CN1678623A - 强有力的诱导型心脏优先的转基因表达系统 - Google Patents

Abstract

本发明的方法和组合物可用于改变转基因动物中心脏优先的表达。本发明的成合包括分离的核酸分子、表达盒、动物细胞、转基因动物、和转基因小鼠。本发明的转基因动物呈现目的核苷酸序列的诱导型心脏优先表达。该方法能产生具有目的核苷酸序列改变的心脏优先表达的转基因动物。尤其，本发明提供改变转基因动物对心脏病的易感性的方法。本发明的转基因动物可用于鉴定抗心脏病的化合物。

Description

强有力的诱导型心脏优先的转基因表达系统

相关申请的交叉参考

[0001]本申请要求2002年7月3日提交的美国临时专利申请第60/393,525号的优先权及其益处，本文引入该专利全文作为参考。

发明领域

[0002]本发明涉及组织优先的基因表达调控领域。

发明背景

[0003]表现为心脏异常或心脏功能障碍的多种疾病或状况能够导致心力衰竭。心力衰竭是心脏不能泵动足够的血液以满足机体循环需求的生理状况。在遗传多样的人中研究这样的疾病和状况是困难的，而且不可预测。因此，需要一种模型系统以便于对心脏疾病和状况机制和成因的研究、以及对有潜力的治疗性靶物的鉴定。

[0004]转基因动物技术的发展已经为获得体内复杂系统的更完整信息提供了重要的进步。通过控制单个或多个基因的体内表达，有可能洞察这样的基因在特定系统中的作用或者研究该系统在受遗传控制环境中的情况。

[0005]尽管在大量大型或小型动物物种中已经完成了成功的转基因试验，但是小鼠已经成为理想的心血管研究动物。参见，例如，美国专利6,353,151，引入本文作为参考。已经将心脏优先的转基因用于建立某一特定蛋白质(或其突变形式)的存在或缺失的结构一功能关联以及分子、细胞、以及生理水平上的正常或异常心脏功能。然而，即使是带有心脏优先启动子，转基因也可能不灵敏，尤其是在研究以低丰度存在时就能对心血管结构、代谢及功能有多向效应的强有力的生物信号蛋白的时候。例如，鼠α-肌球蛋白重链启动子在早期心脏管以及发育的动脉中引发转录；因此贯穿发育过程的大鼠α-肌球蛋白重链启动子的转基因表达具有混淆后期(post-term)表型的潜力。

[0006]因此，多个实验室已经致力于开发条件性或诱导型转基因系统。一种最广泛使用的条件性系统是二元、以四环素为基础的系统，它已经被广泛用于细胞或动物中通过四环素或其类似物的加入或去除来可逆地诱导表达。(参见Bujard(1999)。J.Gene Med.1：372-374；Furth，等人(1994)。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：9302-9306；和Mansuy & Bujard(2000)。Curr.Opin.Neurobiol.10：593-596，引入本文作为参考。)

[0007]尽管上述四环素靶基因诱导/失活系统具有潜在优点，却几乎未曾报道过心脏中的成功。来自心血管系统的极小量数据暗示，上述二元系统在心脏组织中不是强有力的，并且不可能获得常规的成功。此外，这些系统需要开发大量转基因系以获得适合于受调控的、心脏优先的转基因试验的转基因工作对。而且，某些激活物转基因构建体在宿主动物中诱导心脏病表型——甚至当该动物不含有靶转基因或效应器构建体时。心脏病表型在靶转基因缺失时的出现使得这些动物对于用作心脏病和心脏疾病的转基因模型不够理想。

[0008]因此，需要开发用于研究心脏疾病和状况的可调控、转基因模型系统。重要的是开发允许靶转基因在任何发育阶段受控表达的可调控的心脏优先的转基因表达系统。尤其重要的是开发用于研究心脏病的转基因系统模型。

发明概述

[0009]本发明提供用于异源核苷酸序列的心脏优先表达的组合物及方法。本发明的组成包括诱导型心脏优选启动子核苷酸序列、表达盒、载体、宿主细胞、动物细胞以及动物，尤其是含有本发明核苷酸序列的转基因小鼠。本发明的表达盒、载体、宿主细胞、动物细胞和动物含有一个包含与目的核苷酸序列可操作性相连的本发明核苷酸序列的表达盒。在一种实施方式中，该启动子能够引发心脏优先的转录，特别是心室优先的转录。在本发明的动物和转基因小鼠中，目的核苷酸序列的表达，尤其是在心脏组织中的表达得以改变。在一种实施方式中，目的核苷酸序列的表达是心室优先的。在一种实施方式中，目的核苷酸序列的表达是诱导型的。在一种实施方式中，转基因小鼠基因组含有与编码心肌成分的目的核苷酸序列可操作性相连的能够引发心室优先转录的诱导型启动子。含有与本发明核苷酸序列可操作性相连的目的核苷酸序列的转基因小鼠表现出目的核苷酸序列诱导型的改变的表达。在一种实施方式中，转基因小鼠基因组含有与编码ELC1a的核苷酸序列可操作性相连的本发明的核苷酸序列。在一种实施方式中，转基因小鼠基因组含有与编码组成型活性形式GSK-3β的核苷酸序列可操作性相连的本发明的核苷酸序列。

[0010]本发明包括强诱导型以及最低程度泄漏的效应器基因座(responder locus)。该效应器基因座示于SEQ ID NO：1中。本发明的效应器衍生自小鼠α-肌球蛋白重链启动子序列。介于核苷酸-3000和-40间的核苷酸序列替换五个转录调控盒。所得的效应器基因座是一个依赖于拷贝数、不依赖位置的基因座，其中可以插入各种不同的目的转基因。当未被诱导时，这些转基因是沉默的。当诱导时，这些转基因是非常活跃的。之后可以利用诱导型系统将这些基因关闭。

[0011]本发明提供了在动物中改变目的核苷酸序列表达的方法。通过本发明的方法可以改变动物对各种心脏病的易感性，包括但不限于心肌病。心肌病包括，但不限于，家族性肥厚型心肌病、扩张性心肌病、围产期心肌病和限制性心肌病。在一种实施方式中，动物表现出心脏病易感性增加。在一种实施方式中，动物表现出心脏病易感性降低。开发了含有一个带有能够在动物中引发组织优先(特别是心脏优先)的转录的核苷酸序列的启动子的表达盒。该启动子与异源目的核苷酸序列可操作性相连。利用含有与异源目的核苷酸序列可操作性相连的能够引发心脏优先表达的本发明核苷酸序列的表达盒来产生转基因动物。该动物的基因组整合了至少一个含有该启动子和目的核苷酸序列的表达盒。在对启动子的诱导下，目的核苷酸序列优先在心脏组织中表达。目的核苷酸序列的诱导型表达以可探测的水平出现。在一种实施方式中，目的核苷酸序列编码心肌成分，例如，但不限于，α-肌球蛋白重链、β-肌球蛋白重链、基本肌球蛋白轻链-1、肌动蛋白、儿茶酚胺受体和糖原合酶3-β。

[0012]本发明提供了鉴定抗心脏病成分的方法。在一种实施方式中，提供了至少两只在其基因组中含有至少一个稳定整合的表达盒的转基因小鼠，所述表达盒含有与异源目的核苷酸序列可操作性相连的本发明核苷酸序列。向第一小鼠施用一种化合物。将第一和第二小鼠饲养一段时间。监控两种小鼠的心脏病表型。心脏病表型包括，但不限于，死亡率、心肌细胞混乱、间隙纤维化、心脏收缩功能障碍、心脏舒张功能障碍、左心室肥大、心脏质量异常(cardiac mass abnormalities)、右心室流出管阻塞、形态学变化、细胞退化、和过度收缩。

附图简述

[0013]附图1描写与本发明核苷酸序列(SEQ ID NO：1)可操作性相连的心房形式基本轻链-1(ELC1a，SEQ ID NO：5)基因的心室优先表达。版A示出分离自非转基因(NTG)对照小鼠和三个转基因小鼠系的RNA斑点印迹分析结果。硝化纤维膜上印迹了5μg RNA。用ELC1a特异性寡核苷酸探针与膜杂交。用甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)表达将数据标准化。泳道1和2分别包含分离自心房和左心室组织的RNA。泳道3、5、和7包含分离自左心室(LV)组织的RNA。泳道4、6、和8包含分离自右心室(RV)组织的RNA。三个转基因系不含激活物构建体。版B示出非转基因小鼠和三个转基因小鼠系的蛋白质表达的蛋白质印迹分析结果。泳道1和2包含来自非转基因小鼠心房(泳道2)和心室(泳道1)组织的蛋白质。泳道3、5、和7包含来自三个转基因系左心室(LV)组织的蛋白质。泳道4、6、和8包含来自三个转基因系右心室(RV)组织的蛋白质。版C示出非转基因小鼠心房组织(泳道1)以及转基因系各种不同组织的蛋白质印迹分析结果。各泳道包含30μg来自下列组织的蛋白质：泳道2，左心室(LV)；泳道3，右心室(RV)；泳道4，心房(At)；泳道5，横隔膜(Dia)；泳道6，比目鱼肌(Sol)；泳道7，二头肌(Bi)；泳道8，胫骨肌(Tib)；泳道9，咬肌(Mass)；泳道10，舌(Ton)；泳道11，胃(Sto)；泳道12，小肠(S.int)；泳道13，主动脉(Ao)；泳道14，肺；泳道15，肝(Liv)；和泳道16，脾(Spl)。肺组织包含肺心肌层，其衍生自心房组织并由环绕肺静脉和小静脉亚群的一薄层心房样细胞组成。

[0014]附图2示出肌丝蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。凝胶用考马斯染色。在凝胶右侧用箭头指示了心室(ELC1v)和心房(ELC1a)同工型的迁移图。各泳道下方指示了转基因心房同工型取代天然ELC1v同工型的百分数。版A示出，强力霉素(625mg/kg食物)存在和缺失情况下几个小鼠系的结果。泳道1含有分子量标记，凝胶左侧标示了大小。泳道2和3包含分别分离自非转基因对照的心房和左心室组织的蛋白质。泳道4-9包含分离自几个转基因系心室组织的蛋白质。泳道4中所示的转基因系包含激活物构建体(tTA)。泳道5中所示的转基因系包含与ELC1a基因(MHCmin^Tet0-ELC1a)可操作性相连的本发明效应器构建体。泳道6中所示的双重转基因系同时包含激活物构建体(tTA)和与ELC1a基因(MHCmin^Tet0-ELC1a)可操作性相连的效应器构建体两者。来自MHCmin^Tet0-ELC1a同源转基因系的蛋白载入了泳道7中。泳道8和9包含来自用强力霉素(Dox)(625mg/kg饲料)饲喂的动物的蛋白质。双重转基因系示于泳道8。泳道9包含来自MHCmin^Tet0-ELC1a同源转基因系的蛋白质。

[0015]附图2，版B示出对小鼠食谱中的强力霉素的滴定结果。泳道1包含分子量标记。泳道2和3包含来自非转基因对照小鼠心房和左心室的蛋白质。泳道4中所示的转基因系包含激活物构建体(tTA)。泳道5中所示的转基因系包含与ELC1a基因(MHCmin^Tet0-ELC1a)可操作性相连的效应器构建体。双重转基因系示于泳道6。泳道7-9包含获自异源、双重转基因小鼠的蛋白质。小鼠先用指定水平的强力霉素饲喂了三周，然后收集心室组织。泳道7，100mg强力霉素/kg食物；泳道8，200mg强力霉素/kg食物；泳道9，625mg强力霉素/kg食物。

[0016]附图3描述，在表达活性GSK-3β的动物中的肥大应答调控的分析结果。试验细节在本文其它部分得以描述。编码在C末端带有血凝素表位的GSK-3β组成型活性形式的核酸分子与本发明的启动子可操作性相连。

[0017]版A描述了各种试验方案。用于方案1的动物不接受强力毒素处理。用于方案2的动物在TAC前用强力霉素饲喂四周。TAC步骤后，撤出或者保持强力霉素。版B描绘了，接受TAC或者假步骤的动物的左心室重量与体重比率的时间过程。版C描绘，来自几个小鼠群的左心室重量与体重的比率。泳道1-4包含非转基因小鼠(泳道1)、含有tTA激活物构建体的小鼠(泳道2)、含有GSK-CA(组成型活性GSK-3β)效应器构建体(泳道3)、以及含有tTA激活物构建体和GSK-CA效应器构建体的双重转基因小鼠(泳道4)的左心室：体重比率。泳道5描述TAC步骤后两周时非转基因小鼠的左心室：体重比率。泳道6描述TAC步骤后两周时双重转基因小鼠的左心室：体重比率。泳道7-9 TAC步骤后七周时小鼠的左心室：体重比率。泳道7描述来自非转基因小鼠的结果。泳道8描述来自用强力霉素维持的双重转基因小鼠的结果。泳道9描述TAC步骤后一周撤出强力霉素的双重转基因小鼠的结果。版D示出在方案2小鼠中的GSK-3β表达蛋白质印迹分析结果。蛋白质平样品用抗-GSK-3β抗体或抗血凝素抗体进行探测。泳道1和2描述获自缺失或存在强力霉素的非转基因小鼠的结果。泳道3-5描述获自饲喂过程中维持强力霉素的3只双重转基因小鼠的结果。泳道6-8描述获自饲喂过程中撤出了强力霉素的3只双重转基因小鼠的结果。

发明详述

[0017]本发明提供动物中转基因的诱导型心脏优先表达。本发明的组成包括分离的核酸分子、表达盒、载体、宿主细胞和含有本发明分离的核酸分子的转基因动物。本发明提供在动物中改变目的核苷酸序列表达的方法。目的核苷酸序列的表达能改变转基因动物对心脏病的易感性。本发明进一步提供鉴定抗心脏病化合物的方法。

[0018]本发明涉及有关可调控的心脏优先启动子(SEQ ID NO：1)的组合物和方法以及应用方法。本发明的动物细胞或动物稳定转化了含有与目的核苷酸序列可操作性相连的SEQ ID NO：1所示的心脏优先启动子的表达盒。该启动子序列可用于以组织优先，优选以心脏组织优先的表达方式来表达可操作性相连的序列。在一种实施方式中，该启动子是诱导型的。

[0019]含有本发明核苷酸序列的质粒保藏于美国典型培养物专利保藏处(Patent Depository of the American Type CultureCollection，(ATCC))，马纳萨斯，维吉尼亚，于_________，____，并指定专利保藏编号________。这些保藏物在国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条款下保持。这些保藏仅仅是为了本领域技术人员的方便，并不承认根据35 U.S.C。§112必需保藏。

[0020]如同一般在整体动物中所使用的，诱导型表达依赖于二元系统且需要两种转基因。这两种转基因是激活物表达盒和含有与效应器启动子可操作性连接的目的靶核苷酸序列的靶物表达盒。这样的动物可以通过“双重”转基因动物的构建来获得，例如，通过将两种转基因动物杂交，其中一种含有编码所选蛋白的靶转基因而另一种含有激活物转基因。双重转基因系统还用在细胞培养中。在细胞培养系统中，通过几种方法中的任一种来产生双重转基因细胞。可以从双重转基因动物或分离细胞，或者可以将两种转基因转化进细胞。转基因可以同时或相继的转化进细胞。

[0021]这样的二元系统的一个例子是噬菌体P1的cre/loxP重组酶系统。cre/loxP重组酶系统的描述参见例如，Lakso等人(1992)PNAS89：6232-6236。在Cre/LoxP重组酶系统中，激活物转基因编码重组酶。如果用cre/loxP重组酶系统调控转基因的表达，那么需要含有同时编码Cre重组酶以及所选靶蛋白质的转基因的动物。重组酶系统的另一个例子是啤酒酵母(S.cerevisiae)的FLP重组酶系统(O′Gorman等人(1991)Science 251：1351-1355。

[0022]一种最广泛使用的可诱导系统是二元的、基于四环素的系统，它已经被用于细胞或动物中以通过四环素或其类似物的加入或去除来可逆地诱导表达。(参见Bujard(1999)。J.Gene Med.1：372-374；Furth，等人(1994)。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：9302-9306；和Mansuy & Bujard(2000)。Curr.Opin.Neurobiol.10：593-596，引入本文作为参考。)四环素类似物包括，但不限于，强力霉素；去甲基金霉素；土霉素；米诺环素；高压灭菌的金霉素；伟霸霉素；赖氨甲四环素；DMG-米诺环素；经过化学修饰的四环素例如CMT-5、CMT-3、和CMT-8；Co13；以及glycylcyclines，例如GAR-936和9-(N-N-二甲基甘氨酰胺)6二甲基6脱氧土霉素。

[0023]在基于四环素的系统中，两个转基因是1)驱动与转录激活物蛋白质VP-16相连的tet-控制的反式激活物(tTA)序列的心脏优先启动子，和2)由与5-7个tet操纵子拷贝相连的巨细胞病毒最小启动子构成的效应器启动子。对于心脏优先表达，心脏优先启动子，例如α-肌球蛋白重链启动子，控制tTA蛋白质的表达。之后将效应器启动子可操作性连接于将要被条件化控制的靶转基因。在四环素或其类似物存在下，tTA蛋白质与该药物结合并且仅从效应器启动子出现靶基因的转录。如果系统中不存在该药物，则tTA与tetO序列结合，从而允许VP16反式激活物蛋白提高由最小启动子驱动的表达。在一种实施方式中，本发明的分离的核酸分子是一种诱导型、心脏优先效应器启动子。

[0024]“诱导型”意指，化学刺激以至少1％、5％，优选10％、20％，更优选30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或更高程度地改变操作性连接的目的核苷酸序列的表达。这种变化可能是表达水平上的提升或降低。本文其它部分描述了检测表达水平的方法。化学刺激可以施加也可以撤出。各种化学刺激是本领域已知的。在一种实施方式中，该化学刺激是四环素或其类似物。

[0025]“稳定转化的”意指，动物细胞的核基因组或者动物的至少一个细胞的核基因组已经整合了至少一个拷贝的转基因。本发明的转基因动物含有至少一个含有目的核苷酸序列的稳定转化的细胞。在一种实施方式中，转基因动物生殖系细胞的基因组中含有目的核苷酸序列。本发明包括分离的或基本纯化的核酸或蛋白质组合物。“分离的”或基本“纯化的”核酸分子或其生物活性蛋白质是指当其是由重组技术制备而得时其基本不含其它细胞物质、或培养基或者当其是由化学合成时基本不含化学前体或其它化学药品。优选地，“分离的”核酸分子不含在该核酸所来源的生物的基因组DNA中天然存在于该核酸侧翼(也即，位于该核酸5′和3′末端)的序列(优选多肽编码序列)。例如、在不同的实施方式中、分离的核酸分子可包含小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、或0.1kb的在该核酸所来源的细胞的基因组DNA中天然存在于该核酸分子侧翼的核苷酸序列。

[0026]分离启动子区域的方法是本领域熟知的。“分离的”意指，该启动子序列已经被确定，并且可以通过分子技术提取或通过化学手段合成。在任一实例中，该启动子都被除去了其至少一个天然状态下的侧翼序列。

[0027]所公开的核苷酸序列的片段或变体也包括在本发明内。“片段”意指核苷酸序列的一部分。核苷酸序列片段可能保持生物活性并驱动表达，特别是心脏优先的表达，更特别是心室优先表达，以及更特别优选诱导型、心脏优先表达。或者，用作杂交探针的核苷酸序列片段通常不保持生物活性。因此，核苷酸序列片段可以介于SEQ ID NO：1的至少约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、2950、3000、3050、3100、3150、3200、3250、3300、3350、3400、3450、3500、3550、3600、3650、3700、3750、3800、3850、3900、3950、4000、4050、4100、4150、4200、4250、4300、4350、4400、4450、4500、4550、4600、4650、4700、4750、4800、4850、4900、4950、4500、4550、4600、4650、4700、4750、4800、4850、4900、4950、5000、5050、5100、5150、5200、5250、5300、5350、5400、5450、5500、5550、5600、5650、5700、至高达约5735个核苷酸。

[0028]因此诱导型心脏优先启动子的核苷酸序列片段可以编码诱导型、心脏组织优先的启动子的生物活性部分，或者它可以是可用作以下所公开的方法的杂交探针或PCR引物的片段。可以通过分离本文所公开的启动子核苷酸序列的一部分、以及评估该启动子部分的活性来制备诱导型心脏优先启动子的生物活性部分。作为可诱导心脏优先启动子片段的核酸分子含有SEQ ID NO：1的25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、2950、3000、3050、3100、3150、3200、3250、3300、3350、3400、3450、3500、3550、3600、3650、3700、3750、3800、3850、3900、3950、4000、4050、4100、4150、4200、4250、4300、4350、4400、4450、4500、4550、4600、4650、4700、4750、4800、4850、4900、4950、4500、4550、4600、4650、4700、4750、4800、4850、4900、4950、5000、5050、5100、5150、5200、5250、5300、5350、5400、5450、5500、5550、5600、5650、5700、至高达约5735个核苷酸。

[0029]“变体”意指基本相似的序列。对于核苷酸序列，可以用熟知的分子生物技术鉴定天然存在的变体，例如，用聚合酶链式反应(PCR)以及下述的杂交技术。变体核苷酸序列还包括合成衍生的核苷酸序列，例如通过利用，例如，定点诱变产生的那些变体。通常，本发明特定核苷酸序列的变体将与该特定核苷酸序列具有利用本文其它部分所述的序列比对程序以默认参数确定的至少95％、96％、97％，优选98％、99％或更高的同一性。诱变以及核苷酸序列改变的方法是本领域熟知的。参见，例如，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel等人(1987)Methods in Enzymol.154：367-382；美国专利4,873,192；Walker和Gaastra，eds.(1983)Techniques inMolecular Biology(MacMillan Publishing Co.，New York)以及其中所引用的文献。

[0030]变体核苷酸序列还包括衍生自突变或重组方法例如DNA穿梭产生的序列。通过这样一种方法，可以对包括本文所公开的启动子序列的一个或多个不同启动子序列进行操作以创造出具有目的特性的新启动子序列。以这种方式，可以从含有具有基本序列同一性并能在体内或体外发生同源重组的序列区域的相关序列多核苷酸群体产生重组多核苷酸文库。这样的DNA穿梭策略是本领域已知的。参见，例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature 370：389-391；Crameri等人(1997)Nature Biotech.15：436-438；Moore等人(1997)J.Mol.Biol.272：336-347；Zhang等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94：4504-4509；Crameri等人(1998)Nature 391：288-291；Miyazaki(2002)Nucleic Acids Research 30：E139-9；Song等人(2002)Appl.Environ.Microbiol.68：6146-51；Hayes等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.99：15926-31；Coco等人(2001)Nature Biotechnol.19：354-9；Kikuchi等人(2000)Gene243：133-7；及美国专利5,606,793和5,837,458。

[0031]以下术语用于描述两条或多条核酸或核苷酸序列间的序列关系：(a)“查询序列”，(b)“对比窗”，c)“序列同一性”，(d)“序列同一性百分数”，和(e)“基本同一”。

[0032](a)如本文所使用，“查询序列”是一条用作序列比较基础的确定的序列。查询序列可以是某一特异序列的亚组或完整序列；例如，是全长cDNA或基因序列或完整cDNA或基因序列的片段。

[0033](b)如本文所使用，“对比窗”是指多核苷酸序列的连续且特异的片段，其中为进行两条序列间的最理想比对，该多核苷酸序列与查询序列(其不含添加或缺失)相比在对比窗中可能含有添加或缺失部分(即空缺)。通常对比窗为至少长为20个连续的核苷酸，而且可选30、40、50、100个或更长。本领域技术人员理解，为避免由于多核苷酸序列中包括缺口而产生的与查询序列的高度相似性，通常引入缺口罚分，并将其从匹配数中减去。

[0034]用于比较的序列的比对方法是本领域熟知的。因此，可以用数学算法来完成任意两条序列间的序列同一性百分数的确定。这样的数学算法的优选非限制性例子有：Myers和Miller(1988)的算法，CABIOS 4：11-17；Smith等人(1981)的局部同源性算法，Adv.Appl.Math.2：482；Needleman和Wunsch(1970)的同源性比对算法，J.Mol.Bio1.48：443-453；Pearson和Lipman(1988)的相似性搜索方法，Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448；Karlin和Altschul(1990)的算法，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264，Karlin和Altschul所改良的(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877。

[0035]可以将这些数学算法的计算机执行用于序列比较以确定序列同一性。为本发明目的，优选用GCG程序GAP(版本10.00或更新)以其默认参数或任何相当的程序来比较核苷酸或蛋白质以确定与本发明所公开序列的序列同一性百分数。“相当的程序”意指任何序列比较程序，对于任意两条待查询的序列，它都产生与由优选程序所产生的对应比对相同的核苷酸或氨基酸残基匹配以及相同的百分数序列同一性的比对。

[0036]序列比较程序包括，但不限于：PC/Gene程序(可获自Intelligenetics，Mountain View，California)中的CLUSTAL；Wisconsin Genetics Software Package，第8版(可获自GeneticsComputer Group(GCG)，575 Science Drive，Madison，Wis.，USA)中的ALIGN程序(2.0版)和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、以及TFASTA。可以用这些程序以默认参数完成比对。Higgins等人(1988)Gene 73：237-244(1988)；Higgins等人(1989)CABIOS 5：151-153；Corpet等人(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90；Huang等人(1992)CABIOS 8：155-65；和Pearson等人(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331都详细描述了CLUSTAL程序。ALIGN程序是以上述Myers和Miller(1988)的算法为基础的。当比较氨基酸序列时，可以使用PAM120重量残基表(weight residue table)、缺口长度罚分12、以及缺口罚分4。Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLAST程序是以上述Karlin和Altschul(1990)的算法为基础的。可以用BLASTN程序、分值＝100、字长＝12，来完成BLAST核苷酸搜索，以获得与编码本发明蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。可以用BLASTX程序、分值＝50、字长＝3，来完成BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。为得到比较为目的的缺口比对，可以利用如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389中所描述的Gapped BLAST(在BLAST 2.0中)。或者，可以用PSI-BLAST(在BLAST 2.0中)完成探测分子间远近关系(distant relationships)的重复搜索。参见上述Altschul等人(1997)。当利用BLAST、GappedBLAST、PSI-BLAST的时候，各程序可以使用各自的默认参数(例如，核苷酸序列的BLASTN，蛋白质的BLASTX)。参见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。也可以通过人工检查来完成比对。

[0037](c)如本文所使用，多肽或核酸序列在上下文中的“序列同一性”或“同一性”是指，当在某一特定对比窗两条序列进行最大比对时两条序列中相同的残基。当用序列同一性百分数来指示蛋白质时，可以认识到不一致的残基位置常常由于保守氨基酸取代而不同，此处氨基酸残基被具有相似化学特性(例如，电荷或疏水性)的其它氨基酸残基取代且因此不改变该分子的功能特性。当序列区别在于保守取代时，可以将百分比序列同一性上调以校正取代的保守本质。以这样的保守取代相区别的序列被称作具有“序列相似性”或“相似性”。这一调整手段是本领域熟知的。这典型地涉及将保守取代记为部分而非完全不匹配，从而提高序列同一性百分数。因此，例如，当给相同的氨基酸记分为I且非保守取代记分为零时，对保守取代的记分介于零和一之间。例如，如同程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，Calif.)中所执行的来计算保守取代的记分。

[0038](d)如本文所使用，“序列同一性百分数”意指通过将两条最理想比对的序列在对比窗中做比较而测定的值，其中为进行两条序列间的最理想比对，与查询序列(其不含添加或缺失)相比该多核苷酸序列在对比窗中的部分可能含有添加或缺失。该百分数通过如下来计算：确定在两条序列中都出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数量以得到匹配位置的数量、用匹配位置的数量除对比窗中的位置总数、以及将该结果乘以100以得到序列同一性百分数。

[0039](e)(i)术语多核苷酸序列的“基本同一”意指某一多核苷酸序列含有，用上述比对程序以标准参数与查询序列进行比较时具有至少70％序列同一性、优选至少80％、更优选至少90％、以及最优选至少95％的序列同一性。本领域技术人员认识到，通过考虑密码子简并、氨基酸相似性、阅读框位置等，可以适当的调整这些值以确定由两条核苷酸序列编码的蛋白质的对应同一。为此目的氨基酸序列的基本同一通常意味着至少60％的序列同一性，更优选至少70％、80％、90％，以及最优选至少95％的序列同一性。

[0040]另一种表明核苷酸序列基本相同的指示是两个分子在严紧条件下相互杂交。通常，在所限定的离子强度和pH下对特异序列选择的严紧条件为低于热解链温度(T_m)约5℃。然而，依赖于本文中另外限制的目的严紧程度，严紧条件包括比T_m低约1℃至约20℃范围内的温度。在严紧条件下不相互杂交的核酸如果所编码的多肽基本相同，则仍然是基本相同的。这可能出现在，例如，当一个核酸拷贝是用遗传密码允许的最大密码简并产生的时候。两条核酸序列基本相同的指示是，第一条核酸所编码的多肽与第二条核酸所编码的多肽具有免疫交叉反应性。

[0041](e)(ii)术语肽的“基本相同”是指含有在特异对比窗中与查询序列具有至少70％序列同一性、优选80％、更优选85％、最优选至少90％或95％序列同一性的序列的肽。优选，用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的同源性比对算法来完成最理想的比对。表示两条肽序列基本相同的指示是，一条肽与针对第二条肽的抗体具有免疫反应性。因此，例如，当两条肽区别仅在于保守取代时，某肽与第二条肽基本相同。“基本相似的”肽如上所述共享序列，除了不相同的残基的位置可能由于保守氨基酸改变而不同。

[0042]本文所公开的核苷酸序列可用于鉴定细胞、组织以及动物中的对应序列。以这种方式，可以使用象PCR、杂交、以及类似的这样的方法基于与本文所示序列的序列同源性来鉴定这样的序列。这些技术可以用作确定动物或动物细胞中存在本发明启动子序列的诊断检测方法。

[0043]在PCR方法中，可以设计寡核苷酸引物用于PCR反应以从抽提自任何目的动物的cDNA或基因组DNA扩增对应的DNA序列。设计PCR引物和PCR克隆的方法是本领域公知的，而且公开在Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Plainview，N.Y.)中。还可参见Innis等人，eds.(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications(Academic Press，New York)；Innis和Gelfand，eds.(1 995)PCR Strategies(Academic Press，New York)；以及Innis和Gelfand，eds.(1999)PCR Methods Manual(Academic Press，NewYork)。已知的PCR方法包括，但不限于，使用配对引物、巢式引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配的引物等的方法。

[0044]在杂交技术中，将全部或部分已知的核苷酸序列用作选择性与存在于所选生物的克隆基因组DNA片段或cDNA片段群体(即，基因组或cDNA文库)中的其它对应序列杂交的探针。该杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段、或其它寡核苷酸，且可以用可探测的基团例如32P、或任何其它可探测的标记来标记。因此，例如，可以通过对基于本发明启动子序列的合成寡核苷酸进行标记来制备杂交探针。制备杂交探针、构建cDNA和基因组文库的方法是本领域公知的，并公开于Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，N.Y.)。

[0045]例如，本文公开的完整启动子序列、或其一个或多个部分，可用作能特异性与相应启动子序列杂交的探针。为在各种条件下实现杂交，这样的探针包括在诱导型心脏优选启动子中独特的序列，且优选至少长约10核苷酸、以及最优选至少长约20核苷酸。这样的探针可用于利用PCR从所选动物扩增相应的启动子序列。

[0046]杂交技术包括平皿DNA文库(或噬斑或菌落；参见，例如，Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，N.Y.)的杂交筛选。

[0047]可以在严紧条件下完成这样的序列的杂交。“严紧条件”或“严紧杂交条件”意指这样的条件，在该条件下探针以比对其它序列更高的可探测程度与其靶序列杂交(例如，至少是背景的两倍)。严紧条件是序列依赖性的而且在不同情况中会不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严紧度，可以鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可以调节严紧条件以允许序列中的一些错配从而能够检测低程度相似性(异源探测)。一般，探针长度小于约1000核苷酸，优选小于500核苷酸。

[0048]典型地，严紧条件可以是这样的条件，其中：盐浓度低于约1.5M Na离子，典型地约0.01至1.0M Na离子浓度(或其它盐)，pH 7.0至8.3，且温度对于短探针(例如，10至50个核苷酸)为至少约30℃和对于长探针(例如，大于50个核苷酸)为至少约60℃。添加去稳定剂例如甲酰胺可以实现严紧条件。示例性的低严紧条件包括在30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基磺酸钠)中于37℃杂交，并在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中于50至55℃洗涤。示例性的中度严紧条件包括在40至45％甲酰胺、1.0MNaCl、1％SDS(十二烷基磺酸钠)中于37℃杂交，并在0.5×至1×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中于50至60℃洗涤。示例性的高度严紧条件包括与含有50％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中于37℃杂交，并在0.1×SSC中于60至65℃洗涤。通常杂交持续时间小于约24小时，通常约4至约12小时。

[0049]特异性典型地是杂交后洗涤的函数，关键因子是终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂合体，T_m可以从Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284的方程：T_m＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％形式)-500/L估算出来；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟嘌呤和胞嘧啶的百分数，％形式是杂交溶液甲酰胺的百分数％，以及L是杂合体的碱基对长度。T_m是50％互补靶序列与完全匹配探针杂交的温度(在所限定的离子强度和pH下)。每错配1％T_m降低约1℃；因此，可以调节T_a、杂交和/或洗涤条件以与具有目的同一性的序列杂交。例如，如果要寻找具有约90％同一性的序列，则可以使T_m降低10℃。通常，选择严紧条件为：在限定的离子强度和pH下低于特异序列及其互补物热解链温度(T_m)约5℃。然而，极严紧条件可以使用低于热解链温度(T_m)1、2、3、或4℃下的杂交和/或洗涤；中度严紧条件可以利用低于热解链温度(T_m)6、7、8、9、或10℃下的杂交和/或洗涤；低严紧条件可以利用低于热解链温度(T_m)11、12、13、14、15、或20℃下的杂交和/或洗涤。利用该方程、杂交和洗涤组合物、以及目的T_m，普通技术人员可以理解杂交和/或洗涤溶液严紧度的变化自然得到了描述。如果目的错配程度导致低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的T_m，则优选将SSC浓度提高以能够使用更高的温度。在Tijssen(1993)Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology--Hybridization with NucleicAcid Probes，第一部分，第二章(Elsevier，N.Y.)；和Ausubel等人，eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology，第二章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)中可以找得有关核酸杂交的一般指南。参见Sambrook等人(1989)MolecularCloning：A Laboratory Manual(第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Plainview，N.Y.)。因此，本发明包括，具有启动子活性且在严紧条件下与本文所公开的诱导型心脏优先启动子序列杂交的分离的序列或其片段。这样的序列与所公开的序列至少95％、96％、97％、98％至99％同源或更高。也即，序列的序列同一性可以在至少95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的范围变化。

[0050]可以认识到，任何目的核苷酸序列可以可操作性连接于本发明的启动子并在心脏组织中表达。“心脏组织”意指任何获自心脏的组织，包括但不限于，发育上与心脏相关的组织例如肺心肌层。“心室组织”意指任何获自心脏任一心室任何部分的组织。

[0051]为本发明目的的一般目的核苷酸序列种类包括例如，涉及那些信息的基因，例如锌指，那些涉及通讯的基因，例如激酶，和那些涉及管家的基因，例如热休克蛋白。例如，目的核苷酸序列包括但不限于那些编码丝氨酸-苏氨酸激酶、钾通道基因、一氧化氮合酶、糖蛋白受体、1类HLA、2类HLA、组织蛋白酶B、半胱氨酸氨基肽酶、酸性凝胶酶、类胰蛋白酶内肽酶、类胰凝乳蛋白酶内肽酶、中性凝胶酶、血管紧张素II型受体、心肌肌浆网状组织Ca²+-ATP酶、肌钙蛋白T、肌钙蛋白I、α-原肌球蛋白、TGF-β1、IGF-I、IGF-II、PDGF-B、GSK-3β、原肾素、肾素、肌球蛋白结合蛋白C、离子通道基因、视黄酸受体、α-肌球蛋白重链、β-肌蛋白重链、基本肌球蛋白轻链、肌动蛋白、肌节成分、陪护蛋白、凋亡途径元素、以及包括但不限于间线蛋白的细胞骨架元素。

[0052]由本发明启动子表达的目的核苷酸序列可用于改变心脏表型。心脏组织的各种目的表型包括包括，但不限于，肥大；形态学，例如心室间隔厚度；左心室收缩末期或舒张末期内径；乳头肌大小；左心室流出管阻塞；肌节结构，尤其是导致家族性肥厚型心肌病的变化；肌球蛋白同工型表达的变化，尤其是导致改变心脏病易感性的变化；肌原纤维功能；心脏病易感性；对抗心脏病化合物的反应性；受体表达；心率；心室收缩压，心室舒张压；动脉收缩压；动脉舒张压；收缩性；间隙纤维化；心肌细胞混乱；Ca²⁺敏感性；catecholine敏感性；α-肾上腺素敏感性；β-肾上腺素敏感性；血管紧张素-转换酶抑制剂敏感性；乙胺碘呋酮敏感性；利多卡因敏感性；糖蛋白受体拮抗剂敏感性；合成代谢类固醇敏感性；细胞死亡；细胞类型可塑性；以及类似。

[0053]可以在心脏组中中使异源产物表达或者提高内源产物表达来实现这些结果。或者，还可以通过使心脏组织中一个或多个内源产物，(尤其是酶或辅助因子)的表达降低来实现这些结果。这些变化导致转基因动物表型变化。例如，本发明的启动子序列可用于在心室中优先表达ELC1a(基本轻链1，心房同工型)并改变ELC1同工型的表达模式。在一种实施方式中，本发明的启动子序列可用于表达丝氨酸-苏氨酸激酶例如GSK-3β或GSK-3β的组成型活性形式例如GSK-CA。或者，本发明的启动子序列可用于产生与心脏蛋白质编码序列互补的反义mRNA、抑制蛋白质生产、以及改变异源核苷酸序列的表达。或者，本发明的启动子序列可用于生产小的干扰RNA。

[0054]异源核苷酸序列产物包括结构蛋白、酶、辅助因子、激素、信号蛋白，以及类似。

[0055]如所注释的，与本发明所公开的一种启动子可操作性相连的异源核苷酸序列可以是靶基因的反义序列。因此，用这些启动子可以构建与靶序列信使RNA(mRNA)至少部分互补的反义构建物。构建反义核苷酸以与相应的mRNA杂交。可以对反义序列做修饰，只要该序列与相应的序列杂交并干扰其表达。以这种方式，可以使用与相应的被反义的序列具有70％、优选80％、更优选85％序列同一性的反义构建物。此外，可以使用反义核苷酸的部分来破坏靶基因的表达。通常，可以使用具有至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、或更多个核苷酸的序列。因此，本文所公开的启动子序列可以与反义DNA序列可操作性相连以降低或抑制心脏组织中天然蛋白质的表达。

[0056]“启动子”或“转录起始区”意指一段调控区域，其通常含有TATA盒的能够指导RNA聚合酶II在适当的起始位点起始特定编码序列的RNA合成的DNA调控区。启动子还可含有通常位于TATA盒上游或5′的其他识别序列，称作上游启动子元件，它影响转录起始速率。可以认识到，在已经鉴定了本文所公开的启动子区域的核苷酸序列时，进一步分离和鉴定5′非翻译区中的调控元件是在现有技术范围内的。因此，本文公开的启动子通常进一步定义为含有上游调控元件例如那些负责编码基因的组织或时间性表达的元件、增强子及类似。这样的元件典型地经5′非翻译区与目的编码区相连，5′非翻译区进一步调节基因表达。以相同的方式，可以鉴定、分离能促成在目的组织例如心脏组中发生表达的启动子元件，并将它们与其它核心启动子一起使用以巩固心脏优先的表达。对于其5′非翻译区不会影响细胞特异性的基因，5′非翻译引导序列的替代来源可以与这些启动子元件结合使用。

[0057]本发明的调控序列，当其与异源目的核苷酸序列可操作性相连的并插入载体时，能够使得用该载体稳定转化的动物心脏组织中目的核苷酸序列进行诱导型心脏优先的表达。“心脏优先的(cardiac-preferred)”意指，异源序列的表达在心脏组织中是丰度最高的，尽管在其它组织类型中可能出现一些表达，尤其是在发育上与心脏组织相关的组织中。目的异源核苷酸序列的心脏优先表达比在非心脏组织中目的核苷酸序列的表达高至少1％、5％、优选10％、20％、更优选30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高的水平。“心室优先的(ventricle-preferred)”意指，异源序列的表达在心室组织中是丰度最高的，尽管在其它组织类型中可能出现一些表达。目的异源核苷酸序列的心室优先表达比在非心室组织中目的核苷酸序列的表达高至少1％、5％、优选10％、20％、更优选30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高的水平。在一种实施方式中，可能需要在心室中优先表达天然在心房组织中表达的异源核苷酸序列。异源核苷酸序列从心室优先启动子的表达可能不会影响与其天然启动子可操作相连的该核苷酸序列的心房表达。“心房优先的(atria-preferred)”意指，异源序列的表达在心房组织中是丰度最高的，尽管在其它组织类型中可能出现一些表达。目的异源核苷酸序列的心房优先表达比在非心房组织中目的核苷酸序列的表达高至少1％、5％、优选10％、20％、更优选30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高的水平。

[0058]“异源核苷酸序列”意指天然情况下不具有该启动子序列的序列。尽管该核苷酸序列对于该启动子序列是异源的，但是对于动物宿主来说它可能是同源的、或天然的、或外源的。

[0059]可以认识到，启动子可以与其天然编码序列一起使用以提高或降低表达从而导致转化的动物的心脏组织中的表型改变。

[0060]可以对本发明分离的启动子序列进行修饰以提供异源核苷酸序列一定范围的表达水平。因此，可以使用小于整个启动子的区域且保持驱动诱导型、心脏优先表达的能力。然而，可以认识到，mRNA的表达水平可以被改变并且通常通过启动子序列的部分缺失而降低。一般，可以用分离的启动子序列的至少约20个核苷酸来驱动核苷酸序列的表达。

[0061]可以认识到，为提高转录水平或改变组织特异性，可以将增强子和/或组织-优先元件与本发明的启动子区域结合使用。例如，可以将来自其它心脏优先启动子的定量或组织特异性上游元件与本发明的启动子区域结合使用以提高心脏优先转录。这样的元件其特征已经得到描述，例如，鼠TIMP-4启动子(Rahkonen，等人(2002)Biochim BiophysActa 1577：45-52)，A和B-型促尿钠排肽启动子(Grepin等人(1994)Mol.Cell Biol.14：3115-29)，人心脏肌钙蛋白I启动子(Dellow，等人(2001)Cardiovasc.Res.50：3-6)、小鼠S100A1启动子(Kiewitz，等人(2000)Biochim Biophys Acta 1498：207-19)、鲑鱼心脏肽启动子(Majalahti-Palviainen，et al(2000)Endocrinology 141：731-740)、GATA应答元件(Charron等人(1999)Molecular & CellularBiology 19：4355-4365)以及类似，引入本文作为参考.

[0062]可以通过在其它组织以及心脏组织中驱动表达来改变组织特异性的其它增强子是本领域公知的，其它组织例如骨骼组织、CNS组织、肺组织、唾液腺组织、泪腺组织、以及血管组织等。这些包括，例如，水通道蛋白-5启动子的启动子上游元件(Borok，等人(2000)J.Biol.Chem.275：26507-14，引入本文作为参考)，它们能给出肺和唾液腺优先表达以及心脏优先表达。另一个例子包括来自人α-骨骼肌动蛋白启动子的上游元件，它们能给出骨骼肌中的表达，以及心脏优先表达。

[0063]对本发明分离的启动子序列的修饰可以提供一定范围的异源核苷酸序列的表达。因此，可以将它们修饰成强或弱启动子。通常，“弱启动子”意指以低水平驱动编码序列表达的启动子。“低水平”意指，约1/10,000转录物至约1/100,000转录物至约1/500,000转录物的水平；相反，强启动子以高水平驱动编码序列的表达，或以约1/10转录物至约1/100转录物至约1/1000转录物的水平。

[0064]当本发明所公开的心脏优先启动子的核苷酸序列、及其变体或片段与异源核苷酸序列(要控制其表达以达到所需的表型应答)可操作性相连时，其可用于任何动物的遗传操作。“可操作性相连”意指，异源核苷酸序列的转录受启动子序列的影响。以这种方式，本发明启动子的核苷酸序列可以在表达盒中与要将在目的动物(更特别的是在动物心脏)中表达的异源核苷酸序列一起提供。

[0065]这样的表达盒含有与目的核苷酸序列可操作性相连的、含有本发明启动子核苷酸序列或其变体或片段的转录起始区，其中目的核苷酸序列的表达受本文所公开的心脏优先启动子控制。这样的表达盒中提供了至少了一个供插入要受到调控区转录调控的核苷酸序列的限制性位点。该表达还可以包含选择性标记基因。

[0066]该表达盒在5′-至-3′的转录方向中包括，转录及翻译起始区、以及异源目的核苷酸序列。除了包含转录起始及控制位点外，表达盒还可包含转录终止所必需的序列以及在转录区中含有用于翻译的核糖体结合位点。其它用于表达的调控控制元件包括起始和终止密码子以及多聚腺苷酸化信号。本领域普通技术人员能够知道许多可以用于表达载体的调控序列。例如，在Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)中描述了这样的调控序列。

[0067]含有与异源核苷酸序列可操作性相连的本发明启动子序列的表达盒还可以包含至少一条将被共转化进生物体中的附加的核苷酸序列。或者，该附加的序列可以在另一表达盒上提供。

[0068]本文所描述的多核苷酸序列可以与之可操作性相连的调控序列包括用于指导mRNA转录的启动子。这些包括，但不限于，λ噬菌体的左启动子，大肠杆菌的1ac、TRP和TAC启动子，SV40的早期和晚期启动子，CMV立即早期启动子，腺病毒早期和晚期启动子，以及逆转录病毒长末端重复。

[0069]除了促进转录的控制区，表达载体还包括调控转录的区域，例如阻遏物结合位点和增强子。例子包括SV40增强子，巨细胞病毒立即早期增强子，多瘤病毒增强子，腺病毒增强子以及逆转录病毒LTR增强子。

[0070]适当的时候，可以对异源核苷酸序列——其表达受本发明启动子序列的控制，以及任何附加核苷酸序列进行优化以在转化动物中提高表达。也即，可以用物种优选的密码子合成这些核苷酸序列以促进表达，例如在小鼠中用小鼠优先密码子以促进表达。本领域中可以获得合成物种优选的核苷酸序列的方法。参见，例如，Wada等人(1992)Nucleic Acids Res.20(Suppl.)，2111-2118；Butku8等人(1998)Clin Exp Pharmacol Physiol Suppl.25：S28-33；和Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，引入本文作为参考。

[0071]为增强细胞宿主中基因表达的其它序列修饰是已知的。这些包括剔除假多聚腺苷酸化信号编码序列、外显子-内含子拼接位点信号、转座子样重复、以及其它可能对基因表达有害的已知其特征的序列。可以将异源核苷酸序列的G-C含量调节到给定细胞宿主的平均水平，参照已知在该宿主细胞中表达的基因来计算。可能的话，对序列做修饰以避免可以预计的发夹环二级mRNA结构。

[0072]表达盒还可以在表达盒构建体中包含5′前导序列。这样的前导序列可以起增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的，包括：小核糖核酸病毒前导序列，例如，EMCV前导序列(脑心肌炎5′非编码区)(Elroy-Stein等人(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86：6126-6130)；马铃薯Y病毒组前导序列，例如，TEV前导序列(TobaccoEtch Virus)(Allison等人(1986))；MDMV前导序列(玉米矮缩花叶病毒)(Virology 154：9-20)；和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等人(1991)Nature 353：90-94)。还可以利用其它增强翻译和/或mRNA稳定性的已知方法，例如，内含子等。

[0073]当需要将异源核苷酸序列表达产物指向特定细胞器，尤其是线粒体、核、内质网、或高尔基体，或分泌至细胞表面或细胞外时，表达盒可能进一步含有编码转送肽的序列。这样的转送肽是本领域熟知的，且包括但不限于，酰基载体蛋白的转送肽、RUBISCO小亚基，以及类似。

[0074]在制备表达盒的过程中，可以操作各种DNA片段，以为DNA序列提供正确方向且如果适当的话，提供正确的阅读框。为此目的，可以利用衔接子或接头来连接DNA片段或者可以使用其它的操作以提供便利的限制性位点、除去多余的DNA、除去限制性位点等。为此目的，可以利用：体外诱变；引物修补；限制性；退火；取代，例如，转换和颠换；或其任何组合。

[0075]表达盒中可以包括报告基因或选择性标记基因。例如，Ausubel等人(2002)Current Protocols in Molecular Biology.JohnWiley & Sons，New York，New York，引入本文作为参考，中可以找到本领域已知的适宜报告基因的例子。

[0076]用于选择转化的细胞或组织的选择性标记基因可以包括赋予抗生素抗性的基因。适宜的选择性标记基因的例子包括，但不限于，编码对下列药物抗性的基因：氯霉素(Herrera Estrella等人(1983)EMBO J.2：987-992)；氨甲蝶呤(Herrera Estrella等人(1983)Nature 303：209-213；Meijer等人(1991)Plant Mol.Biol.16：807-820)；潮霉素(Waldron等人(1985)Plant Mol.Biol.5：103-108；Zhijian等人(1995)Plant Science 108：219-227)；链霉素(Jones等人(1987)Mol.Gen.Genet.210：86-91)；壮观霉素(Bretagne-Sagnard等人(1996)Transgenic Res.5：131-137)；博来霉素(Hille等人(1990)Plant Mol.Biol.7：171-176)；磺胺药物(Guerineau等人(1990)Plant Mol.Biol.15：127-136)；嘌呤霉素(Abbate等人(2001)Biotechniques 31：336-40)；胞嘧啶阿拉伯糖苷(Eliopoulos等人(2002)Gene Ther.9：452-462)；6-硫鸟嘌呤(Tucker等人(1997)Nucleic Acid Research 25：3745-46)。

[0077]其它可以在转基因事件回收中起作用但是可能在终产物中不是必需的基因包括但不限于，比如GUS(b-glucoronidase；Jefferson(1987)Plant Mol.Biol.Rep.5：387)；GFP(绿色荧光蛋白；Wang等人(2001)Anim Biotechnol 12：101-110；Chalfie等人(1994)Science 263：802)，BFP(蓝色荧光蛋白；Yang等人(1998)J.Biol.Chem.273：8212-6)，CAT；和荧光素酶(Riggs等人(1987)NucleicAcid Res.15(19)：8115；Luchrsen等人(1992)Methods EnzyMol.216：397-414)这样的例子。

[0078]在表达载体中有用的任何调控或其它序列可以形成部分转基因序列。这包括基因内的序列和多聚腺苷酸化信号，如果还未包括在内的话。在一种实施方式中，动物细胞可以是可用于产生转基因动物的已受精卵母细胞或胚胎干细胞，该转基因动物含有至少一个稳定转化的含有目的核苷酸序列的表达盒。或者，宿主细胞可以是干细胞、或其它产生特异细胞亚组和可用于在动物中产生转基因组织的早期组织前体。亦参见Thomas等人，(1987)Cell 51：503，对同源重组载体的描述。载体被导入胚胎干细胞(例如，通过电穿孔)，并选择其中所导入的基因与基因组间发生了重组的细胞(参见例如，Li，E.等人(1992)Cell69：915)。之后将所选择的细胞注射进动物的胚泡(例如，小鼠)以形成凝集嵌合体(参见例如，Bradley，A.，Teratocarcinomas andEmbryonic Stem Cells：A Practical Approach，E.J.Robertson，ed.(IRL，Oxford，1987)第113-152页)。之后可以将嵌合胚泡植入适宜的假孕雌性代孕动物，并育至足月。生殖细胞中带有重组DNA的后代可用于繁育动物，通过生殖细胞传递转基因，这些繁育出的动物在其所有细胞中都含有重组DNA。构建同源重组载体和同源重组动物的方法进一步描述于Bradley，A.(1991)Current Opinion in Biotechnology2：823-829和PCT国际公开号WO 90/11354；WO 91/01140；和WO93/04169，引入本文作为参考。

[0079]可用遗传改造的宿主细胞来产生非人转基因动物。转基因动物优选为哺乳动物，例如小鼠，其一或多个动物细胞包括转基因。转基因是整合进细胞基因组中的外源DNA，从该细胞可以发育出转基因动物，并且在转基因动物的一或多种细胞类型或组织中该转基因保持在成熟动物的基因组中。本发明的转基因动物可用于研究心脏成分的功能以及鉴定和评估心脏表型的调节剂。

[0080]经胚操作或微注射产生转基因动物的方法，尤其象小鼠这样的动物，已经是本领域中常规，并且描述于，例如，美国专利号4,736,866；4,870,009；4,873,191；和Hogan，B.，Manipulating theMouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，1986)，引入本文作为参考。

[0081]用类似的方法产生其它转基因动物。可以通过将核酸导入受精卵母细胞的雄性原核，例如，通过微注射、逆转录病毒感染，并允许卵母细胞在假孕雌性代孕动物中发育来产生转基因动物。可以根据其基因组中转基因的存在和/或该动物组织或细胞中转基因mRNA的表达来鉴定转基因起始(founder)动物。转基因起始动物可用于繁育带有转基因的其它动物。此外，带有转基因的转基因动物可进一步繁育成带有其它转基因的其它转基因动物。转基因动物还包括其中已经利用本文所描述的同源重组宿主细胞产生了完整动物或该动物的组织的动物。

[0082]本文所描述的非人转基因动物克隆还可根据Wilmut等人(1997)Nature 385：810-813和PCT国际公开文本WO 97/07668和WO97/07669中所描述的方法产生。简言之，可以从转基因动物中分离细胞，例如，体细胞，并诱导其脱离生长周期并进入G₀期。之后可以通过，例如使用电脉冲，将静止细胞与去核卵母细胞融合，该去核卵母细胞来自与分离该静止细胞的相同物种动物。之后培养该重新构建的卵母细胞以使其发育成桑椹胚或胚泡，且之后转移到假孕雌性代孕动物。该雌性代孕动物产下的后代将是从中分离出细胞(例如体细胞)的动物的克隆。

[0083]转基因动物的其它例子包括非人灵长类、绵羊、狗、猪、奶牛、山羊、兔和大鼠。Marian等人(1999)J.Clin.Invest.104：1683-1692和James等人(2000)Circulation 101：1715-1721，引入本文作为参考，其中描述了提供转基因兔的方法。

[0084]在一种实施方式中，本发明提供改变目的核苷酸序列在动物中的表达的方法，特别是改变目的核苷酸序列的心脏优先表达。在该方法中，目的核苷酸序列与诱导型心脏优先启动子，例如示于SEQ IDNO：1的核苷酸序列，可操作性相连。将含有与目的核苷酸序列可操作性相连的表达盒用于转化动物。动物转化方法是本领域已知的，本文其它地方做了回顾。利用本领域技术人员已知的方法鉴定转基因动物，包括但不限于，DNA印迹、PCR、和杂交方法。可以用本领域技术人员已知的方法来鉴定具有目的诱导型心脏优先表达模式的单个转基因动物，包括但不限于，RNA斑点印迹、RNA印迹、RT-PCR、蛋白质印迹、和Taqman分析。将具有目的表达模式的单个转基因动物与含有激活物转基因构建体(例如但不限于本文别处所描述的αMHC-tTA构建体)的转基因动物杂交。该方法产生稳定转化的转基因动物，其表现改变了的目的核苷酸序列表达。

[0085]“改变的心脏优先表达”意指，本发明转基因动物的转基因细胞或心脏组织中的异源核苷酸序列表达与非心脏组织或非转基因动物的心脏组织中的表达水平相差至少1％、5％、优选10％、20％、更优选30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或更高。该差异可以是表达水平的提高或降低。

[0086]确定表达水平的方法是本领域已知的，且包括但不限于，定性蛋白质印迹分析、免疫沉淀法、放射分析。多肽纯化、分光光度法、丙烯酰胺凝胶的考马斯染色、ELISA、RT-PCR、2-D凝胶电泳、微阵列分析、原位杂交、化学发光、银染、酶促分析、丽春红S染色、多重RT-PCR、免疫组织化学分析、放射免疫分析、比色分析、免疫放射测定分析、正电子放射X线断层摄影术、RNA印迹、荧光测定分析和SAGE。参见，例如，Ausubel等人，eds.(2002)Current Protocols in MolecularBiology，Wiley-Interscience，New York，New York；Coligan等人(2002)Current Protocols in Protein Science，Wiley-Interscience，New York，New York；和Sun等人(2001)Gene Ther.8：1572-1579，引入本文作为参考。本文别处描述了GSK-3β和ELC1同工型表达的分析。

[0087]GSK-3β是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，其影响细胞过程，包括但不限于，发育、分化、和增殖。当第9个丝氨酸被去磷酸化时，GSK-3β的激酶活性是组成型活性。如本文别处所述，编码组成型活性形式GSK-3β的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)、GSK-CA(SEQ ID NO：8)与本发明启动子可操作性相连。

[0088]“激酶活性”意指使底物磷酸化，底物例如但不限于，氨基酸、多肽、或蛋白质。可以认识到，本发明不依赖于特定的磷酸化机制。本发明小鼠的GSK-3β激酶活性提高底物磷酸化，而不管该磷酸化是如何被提高或实现的。

[0089]检测激酶活性的方法是本领域已知的，包括但不限于，抗体与磷酸氨基酸例如磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸的免疫沉淀；荧光偏振；采用放射性同位素的滤膜结合试验，闪烁亲近测定法，利用耦联抗体的96孔检测；时间分辨荧光测定法，薄层层析；免疫沉淀和免疫复合物检测；非三氯乙酸磷酸氨基酸测定；蛋白质激酶检测；SAPK/Jun激酶活性检测；和酪氨酸激酶活性检测。参见美国专利申请20030036106；美国专利第5447860；Walker，John，ed.(2002)Protein Protocols onCD-ROMv.2；和Ausubel等人，eds.(1995)Current Protocols in MolecularBiology，(Greene Publishing和Wiley-Interscience，New York)；引入本文作为参考。

[0090]如本文别处所述，编码ELC1a(SEQ ID NO：6)核苷酸序列(SEQ ID NO：5)与本发明的启动子可操作性相连。ELC1a是基本肌球蛋白轻链1的心房同工型，一种丰富的收缩性多肽。不同的ELC1同工型影响心肌收缩。基本肌浆球蛋白轻链例如ELC1a与肌球蛋白重链的颈部区域结合。ELC1a能够与心脏肌浆球蛋白重链结合。ELC1a被认为与肌动蛋白相互作用并可能影响肌球蛋白-肌动蛋白跨桥循环(cross-bridge cycling)。此外，ELC1a可能调节心脏的收缩和舒张功能。参见Sanbe等人(2001)J.Biolohical Chemistry 276：32682-32686，引入本文作为参考。

[0091]分析ELC1a与心脏肌球蛋白重链结合的方法是本领域已知的，且包括但不限于，X-射线结晶、NMR、超离心、免疫沉淀、共免疫沉淀、交联、酵母双杂交检测、以及亲和层析。参见例如Walker，John，ed.(2002)Protein Protocols on CD-ROM v.2；和Ausubel等人，eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology，(GreenePublishing和Wiley-Interscience，New York)；引入本文作为参考。

[0092]表现出目的核苷酸序列的改变的心脏优先表达的转基因动物，可用于实施鉴定影响心脏功能的化合物的检测方法。异源核苷酸序列的改变的心脏优先表达可能导致改变的对心脏病的易感性。

[0093]“心脏病”是涉及心脏或心脏组织的任何失调或状况。涉及心脏的失调包括但不限于，心力衰竭，包括但不限于，心脏肥大、左侧心力衰竭、和右侧心力衰竭；缺血心脏疾病，包括但不限于心绞痛、心肌梗死、慢性缺血心脏疾病、和意外心死亡；高血压心脏病，包括但不限于，系统性(左侧)高血压心脏病和肺(右侧)高血压心脏病；心脏瓣膜心脏病，包括但不限于，由钙化导致的瓣膜退化，比如钙化大动脉狭窄，先天性二尖大动脉瓣钙化(calcification of a congenitallybicuspid aortic valve)、和二尖瓣环状钙化，和二尖瓣阀的粘液瘤退化(二尖瓣阀脱垂)、风湿热和风湿性心脏病，传染性心内膜炎，和非传染性赘生物，比如非细菌性血栓形成心内膜炎和系统性红斑狼疮心内膜炎(Libman-Sacks病)，类癌心脏病，和人造阀并发症；心肌病，包括但不限于扩张性心肌病；肥大性心肌病，限制性心肌病，和心肌炎；心包病，包括但不限于，心包渗出和心包积血和心包炎，包括急性心包炎和治愈的心包炎，和风湿性心脏病；Brock’s病，瘤形成的心脏病，包括但不限于，初级心脏肿瘤，比如粘液瘤，脂肪瘤，乳头纤维组织瘤，横纹肌瘤，和肉瘤，和非心脏瘤的心脏效应，先天性心脏病，包括但不限于，左至右支路-末期发绀，比如心房隔膜缺陷，心室隔膜缺陷，开放式的(patent)动脉导管，和房室隔膜缺陷，左至右支路-早期发绀，比如四联症，大动脉转位，干动脉病，三尖瓣闭锁，和总不规则肺静脉连接，障碍性先天性畸形，比如大动脉缩窄，肺狭窄和闭锁，和动脉窄缩和闭锁；涉及心脏移植的失调；心肌顿抑；动脉高血压；围产期心肌病；醇心肌病；室上心动过速，心动过缓；心房扑动；胎儿水肿；期外收缩性心律不齐；胎儿心脏心律不齐；心内膜炎；心房纤维性颤动；原发性扩张性心肌病；Chagas′心脏病；长QT综合征；和Brugada综合征。

[0094]“心肌病”是涉及心肌组织的任何失调或状况。涉及心肌组织的失调包括，但不限于，心肌病，包括但不限于扩张性心肌病，肥大性心肌病，限制性心肌病，心肌顿抑，和心肌炎；风湿性热；横纹肌瘤；肉瘤；先天性心脏病，包括但不限于，左至右支路-末期发绀，比如心房隔膜缺陷，心室隔膜缺陷，开放式动脉导管，和房室隔膜缺陷，左至右支路-早期发绀，比如四联症，大动脉转位，干动脉病，三尖瓣闭锁，和总不规则肺静脉连接，障碍性先天性畸形，比如大动脉缩窄，肺狭窄和闭锁，和动脉窄缩和闭锁；涉及心脏移植的失调；动脉高血压；围产期心肌病；醇心肌病；室上心动过速，心动过缓；心房扑动；胎儿水肿；期外收缩性心律不齐；胎儿心脏心律不齐；心内膜炎；心房纤维性颤动；原发性扩张性心肌病；Chagas′心脏病；长QT综合征；和Brugada综合征。

[0095]“改变的易感性”意指本发明的转基因动物表现心脏病表型而不同于非转基因动物。心脏病表型可能出现在发育的任何阶段包括但不限于，胚胎期、分娩后、成年、以及当动物接近生命末期时。在一种实施方式中，心脏病表型可以被外界刺激诱导，例如，但不限于，食谱、运动、化学治疗、或外科手术。

[0096]心脏病表型包括，但不限于，肥大；形态学，例如心室间间隔增厚；左心室收缩末期dP/dt_max或舒张末期内径(r)；乳头肌大小；左心室流出管阻塞；中心室肥大；尖端肥大；不对称肥大；肌节结构；肌原纤维功能；受体表达；心率；心室收缩压，心室舒张压；动脉收缩压；动脉舒张压；收缩性；间隙纤维化；心肌细胞混乱；Ca²⁺敏感性；catecholine敏感性；α-肾上腺素敏感性；β-肾上腺素敏感性；多巴酚丁胺敏感性；甲状腺素敏感性；血管紧张素-转换酶抑制剂敏感性；乙胺碘呋酮敏感性；利多卡因敏感性；糖蛋白受体拮抗剂敏感性；合成代谢类固醇敏感性；肉毒碱转送紊乱；降低的左心室射血分数；左心室扩张；左心房扩张；利尿剂敏感性；volemia；缺血；白细胞流特性；多形核白细胞(PMN)膜流动性；PMN细胞溶质Ca²⁺含量；高心室间间隔缺陷，玫瑰花结抑制效应；收缩力传递；心肌纤维混乱，增强的腔硬度，受损舒张，小血管疾病，呼吸困难，咽峡炎，昏厥前期，心动过速，和昏厥，以及类似。参见，例如，Braunwald等人(2002)Circulation 106：1312-1316和Wigle等人(1995)Circulation 92：1680-1692，将其全文引入本文作为参考。

[0097]测定心脏病表型的方法是本领域已知的，包括但不限于，超声波心动描记术、经食管超声波心动描记术、运动测试、尿/儿茶酚胺分析、EIAs、光显微术、心脏导管插入术、动力学心电描记术、MRI、多重RT-PCR、正电子放射X线断层摄影术、血管造影术、磁共振旋转回声、短轴MRI扫描、Doppler速度记录、Doppler色流成像、应激铊研究、心脏超声波、胸X-光、氧耗测试、电生理研究、听诊、扫描EM、重力分析、H&E染色、剥皮纤维分析、透射电子显微术、免疫荧光分析、三色染色法、2-D超声波心动描记术、心力娩力描记术、基线M-型超声心动图，和心肌乳酸盐生产检测。参见，例如，Braunwald等人(2002)Circulation 106：1312-1316；Sohal等人(2001)Circulation Res.89：20-25；Nagueh等人(2000)Circulation 102：1346-1350；Sanbe等人(2001)J.Biol.Chem.276：32682-32686；Sanbe等人(1999)J.Biol.Chem.274：21085-21094，和Wigle等人(1995)Circulation92：1680-1692，将其全文引入本文作为参考。

[0098]在一种实施方式中，本发明的转基因动物可以用于鉴定抗-心脏病的化合物。“抗心脏病”化合物调节心脏病表型。调节可以是心脏病表型的提高或降低。与未处理或安慰剂处理的效果相比，抗心脏病化合物可以调节心脏病表型的至少1％、5％、优选10％、20％、更优选30％、40％、50％、60％、仍更优选70％、80％、90％、或100％。本文别处描述了检测心脏病表型的方法。本领域已知的任何一种检测心脏病的方法都可用于监控目的化合物对本发明转基因动物的效应。

[0099]为了鉴定抗-心脏病化合物，提供了本发明的多重转基因动物，例如至少第一和第二转基因动物。术语“第一”、“试验的”或“测试”转基因动物指被施用了目的化合物的转基因动物。术语“第二”或“对照”转基因动物指被施用了安慰剂的转基因动物。在一种实施方式中，第一和第二转基因动物是无性系的、年龄相配的、性别相配的，并接受类似的环境条件。在一种实施方式中，多于一只的动物可以是第一转基因动物。在一种实施方式中，多于一只的动物可以是第二转基因动物。

[0100]施用目的化合物或安慰剂后，将第一和第二转基因动物培养一段时间。该时间段具有预先确定的适于心脏病表型分析的持续时间。这样的持续时间包括但不限于，30秒；1、5、10、30、或60分钟；8、12、24、36、或48小时；3、4、5、6、或7天；2、3、或4周；2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12月；高至3年。对心脏病表型的监控可以持续进行；以单次间隔；或以多次间隔，例如，但不限于，每小时、每天、每周、或每月。本领域已知的任何一种检测心脏病的方法都可用于监控目的化合物对本发明转基因动物的效应。

[0101]术语“施用”以最广泛的含义使用，且包括将化合物导入本发明转基因动物的任何方法。这包括如通过已被外源导入主体中的多核苷酸的体内转录和翻译而在体内生产多肽或多核苷酸。因此，在主体中从外源组合物产生的多肽或核酸包括在术语“施用”中。

[0102]“化合物”包括，但不限于，核酸分子、肽、肽模拟物、脂质、抗体、受体抑制剂、配体、固醇、类固醇、激素、激酶、激酶抑制剂、激动剂、拮抗剂、离子通道调节剂、利尿剂、酶、酶抑制剂、碳水化合物、脱氨酶、脱氨酶抑制剂、G-蛋白、G-蛋白受体抑制剂、ACE抑制剂、激素受体调节剂、醇类、逆转录酶抑制剂、神经递质抑制剂、血管紧张素转换酶抑制剂、洋地黄、神经递质受体抑制剂、负收缩性剂、β-阻断剂、Ca²⁺拮抗剂、丙吡胺、抗-心率不齐试剂、激素、氟卡胺、和血管扩张药。化合物还可含有药学可接受载体。

[0103]如本文所使用，用语“药学可接受载体”意指，包括与药学给药相容的任何及全部溶剂、分散介质、包被物、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。这样的介质和物质对药学活性物质的用途是本领域熟知的。除了与活性化合物不相容的任何常规介质或物质之外，这样的介质都可用在本发明的组合物中。该组合物中还可以加入补充的活性化合物。本发明的药物组合物根据其目的给药途径进行配制。给药途径的例子包括非肠道途径，例如，静脉内、皮内、皮下，口服(例如，吸入)，经皮(局部)，经粘膜，以及直肠给药。用于非肠道途径、皮内、或皮下应用的溶液或悬液可包括以下成分：无菌稀释剂例如注射用水、盐溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂例如苄醇或对羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸；缓冲液例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和渗透压调节剂例如氯化钠或葡萄糖。pH可以用酸或碱来调节，例如盐酸或氢氧化钠。非肠道制剂可以包装在用玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多剂量瓶中。

[0104]适宜注射使用的药物组合物包括无菌液体溶液(水可溶的)或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内给药，适宜的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物都必需是无菌的并且应当处于易于注射的流体。它在生产和保存条件下必需是稳定的而且必需在保持其不受微生物例如细菌和真菌的污染。载体可以是溶剂或分散介质，包括，例如，水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇和液态聚乙二醇等)，及其适宜的混合物。例如，通过使用象卵磷脂这样的包被、对于分散体通过保持其所需颗粒大小、以及通过使用表面活性剂，可以保持恰当的流动性。可以用各种抗细菌和抗真菌剂来预防微生物的作用，例如，对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况中，优选在组合物中包括等渗剂，例如，糖类，多元醇例如甘露醇、山梨醇，和氯化钠。通过在组合物中加入延迟吸收的物质，例如一硬脂酸铝和明胶，可以延长可注射组合物的吸收。

[0105]可以通过将所需量的活性化合物(例如，羧肽酶蛋白或抗-羧肽酶抗体)与一种上述列举的成分或其组合加入适宜溶剂中，按需要，之后再过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，可以通过将活性化合物加入含有基本分散介质以及上述列举的其它所需成分的无菌载体中来制备分散体。对于用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这些方法从事先无菌过滤的溶液产生活性成分及任何所需的附加成分的粉末。

[0106]口服组合物通常包括惰性稀释剂和可食用载体。可以把它们包在明胶胶囊中或压成片剂。对于口服给药，通过已知方法可以将药剂包含在肠形式中以经过胃部或者进一步包被或混合以在胃肠道的特定区域中释放。对于口服治疗性给药，可以将活性化合物与赋形剂结合并以片剂、锭剂、或胶囊的形式使用。还可以用液体载体制备用作漱口液的口服组合物，其中液体载体中的化合物经口腔和漱洗以及吐出或吞入而使用。药学相容性结合试剂，和/或佐剂物质可以作为该组合物的一部分。片剂、丸剂、锭剂等可以包含以下任何成分、或性质类似的化合物：结合剂例如微晶纤维素、树胶黄芪胶或明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖，崩解剂例如海藻酸、Primogel、或玉米淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂例如胶状二氧化硅；甜味剂例如蔗糖或糖精；或调味剂例如薄荷油、甲基水杨酸盐、或橙味调味剂。

[0107]对于吸入给药，该化合物可以从含有适宜的推进剂的受压容器或分配器或喷雾器以气溶胶的形式运送，推进剂例如一种气体，如二氧化碳。

[0108]系统性给药还可以是经粘膜或透皮方式的。对于经粘膜或经皮给药，配方中使用适合于将要渗入的屏障的渗透剂。这样的渗透剂是本领域公知的，且例如对于经粘膜给药包括洗涤剂、胆汁盐、和褐霉酸衍生物。经粘膜给药可以通过使用鼻喷剂或栓剂来完成。对于经皮给药，如本领域公知地将活性化合物配制成药膏、油膏、凝胶、或霜。

[0109]该化合物还可以被制成栓剂的形式(例如，用常规的栓剂基本成分例如可可脂和其它甘油酯)或直肠运送的滞留灌肠剂。

[0110]在一种实施方式中，将活性化合物与载体制备成例如受控制释放的剂型，包括植入和微囊化的运送系统，该载体可以保护化合物不会从机体中快速清除。可以使用生物可降解的、生物相容性的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙二酸、胶原、聚正酯、和聚乳酸。制备这样的制剂的方法是对于本领域技术人员来说是显而易见的。原料还可从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.购得。脂质体悬液(包括用针对病毒抗原的单克隆抗体而靶向受感染细胞的脂质体)也可用作药学可接受载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备，例如，如美国专利第4,522,811中所述。

[0111]为便于给药以及剂量一致性，特别有利的是以剂量单位的形式配制口服或非肠道组合物。如本文所使用的“剂量单位形式”是指物理不连续的单位，适于以整体剂量给有需要的个体应用；各单位含有预定量的活性化合物，该量以与所需的药物载体一起产生目的治疗效果来计算。本发明剂量单位形式根据并直接依赖于该活性化合物的独特特性和欲达到的特定治疗效应、以及在化合物领域中这样的活性化合物对于个体治疗的固有限制来确定。

[0112]通过本发明的方法鉴定的抗心脏病化合物可用于人类个体的治疗。

[0113]以下提供实施例作为举例说明而不作为限制。

实施例

实施例1本发明的诱导型心脏优先启动子的产生

[0114]Transgenic Research(1995)4：397-405，引入本文作为参考，其中所描述的改良的α启动子用作制备本发明最小启动子的起点。所有的内切核酸酶来自Roche BioPharmeceuticals，Indianapolis，IN.。根据标准程序完成限制性酶反应。从改良的α启动子切出了两个片段。

[0115]利用PCR对～700bp的Sma1-Sph1片段做了改动。用TTGA序列替换了起始于约2456位的TATC序列。对约1.7kb的Sph1-Nde1片段做了改动。用序列TGCATGCCCTGA(SEQ ID NO：2)替换了序列TATCTGCCCATC(SEQ ID NO：3)。SEQ ID NO：3的插入引入了一个附加的Sph1限制酶位点，并改变了位置4106附近的2个GATA位点。将包括重复七次的SEQ ID NO：4的约300碱基对的片段在位置4282附近插入Sph1-Nde1片段。这七个重复结合位点的插入始于位置4282。该重复由序列TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG(SEQ IDNO：4)构成。

[0116]在将较小的片段插回到全长启动子中之前，先将它们连接在一起。首先，用Sph1和Nde1切割Sma1-Sph1片段，并将510bp的Nde1-Sph1片段与载体连接。所得到的克隆用Sph1打开，并加入由Sph1消化被修饰过的Sph1-Nde1片段而得到的约1460bp Sph1片段。用PCR核查方向。接下来用Sma1和Nde1消化该克隆。用Sma1-Nde1片段替换原始α启动子中的野生型序列。通过Nde完全消化和Sma部分消化除去野生型序列。对完整的MHCmin^Tet0诱导型心脏优先启动子序列测序以验证改变的碱基，并列在SEQ ID NO：1中。

实施例2 ELC1a表达盒的产生

[0117]用限制酶Sal I消化包含MHCmin^teto-诱导型启动子区域(SEQID NO：1)的质粒，并将其线性化。从琼脂糖中纯化了一个9142碱基对的片段。用Sal I消化小鼠ELC1a cDNA(Fewell，等人(1998)J ClinInvest。101：2630-2639，此处将其全文引作参考)，并从琼脂糖中纯化编码ELC1a基因的627个碱基对的cDNA片段(SEQ ID NO：5)。用快速连接试剂盒(Roche，Indianapolis，IN)将ELC1a片段连接进MHCmin^teto诱导型启动子区域。用Not I对包含与MHCmin^teto诱导型启动子连接的ELC1a的质粒进行了消化。从琼脂糖中纯化最终的9769碱基对片段，并用于注射。

实施例3 GSK-3β CA表达盒的产生

[0118]以分离自Fvb/N小鼠心室的聚A+RNA作模板反转录(RT)-PCR合成了全长鼠糖原合酶激酶3β(GSK-3β)cDNA(GenbankBC00693)。制备了末端带有Sal I位点的GSK3β cDNA 3’和5’非翻译区的引物。5’引物为GTCGACAAGAAGAG CCATCATGTCGGGGCGAC(SEQ IDNO：9)，且3’末端为GTCGACTGTTCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGGTGGAGTTGGAAGCTGATGCAG(SEQ ID NO：10)。3’末端引物含有血凝素表位标签序列以将该标签序列导入GSK-3β cDNA。为制备GSK-3β的组成型活性形式，利用PCR(TCC GCG)将氨基酸编码区域第9位的丝氨酸突变成了丙氨酸。将突变的GSK-3β(S9A)连接进质粒载体并测序。用Sal I消化含有GSK3-β S9A(GSK-3β CA；SEQ ID NO：7)的质粒。纯化GSK-3β CA的1318碱基对片段，并将其连接进经Sal I消化、并纯化自琼脂糖的MHCmin^teto-诱导型启动子表达盒的片段。从琼脂糖中纯化了最终的10460碱基对片段，并用于注射。

实施例4转基因小鼠的产生

[0119]用NotI将本文上述的表达盒从载体序列中消化出来，并从琼脂糖中纯化。如Hogan，等人1986 Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY，Cold Spring HarborLaboratory pp89-197(此处将其全文引作参考)所述制备表达盒用于微注射。将衍生自过度排卵的FVB/N雌性的单细胞胚用于微注射。将经过微注射的存活胚植入假孕的CBA/B6代孕母体。建立的小鼠经聚合酶链式反应鉴定，并用获自尾夹的DNA经基因组DNA印迹进行验证。将所建立的小鼠与非转基因的同窝小鼠交配产生稳定的转基因系。用PCR筛选随后的子代。筛选具有诱导型表达方式的稳定的转基因系(附图1，A版，本文中别处所描述)。筛选来自转基因小鼠的多个组织的表达(附图1，B版)。

[0120]将表现目的表达方式的稳定转基因与在Sal I限制酶位点带有与鼠α-MHC启动子操作性连接的原始的四环素控制的转录激活物构建体的转基因系交配(Gossen，等人(1994)Curr.Opin.Biotechnol.5：516-520，此处将其全文引作参考)。

[0121]繁育在MHCmin^Tet0-ELC1a位点出现纯合的双重转基因系。

实施例5 ELC1a表达的检测

[0122]用几种方法检测了从本发明启动子产生的ELC1a表达。用CO₂窒息使来自非转基因系和三个转基因系的小鼠安乐死。这三个转基因系含有MHCmin^Tet0-ELC1a表达盒。从非转基因小鼠系新鲜分离心房和左心室组织。从三个转基因小鼠系新鲜分离左和右心室组织。

[0123]用RNA斑点印迹分析ELC1a表达。将组织样品在Tri-Reagent(Molecular Research Center，Cincinnati Oh)中匀浆。根据制造商的说明提取总RNA。将来自各组织的5μg RNA印迹到硝化纤维上，并与ELC1a特异性寡核苷酸探针杂交。用GAPDH(甘油醛3-磷酸脱氢酶)表达将数据标准化。在Phosphorimager(MolecularDynamics)上收集杂交信号。获得的结果示于附图1A。

[0124]还用蛋白质印迹分析对ELC1a表达进行了分析。根据本领域技术人员已知的方法分离肌纤维蛋白质(Sanbe等人(1999)。J.Biol.Chem.274：21085-21094和McAuliffe等人(1990)Circ.Res.66：1204-1216，此处将其全文引作参考)。将蛋白质样品上载到SDS-聚丙烯酰胺凝胶上并在120伏特下电泳约3小时。4℃过夜将蛋白质从SDS-PA凝集转移到PVDF膜(Amersham Life Sciences，Buckinghamshire，England)上。用针对ELC1a的兔多克隆抗血清(Genemed Biotech，California)探测该膜。获得的结果示于附图1B。

[0125]还用蛋白质印迹分析了许多组织中的ELC1a表达。从非转基因小鼠中新鲜分离了心房组织。从带有ELC1a表达盒的转基因小鼠切下了左心室、右心室、心房、横隔膜、比目鱼肌、二头肌、胫骨肌、咬肌、舌、胃、小肠、主动脉、肺、肝、和脾组织。如前所述完成了蛋白质印迹。获得的结果示于附图1C。

实施例6强力霉素对ELC1a表达的效应

[0126]根据常规实验动物操作手册喂养非转基因小鼠和来自各种转基因系的小鼠。转基因系是tTA激活物单转基因系、MHCmin^Tet0-ELC1a单转基因系、双tTA激活物/MHCmin^Tet0-ELC1a应答器系，及双tTA激活物/MHCmin^Tet0-ELC1a纯合应答器系。收获前的三周，向杂合及纯合MHCmin^Tet0-ELC1a双转基因小鼠的食谱中补加625mg强力霉素/kg饲料。心房和左心室蛋白质获自一只非转基因小鼠。肌纤维蛋白质获自两个单转基因系，MHCmin^Tet0-ELC1a杂合及纯化双转基因系，以及经强力霉素饲喂的MHCmin^Tet0-ELC1a杂合及纯化单转基因系。将蛋白质上载至SDS/聚丙烯酰胺凝胶。如上进行凝胶电泳。凝胶用考马斯染料染色。根据用NIH Image软件在MacIntosh G4计算机上作的电泳分析和定量来测定被转基因ELC1-a替换的ELC1-v的百分数。附图2，A版中给出了从一个这样的试验获得的结果。

实施例7强力霉素水平对ELC1a表达的影响

[0127]根据常规试验动物操作实践喂养来自tTA激活物单转基因系、MHCmin^Tet0-ELC1a单转基因系、和MHCmin^Tet0-ELC1a杂合和纯合双转基因系的小鼠。从收获前三周开始，向杂合MHCmin^Tet0-ELC1a双转基因小鼠的食谱中补加0、100、200、或625mg强力霉素/kg饲料。

[0128]心房和左心室蛋白质获自一只非转基因小鼠。肌纤维蛋白获自两种单个转基因系，MHCmin^Tet0-ELC1a杂合和纯合双转基因系、和经强力霉素饲喂的MHCmin^Tet0-ELC1a杂合和纯合双转基因系。将蛋白质上载至SDS/聚丙烯酰胺凝胶。如上进行凝胶电泳。凝胶用用考马斯染料染色。根据用NIH Image软件在MacIntosh G4计算机上作的电泳分析和定量来测定被转基因ELC1-a替换的ELC1-v的百分数。附图2，B版中给出了从一个这样的试验获得的结果。

实施例8转基因小鼠左心室中的GSK-CA表达的检测

[0129]如实施例3中所述，用标准分子生物学技术将编码丝氨酸/苏氨酸激酶GSK-3β组成型活性形式的核苷酸序列克隆进含有本发明的MHCmin^Tet0启动子的表达盒。如实施例4中所述，将MHCmin^Tet0-GSK-CA表达盒用于产生转基因小鼠。如本文别处所述(参见实施例4)，将MHCmin^Tet0-GSK-CA单转基因小鼠与tTA激活子单转基因小鼠交配以产生双转基因小鼠。

[0130]雄性、年龄相配的非转基因小鼠与六只双转基因小鼠用不含或含强力霉素的食谱喂养六周。第六周时，从三只双转基因小鼠的食谱中撤除强力霉素。第七周时，如本文别处所述，从这八只动物收集肌纤维蛋白。如本文别处所述将蛋白质上载至SDS/聚丙烯酰胺凝胶上并电泳。4℃过夜将蛋白质转移到PVDF膜上。用或者抗-GSK-3β(BDTransduction Laboratory，NJ)或抗-HA抗血清(Santa CruzBiotechnology，CA)探测膜。附图3，D版中给出了从一个这样的试验获得的结果。

实施例9评估鼠肥大反应

[0131]建立了两群年龄相配、雄性非转基因小鼠。对第一组小鼠做主动脉缩窄(TAC)处理，而对第二群做假操作。TAC和假TAC处理是本领域技术人员已知的(Dorn等人(1994)Am.J.Physiol.267：H400-5，此处将其全文引作参考)。处理后1、2、3、4、5、6、和7周时，对TAC群体和假群体做分析。

[0132]测定各小鼠在某时间点的总体重。小鼠经CO₂安乐死，并切出左心室。测定左心室重量。测定各时间点左心室重量与总体重的比率。附图3，B版中给出了从一个这样的试验获得的结果。

实施例10测定GSK-CA对肥大反应的影响

[0133]建立九群4-6只雄性、12周龄小鼠。对非转基因小鼠、tTA激活物单转基因小鼠、MHCmin^Tet0-GSK-CA单转基因小鼠、和tTA激活物/MHCminTet0-GSK-CA双转基因小鼠做假TAC处理。对来自非转基因和双转基因群的小鼠做TAC处理。处理后两周，终止试验。终止后，测定左心室/总体重比率。

[0134]对一个非转基因群和两个双转基因小鼠群实施了一个不同的方案(方案2)。在做TAC处理前，向双转基因小鼠的食谱中补加了625mg/kg饲料的强力霉素四周。对这三个群体做TAC处理。在一个双转基因群体的食谱中保持强力霉素。TAC处理后一周，将强力霉素从第二个双转基因群体的食谱中撤出。TAC处理后七周终止试验。测定这三个群体的左心室/总体重比率。

[0135]附图3，C版中给出了从一个这样的试验获得的结果。

实施例11鉴定抗心脏病化合物的方法

[0136]这一检测方法可用于多种心脏病表型。将目的寡核苷酸序列克隆进含有本发明启动子的表达载体。用限制性酶消化含有与目的寡核苷酸序列可操作性相连的本发明启动子(MHCmin^Tet0)的表达盒。将限制性反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，并从琼脂糖纯化该表达盒。根据本领域技术人员已知的任何方法制备表达盒以用于微注射。该表达盒用于制备转基因小鼠。用DNA印迹分析验证转基因的存在。将单转基因小鼠与含有tTA激活物转基因的小鼠交配以产生含有tTA激活物转基因和与目的核苷酸序列可操作性相连的本发明启动子的双转基因小鼠。

[0137]建立两群年龄相配的双转基因小鼠。用强力霉素调控目的核苷酸的表达。向一个群体的食谱中补加目的化合物。向第二个群体的食谱中补加安慰剂。将两个小鼠群体培养适宜的时间，并终止试验。用本文别处所述的左心室/体重比率监控小鼠的心脏病表型，例如肥大。比较各群小鼠所呈现的心脏病表型。

[0138]说明书中所提及的所有的公开出版物、专利、和专利申请代表本发明所属领域技术人员的水平。所有的公开出版物、专利、和专利申请以相同程度引入本文作为参考，如同各独立的公开出版物或专利申请被特异性单独引入作参考。

[0139]尽管为了清楚理解的目的前述发明已经通过举例说明和实施例在某些细节上作了描述，但是显然在所附权利要求范围内还可以作出特定的改变和修饰。

序列表

<110>Cincinnati Children′s Hospital Medical Center

     Robbins，Jeffrey

<120>强有力的诱导型心脏优先的转基因表达系统

<130>CHMO2 GN053

<150>60/393,525

<151>2002-07-03

<160>10

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>5735

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>诱导型心脏优先的启动子

<400>1

ggatcctgca aggtcacaca agggtctcca cccaccaggt gccctagtct caatttcagt 610

ttccatgcct tgttctcaca atgctggcct ccccagagct aatttggact ttgtttttat 120

ttcaaaaggg cctgaatgag gagtagatct tgtgctaccc agctctaagg gtgcccgtga 180

agccctcaga cctggagcct ttgcaacagc cctttaggtg gaagcagaat aaagcaattt 240

tccttaaagc caaaatcctg cctctagact cttcttctct gacctcggtc cctgggctct 300

agggtgggga ggtggggctt ggaagaagaa ggtggggaag tggcaaaagc cgatccctag 360

ggccctgtga agttcggagc cttccctgta cagcactggc tcatagatcc tcctccagcc 420

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agaatctgga agcgctggaa acgataccat aaagggaaga acccaggcta cctttagatg 1860

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catggaagca aggacaagcc aggttgagcg ctccgtgaaa tcagcctgct gaaggcagag 1980

ccctggtatg agcaccagaa cagcagaggc tagggttaat gtcgagacag ggaacagaag 2040

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ccacccacca taaggggagt gaactatcct agggggctgg cgaccttggg gagacaccac 2760

attactgaga gtgctgagcc cagaaaaact gaccgccctg tgtcctgccc acctccacac 2820

tctagagcta tattgagagg tgacagtaga tagggtggga gctggtagca gggagagtgt 2880

tcctgggtgt gagggtgtag gggaaagcca gagcagggga gtctggcttt gtctcctgaa 2940

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taaatctctg ggcctgccag gcattcaaag cagcacctgc atcctctggc agcctgggga 3240

ggcggaaggg agcaaccccc cacttatacc ctttctccct cagccccagg attaacacct 3300

ctggccttcc cccttcccac ctcccatcag gagtggaggg ttgcagaggg agggtaaaaa 3360

cctacatgtc caaacatcat ggtgcacgat atatggatca gtatgtgtag aggcaagaaa 3420

ggaaatctgc aggcttaact gggttaatgt gtaaagtctg tgtgcatgtg tgtgtgtctg 3480

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ggtttgtgtg taaattgccc aaggcaaagt gggtgaatcc cttccatggt ttaaagagat 3600

tggatgatgg cctgcatctc aaggaccatg gaaaatagaa tggacactct atatgtgtct 3660

ctaagctaag gtagcaaggt ctttggagga cacctgtcta gagatgtggg caacagagac 3720

tacagacagt atctgtacag agtaaggaga gagaggaggg ggtgtagaat tctcttacta 3780

tcaaagggaa actgagtcgt gcacctgcaa agtggatgct ctccctagac atcatgactt 3840

tgtctctggg gagccagcac tgtggaactt caggtctgag agagtaggag gctcccctca 3900

gcctgaagct atgcagatag ccagggttga aagggggaag ggagagcctg ggatgggagc 3960

ttgtgtgttg gaggcagggg acagatatta agcctggaag agaaggtgac ccttacccag 4020

ttgttcaact cacccttcag attaaaaata actgaggtaa gggcctgggt aggggaggtg 4080

gtgtgagacg ctcctgtctc tcctctgcat gccctgaggc cctttgggga ggaggaatgt 4140

gcccaaggac taaaaaaagg ccatggagcc agaggggcga gggcaacaga cctttcatgg 4200

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ttctaacgga caggagggaa ctcgagttta ccactcccta tcagtgatag agaaaagtga 4320

aagtcgagtt taccactccc tatcagtgat agagaaaagt gaaagtcgag tttaccactc 4380

cctatcagtg atagagaaaa gtgaaagtcg agtttaccac tccctatcag tgatagagaa 4440

aagtgaaagt cgagtttacc actccctatc agtgatagag aaaagtgaaa gtcgagttta 4500

ccactcccta tcagtgatag agaaaagtga aagtcgagtt taccactccc tatcagtgat 4560

agagaaaagt gaaagtcgag ctcggtacca gcagaggact ccaaatttag gcagcaggca 4620

tatgggatgg gatataaagg ggctggagca ctgagagctg tcagagattt ctccaaccca 4680

ggtaagaggg agtttcgggt gggggctctt cacccacacc agacctctcc ccacctagaa 4740

ggaaactgcc tttcctggaa gtggggttca ggccggtcag agatctgaca gggtggcctt 4800

ccaccagcct gggaagttct cagtggcagg aggtttccac aagaaacact ggatgcccct 4860

tcccttacgc tgtcttctcc atcttcctcc tggggatgct cctccccgtc ttggtttatc 4920

ttggctcttc gtcttcagca agatttgccc tgtgctgtcc actccatctt tctctactgt 4980

ctccgtgcct tgccttgcct tcttgcgtgt ccttcctttc cacccatttc tcacttcacc 5040

ttttctcccc ttctcatttg tattcatcct tccttccttc cttccttcct tccttccttc 5100

cttccttcct tcctttctcc cttccttcct tccttccttc cttccttcct tccttccttc 5160

ctgtgtcaga gtgctgagaa tcacacctgg ggttcccacc cttatgtaaa caatcttcca 5220

gtgagccaca gcttcagtgc tgctgggtgc tctcttacct tcctcacccc ctggcttgtc 5280

ctgttccatc ctggtcagga tctctagatt ggtctcccag cctctgctac tcctcttcct 5340

gcctgttcct ctctctgtcc agctgcgcca ctgtggtgcc tcgttccagc tgtggtccac 5400

attcttcagg attctctgaa aagttaacca ggtgagaatg tttcccctgt agacagcaga 5460

tcacgattct cccggaagtc aggcttccag ccctctcttt ctctgcccag ctgcccggca 5520

ctcttagcaa acctcaggca cccttacccc acatagacct ctgacagaga agcaggcact 5580

ttacatggag tcctggtggg agagccatag gctacggtgt aaaagaggca gggaagtggt 5640

ggtgtaggaa agtcaggact tcacatagaa gcctagccca caccagaaat gacagacaga 5700

tccctcctat ctcccccata agagtttgag tcgac                            5735

<210>2

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>插入启动子的序列

<400>2

tgcatgccct ga                                                    12

<210>3

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>从启动子切出的序列

<400>3

tatctgccca tc                                                    12

<210>4

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>插入具有TetO结合位点的启动子的序列

<400>4

tcgagtttac cactccctat cagtgataga gaaaagtgaa ag                   42

<210>5

<211>627

<212>DNA

<213>小家鼠

<220>

<221>CDS

<222>(21)…(602)

<223>ELC1-a

<400>5

gtcgacgagc ctaaagcaac atg cct ccc aag aaa ccc gag cct aag aag gag 53

                      Met Pro Pro Lya Lys Pro Glu Pro Lys Lya Glu

                       1               5                   10

act gcc aag ccg gct gca gcc cct gct cca gct gca tcc gca gct ccg   101

Thr Ala Lys Pro Ala Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ser Ala Ala Pro

             15                  20                  25

gag ccc ctc aag gac tct gcc ttt gac cca aag agt gtg aag ata gac   149

Glu Pro Leu Lys Asp Ser Ala Phe Asp Pro Lys Ser Val Lys Ile Asp

         30                  35                  40

ttc agt gct gac cag atc gaa gaa ttc aaa gag gcc ttt tca ttg ttt   197

Phe Ser Ala Asp Gln Ile Glu Glu Phe Lys Glu Ala Phe Ser Leu Phe

     45                  50                  55

gac cgg act cca acg gga gag atg aag atc acc tac ggg cag tgt ggg   245

Asp Arg Thr Pro Thr Gly Glu Met Lys Ile Thr Tyr Gly Gln Cys Gly

 60                  65                  70                  75

gac gtg ctg cgg gcc ctg ggc cag aac ccc acc aac gca gag gtg ctg   293

Asp Val Leu Arg Ala Leu Gly Gln Asn Pro Thr Asn Ala Glu Val Leu

                 80                  85                  90

cgc gtt ttg ggc aaa ccc aag cct gaa gag atg agt tcc aag aca ctg   341

Arg Val Leu Gly Lys Pro Lys Pro Glu Glu Met Ser Ser Lys Thr Leu

             95                 100                 105

gac ttc gag atg ttc ctg ccc atc ctg caa cac atc tcc cgc aac aag   389

Asp Phe Glu Met Phe Leu Pro Ile Leu Gln His Ile Ser Arg Asn Lys

        110                 115                 120

gag cag ggc acc tat gag gac ttc gtg gag ggg ctg cgg gtc ttt gac   437

Glu Gln Gly Thr Tyr Glu Asp Phe Val Glu Gly Leu Arg Val Phe Asp

    125                 130                 135

aaa gaa agc aac ggc aca gtc atg ggt gcc gag ctt cgg cat gtc ctt   485

Lys Glu Ser Asn Gly Thr Val Met Gly Ala Glu Leu Arg His Val Leu

140                 145                 150                 155

gcc acc ctg gga gag aag atg agc gag gca gag gtg gag cag ctg ttg   533

Ala Thr Leu Gly Glu Lys Met Ser Glu Ala Glu Val Glu Gln Leu Leu

                160                 165                 170

tct ggg cag gag gat gcc aat ggc tgc atc aac tat gaa gcc ttt gtc   581

Ser Gly Gln Glu Asp Ala Asn Gly Cys Ile Asn Tyr Glu Ala Phe Val

            175                 180                 185

aag cac atc atg tct ggg taa agcacgtttc tccagggtgg tcgac           627

Lys His Ile Met Ser Gly  *

        190

<210>6

<211>193

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>6

Met Pro Pro Lys Lys Pro Glu Pro Lys Lya Glu Thr Ala Lys Pro Ala

 1               5                  10                  15

Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ser Ala Ala Pro Glu Pro Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Ser Ala Phe Asp Pro Lys Ser Val Lys Ile Asp Phe Ser Ala Asp Gln

        35                  40                  45

Ile Glu Glu Phe Lys Glu Ala Phe ger Leu Phe Asp Arg Thr Pro Thr

    50                  55                  60

Gly Glu Mer Lys Ile Thr Tyr Gly Gln Cys Gly Asp Val Leu Arg Ala

65                  70                  75                  80

Leu Gly Gln Asn Pro Thr Asn Ala Glu Val Leu Arg Val Leu Gly Lys

                85                  90                  95

Pro Lys Pro Glu Glu Met Ser Ser Lys Thr Leu Asp Phe Glu Met Phe

            100                 105                 110

Leu Pro Ile Leu Gln His Ile Ser Arg Asn Lys Glu Gln Gly Thr Tyr

        115                 120                 125

Glu Asp Phe Val Glu Gly Leu Arg Val Phe Asp Lys Glu Ser Asn Gly

    130                 135                 140

Thr Val Met Gly Ala Glu Leu Arg His Val Leu Ala Thr Leu Gly Glu

145                 150                 155                 160

Lys Met Ser Glu Ala Glu Val Glu Gln Leu Leu Ser Gly Gln Glu Asp

                165                 170                 175

Ala Asn Gly Cys Ile Asn Tyr Glu Ala Phe Val Lys His Ile Met Ser

            180                 185                 190

Gly

<210>7

<211>1503

<212>DNA

<213>小家鼠

<220>

<221>CDS

<222>(33)…(1295)

<223>GSK-CA

<400>7

cggacgcgtg gggtgattca agaagagcca tc atg tcg ggg cga ccg aga acc   53

                                    Met Ser Gly Arg Pro Arg Thr

                                     1               5

acc gcg ttt gcg gag agc tgc aag cca gtg cag cag cct tca gct ttt   101

Thr Ala Phe Ala Glu Ser Cys Lys Pro Val Gln Gln Pro Ser Ala Phe

         10                  15                  20

ggt agc atg aaa gtt agc aga gat aaa gat ggc agc aag gta acc aca   149

Gly Ser Met Lys Val Ser Arg Asp Lys Asp Gly Ser Lys Val Thr Thr

     25                  30                  35

gta gtg gca act cct ggc cag ggt cct gac agg cca cag gaa gtc agt   197

Val Val Ala Thr Pro Gly Gln Gly Pro Asp Arg Pro Gln Glu Val Ser

 40                  45                  50                  55

tat aca gac acg aaa gtg att gga aat gga tca ttt ggt gtg gta tat   245

Tyr Thr Asp Thr Lys Val Ile Gly Asn Gly Ser Phe Gly Val Val Tyr

                 60                  65                  70

caa gcc aaa ctt tgt gat tct gga gaa ctg gtt gcc atc aag aaa gtt   293

Gln Ala Lys Leu Cys Asp Ser Gly Glu Leu Val Ala Ile Lys Lys Val

             75                  80                  85

cta cag gac aag cga ttt aag aac cga gag ctc cag atc atg aga aag   341

Leu Gln Asp Lys Arg Phe Lys Asn Arg Glu Leu Gln Ile Met Arg Lys

         90                  95                 100

cta gac cac tgt aac ata gtc cga ctg cgg tat ttc ttc tac tcg agt   389

Leu Asp His Cys Asn Ile Val Arg Leu Arg Tyr Phe Phe Tyr Ser Ser

    105                 110                 115

ggt gag aag aaa gat gag gtc tac ctt aac ctg gtg ctg gac tat gtt   437

Gly Glu Lys Lys Asp Glu Val Tyr Leu Asn Leu Val Leu Asp Tyr Val

120                 125                 130                 135

ccg gag aca gtg tac aga gtc gcc aga cac tat agt cga gcc aag cag   485

Pro Glu Thr Val Tyr Arg Val Ala Arg His Tyr Ser Arg Ala Lys Gln

                140                 145                 150

aca ctc cct gtg atc tat gtc aag ttg tat atg tat cag ctg ttc aga   533

Thr Leu Pro Val Ile Tyr Val Lys Leu Tyr Met Tyr Gln Leu Phe Arg

            155                 160                 165

agt cta gcc tat atc cat tcc ttt gga atc tgc cat cga gac att aaa   581

Ser Leu Ala Tyr Ile His Ser Phe Gly Ile Cys His Arg Asp Ile Lys

        170                 175                 180

cca cag aac ctc ttg ttg gat cct gat aca gct gta tta aaa ctc tgt   629

Pro Gln Asn Leu Leu Leu Asp Pro Asp Thr Ala Val Leu Lys Leu Cys

    185                 190                 195

gac ttt gga agt gca aag cag ctg gtc cga gga gag ccc aat gtt tca   677

Asp Phe Gly Ser Ala Lys Gln Leu Val Arg Gly Glu Pro Asn Val Ser

200                 205                 210                 215

tat atc tgt tct cgg tac tac agg gca cca gag ttg atc ttt gga gcc   725

Tyr Ile Cys Ser Arg Tyr Tyr Arg Ala Pro Glu Leu Ile Phe Gly Ala

                220                 225                 230

act gat tac acg tcc agt ata gat gta tgg tct gca ggc tgt gtg ttg   773

Thr Asp Tyr Thr Ser Ser Ile Asp Val Trp Ser Ala Gly Cys Val Leu

            235                 240                 245

gct gaa ttg ttg cta gga caa cca ata ttt cct ggg gac agt ggt gtg   821

Ala Glu Leu Leu Leu Gly Gln Pro Ile Phe Pro Gly Asp Ser Gly Val

        250                 255                 260

gat cag ttg gtg gaa ata ata aag gtc cta gga aca cca aca agg gag   869

Asp Gln Leu Val Glu Ile Ile Lys Val Leu Gly Thr Pro Thr Arg Glu

    265                 270                 275

caa att aga gaa atg aac cca aat tat aca gaa ttc aaa ttc cct caa   917

Gln Ile Arg Glu Met Asn Pro Asn TyT Thr Glu Phe Lya Phe Pro Gln

280                 285                 290                 295

atc aag gca cat cct tgg aca aag gtc ttc cgg ccc cga act cca cca   965

Ile Lys Ala His Pro Trp Thr Lys Val Phe Arg Pro Arg Thr Pro Pro

                300                 305                 310

gag gca att gca ctg tgc agc cgt ctg ctg gag tac aca cct acc gcc   1013

Glu Ala Ile Ala Leu Cys Ser Arg Leu Leu Glu Tyt Tnr Pro Thr Ala

            315                 320                 325

cgg cta aca cca ctg gaa gct tgt gca cat tca ttt ttc gat gaa ttg   1061

Arg Leu Tgr Pro Leu Glu Ala Cys Ala His Ger Phe Phe Asp Glu Leu

        330                 335                 340

cgg gac cca aat gtc aaa cta cca aat ggg cga gac aca cct gca ctc   1109

Arg Asp Pro Asn Val Lys Leu Pro Asn Gly Arg Asp Thr Pro Ala Leu

    345                 350                 355

ttc aac ttt acc act caa gaa ctg tca agt aac ccc cct ctg gcc acc   1157

Phe Asn Phe Thr Thr Gln Glu Leu Ser Ser Prn Pro Pro Leu Ala Thr

360                 365                 370                 375

atc ctt atc cct cca cat gct cgg att cag gcc gct gct tca ccg cct   1205

Ile Leu Ile Pro Pro His Ala Arg Ile Gln Ala Ala Ala Ser Pro Pro

                380                 385                 390

gcc aac gcc aoa gca gcc tca gat act aat gct gga gac cgt gga cag   1253

Ala Asn Ala Thr Ala Ala Ser Asp Thr Asn Ala Gly Asp Arg Gly Gln

            395                 400                 405

acc aat aac gcc gct tct gca tca gct tcc aac tcc acc tga           1295

Thr Asn Asn Ala Ala Ser Ala Ser Ala Ser Asn Ser Thr  *

        410                 415                 420

acagccccca ggagccagct gcgcgggaaa gaccagcact tacttgagtg ccactcagca 1355

acactggtca cgtttggaaa gaaaattaaa aagaggaaaa caaaaacaaa aacaaaaaaa 1415

ccctgttcat tttagtgttc aatttttttt attgttgttc ttatttaacc ttgtaaaata 1475

tctatataaa tacaaaaaaa aaaaaaaa                                    1503

<210>8

<211>420

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>8

Met Ser Gly Arg Pro Arg Thr Thr Ala Phe Ala Glu Ser Cys Lys Pro

  1              5                  10                  15

Val Gln Gln Pro Ser Ala Phe Gly Ser Met Lys Val Ser Arg Asp Lys

             20                 25                  30

Asp Gly Ser Lys Val Thr Thr Val Val Ala Thr Pro Gly Gln Gly Pro

        35                  40                  45

Asp Arg Pro Gln Glu Val Ser Tyr Thr Asp Thr Lys Val Ile Gly Asn

    50                  55                  60

Gly Ser Phe Gly Val Val Tyr Gln Ala Lys Leu Cys Asp Ser Gly Glu

65                  70                  75                  80

Leu Val Ala Ile Lys Lys Val Leu Gln Asp Lys Arg Phe Lys Asn Arg

                85                  90                  95

Glu Leu Gln Ile Met Arg Lys Leu Asp His Cys Asn Ile Val Arg Leu

            100                 105                 110

Arg Tyr Phe Phe Tyr Ser Ser Gly Glu Lys Lys Asp Glu Val Tyr Leu

        115                 120                 125

Asn Leu Val Leu Asp Tyr Val Pro Glu Thr Val Tyr Arg Val Ala Arg

    130                 135                 140

His Tyr Ser Arg Ala Lys Gln Thr Leu Pro Val Ile Tyr Val Lys Leu

145                 150                 155                 160

Tyr Met Tyr Gln Leu Phe Arg Ser Leu Ala Tyr Ile His Ser Phe Gly

                165                 170                 175

Ile Cys His Arg Asp Ile Lys Pro Gln Asn Leu Leu Leu Asp Pro Asp

            180                 185                 190

Thr Ala Val Leu Lys Leu Cys Asp Phe Gly Ser Ala Lys Gln Leu Val

        195                 200                 205

Arg Gly Glu Pro Asn Val Ser Tyr Ile Cys Ser Arg Tyr Tyr Arg Ala

    210                 215                 220

Pro Glu Leu Ile Phe Gly Ala Thr Asp Tyr Thr Ger Ser Ile Asp Val

225                 230                 235                 240

Trp Ser Ala Gly Cys Val Leu Ala Glu Leu Leu Leu Gly Gln Pro Ile

                245                 250                 255

Phe Pro Gly Asp Ser Gly Val Asp Gln Leu Val Glu Ile Ile Lys Val

            260                 265                 270

Leu Gly Thr Pro Thr Arg Glu Gln Ile Arg Glu Met Asn Pro Asn Tyr

        275                 280                 285

Thr Glu Phe Lys Phe Pro Gln Ile Lys Ala His Pro Trp Thr Lys Val

    290                  295                300

Phe Arg Pro Arg Thr Pro Pro Glu Ala Ile Ala Leu Cys Ser Arg Leu

305                 310                 315                 320

Leu Glu Tyr Thr Pro Thr Ala Arg Leu Thr Pro Leu Glu Ala Cys Ala

                325                 330                 335

His Ser Phe Phe Asp Glu Leu Arg Asp Pro Asn Val Lys Leu Pro Asn

            340                 345                 350

Gly Arg Asp Thr Pro Ala Leu Phe Asn Phe Thr Thr Gln Glu Leu Ser

        355                 360                 365

Ser Asn Pro Pro Leu Ala Thr Ile Leu Ile Pro Pro His Ala Arg Ile

    370                 375                 380

Gln Ala Ala Ala Ser Pro Pro Ala Asn Ala Thr Ala Ala Ser Asp Thr

385                 390                 395                 400

Asn Ala Gly Asp Arg Gly Gln Thr Asn Asn Ala Ala Ser Ala Ser Ala

                405                 410                 415

Ser Asn Ser Thr

            420

<210>9

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增GSK的引物

<400>9

gtcgacaaga gagccatca tgtcggggcg ac                              32

<210>10

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增GSK的引物

<400>10

gtcgactgtt caagcgtagt ctgggacgtc gtatgggtag gtggagttgg aagctgatgc 60

ag                                                                62

Claims (37)

1.一种分离的核酸分子，它具有包含SEQ ID NO：1中所示序列的核苷酸序列。

2.包含与目的核苷酸序列可操作性连接的权利要求1的分离的核酸分子的表达盒。

3.包含权利要求2的表达盒的载体。

4.用权利要求2的表达盒稳定转化的宿主细胞。

5.根据权利要求4的宿主细胞，其中所述宿主细胞是动物细胞。

6.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述核苷酸能够引发心脏优先的转录。

7.权利要求6的分离的核酸分子，其中所述心脏优先的转录是心室优先的。

8.权利要求6的分离的核酸分子，其中所述心脏优先的转录是诱导型的。

9.具有与SEQ ID NO：1中所示序列有至少95％同一性的核苷酸序列的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列能够在心脏组织中引发转录。

10.包含与目的核苷酸序列可操作性连接的权利要求9的分离的核酸分子的表达盒。

11.包含权利要求10的表达盒的载体。

12.用权利要求10的表达盒稳定转化的宿主细胞。

13.根据权利要求12的宿主细胞，其中所述宿主细胞是动物细胞。

14.权利要求9的分离的核酸分子，其中所述转录是心室优先的。

15.权利要求9的分离的核酸分子，其中所述转录是诱导型的。

16.一种转基因动物，在其基因组中包含至少一个稳定整合的表达盒，所述表达盒包含与具有选自下组的核苷酸序列的核酸分子可操作性连接的目的核苷酸序列：

(a)包含SEQ ID NO：1所示序列的核苷酸序列；和

(b)与SEQ ID NO：1所示序列具有至少95％同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能在心脏组织中引发转录。

17.权利要求16的动物，其中所述转录是心室优先的。

18.权利要求16的动物，其中所述转录是诱导型的。

19.权利要求16的动物，其中所述转基因动物表现改变的目的核苷酸序列表达。

20.权利要求16的动物，其中所述动物选自小鼠、兔、狗、猪、山羊、猴、黑猩猩和牛。

21.权利要求16的动物，其中所述目的核苷酸序列编码心肌成分。

22.一种转基因小鼠，在其基因组中包含至少一个稳定整合的表达盒，所述表达盒包含与具有选自下组的核苷酸序列的核酸分子可操作性连接的目的核苷酸序列：

(a)包含SEQ ID NO：1所示序列的核苷酸序列；和

(b)与SEQ ID NO：1所示序列具有至少95％同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能在心脏组织中引发转录。

23.权利要求22的小鼠，其中所述转录是心室优先的。

24.权利要求22的小鼠，其中所述转录是诱导型的。

25.权利要求22的小鼠，其中所述小鼠表现改变的目的核苷酸序列表达。

26.权利要求22的小鼠，其中所述目的核苷酸序列编码心肌成分。

27.权利要求22的小鼠，其中所述目的核苷酸序列包含选自下组的核苷酸序列：

a.)具有SEQ ID NO：5中所示序列的核苷酸序列；和

b.)编码具有SEQ ID NO：6中所示序列的氨基酸序列的核苷酸序列。

28.权利要求22的小鼠，其中所述目的核苷酸序列包含选自下组的核苷酸序列：

a)与SEQ ID NO：5所示序列具有至少95％同一性的核苷酸序列，其中所述序列编码能与心肌肌球蛋白重链结合的多肽；和

b.)编码与SEQ ID NO：6中所示序列具有至少95％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多肽能与心肌肌球蛋白重链结合。

29.权利要求22的小鼠，其中所述目的核苷酸序列包含选自下组的核苷酸序列：

a.)具有SEQ ID NO：7中所示序列的核苷酸序列；和

b.)编码具有SEQ ID NO：8中所示序列的氨基酸序列的核苷酸序列。

30.权利要求22的小鼠，其中所述目的核苷酸序列包含选自下组的核苷酸序列：

a.)与SEQ ID NO：7所示序列具有至少95％同一性的核苷酸序列，其中所述序列编码保持激酶活性的多肽；和

b.)编码与SEQ ID NO：8中所示序列具有至少95％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多肽保持激酶活性。

31.改变目的核苷酸序列在小鼠中的表达的方法，所述方法包括提供转基因小鼠，所述转基因小鼠在其基因组中包含至少一个稳定整合的表达盒，所述表达盒包含与分离的核酸分子可操作性连接的目的核苷酸序列，所述分离的核酸分子具有选自下组的核苷酸序列：

(a)包含SEQ ID NO：1所示序列的核苷酸序列；和

(b)与SEQ ID NO：1所示序列具有至少95％同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能在心脏组织中引发转录。

32.权利要求31的方法，其中所述表达是诱导型的。

33.权利要求31的方法，其中所述表达是心室优先的。

34.权利要求31的方法，其中所述表达改变小鼠的心脏病易感性。

35.权利要求34的方法，其中所述心脏病是心肌病。

36.权利要求35的方法，其中所述心肌病选自下组：家族性肥厚型心肌病、扩张型心肌病、围产期心肌病和限制型心肌病。

37.鉴定抗心肌病化合物的方法，包括步骤：

(a)提供第一和第二转基因小鼠，所述小鼠的基因组中包含至少一个稳定整合的表达盒，所述表达盒包含与分离的核酸分子可操作性连接的目的核苷酸序列，所述分离的核酸分子具有选自下组的核苷酸序列：

(i)包含SEQ ID NO：1所示序列的核苷酸序列；和

(ii)与SEQ ID NO：1所示序列具有至少95％同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能在心脏组织中引发转录；

(b)向所述第一小鼠施用化合物；

(c)将第一和第二小鼠都喂养一段时间；和

(d)对所述第一小鼠进行监测，监测其中与所述第二小鼠相比的心脏病表型的调节。