CN1927958B - 用于基于酶电化学的传感器的水可混溶性导电油墨 - Google Patents

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Abstract

一种用于基于酶电化学的传感器的水可混溶性导电油墨包括导电物质、一种酶、介体和粘合剂。所述导电物质、酶、介体和粘合剂被配制成一种水可混溶性的水基分散体系，并且所述粘合剂在干燥时变为在操作上不溶于水的。

Description

用于基于酶电化学的传感器的水可混溶性导电油墨
交叉引用
本申请要求享有于2005年4月12日提交的U.S.临时申请No.60/671,026、标题为“用于基于酶电化学的传感器的水可混溶性导电油墨”的优先权。
背景技术
1.技术领域
本申请总体上涉及传感器，并且尤其是基于酶电化学的传感器。
2.现有技术的描述
近年来，利用采用酶试剂如包含氧化还原介体(例如二茂铁)和氧化还原酶(例如葡糖氧化酶)的酶试剂，与电极一起用于测定液体样品中的分析物的基于酶电化学的传感器已经引起了高度的兴趣。所述基于酶电化学的传感器被认为特别适用于连续或半连续的监测流体样品(例如，血液或间质性流体样品)中的分析物(例如，葡萄糖)。例如，基于酶电化学的葡萄糖传感器，采用了氧化还原介体、氧化还原酶和工作电极，可以使用相对低的电势(例如，小于0.4V vs SCE)来测定(即测量)葡萄糖的浓度，从而限制了工作电极上的任何干扰响应。对于基于酶电化学的传感器的进一步描述，例如参见U.S.专利Nos.5,089,112和6,284,478，每一个由此都全部作为参考并入本文。
附图简述
通过参照以下的详细说明及附图，将获得对本发明特征和优点的更好理解，其给出了利用本发明原理的示例性实施方案，其中：
图1描述了一种可用在根据本发明一个例举性实施方案的水可混溶性导电油墨的粘合剂中的共聚物；
图2描述了可用在根据本发明另一例举性实施方案的水可混溶性导电油墨的粘合剂中的另一种共聚物；
图3描述了又一个可用在根据本发明另一个例举性实施方案的水可混溶性导电油墨的粘合剂中的另一种共聚物；
图4描述了一种用于制备可用在根据本发明另一个例举性实施方案的水可混溶性导电油墨的粘合剂中的共聚物的反应流程；
图5A为一个简化的顶视图，描述了根据本发明一个例举性实施方案的基于酶电化学的传感器的一部分；
图5B描述了图5A基于酶电化学的传感器沿线5B-5B的一简化横截面图，的；
图5C描述了图5A基于酶电化学的传感器沿线5C-5C的一简化横截面图，；
图5D描述了图5A基于酶电化学的传感器沿线5D-5D的一简化横截面图；
图6为用于制造一部分根据本发明一个例举性实施方案的基于酶电化学的传感器的工艺流程图；
图7描述了一个用于合成高分子量的丙烯酰胺和乙烯基二茂铁的氧化还原共聚物的简化的反应流程，其可用在根据本发明一个例举性实施方案的水可混溶性导电油墨的粘合剂中；
图8A的曲线描述了根据本发明的一个例举性实施方案的基于酶电化学的葡萄糖传感器的校准数据，以连续流动方式获得；
图8B的曲线描述了用于根据本发明的一个例举性实施方案的基于酶电化学的葡萄糖传感器的电流随时间的稳定性；
图9的曲线描述了根据本发明的一个例举性实施方案的基于酶电化学的传感器的校准数据，采用微流控检测系统而获得；
图10的曲线描述了根据本发明的一个例举性实施方案的基于酶电化学的传感器对各个葡萄糖浓度的瞬时响应；
图11的曲线描述了根据本发明的一个例举性实施方案的基于酶电化学的传感器对各个葡萄糖浓度的总瞬时响应；
图12是用于根据本发明的一个例举性实施方案的基于酶电化学的传感器的校准曲线；
图13的曲线描述了根据本发明的一个例举性实施方案的基于酶电化学的传感器的响应稳定性；以及
图14为用于根据本发明的一个例举性实施方案的基于酶电化学的葡萄糖传感器的校准数据的曲线描述。
本发明示例性实施方案的详细描述
用于根据本发明实施方案的基于酶电化学的传感器的水可混溶性导电油墨包括导电物质、酶、介体和粘合剂。此外，所述导电物质、酶、介体和粘合剂被制成水可混溶性的基于水的分散体系，其中，粘合剂在干燥时变为在操作上不溶于水的。在这点上，本领域技术人员将意识到分散体系实质上为一种混合物，其包括分散在一种不同物质的连续相(例如，连续的粘合剂相)中的分散的颗粒物质(例如，导电物质的颗粒)。下面将描述用于根据本发明多个例举性实施方案的基于酶电化学的传感器的水可混溶性导电油墨的特性、优点和其它例举的细节。
根据本发明实施方案的水可混溶性导电油墨能够最紧密地接近并正好置在酶、介体和导电物质之间，从而便于其间的快速电子交换(即电子转移)。所述的快速电子交换可以导致有利的增加电流收集效率。
根据本发明实施方案的水可混溶性导电油墨可以很容易地用在常规的基于酶电化学的传感器制造技术中，例如丝网印刷技术。此外，水可混溶性导电油墨的实施方案适用于在干燥时被固定到基于酶电化学的传感器的衬底上作为导电层，因而可防止在使用基于酶电化学的传感器期间介体和/或酶从导电层流失。而且，与常规的分离电极相比，该导电层的导电物质可具有更大的介体可及的表面积。
由于本发明实施方案的水可混溶性导电油墨被制成水基分散体系，它们很容易与典型的酶和介体兼容。此外，根据本发明实施方案的水可混溶性导电油墨具有的优点在于其水可混溶的本质，它能够使得在酶和介体的比例方面有很宽的配制区，酶和介体可以在其中结合成一种均匀的分散体系。
根据本发明实施方案的水可混溶性导电油墨可以很容易地制造，并且可以很容易地施加到基于酶电化学的传感器的衬底上。因此，水可混溶性导电油墨可有利地适用于快速且成本高效的制造基于酶电化学的传感器。而且，由于根据本发明实施方案的水可混溶性导电油墨将酶、介体和导电物质结合为单一的组合物，可以有利地降低处理步骤的数量以及制造基于酶电化学的传感器所需的昂贵造价。
应当注意，根据本发明实施方案的水可混溶性导电油墨为这样的导电油墨，其可以均匀地溶解和/或另外分散在水或其它水溶液中，尽管水可混溶性导电油墨也可以包含不引起相分离的有机溶剂(例如，水溶性有机溶剂)。
下面将详细地描述适合的导电物质、酶、介体和粘合剂，以及适于将导电物质、酶、介体和粘合剂制成根据本发明实施方案的水可混溶性导电油墨的技术。
导电物质
本领域技术人员公知的任何合适的导电物质(由于上下文可以保证，也称作颜料或碳墨)可以用于本发明的实施方案中。例如，导电物质可以为细碎的导电颗粒物质，如碳黑材料、石墨材料、铂颗粒材料、镀铂碳材料、金颗粒材料、铂/钯合金颗粒材料、钯颗粒材料、钌颗粒材料或铈颗粒材料。这些细碎的导电颗粒材料的尺寸可以例如小于100微米，并且更优选处于1nm-20微米的范围内。此外，尺寸范围可以具有双峰式分布。
当根据本发明实施方案的水可混溶性导电油墨被用于制造基于酶电化学的传感器的导电层时，水可混溶性导电油墨的导电物质可以起电极的作用，并且与水可混溶性导电油墨的介体交换电子。在这点上，一旦获知本发明的公开，本领域技术人员将意识到由根据本发明的水可混溶性导电油墨形成的导电层含有存在于水可混溶性导电油墨中的导电物质、酶和介体，被用于形成导电层。由于导电物质和介体(以及酶和粘合剂)可以被制成均匀的分散体系，与在独立的导电物质层(如常规的电极)和含有介体的独立层之间的电子交换相比，获得的导电层对于导电物质和介体之间的电子交换具有增强的稳定性。
一旦获知本发明的公开，本领域技术人员可以选择导电颗粒、粘合剂、介体、酶和任选水可混溶性的有机共溶剂的组合来产生均匀的分散体系，并且在干燥时产生均匀的导电层(例如，具有基本上均匀分布的酶、介体和导电物质的导电层)。在这样做时，可采用用于评估分散体系和导电层均匀性的常规和公知的实验技术(如可视和扫描电子显微镜(SEM)检测和机械性能表征)。
在水可混溶性导电油墨中采用的导电物质(以及粘合剂)的电性能以及导电物质的比例可以被预先确定，从而使得通过干燥水可混溶性导电油墨而形成的导电层具有小于大约10kΩ的导电率。在这点上，形成导电率小于约1kΩ的导电层可以是特别有利的。
酶
本领域技术人员公知的任何合适的酶可以用于本发明的实施方案中。例如，所述酶可以是选择性地识别流体样品(如血液样品)中的待测(即检测或测定)分析物(如葡萄糖)的酶。如基于酶电化学的传感器领域的技术人员所公知的，所述酶参与作为通过基于酶电化学的传感器而电化学测定分析物的基础的电化学反应。例如，所述酶利用介体可以将电子往返于电极(或其它的导电物质)，从而使能够在电极上测量与分析物浓度成正比的电流。
例如，所述酶可以是氧化还原酶，如葡萄糖氧化酶。在这种情况下，采用含有葡萄糖氧化酶的水可混溶性导电油墨的基于酶电化学的传感器可以被用于测定流体样品(例如，全血液样品)中的葡萄糖。葡糖氧化酶的例子包括但不局限于葡糖氧化酶和吡咯并喹啉醌(PQQ)葡萄糖脱氢酶。
根据本发明实施方案的水可混溶性导电油墨的制剂使该水可混溶性导电油墨的酶能够可操作性地固定在基于酶电化学的传感器的衬底上。可操作性的固定是指当固定到衬底上时，酶能够与分析物发生反应并通过介体将电子转移到导电物质上。
介体
本领域技术人员公知的任何合适的介体可以用于本发明的实施方案中。介体基本上为一个化学实体，其能够可操作性地与水可混溶性导电油墨的导电物质和酶交换电子。
例如，所述介体可以是铁氰化物或二茂铁。此外，所述介体可以为聚合物介体，如在共同待审的U.S.专利申请No.10/957,441、申请No.10/931,724和申请No.10/900,511中的描述并涉及的作为氧化还原聚合物的那些。所述聚合物介体可以为水溶性并具有高分子量，如乙烯二茂铁和丙烯酰胺的共聚物。
具有有限水溶性适当介体例如二茂铁或四硫富瓦烯/四氰基醌二甲烷(TTF/TCNQ)可以通过在配制前将介体分散或溶解到水可混溶的共溶剂如甲基卡必醇或二醇醚中而被制备用于根据本发明实施方案的水可混溶性导电油墨。所述水可混溶的共溶剂使介体能够有效地与水可混溶性导电油墨的导电物质、酶和粘合剂一起分散，尽管介体在无共溶剂存在时水溶性有限。
根据本发明实施方案的水可混溶性导电油墨制剂使介体能够可操作性地固定到基于酶电化学的传感器的衬底上。可操作性的固定是指当介体固定到衬底上时能够与酶发生反应并将电子转移到导电物质上。
粘合剂
本领域技术人员公知的任何适当的粘合剂(由于上下文可以证明，也称作树脂或树脂聚合物)可以用于本发明的实施方案中。根据本发明实施方案的水可混溶性导电油墨的粘合剂发挥作用以便可操作性地将水可混溶性导电油墨的导电物质、介体和酶固定到基于酶电化学的传感器的衬底上。
例如，所述粘合剂可以包括树脂聚合物和反离子，其中，该反离子通过为树脂聚合物的酸性或碱性基团的脱质子化或质子化而使树脂聚合物可溶解于水。所述反离子可以为挥发性的，使得当水可混溶性导电油墨被干燥时，反离子基本上蒸发，并且获得的粘合剂(即干燥的树脂聚合物)变成可操作性地不溶于水的。例如，所述树脂聚合物可以具有从羧酸物质衍生的酸性基团，并且挥发性反离子可以从挥发性胺如氨、N`N`-二甲基乙醇胺或挥发性的有机胺衍生而来。当挥发性的反离子从水可混溶性导电油墨中蒸发时，树脂聚合物可以以这样一种方式变成离子交联到基于酶电化学的传感器的衬底上，该方式使得水可混溶性导电油墨的酶、导电物质和介体基本上被固定。对于带有负电荷酸性基团的树脂聚合物，带负电荷的酸性基团可以与树脂聚合物本身的带正电荷的物质或者导电物质、酶和介体中的任何一种离子键合。
供选地，例如，聚合物树脂的酸性或碱性基团可以为这样的，使得所述酸性或碱性基团仅仅在预定的pH范围内离子化，因而使得聚合物树脂在预定的pH范围内为水溶性。当干燥水可混溶性导电油墨时，已干燥的或正在干燥的油墨可以用超出预定pH范围的适当pH的溶液处理，以便使树脂在操作上为不溶于水的。
粘合剂的作用可以通过共溶效应的作用而被增强，借此，在水可混溶性导电油墨中存在水可混溶的有机共溶剂改善了粘合剂的水溶性。当水可混溶性导电油墨被干燥时，所述有机共溶剂可以例如通过蒸发而去除。特别是，在使用基于酶电化学的传感器期间，当与流体样品接触时，有机溶剂不存在，并且树脂聚合物在操作上为不溶于水的。例如，适当的水可混溶的有机共溶剂包括醇类、二醇醚类、甲基卡必醇、丁基卡必醇、乙二醇、乙二醇二乙酸酯、双丙酮醇和磷酸三乙酯。
一旦获知本发明的公开，本领域技术人员将意识到根据本发明的水可混溶性导电油墨的各组分可以从市场上购买。例如，适用于根据本发明多种实施方案的水可混溶性导电油墨的导电石墨材料和粘合剂的水可混溶组合物可作为目录号为66756的导电石墨糊购自Coates Electrographics，其为Sun Chemical Screen，Norton Hill，Midsomer Norton，Bath UK的一个分公司。另外的导电物质和粘合剂的水可混溶组合物可作为水溶性导电物质LFW201-H从市场上购自Precisia，Ann Arbor，Michigan，U.S.A。
通过干燥根据本发明各实施方案的水可混溶性导电油墨而形成的导电层的干燥粘合剂可以作为透析膜，同时介体、酶和导电物质被限制在干燥的并且在操作上为不溶于水的粘合剂中，从而固定到基于酶电化学的传感器的衬底上。所述透析膜可允许相对较小的分子如葡萄糖穿过其中并与限制于其中的酶发生反应。
参照图1、2、3和4，适用于根据本发明实施方案的水可混溶性导电油墨的粘合剂可以包括带有羧基官能团、酸酐官能团和/或磷酸基团的聚合物。例如，所述粘合剂可以为图1描述的聚苯乙烯共马来酐的共聚物10、图2描述的聚苯乙烯共马来酐的水解共聚物20、聚苯乙烯共马来酐的部分水解共聚物、图3描述的聚苯乙烯共马来酐的部分酯化共聚物30或通过磷酸42与环氧树脂44反应而获得的磷酸官能团的聚合物40，如图4所示。
而且，粘合剂也可以被制成含有通过将适当的酸性官能团乙烯基单体与其它单体混合而制得的共聚物或三元共聚物，所述酸性官能团乙烯基单体是例如丙烯酸单体和/或甲基丙烯酸单体和/或衣康酸单体和/或马来酸单体，所述其它单体是例如其它乙烯基单体，如甲基丙烯酸甲酯单体和/或苯乙烯单体和/或丙烯酸乙酯单体和/或丙烯酸异丙酯单体和/或丙烯酸丁酯单体和/或丙烯腈单体和/或甲基苯乙烯单体和/或苯甲酸乙烯酯单体和/或丙烯酰胺单体和/或甲基丙烯酸羟基甲酯单体。所述聚合物粘合剂将水溶性与良好的导电物质分散性能结合起来。
参照图5A、5B、5C和5D，根据本发明一个实施方案的基于酶电化学的传感器100包括衬底102、具有电极表面106a的参比电极104a，具有电极表面106b的工作电极104b，以及设置在电极表面106b上的导电层108。导电层108通过干燥根据本文描述的本发明实施方案的水可混溶性导电油墨而形成。因此，导电层108包括干燥的粘合剂(其在操作上为不溶于水的)、介体、酶和导电物质。尽管导电层108被描述为设置在工作电极104b上，由根据本发明实施方案的水可混溶性导电油墨形成的导电层本身可以作为基于酶电化学的传感器的工作电极或其它适当的导电元件。
基于酶电化学的传感器100也包括参比油墨层114以及任选的绝缘层112。本领域技术人员将意识到图5A-5D仅描述了一个完整的基于酶电化学的传感器的一部分，并且该基于酶电化学的传感器的其它组件(例如，腔体、分析/微处理器模块和电子通讯电路)未被显示，以避免使图5A-5D过度复杂。
本领域技术人员也将意识到参比油墨层114，其组成了与参比电极104a成一体的电化学活性层，设定了“零电势”，与其相对，将测量电势施加到工作电极104b上。本领域技术人员还将意识到尽管图5A-5D描述了具有两电极模式的基于酶电化学的传感器，本领域公知的其它基于酶电化学的传感器模式可以用于本发明的实施方案中。
衬底102可以例如由聚对苯二甲酸乙二醇酯板、聚对苯二甲酸丁二醇酯板形成(例如，可从市场上购自GE Plastic，美国)，或由定向的聚苯乙烯膜形成(例如，可从市场上购自NSW GmBH，德国)。
参比油墨层114可以例如由Ag/AgCl糊(可从市场上购自Gwent ElectronicMaterials，Pontypool Wales，UK)或任何适当的电化学参比材料形成，包括但不局限于包含形成部分溶解盐的金属(例如，银、铜、钛和锂)的材料。
任选的绝缘层112可以例如由介电丝网可印刷的油墨糊(例如，可从市场上购自Sericol Inks Ltd.)形成。参比电极104a和工作电极104b可以由本领域公知的任何适当的材料形成。
参比电极104a、工作电极104b、绝缘层112可以具有适当的厚度。然而，对于这些层中的每一个厚度，一般处于1-100微米的范围内。
图6为用于制造根据本发明一个例举性实施方案的基于酶电化学的传感器的方法600的流程图。制造的部分可以为任何导电层，例如图5A-5D中描述的电极、导电图形或导电层。然而，本领域技术人员将意识到尽管图5A-5D显示了可以利用根据本发明的方法所制造的基于酶电化学的传感器，所述方法不局限于图5A-5D描述的基于酶电化学的传感器。
方法600包括将水可混溶性导电油墨施加到基于酶电化学的传感器的衬底上，如步骤610中所示。水可混溶性导电油墨包括导电物质、酶、介体和粘合剂，该导电物质、酶、介体和粘合剂被制成水可混溶的水基分散体系，并且其中粘合剂在干燥时变为在操作性上不溶于水的。
衬底可以为任何适当的衬底，例如包括基于酶电化学的传感器的电绝缘衬底和/或基于酶电化学的传感器的导电衬底。
步骤610的施加可以例如通过任何适当的施加技术包括丝网印刷技术、浸涂技术、喷涂技术和喷墨涂敷技术而完成。本文相对于根据本发明的水可混溶性导电油墨和基于酶电化学的传感器进一步描述了步骤610中施加的水可混溶性导电油墨。
如图6的步骤620中所示，方法600还包括干燥水可混溶性导电油墨以在衬底上形成一个导电层，该层包含在操作上不溶于水的粘合剂。
干燥可以在足以将已干燥的水可混溶性导电油墨固定到衬底上并形成导电层但不足以明显降低酶活性的温度下进行一段时间。例如，水可混溶性导电油墨可以在约75℃下干燥约20分钟。
实施例1
制备根据本发明的一个例举性实施方案的水可混溶性导电油墨，其包括酶葡糖氧化酶、介体二茂铁和可从市场上购买的导电物质和粘合剂的组合物(可购自Coates的水溶性的石墨糊66756)。水可混溶性导电油墨按如下过程制备：将50mg葡糖氧化酶溶解在0.7ml的高纯水中。将获得的溶液加入到5g水可混溶的石墨糊66756中，接着混入25mg已溶于1ml甲基卡必醇共溶剂中的二茂铁。
将上述水可混溶性导电油墨的一部分涂敷到玻碳电极上，并在烘箱中于75℃干燥20分钟以产生其上带有导电层的玻碳电极。本领域的技术人员将意识到其上带有导电层的该电极代表基于酶电化学的传感器的一部分。
在含有搅拌缓冲葡萄糖溶液的烧杯中，在300mV的恒电势下测试其上带有导电层的电极。该测试采用了银/氯化银参比电极和铂丝对电极。在烧杯中增加葡萄糖的浓度而观察到电流响应。电流测试进行了超过12小时的一段时间，通过连续改变缓冲液和葡萄糖添加物。在延长的测试中，电流响应降低。假设该降低是从导电层损失介体的结果。
实施例2
通过图7描述的自由基共聚反应合成适用于根据本发明一个实施方案的水可混溶性导电油墨的亲水性的高分子量氧化还原聚合物(即图7的氧化还原聚合物700)，利用了在40ml二氧杂环己烷和乙醇的混合物(体积比为1：1)中含有1.8g97％丙烯酰胺(AAM)、0.3g97％乙烯基二茂铁(VFc)和0.03g2.2`-偶氮二异丁腈(AIBN)的反应溶液。反应在圆底烧瓶中进行。采用5摩尔百分比的乙烯基二茂铁和95摩尔百分比的丙烯酰胺进行反应。
在开始反应前，通过鼓氮气泡1小时而将上述反应溶液脱氧。随后在油浴中将反应液加热到70℃，持续24小时，在氮气氛中连续进行磁力搅拌。将获得的聚合物沉淀滤出，并反复用丙酮清洗以提供纯的聚合物沉淀物样品。随后将纯化的样品在烘箱中于50℃干燥。
随后，通过相对于去离子水透析而将分子量相对较低的部分从干燥的纯样品中除去，利用了分子量截止为13Kg/mol的纤维素膜管。获得的组合物为亲水性的高分子量氧化还原聚合物(即图7的氧化还原聚合物700)。
实施例3
采用实施例2描述的氧化还原聚合物700制备根据本发明一个实施方案的水可混溶性导电油墨。制备过程包括将30mg葡糖氧化酶(得自AspergillusNiger)、160mg5％的氧化还原聚合物700的水溶液、1ml高纯水、3g水溶性的石墨糊(可从市场上购自Coates Screen，Sun Chemical的一个分公司，目录号为66756))混合起来以形成均匀的水基分散体系。
将上述刚描述的水可混溶性导电油墨涂敷到基于酶电化学的传感器的衬底上(即3.75毫米2的传感器布线图，带有导电轨道和参比电极(丝网印刷的Ag/AgCl))。将涂敷的衬底于75℃下干燥20分钟。接着将干燥的涂敷衬底放入流通池中，并连接到恒电位器。将300mV的电势施加到工作电极上(由以上刚描述的水可混溶性导电油墨形成)，Pt丝插入池中以充当对电极。
磷酸缓冲盐水(PBS)，含有处于0-20mmol/L范围的生理相关浓度的葡萄糖，以0.7ml/分钟的速度流经基于酶电化学的传感器。产生的电流响应正比于恰好在特定点流动的分析物中葡萄糖的浓度，如图8A的数据所例示，并在超过20小时的期间内保持稳定。稳定性进一步由图8B的数据例示，其描述了11小时的数据。
基于图8A和8B的数据，该实施例的基于酶电化学的传感器突出地适用于以连续操作的方式检测葡萄糖的生理相关浓度。假定基于酶电化学的传感器采用的水可混溶性导电油墨组合了固定的高分子量介体和固定酶的优点，在酶、介体和导电物质之间具有改进的电化学联系。
实施例4
制备了与实施例3类似的水可混溶性导电油墨，但加入了流变学改性剂(即Cabosil LM150亲水性的热解法二氧化硅)。加入流变学改性剂(即Cabosil LM150亲水性的热解法二氧化硅或Cabosil TS610疏水性的热解法二氧化硅)可以改善水可混溶性导电油墨对丝网印刷的适用性。
通过混合540mg来自Aspergillus Niger的葡糖氧化酶、8.14g5％氧化还原聚合物700的水溶液、60g Coates66756水可混溶的石墨糊和1.6g Cabosil LM150亲水性的热解法二氧化硅而制备水可混溶性导电油墨。将混合物在高剪切速率下(即2000rpm)混合5分钟直到为均匀的高粘性糊。接着利用DEK248的丝网印刷机将高粘性糊通过筛网印刷到基于酶电化学的传感器的衬底上并干燥以形成导电层。获得的酶电化学传感器基本上如图5D所描述的。
随后，结合微流控检测系统检测这样形成的基于酶电化学的结构。当采用数个葡萄糖浓度检测时，基于酶电化学的传感器的响应在超过10小时的期间内是非常稳定的，并且在300mV下线性达20mmol的葡萄糖浓度。
在进一步的测试中，在磷酸盐缓冲液中，多种浓度的葡萄糖以200nL/分钟的速度流经微流控检测系统。电流响应(如图9的数据所示)正比于采用的葡萄糖浓度。图9的数据表明可以在超过10小时的时间段内进行连续的稳定测量，不需要重新校正或基线校正。
实施例5
制备了实施例4描述的另一基于酶电化学的传感器结构和微流控检测系统，并采用通过将新提取的人血浆和磷酸缓冲液以1：2的比例混合而产生的分析物进行测试，从而，获得的流体在生理上与人的间质性流体匹配。将葡萄糖添加物加入到该流体中以产生代表糖尿病患者中常见的生理葡萄糖范围的一定范围的样品。
将获得的样品流体以300nL/分钟的速度在5分钟内导入微流控检测系统，期间，在基于酶电化学法传感器结构的工作电极和对电极之间施加0V的电势。接下来是分析物停滞的10分钟间隔。在分析物停滞不动的该10分钟间隔内，将300mV的电势施加到工作电极上，并测定瞬时的电流响应。该过程重复多次，每次用含有不同葡萄糖浓度的样品液体。在每次测量周期内产生的电流响应描述在图10中。
图10的数据代表在超过20小时的时间段内以10-15分钟的间隔进行的测量。图10的数据表明可以通过在选定的时间进行的电流测定或者通过在特定的测量时间对电流响应积分或部分积分进行的库仑定量而从电流响应中测定葡萄糖的浓度。例如，图11的曲线代表对图10所示的每个瞬时电流的库仑积分，表明所加入的分析物的葡萄糖水平和进行测量时的时间。图12描述了一个从图11的数据得出的校正曲线。图13的数据表明当以上述方式测试时，基于酶电化学的传感器显示出在超过20小时的期间内具有稳定性。
实施例6
如实施例4所描述的水可混溶性导电油墨在测试前于5℃保持冷藏21天。当进行如实施例4所述的检测时，与连续几天进行制造、印刷并检测的水可混溶性导电油墨相比，采用已经于5℃储存21天的水可混溶性导电油墨在电流响应上无显著差别。
实施例7
通过将83g Precisia LFW201-H水溶性导电物质和粘合剂、8.7g5％的氧化还原聚合物700(如上所述)的溶液和0.5g来自Aspergillus Niger的葡糖氧化酶混合而制备根据本发明一个实施方案的水可混溶性导电油墨。混合后，将获得的水可混溶性导电油墨涂敷在(即施加到)印刷的碳电极上，如实施例4所述。当暴露于10mM葡萄糖时，获得的基于酶电化学的产生一个约10nA的信号。该信号保持1小时的测试持续时间，因而表明可操作性地固定水可混溶性导电油墨的各种组分。
实施例8
将5g微粉末的Mw2300的具有异丙基苯封端的聚苯乙烯共马来酸酐部分异辛基酯(得自Aldrich)溶解在20g2-丁氧基乙醇中以形成聚合物树脂糊而制备根据本发明的水可混溶性导电油墨。接着，将12g石墨粉(粒度为2微米，得自Aldrich)和2g碳黑(黑珍珠3700等级，得自Cabot Chemical company)与聚合物树脂糊在三辊式研磨机上混合10分钟。之后将10g获得的混合物进一步与0.5g N`N`二甲基乙醇胺(一种挥发性反离子，得自Aldrich)混合。接下来，加入3ml水以形成中间混合物。用no3K-bar涂敷于聚酯衬底上的该中间混合物的一部分的电阻约为300欧姆/每平方。
将1.3g该中间混合物与0.56g5％的氧化还原聚合物700的水溶液和30mg得自Aspergillus Niger的葡糖氧化酶混合以产生根据本发明一个实施方案的水可混溶性导电油墨。
将水可混溶性导电油墨涂敷在碳电极上(如图5A-5D所述)并在流动体系中以0.7ml/分钟的速度进行测试，含有葡萄糖的溶液以0.7ml/分钟的速度进行约5小时的一段时间。在测试期间，响应于10mmol的葡萄糖溶液，获得了80nA的电流。
实施例9
通过将120mg葡萄糖脱氢酶-PQQ加合物(可从市场上购自Toyobo，高于500IU/mg)与6.1g3.5％的氧化还原聚合物700的水溶液混合而制备根据本发明一个实施方案的水可混溶性导电油墨。将获得的混合物加入到65g Coates66756水可混溶的石墨糊中。接着加入930mg Cabosil LM150二氧化硅，并且将获得的组合物用搅拌器在2000rpm下混合10分钟。
将水可混溶性导电油墨印刷到3.75mm2带有银/氯化银参比电极的电极布线图上，并于75℃下干燥20分钟以形成基于酶电化学的传感器。将基于酶电化学的传感器在流通池中于施加300mV的电势下进行测试，如实施例4所述，并利用了磷酸缓冲盐水溶液中的葡萄糖，以0.7ml/分钟的速度流动。获得的电流响应由图14的数据来描述。在图14描述的连续传感器操作和测试中，电流响应稳定超过2.5小时。
应当理解，对本文描述的本发明实施例的各种替换可以用在本发明的实施中。意欲通过以下的权利要求书限定了本发明的范围，并因此也涵盖了这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (33)

1.一种用于基于酶电化学的传感器的水可混溶性导电油墨，该水可混溶性导电油墨包括：导电物质、酶、介体和粘合剂，其中，所述导电物质、酶、介体和粘合剂被配制成水可混溶性的水基均匀分散体系，其中，所述粘合剂含有树脂聚合物和挥发性反离子，或者含有树脂聚合物和干燥该水可混溶性导电油墨时可从所述水可混溶性导电油墨除去的水可混溶性有机共溶剂，所述粘合剂在所述水可混溶性导电油墨干燥时变为在操作上不溶于水，并且所述粘合剂以连续相存在于所述水可混溶性水基均匀分散体系中。
2.根据权利要求1的水可混溶性导电油墨，其中，所述导电物质为细碎的导电颗粒材料。
3.根据权利要求2的水可混溶性导电油墨，其中，所述细碎的导电颗粒材料为碳黑材料、石墨材料、铂颗粒材料、镀铂碳材料、金颗粒材料、铂/钯合金颗粒材料、钯颗粒材料、钌颗粒材料或铈颗粒材料中的至少之一。
4.根据权利要求1的水可混溶性导电油墨，其中，所述酶为葡萄糖氧化酶。
5.根据权利要求4的水可混溶性导电油墨，其中，所述葡萄糖氧化酶为葡糖氧化酶。
6.根据权利要求4的水可混溶性导电油墨，其中，所述葡萄糖氧化酶为吡咯并喹啉醌(PQQ)葡萄糖脱氢酶。
7.根据权利要求1的水可混溶性导电油墨，其中，所述介体为二茂铁。
8.根据权利要求1的水可混溶性导电油墨，其中，所述介体为铁氰化物。
9.根据权利要求1的水可混溶性导电油墨，其中，所述介体为聚合物介体。
10.根据权利要求1的水可混溶性导电油墨，其中，所述水可混溶性的有机共溶剂为醇类、二醇醚类、乙二醇二乙酸酯和磷酸三乙酯中的至少之一。
11.根据权利要求10的水可混溶性导电油墨，其中，所述水可混溶性的有机共溶剂为甲基卡必醇、丁基卡必醇、乙二醇或双丙酮醇中的至 少之一。
12.根据权利要求1的水可混溶性导电油墨，其还包括一种水可混溶性共溶剂。
13.根据权利要求1的水可混溶性导电油墨，其中，所述介体为四硫富瓦烯/四氰基醌二甲烷。
14.根据权利要求1的水可混溶性导电油墨，其中，所述粘合剂包括聚苯乙烯共马来酐的共聚物、聚苯乙烯共马来酐的水解共聚物、聚苯乙烯共马来酐的部分水解共聚物、聚苯乙烯共马来酐的部分酯化共聚物和通过磷酸与环氧树脂反应而获得的磷酸官能团的聚合物中的至少之一。
15.根据权利要求1的水可混溶性导电油墨，其中，所述粘合剂包括丙烯酸单体、甲基丙烯酸单体、衣康酸单体、马来酸单体中的至少一种和甲基丙烯酸甲酯单体、苯乙烯单体、丙烯酸乙酯单体、丙烯酸异丙酯单体、丙烯酸丁酯单体、丙烯腈单体、甲基苯乙烯单体、苯甲酸乙烯酯单体、丙烯酰胺单体和甲基丙烯酸羟基甲酯单体中的至少一种的共聚物。
16.一种基于酶电化学的传感器，包括：衬底；以及由干燥的权利要求1-15中任一项的水可混溶性导电油墨形成的导电层。
17.根据权利要求16的基于酶电化学的传感器，其中，所述导电层的干燥粘合剂起透析膜的作用。
18.根据权利要求16的基于酶电化学的传感器，其中，所述衬底为工作电极。
19.根据权利要求16的基于酶电化学的传感器，其中，所述介体为聚合物介体。
20.根据权利要求16的基于酶电化学的传感器，其中，所述导电层起基于酶电化学的传感器的电极的作用。
21.根据权利要求20的基于酶电化学的传感器，其中，所述导电层起基于酶电化学的传感器的工作电极的作用。
22.根据权利要求16的基于酶电化学的传感器，其中，所述酶、介体和粘合剂基本上均匀地遍布整个导电层。
23.一种用于制造一部分基于酶电化学的传感器的方法，该方法包括： 将权利要求1-15中任一项的水可混溶性导电油墨施加到基于酶电化学的传感器的衬底上；以及干燥所述的水可混溶性导电油墨以便在衬底上形成导电层，所述导电层含有在操作上不溶于水的粘合剂。
24.根据权利要求23的方法，其中，所述施加步骤是利用丝网印刷技术而实现的。
25.根据权利要求23的方法，其中，所述干燥步骤是在75℃的温度下进行20分钟而实现的。
26.根据权利要求23的方法，其中，所述干燥步骤将该水可混溶性导电油墨固定到衬底上，因而形成导电层。
27.根据权利要求23的方法，其中，所述施加步骤施加含有聚合物介体的水可混溶性导电油墨。
28.根据权利要求23的方法，其中，所述干燥步骤形成导电层，其起所述基于酶电化学的传感器的电极的作用。
29.根据权利要求28的方法，其中，所述干燥步骤形成导电层，其起所述酶电化学传感器的工作电极的作用。
30.根据权利要求23的方法，其中，所述施加步骤施加水可混溶性导电油墨，其中，所述酶为葡萄糖氧化酶。
31.根据权利要求23的方法，其中，所述施加步骤施加一种制备成均匀分散体系的水可混溶性导电油墨。
32.根据权利要求31的方法，其中，所述干燥步骤形成导电层，其含有均匀分布的酶、介体和导电物质。
33.根据权利要求23的方法，其中，所述施加步骤施加含有导电物质的水可混溶性导电油墨，该导电物质包括细碎的导电颗粒，具有小于100微米的尺寸。 
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