat cac tgt ggg tca ctg    390
Ile His Thr Tyr Gly Ser Pro Thr Phe Cys Asp His Cys Gly Ser Leu
                110                 115                 120
ctc tat gga ctt atc cat caa ggg atg aaa tgt gac acc tgc gat atg    438
Leu Tyr Gly Leu Ile His Gln Gly Met Lys Cys Asp Thr Cys Asp Met
            125                 130                 135
aac gtt cac aag caa tgc gtc atc aat gtc ccc agc ctc tgc gga atg    486
Asn Val His Lys Gln Cys Val Ile Asn Val Pro Ser Leu Cys Gly Met
        140                 145                 150
gat cac act gag aag agg ggg cgg att tac cta aag gct gag gtt gct    534
Asp His Thr Glu Lys Arg Gly Arg Ile Tyr Leu Lys Ala Glu Val Ala
    155                 160                 165
gat gaa aag ctc cat gtc aca gta cga gat gca aaa aat cta atc cct     582
Asp Glu Lys Leu His Val Thr Val Arg Asp Ala Lys Asn Leu Ile Pro
170                 175                 180                 185
atg gat cca aac ggg ctt tca gat cct tat gtg aag ctg aaa ctt att     630
Met Asp Pro Asn Gly Leu Ser Asp Pro Tyr Val Lys Leu Lys Leu Ile
                190                 195                 200
cct gat ccc aag aat gaa agc aag caa aaa acc aaa acc atc cgc tcc     678
Pro Asp Pro Lys Asn Glu Ser Lys Gln Lys Thr Lys Thr Ile Arg Ser
            205                 210                 215
aca cta aat ccg cag tgg aat gag tcc ttt aca ttc aaa ttg aaa cct     726
Thr Leu Asn Pro Gln Trp Asn Glu Ser Phe Thr Phe Lys Leu Lys Pro
        220                 225                 230
tca gac aaa gac cga cga ctg tct gta gaa atc tgg gac tgg gat cga     774
Ser Asp Lys Asp Arg Arg Leu Ser Val Glu Ile Trp Asp Trp Asp Arg
    235                 240                 245
aca aca agg aat gac ttc atg gga tcc ctt tcc ttt gga gtt tcg gag     822
Thr Thr Arg Asn Asp Phe Met Gly Ser Leu Ser Phe Gly Val Ser Glu
250                 255                 260                 265
ctg atg aag atg ccg gcc agt gga tgg tac aag ttg ctt aac caa gaa     870
Leu Met Lys Met Pro Ala Ser Gly Trp Tyr Lys Leu Leu Asn Gln Glu
                270                 275                 280
gaa ggt gag tac tac aac gta ccc att ccg gaa ggg gac gag gaa gga     918
Glu Gly Glu Tyr Tyr Asn Val Pro Ile Pro Glu Gly Asp Glu Glu Gly
            285                 290                 295
aac atg gaa ctc agg cag aaa ttc gag aaa gcc aaa ctt ggc cct gct     966
Asn Met Glu Leu Arg Gln Lys Phe Glu Lys Ala Lys Leu Gly Pro Ala
        300                 305                 310
ggc aac aaa gtc atc agt ccc tct gaa gac agg aaa caa cct tcc aac    1014
Gly Asn Lys Val Ile Ser Pro Ser Glu Asp Arg Lys Gln Pro Ser Asn
    315                 320                 325
aac ctt gac cga gtg aaa ctc acg gac ttc aat ttc ctc atg gtg ttg    1062
Asn Leu Asp Arg Val Lys Leu Thr Asp Phe Asn Phe Leu Met Val Leu
330                 335                 340                 345
gga aag ggg agt ttt gga aag gtg atg ctt gcc gac agg aag ggc aca    1110
Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys Val Met Leu Ala Asp Arg Lys Gly Thr
                350                 355                 360
gaa gaa ctg tat gca atc aaa atc ctg aag aag gat gtg gtg att cag    1158
Glu Glu Leu Tyr Ala Ile Lys Ile Leu Lys Lys Asp Val Val Ile Gln
            365                 370                 375
gat gat gac gtg gag tgc acc atg gta gaa aag cga gtc ttg gcc ctg    1206
Asp Asp Asp Val Glu Cys Thr Met Val Glu Lys Arg Val Leu Ala Leu
        380                 385                 390
ctt gac aaa ccc ccg ttc ttg acg cag ctg cac tcc tgc ttc cag aca    1254
Leu Asp Lys Pro Pro Phe Leu Thr Gln Leu His Ser Cys Phe Gln Thr
    395                 400                 405
gtg gat cgg ctg tac ttc gtc atg gaa tat gtc aac ggt ggg gac ctc    1302
Val Asp Arg Leu Tyr Phe Val Met Glu Tyr Val Asn Gly Gly Asp Leu
410                 415                 420                 425
atg tac cac att cag caa gta gga aaa ttt aag gaa cca caa gca gta    1350
Met Tyr His Ile Gln Gln Val Gly Lys Phe Lys Glu Pro Gln Ala Val
                430                 435                 440
ttc tat gcg gca gag att tcc atc gga ttg ttc ttt ctt cat aaa aga    1398
Phe Tyr Ala Ala Glu Ile Ser Ile Gly Leu Phe Phe Leu His Lys Arg
            445                 450                 455
gga atc att tat agg gat ctg aag tta gat aac gtc atg ttg gat tca    1446
Gly Ile Ile Tyr Arg Asp Leu Lys Leu Asp Asn Val Met Leu Asp Ser
        460                 465                 470
gaa gga cat atc aaa att gct gac ttt ggg atg tgc aag gaa cac atg    1494
Glu Gly His Ile Lys Ile Ala Asp Phe Gly Met Cys Lys Glu His Met
    475                 480                 485
atg gat gga gtc acg acc agg acc ttc tgt ggg act cca gat tat atc    1542
Met Asp Gly Val Thr Thr Arg Thr Phe Cys Gly Thr Pro Asp Tyr Ile
490                 495                 500                 505
gcc cca gag ata atc gct tat cag ccg tat gga aaa tct gtg gac tgg    1590
Ala Pro Glu Ile Ile Ala Tyr Gln Pro Tyr Gly Lys Ser Val Asp Trp
                510                 515                 520
tgg gcc tat ggc gtc ctg ttg tat gaa atg ctt gcc ggg cag cct cca    1638
Trp Ala Tyr Gly Val Leu Leu Tyr Glu Met Leu Ala Gly Gln Pro Pro
            525                 530                 535
ttt gat ggt gaa gat gaa gac gag cta ttt cag tct atc atg gag cac    1686
Phe Asp Gly Glu Asp Glu Asp Glu Leu Phe Gln Ser Ile Met Glu His
        540                 545                 550
aac gtt tcc tat cca aaa tcc ttg tcc aag gag gct gtt tct atc tgc    1734
Asn Val Ser Tyr Pro Lys Ser Leu Ser Lys Glu Ala Val Ser Ile Cys
    555                 560                 565
aaa gga ctg atg acc aaa cac cca gcc aag cgg ctg ggc tgt ggg cct    1782
Lys Gly Leu Met Thr Lys His Pro Ala Lys Arg Leu Gly Cys Gly Pro
570                 575                 580                 585
gag ggg gag agg gac gtg aga gag cat gcc ttc ttc cgg agg atc gac    1830
Glu Gly Glu Arg Asp Val Arg Glu His Ala Phe Phe Arg Arg Ile Asp
                590                 595                  600
tgg gaa aaa ctg gag aac agg gag atc cag cca cca ttc aag ccc aaa    1878
Trp Glu Lys Leu Glu Asn Arg Glu Ile Gln Pro Pro Phe Lys Pro Lys
            605                 610                 615
gtg tgt ggc aaa gga gca gag aac ttt gac aag ttc ttc aca cga gga    1926
Val Cys Gly Lys Gly Ala Glu Asn Phe Asp Lys Phe Phe Thr Arg Gly
        620                 625                 630
cag ccc gtc tta aca cca cct gat cag ctg gtt att gct aac ata gac    1974
Gln Pro Val Leu Thr Pro Pro Asp Gln Leu Val Ile Ala Asn Ile Asp
    635                 640                 645
cag tct gat ttt gaa ggg ttc tcg tat gtc aac ccc cag ttt gtg cac    2022
Gln Ser Asp Phe Glu Gly Phe Ser Tyr Val Asn Pro Gln Phe Val His
650                 655                 660                 665
ccc atc tta cag agt gca gta tga aactcaccag cgagaacaaa cacctcccca   2076
Pro Ile Leu Gln Ser Ala Val
                670
gcccccagcc ctccccgcag tggaagtgaa tccttaaccc taaaatttta aggccacggc  2136
ttgtgtctga ttccatatgg aggcctgaaa attgtagggt tattagtcca aatgtgatca  2196
actgttcagg gtctctctct tacaaccaag aacattatct tagtggaag              2245
<210>6
<211>672
<212>PRT
<213>智人(homo sapiens)
<400>6
Met Ala Asp Val Phe Pro Gly Asn Asp Ser Thr Ala Ser Gln Asp Val
1               5                   10                  15
Ala Ash Arg Phe Ala Arg Lys Gly Ala Leu Arg Gln Lys Asn Val His
            20                  25                  30
Glu Val Lys Asp His Lys Phe Ile Ala Arg Phe Phe Lys Gln Pro Thr
        35                  40                  45
Phe Cys Ser His Cys Thr Asp Phe Ile Trp Gly Phe Gly Lys Gln Gly
    50                  55                  60
Phe Gln Cys Gln Val Cys Cys Phe Val Val His Lys Arg Cys His Glu
65                  70                  75                  80
Phe Val Thr Phe Ser Cys Pro Gly Ala Asp Lys Gly Pro Asp Thr Asp
                85                  90                  95
Asp Pro Arg Ser Lys His Lys Phe Lys Ile His Thr Tyr Gly Ser Pro
            100                 105                 110
Thr Phe Cys Asp His Cys Gly Ser Leu Leu Tyr Gly Leu Ile His Gln
        115                 120                 125
Gly Met Lys Cys Asp Thr Cys Asp Met Asn Val His Lys Gln Cys Val
    130                 135                 140
Ile Asn Val Pro Ser Leu Cys Gly Met Asp His Thr Glu Lys Arg Gly
145                 150                 155                 160
Arg Ile Tyr Leu Lys Ala Glu Val Ala Asp Glu Lys Leu His Val Thr
                165                 170                 175
Val Arg Asp Ala Lys Asn Leu Ile Pro Met Asp Pro Asn Gly Leu Ser
            180                 185                 190
Asp Pro Tyr Val Lys Leu Lys Leu Ile Pro Asp Pro Lys Asn Glu Ser
        195                 200                 205
Lys Gln Lys Thr Lys Thr Ile Arg Ser Thr Leu Asn Pro Gln Trp Asn
    210                 215                 220
Glu Ser Phe Thr Phe Lys Leu Lys Pro Ser Asp Lys Asp Arg Arg Leu
225                 230                 235                 240
Ser Val Glu Ile Trp Asp Trp Asp Arg Thr Thr Arg Asn Asp Phe Met
                245                 250                 255
Gly Ser Leu Ser Phe Gly Val Ser Glu Leu Met Lys Met Pro Ala Ser
            260                 265                 270
Gly Trp Tyr Lys Leu Leu Asn Gln Glu Glu Gly Glu Tyr Tyr Asn Val
        275                 280                 285
Pro Ile Pro Glu Gly Asp Glu Glu Gly Asn Met Glu Leu Arg Gln Lys
    290                 295                 300
Phe Glu Lys Ala Lys Leu Gly Pro Ala Gly Asn Lys Val Ile Ser Pro
305                 310                 315                 320
Ser Glu Asp Arg Lys Gln Pro Ser Asn Asn Leu Asp Arg Val Lys Leu
                325                 330                 335
Thr Asp Phe Asn Phe Leu Met Val Leu Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys
            340                 345                 350
Val Met Leu Ala Asp Arg Lys Gly Thr Glu Glu Leu Tyr Ala Ile Lys
        355                 360                 365
Ile Leu Lys Lys Asp Val Val Ile Gln Asp Asp Asp Val Glu Cys Thr
    370                 375                 380
Met Val Glu Lys Arg Val Leu Ala Leu Leu Asp Lys Pro Pro Phe Leu
385                 390                 395                 400
Thr Gln Leu His Ser Cys Phe Gln Thr Val Asp Arg Leu Tyr Phe Val
                405                 410                 415
Met Glu Tyr Val Asn Gly Gly Asp Leu Met Tyr His Ile Gln Gln Val
            420                 425                 430
Gly Lys Phe Lys Glu Pro Gln Ala Val Phe Tyr Ala Ala Glu Ile Ser
        435                 440                 445
Ile Gly Leu Phe Phe Leu His Lys Arg Gly Ile Ile Tyr Arg Asp Leu
    450                 455                 460
Lys Leu Asp Asn Val Met Leu Asp Ser Glu Gly His Ile Lys Ile Ala
465                 470                 475                 480
Asp Phe Gly Met Cys Lys Glu His Met Met Asp Gly Val Thr Thr Arg
                485                 490                 495
Thr Phe Cys Gly Thr Pro Asp Tyr Ile Ala Pro Glu Ile Ile Ala Tyr
            500                 505                 510
Gln Pro Tyr Gly Lys Ser Val Asp Trp Trp Ala Tyr Gly Val Leu Leu
        515                 520                 525
Tyr Glu Met Leu Ala Gly Gln Pro Pro Phe Asp Gly Glu Asp Glu Asp
    530                 535                 540
Glu Leu Phe Gln Ser Ile Met Glu His Asn Val Ser Tyr Pro Lys Ser
545                 550                 555                 560
Leu Ser Lys Glu Ala Val Ser Ile Cys Lys Gly Leu Met Thr Lys His
                565                 570                 575
Pro Ala Lys Arg Leu Gly Cys Gly Pro Glu Gly Glu Arg Asp Val Arg
            580                 585                 590
Glu His Ala Phe Phe Arg Arg Ile Asp Trp Glu Lys Leu Glu Asn Arg
        595                 600                 605
Glu Ile Gln Pro Pro Phe Lys Pro Lys Val Cys Gly Lys Gly Ala Glu
    610                 615                 620
Asn Phe Asp Lys Phe Phe Thr Arg Gly Gln Pro Val Leu Thr Pro Pro
625                 630                 635                 640
Asp Gln Leu Val Ile Ala Asn Ile Asp Gln Ser Asp Phe Glu Gly Phe
                645                 650                 655
Ser Tyr Val Asn Pro Gln Phe Val His Pro Ile Leu Gln Ser Ala Val
            660                 665                 670
<210>7
<211>2019
<212>DNA
<213>家兔(Oryctolagus cuniculus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2019)
<400>7
atg gct gac gtt ttc ccg gcc aac gac tcc acg gcg tct cag gac gtg     48
Met Ala Asp Val Phe Pro Ala Asn Asp Ser Thr Ala Ser Gln Asp Val
1               5                   10                  15
gcc aac cgc ttc gcc cgc aaa ggg gcg ctg agg cag aag aac gtg cac     96
Ala Asn Arg Phe Ala Arg Lys Gly Ala Leu Arg Gln Lys Asn Val His
            20                  25                  30
gag gtg aaa gac cac aaa ttc atc gcg cgc ttc ttc aag cag ccc acc    144
Glu Val Lys Asp His Lys Phe Ile Ala Arg Phe Phe Lys Gln Pro Thr
        35                  40                  45
ttc tgc agc cac tgc acc gac ttc atc tgg ggg ttt ggg aag caa ggc    192
Phe Cys Ser His Cys Thr Asp Phe Ile Trp Gly Phe Gly Lys Gln Gly
    50                  55                  60
ttc cag tgc caa gtt tgc tgt ttt gtg gtt cac aag agg tgc cat gaa    240
Phe Gln Cys Gln Val Cys Cys Phe Val Val His Lys Arg Cys His Glu
65                  70                  75                  80
ttt gtt acc ttt tct tgt ccg ggt gcg gat aag gga cct gac act gat    288
Phe Val Thr Phe Ser Cys Pro Gly Ala Asp Lys Gly Pro Asp Thr Asp
                85                  90                  95
gac ccc agg agc aag cac aag ttt aaa atc cac acc tac ggg agc ccc    336
Asp Pro Arg Ser Lys His Lys Phe Lys Ile His Thr Tyr Gly Ser Pro
            100                 105                 110
acc ttc tgc gat cac tgt ggg tca ctg ctg tac gga ctc atc cac cag    384
Thr Phe Cys Asp His Cys Gly Ser Leu Leu Tyr Gly Leu Ile His Gln
        115                 120                 125
ggg atg aaa tgt gac acc tgc gac atg aac gtt cac aag cag tgt gtg    432
Gly Met Lys Cys Asp Thr Cys Asp Met Asn Val His Lys Gln Cys Val
    130                 135                 140
atc aat gtc ccc agc ctg tgt ggg atg gac cat acg gag aag agg gga    480
Ile Asn Val Pro Ser Leu Cys Gly Met Asp His Thr Glu Lys Arg Gly
145                 150                 155                 160
cgg atc tac ctg aag gcc gag gtc acc gat gaa aag ctc cac gtc acg    528
Arg Ile Tyr Leu Lys Ala Glu Val Thr Asp Glu Lys Leu His Val Thr
                165                 170                 175
gta cga gat gca aaa aac ctg atc ccc atg gat ccc aac ggg ctt tca    576
Val Arg Asp Ala Lys Asn Leu Ile Pro Met Asp Pro Asn Gly Leu Ser
            180                 185                 190
gat ccc tac gtg aag ctg aaa ctc att cct gat ccc aag aat gaa agc    624
Asp Pro Tyr Val Lys Leu Lys Leu Ile Pro Asp Pro Lys Asn Glu Ser
        195                 200                 205
aaa caa aaa acc aaa acc atc cgc tcc acg ctg aac ccg cag tgg aac    672
Lys Gln Lys Thr Lys Thr Ile Arg Ser Thr Leu Asn Pro Gln Trp Asn
    210                 215                 220
gaa tcc ttt acc ttc aaa tta aaa ccc tcc gac aaa gac cga cga ctg    720
Glu Ser Phe Thr Phe Lys Leu Lys Pro Ser Asp Lys Asp Arg Arg Leu
225                 230                 235                 240
tct gta gaa atc tgg gac tgg gac cga aca aca agg aat gac ttc atg    768
Ser Val Glu Ile Trp Asp Trp Asp Arg Thr Thr Arg Asn Asp Phe Met
                245                 250                 255
ggg tcg ctc tcc ttt ggc gtc tcg gag ctc atg aag atg cca gcc agt    816
Gly Ser Leu Ser Phe Gly Val Ser Glu Leu Met Lys Met Pro Ala Ser
            260                 265                 270
gga tgg tac aag ttg ctg aac caa gaa gaa ggt gaa tac tac aat gtg    864
Gly Trp Tyr Lys Leu Leu Asn Gln Glu Glu Gly Glu Tyr Tyr Asn Val
        275                 280                 285
ccc att ccg gaa ggg gac gaa gat ggg aac gtg gag ctc agg cag aaa    912
Pro Ile Pro Glu Gly Asp Glu Asp Gly Asn Val Glu Leu Arg Gln Lys
    290                 295                 300
ttc gag aaa gcc aag ctg ggg ccc gct ggc aac aag gtg atc agt ccc     960
Phe Glu Lys Ala Lys Leu Gly Pro Ala Gly Asn Lys Val Ile Ser Pro
305                 310                 315                 320
tcg gaa gac agg aag cag ccg tcc aac aac ctg gac cga gtg aag ctc    1008
Ser Glu Asp Arg Lys Gln Pro Ser Asn Asn Leu Asp Arg Val Lys Leu
                325                 330                 335
acc gac ttc aac ttc ctc atg gtc ctg gga aaa ggc agt ttt ggg aag    1056
Thr Asp Phe Asn Phe Leu Met Val Leu Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys
            340                 345                 350
gtg atg ctg gcg gac agg aag ggc acg gaa gag ctg tac gcc atc agg    1104
Val Met Leu Ala Asp Arg Lys Gly Thr Glu Glu Leu Tyr Ala Ile Arg
        355                 360                 365
atc ctg aag aag gac gtg gtg att cag gat gac gac gtg gag tgc acc    1152
Ile Leu Lys Lys Asp Val Val Ile Gln Asp Asp Asp Val Glu Cys Thr
    370                 375                 380
atg gtg gag aag cgg gtt ctg gcc ctg atg gac aag ccg ccc ttc ctg    1200
Met Val Glu Lys Arg Val Leu Ala Leu Met Asp Lys Pro Pro Phe Leu
385                 390                 395                 400
aca cag ctg cac tcc tgc ttc cag acc gtg gac cgg ctg tac ttt gtc    1248
Thr Gln Leu His Ser Cys Phe Gln Thr Val Asp Arg Leu Tyr Phe Val
                405                 410                 415
atg gaa tac gtc aac ggc gga gac ctc atg tac cac atc cag caa gtg    1296
Met Glu Tyr Val Asn Gly Gly Asp Leu Met Tyr His Ile Gln Gln Val
            420                 425                 430
gga aag ttc aag gag cca caa gca gta ttc tat gca gca gag att tcc    1344
Gly Lys Phe Lys Glu Pro Gln Ala Val Phe Tyr Ala Ala Glu Ile Ser
        435                 440                 445
att ggg ctg ttc ttc ctt cac aaa aga ggg atc atc tat agg gac ctg    1392
Ile Gly Leu Phe Phe Leu His Lys Arg Gly Ile Ile Tyr Arg Asp Leu
    450                 455                 460
aag cta gat aac gtc atg ctg gac tcg gaa gga cac atc aaa atc gct    1440
Lys Leu Asp Asn Val Met Leu Asp Ser Glu Gly His Ile Lys Ile Ala
465                 470                 475                 480
gac ttt ggg atg tgc aag gaa cac atg atg gac ggg gtc acc acc agg    1488
Asp Phe Gly Met Cys Lys Glu His Met Met Asp Gly Val Thr Thr Arg
                485                 490                 495
acc ttc tgt ggg act cca gat tac atc gcc ccg gag atc atc gct tat    1536
Thr Phe Cys Gly Thr Pro Asp Tyr Ile Ala Pro Glu Ile Ile Ala Tyr
            500                 505                 510
cag ccg tac ggc aaa tcc gtg gac tgg tgg gcc tac ggc gtc ctg ctg    1584
Gln Pro Tyr Gly Lys Ser Val Asp Trp Trp Ala Tyr Gly Val Leu Leu
        515                 520                 525
tat gag atg ctg gct ggg cag cct cca ttt gat ggc gag gac gaa gac    1632
Tyr Glu Met Leu Ala Gly Gln Pro Pro Phe Asp Gly Glu Asp Glu Asp
    530                 535                 540
gag ctg ttt cag tcc atc atg gag cac aac gtt tcc tac ccc aaa tcc    1680
Glu Leu Phe Gln Ser Ile Met Glu His Asn Val Ser Tyr Pro Lys Ser
545                 550                 555                 560
ttg tcc aag gag gcc gtc tcc atc tgc aag ggg ctg atg acc aaa cac    1728
Leu Ser Lys Glu Ala Val Ser Ile Cys Lys Gly Leu Met Thr Lys His
                565                 570                 575
ccg gcc aag cgg ctg ggc tgc ggg ccc gag gga gag cgg gac gtg agg    1776
Pro Ala Lys Arg Leu Gly Cys Gly Pro Glu Gly Glu Arg Asp Val Arg
            580                 585                 590
gaa cac gcc ttc ttc cgg agg atc gac tgg gag aaa ctg gag aac agg    1824
Glu His Ala Phe Phe Arg Arg Ile Asp Trp Glu Lys Leu Glu Asn Arg
        595                 600                 605
gag atc cag ccg ccg ttc aag ccc aaa gtg tgt ggc aaa gga gca gaa    1872
Glu Ile Gln Pro Pro Phe Lys Pro Lys Val Cys Gly Lys Gly Ala Glu
    610                 615                 620
aac ttc gac aag ttc ttc acg cga ggg cag ccc gtc gtc acg ccg ccg    1920
Asn Phe Asp Lys Phe Phe Thr Arg Gly Gln Pro Val Val Thr Pro Pro
625                 630                 635                 640
gat caa ctg gtc atc gct aac ata gac cag tct gat ttc gaa ggg ttc    1968
Asp Gln Leu Val Ile Ala Asn Ile Asp Gln Ser Asp Phe Glu Gly Phe
                645                 650                 655
tcg tat gtc aac ccc cag ttc gtg cac ccg atc cta cag agc tca gta    2016
Ser Tyr Val Asn Pro Gln Phe Val His Pro Ile Leu Gln Ser Ser Val
            660                 665                 670
tga                                                                2019
<210>8
<211>672
<212>PRT
<213>家兔(Oryctolagus cuniculus)
<400>8
Met Ala Asp Val Phe Pro Ala Asn Asp Ser Thr Ala Ser Gln Asp Val
1               5                   10                  15
Ala Asn Arg Phe Ala Arg Lys Gly Ala Leu Arg Gln Lys Asn Val His
            20                  25                  30
Glu Val Lys Asp His Lys Phe Ile Ala Arg Phe Phe Lys Gln Pro Thr
        35                  40                  45
Phe Cys Ser His Cys Thr Asp Phe Ile Trp Gly Phe Gly Lys Gln Gly
    50                  55                  60
Phe Gln Cys Gln Val Cys Cys Phe Val Val His Lys Arg Cys His Glu
65                  70                  75                  80
Phe Val Thr Phe Ser Cys Pro Gly Ala Asp Lys Gly Pro Asp Thr Asp
                85                  90                  95
Asp Pro Arg Ser Lys His Lys Phe Lys Ile His Thr Tyr Gly Ser Pro
            100                 105                 110
Thr Phe Cys Asp His Cys Gly Ser Leu Leu Tyr Gly Leu Ile His Gln
        115                 120                 125
Gly Met Lys Cys Asp Thr Cys Asp Met Asn Val His Lys Gln Cys Val
    130                 135                 140
Ile Asn Val Pro Ser Leu Cys Gly Met Asp His Thr Glu Lys Arg Gly
145                 150                 155                 160
Arg Ile Tyr Leu Lys Ala Glu Val Thr Asp Glu Lys Leu His Val Thr
                165                 170                 175
Val Arg Asp Ala Lys Asn Leu Ile Pro Met Asp Pro Asn Gly Leu Ser
            180                 185                 190
Asp Pro Tyr Val Lys Leu Lys Leu Ile Pro Asp Pro Lys Asn Glu Ser
        195                 200                 205
Lys Gln Lys Thr Lys Thr Ile Arg Ser Thr Leu Asn Pro Gln Trp Asn
    210                 215                 220
Glu Ser Phe Thr Phe Lys Leu Lys Pro Ser Asp Lys Asp Arg Arg Leu
225                 230                 235                 240
Ser Val Glu Ile Trp Asp Trp Asp Arg Thr Thr Arg Asn Asp Phe Met
                245                 250                 255
Gly Ser Leu Ser Phe Gly Val Ser Glu Leu Met Lys Met Pro Ala Ser
            260                 265                 270
Gly Trp Tyr Lys Leu Leu Asn Gln Glu Glu Gly Glu Tyr Tyr Asn Val
        275                 280                 285
Pro Ile Pro Glu Gly Asp Glu Asp Gly Asn Val Glu Leu Arg Gln Lys
    290                 295                 300
Phe Glu Lys Ala Lys Leu Gly Pro Ala Gly Asn Lys Val Ile Ser Pro
305                 310                 315                 320
Ser Glu Asp Arg Lys Gln Pro Ser Asn Asn Leu Asp Arg Val Lys Leu
                325                 330                 335
Thr Asp Phe Asn Phe Leu Met Val Leu Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys
            340                 345                 350
Val Met Leu Ala Asp Arg Lys Gly Thr Glu Glu Leu Tyr Ala Ile Arg
        355                 360                 365
Ile Leu Lys Lys Asp Val Val Ile Gln Asp Asp Asp Val Glu Cys Thr
    370                 375                 380
Met Val Glu Lys Arg Val Leu Ala Leu Met Asp Lys Pro Pro Phe Leu
385                 390                 395                 400
Thr Gln Leu His Ser Cys Phe Gln Thr Val Asp Arg Leu Tyr Phe Val
                405                 410                 415
Met Glu Tyr Val Asn Gly Gly Asp Leu Met Tyr His Ile Gln Gln Val
            420                 425                 430
Gly Lys Phe Lys Glu Pro Gln Ala Val Phe Tyr Ala Ala Glu Ile Ser
        435                 440                 445
Ile Gly Leu Phe Phe Leu His Lys Arg Gly Ile Ile Tyr Arg Asp Leu
    450                 455                 460
Lys Leu Asp Asn Val Met Leu Asp Ser Glu Gly His Ile Lys Ile Ala
465                 470                 475                 480
Asp Phe Gly Met Cys Lys Glu His Met Met Asp Gly Val Thr Thr Arg
                485                 490                 495
Thr Phe Cys Gly Thr Pro Asp Tyr Ile Ala Pro Glu Ile Ile Ala Tyr
            500                 505                 510
Gln Pro Tyr Gly Lys Ser Val Asp Trp Trp Ala Tyr Gly Val Leu Leu
        515                 520                 525
Tyr Glu Met Leu Ala Gly Gln Pro Pro Phe Asp Gly Glu Asp Glu Asp
    530                 535                 540
Glu Leu Phe Gln Ser Ile Met Glu His Asn Val Ser Tyr Pro Lys Ser
545                 550                 555                 560
Leu Ser Lys Glu Ala Val Ser Ile Cys Lys Gly Leu Met Thr Lys His
                565                 570                 575
Pro Ala Lys Arg Leu Gly Cys Gly Pro Glu Gly Glu Arg Asp Val Arg
            580                 585                 590
Glu His Ala Phe Phe Arg Arg Ile Asp Trp Glu Lys Leu Glu Asn Arg
        595                 600                 605
Glu Ile Gln Pro Pro Phe Lys Pro Lys Val Cys Gly Lys Gly Ala Glu
    610                 615                 620
Asn Phe Asp Lys Phe Phe Thr Arg Gly Gln Pro Val Val Thr Pro Pro
625                 630                 635                 640
Asp Gln Leu Val Ile Ala Asn Ile Asp Gln Ser Asp Phe Glu Gly Phe
                645                 650                 655
Ser Tyr Val Asn Pro Gln Phe Val His Pro Ile Leu Gln Ser Ser Val
            660                 665                 670
<210>9
<211>147
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221>CDS
<222>(2)..(145)
<400>9
g ttt gag aaa gcc aag cta ggc cct gct ggt aac aaa gtc atc agc cct   49
  Phe Glu Lys Ala Lys Leu Gly Pro Ala Gly Asn Lys Val Ile Ser Pro
  1               5                   10                  15
tca gaa gac aga aag caa cca tcc aac aac ctg gac aga gtg aaa ctc     97
Ser Glu Asp Arg Lys Gln Pro Ser Asn Asn Leu Asp Arg Val Lys Leu
            20                  25                  30
aca gac ttc aac ttc ctc atg gtg ctg ggg aag ggg agt ttt ggg aag    145
Thr Asp Phe Asn Phe Leu Met Val Leu Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys
        35                  40                  45
gt                                                                 147
<210>10
<211>48
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>10
Phe Glu Lys Ala Lys Leu Gly Pro Ala Gly Asn Lys Val Ile Ser Pro
1               5                   10                  15
Ser Glu Asp Arg Lys Gln Pro Ser Asn Asn Leu Asp Arg Val Lys Leu
            20                  25                  30
Thr Asp Phe Asn Phe Leu Met Val Leu Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys
        35                  40                  45
<210>11
<211>32
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>11
gactgtcgag tcgaccgagg tgtccctgta gt                                32
<210>12
<211>29
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>12
caatagccag tcgactcgat ccacagtca                                    29
<210>13
<211>33
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>13
tagtcaacaa tcgatggacg gtacttctgc gca                               33
<210>14
<211>30
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>14
acttgtcata tcgatgaaat gagttaccca                                   30
<210>15
<211>5443
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>15
ggatcctgca aggtcacaca agggtctcca cccaccaggt gccctagtct caatttcagt  60
ttccatgcct tgttctcaca atgctggcct ccccagagct aatttggact ttgtttttat   120
ttcaaaaggg cctgaatgag gagtagatct tgtgctaccc agctctaagg gtgcccgtga   180
agccctcaga cctggagcct ttgcaacagc cctttaggtg gaagcagaat aaagcaattt   240
tccttaaagc caaaatcctg cctctagact cttcttctct gacctcggtc cctgggctct   300
agggtgggga ggtggggctt ggaagaagaa ggtggggaag tggcaaaagc cgatccctag   360
ggccctgtga agttcggagc cttccctgta cagcactggc tcatagatcc tcctccagcc   420
aaacatagca agaagtgata cctcctttgt gacttcccca ggcccagtac ctgtcaggtt   480
gaaacaggat ttagagaagc ctctgaactc acctgaactc tgaagctcat ccaccaagca   540
agcacctagg tgccactgct agttagtatc ctacgctgat aatatgcaga gctgggccac   600
agaagtcctg gggtgtagga actgaccagt gacttttcag tcggcaaagg tatgaccccc   660
tcagcagatg tagtaatgtc cccttagatc ccatcccagg caggtctcta agaggacatg   720
ggatgagaga tgtagtcatg tggcattcca aacacagcta tccacagtgt cccttgcccc   780
ttccacttag ccaggaggac agtaacctta gcctatcttt cttcctcccc atcctcccag   840
gacacacccc ctggtctgca gtattcattt cttccttcac gtcccctctg tgacttccat   900
ttgcaaggct tttgacctct gcagctgctg gaagatagag tttggcccta ggtgtggcaa   960
gccatctcaa gagaaagcag acaacagggg gaccagattt tggaaggatc aggaactaaa  1020
tcactggcgg gcctgggggt agaaaaaaga gtgagtgagt ccgctccagc taagccaagc  1080
tagtccccga gatactctgc cacagctggg ctgctcgggg tagctttagg aatgtgggtc  1140
tgaaagacaa tgggattgga agacatctct ttgagtctcc cctcaacccc acctacagac  1200
acactcgtgt gtggccagac tcctgttcaa cagccctctg tgttctgacc actgagctag  1260
gcaaccagag catgggccct gtgctgagga tgaagagttg gttaccaata gcaaaaacag  1320
caggggaggg agaacagaga acgaaataag gaaggaagaa ggaaaggcca gtcaatcaga  1380
tgcagtcaga agagatggga agccaacaca cagcttgagc agaggaaaca gaaaagggag  1440
agattctggg cataaggagg ccacagaaag aagagcccag gccccccaag tctcctcttt  1500
ataccctcat cccgtctccc aattaagccc actcttcttc ctagatcaga cctgagctgc  1560
agcgaagaga cccgtaggga ggatcacact ggatgaagga gatgtgtgga gaagtccagg  1620
gcaacctaag agccagagcc taaaagagca agagataaag gtgcttcaaa ggtggccagg  1680
ctgtgcacac agagggtcga ggactggtgg tagagcctca agataaggat gatgctcaga  1740
atgggcgggg ggggggattc tggggggggg agagagaagg tgagaaggag cctggaacag  1800
agaatctgga agcgctggaa acgataccat aaagggaaga acccaggcta cctttagatg  1860
taaatcatga aagacaggga gaagggaagc tggagagagt agaaggaccc cggggcaaga  1920
catggaagca aggacaagcc aggttgagcg ctccgtgaaa tcagcctgct gaaggcagag  1980
ccctggtatg agcaccagaa cagcagaggc tagggttaat gtcgagacag ggaacagaag  2040
gtagacacag gaacagacag agacggggga gccaggtaac aaaggaatgg tccttctcac  2100
ctgtggccag agcgtccatc tgtgtccaca tactctagaa tgttcatcag actgcagggc  2160
tggcttggga ggcagctgga aagagtatgt gagagccagg ggagacaagg gggcctagga  2220
aaggaagaag agggcaaacc aggccacaca agagggcaga gcccagaact gagttaactc  2280
cttccttgtt gcatcttcca taggaggcag tgggaactct gtgaccacca tcccccatga  2340
gcccccacta cccataccaa gtttggcctg agtggcattc taggttccct gaggacagag  2400
cctggccttt gtctcttgga cctgacccaa gctgacccaa tgttctcagt accttatcat  2460
gccctcaaga gcttgagaac caggcagtga catattaggc catgggctaa ccctggagct  2520
tgcacacagg agcctcaagt gacctccagg gacacagctg cagacaggtg gcctttatcc  2580
ccaaagagca accatttggc ataggtggct gcaaatggga atgcaaggtt gaatcaggtc  2640
ccttcaagaa tactgcatgc aagacctaag acccctggag agaggggtat gctcctgccc  2700
ccacccacca taaggggagt gaactatcct agggggctgg cgaccttggg gagacaccac  2760
attactgaga gtgctgagcc cagaaaaact gaccgccctg tgtcctgccc acctccacac  2820
tctagagcta tattgagagg tgacagtaga tagggtggga gctggtagca gggagagtgt  2880
tcctgggtgt gagggtgtag gggaaagcca gagcagggga gtctggcttt gtctcctgaa  2940
cacaatgtct acttagttat aacaggcatg acctgctaaa gacccaacat ctacgacctc  3000
tgaaaagaca gcagccctgg aggacagggg ttgtctctga gccttgggtg cttgatggtg  3060
ccacaaagga gggcatgagt gtgagtataa ggccccagga gcgttagaga agggcacttg  3120
ggaaggggtc agtctgcaga gcccctatcc atggaatctg gagcctgggg ccaactggtg  3180
taaatctctg ggcctgccag gcattcaaag cagcacctgc atcctctggc agcctgggga  3240
ggcggaaggg agcaaccccc cacttatacc ctttctccct cagccccagg attaacacct  3300
ctggccttcc cccttcccac ctcccatcag gagtggaggg ttgcagaggg agggtaaaaa  3360
cctacatgtc caaacatcat ggtgcacgat atatggatca gtatgtgtag aggcaagaaa  3420
ggaaatctgc aggcttaact gggttaatgt gtaaagtctg tgtgcatgtg tgtgtgtctg  3480
actgaaaacg ggcatggctg tgcagctgtt cagttctgtg cgtgaggtta ccagactgca  3540
ggtttgtgtg taaattgccc aaggcaaagt gggtgaatcc cttccatggt ttaaagagat  3600
tggatgatgg cctgcatctc aaggaccatg gaaaatagaa tggacactct atatgtgtct  3660
ctaagctaag gtagcaaggt ctttggagga cacctgtcta gagatgtggg caacagagac  3720
tacagacagt atctgtacag agtaaggaga gagaggaggg ggtgtagaat tctcttacta  3780
tcaaagggaa actgagtcgt gcacctgcaa agtggatgct ctccctagac atcatgactt  3840
tgtctctggg gagccagcac tgtggaactt caggtctgag agagtaggag gctcccctca  3900
gcctgaagct atgcagatag ccagggttga aagggggaag ggagagcctg ggatgggagc  3960
ttgtgtgttg gaggcagggg acagatatta agcctggaag agaaggtgac ccttacccag  4020
ttgttcaact cacccttcag attaaaaata actgaggtaa gggcctgggt aggggaggtg  4080
gtgtgagacg ctcctgtctc tcctctatct gcccatcggc cctttgggga ggaggaatgt  4140
gcccaaggac taaaaaaagg ccatggagcc agaggggcga gggcaacaga cctttcatgg  4200
gcaaaccttg gggccctgct gtcctcctgt cacctccaga gccaagggat caaaggagga  4260
ggagccagga caggagggaa gtgggaggga gggtcccagc agaggactcc aaatttaggc  4320
agcaggcata tgggatggga tataaagggg ctggagcact gagagctgtc agagatttct  4380
ccaacccagg taagagggag tttcgggtgg gggctcttca cccacaccag acctctcccc  4440
acctagaagg aaactgcctt tcctggaagt ggggttcagg ccggtcagag atctgacagg  4500
gtggccttcc accagcctgg gaagttctca gtggcaggag gtttccacaa gaaacactgg  4560
atgccccttc ccttacgctg tcttctccat cttcctcctg gggatgctcc tccccgtctt  4620
ggtttatctt ggctcttcgt cttcagcaag atttgccctg tgctgtccac tccatctttc  4680
tctactgtct ccgtgccttg ccttgccttc ttgcgtgtcc ttcctttcca cccatttctc  4740
acttcacctt ttctcccctt ctcatttgta ttcatccttc cttccttcct tccttccttc  4800
cttccttcct tccttccttc ctttctccct tccttccttc cttccttcct tccttccttc  4860
cttccttcct gtgtcagagt gctgagaatc acacctgggg ttcccaccct tatgtaaaca  4920
atcttccagt gagccacagc ttcagtgctg ctgggtgctc tcttaccttc ctcaccccct  4980
ggcttgtcct gttccatcct ggtcaggatc tctagattgg tctcccagcc tctgctactc  5040
ctcttcctgc ctgttcctct ctctgtccag ctgcgccact gtggtgcctc gttccagctg  5100
tggtccacat tcttcaggat tctctgaaaa gttaaccagg tgagaatgtt tcccctgtag  5160
acagcagatc acgattctcc cggaagtcag gcttccagcc ctctctttct ctgcccagct  5220
gcccggcact cttagcaaac ctcaggcacc cttaccccac atagacctct gacagagaag  5280
caggcacttt acatggagtc ctggtgggag agccataggc tacggtgtaa aagaggcagg  5340
gaagtggtgg tgtaggaaag tcaggacttc acatagaagc ctagcccaca ccagaaatga  5400
cagacagatc cctcctatct cccccataag agtttgagtc gac                    5443

Claims (16)

1.一种转基因小鼠，所述转基因小鼠在至少一个细胞的基因组中包含至少一个稳定掺入的表达弹夹，所述表达弹夹包含一种心脏组织优选的调节序列，所述调节序列可操作地连接到相关的核苷酸序列，所述相关核苷酸序列选自：
(a)序列标识号：1的核苷酸序列；
(b)具有与序列标识号：1的核苷酸序列至少约90％同一性的核苷酸序列；
(c)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽具有序列标识号：2的氨基酸序列；
(d)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽具有与序列标识号：2中阐明的氨基酸序列至少约90％的同一性；
(e)包含与序列标识号：1中阐明的核苷酸序列相邻的至少约50个核苷酸的核苷酸序列；
(f)在严紧条件下杂交到序列标识号：1中阐明的核苷酸序列的核苷酸序列；
(g)序列标识号：7中阐明的核苷酸序列；和
(h)由(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、或(g)中任何一种核苷酸序列的补充组成的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的转基因小鼠，其中包含心脏组织优选的调节序列的表达弹夹被可操作地连接到序列标识号：1的核苷酸序列。
3.一种鉴定调节心肌收缩能力的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将化合物与蛋白致活酶C-α蛋白接触；
(b)测定是否所述化合物结合蛋白致活酶C-α；和
(c)鉴定那些结合蛋白致活酶C-α的化合物作为心肌收缩能力的调节子。
4.一种鉴定调节心肌病的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将化合物与蛋白致活酶C-α蛋白接触；
(b)测定是否所述化合物结合蛋白致活酶C-α；和
(c)鉴定那些结合蛋白致活酶C-α的化合物作为心肌病的调节子。
5.如权利要求3或权利要求4所述的方法，其中所述蛋白致活酶C-α蛋白在细胞中被表达，并且所述调节子的效果以所述蛋白致活酶C-α活性与不接触所述化合物的细胞相比发生的变化进行测量。
6.如权利要求3或5所述的方法，所述方法还包括以下步骤：
(a)选择那些调节蛋白致活酶C-α蛋白活性的化合物，并且进一步测定是否那些化合物调节心肌收缩能力模型体系中的心肌收缩能力；和
(b)鉴定那些在心肌收缩能力模型体系中调节心肌收缩能力的测试化合物作为用以调节心肌收缩能力的候选化合物。
7.如权利要求4或5所述的方法，所述方法还包括以下步骤：
(a)选择那些调节蛋白致活酶C-α蛋白活性的化合物，并且进一步测定是否那些化合物调节心肌病模型体系中的心肌病；和
(b)鉴定那些在所述心肌病模型体系中调节心肌病的测试化合物作为用以调节心肌病的候选化合物。
8.如权利要求1或2所述的转基因小鼠或它们的细胞或组织在权利要求5、6或7中任一项所述的方法中作为所述模型体系的应用。
9.一种转基因小鼠，所述转基因小鼠在至少一个细胞的基因组中包含至少一个断裂的蛋白致活酶C-α基因，所述断裂足以降低蛋白致活酶C-α的表达水平。
10.一种蛋白致活酶C-α调节化合物在制造用于治疗或预防哺乳动物中被心肌收缩能力调节的失调的药物中的应用。
11.一种蛋白致活酶C-α调节化合物在制造用于治疗或预防哺乳动物中的心肌病的药物中的应用。
12.一种蛋白致活酶C-α调节化合物在制造用于治疗或预防有此需要的哺乳动物中的急性心力衰竭的药物中的应用。
13.如权利要求10、11或12中的任一项所述的蛋白致活酶C-α调节化合物的应用，其中所述蛋白致活酶C-α调节化合物是一种选自Ro-32-0432、LY333531和Ro-31-8220的蛋白致活酶C-α抑制剂。
14.一种在需要治疗的哺乳动物中治疗或预防由心肌收缩能力调节的失调的方法，所述方法包括：
(a)鉴定需要治疗或预防由心肌收缩能力调节的失调的动物；和
(b)施用蛋白致活酶C-α调节化合物给所述哺乳动物。
15.一种在需要治疗的哺乳动物中治疗或预防心肌病的方法，所述方法包括：
(a)鉴定需要治疗或预防心肌病的动物；和
(b)施用蛋白致活酶C-α调节化合物给所述哺乳动物。
16.一种在需要治疗的哺乳动物中治疗或预防急性心力衰竭的方法，所述方法包括：
(a)鉴定需要治疗或预防急性心力衰竭的动物；和
(b)施用蛋白致活酶C-α调节化合物给所述哺乳动物。
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CN104666296A (zh) * 2015-02-06 2015-06-03 哈尔滨医科大学 蛋白激酶Cβ抑制剂LY333531在制备防治酒精性心肌病的药物中的应用

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