CN1923791A - 粘盖牛肝菌素的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供粘盖牛肝菌素(Suillin)的制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明提供的Suillin的分子式为C28H40O4，分子量为440，是将原料黄白粘盖牛肝菌真空冻干粉碎后得干粉，加乙酸乙酯室温浸提，过滤，将滤液蒸发浓缩回收所得浸膏加到反相硅胶柱上，梯度洗脱，收集有生物活性的洗脱峰浓缩后，再用溶剂溶解上C8反相制备柱分离纯化得到。本发明提供的粘盖牛肝菌素具有广谱抗肿瘤活性，体外对六种人肿瘤株均有强烈的抑制效应，平均半数抑制增值浓度IC50为6.71μg/ml，可在制备抗肿瘤活性药物中应用。本发明为研究开发粘盖牛肝菌素新的医药用途，对开发我国真菌资源具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地说是从天然菌物中提取有效成分及其用途，尤其是从黄白粘盖牛肝菌[Suillus placidus(Bonord.)Singer]中提取有效成分粘盖牛肝菌素(Suillin)的方法，及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
高等真菌(蘑菇)因其富含营养和药用成分，越来越引起人们的关注，但相对于植物和微生物，从蘑菇中发现的有生物活性的化合物还很少；恶性肿瘤是当今威胁人类身心健康最严重的疾病，死亡率高，目前尚无治愈率较高的药物报道，因此从不同途径寻找高效低毒选择性强的化疗药物仍然是肿瘤药物研发的当务之急。
黄白粘盖牛肝菌[Suillus placidus(Bonord.)Singer]，别名黄粘盖牛肝、滑肚子(四川)，属伞菌目牛肝菌科粘盖牛肝菌属，夏秋季在松林和青杠林中地上群生或丛生，主要分布于吉林、四川、广东、云南等地。国内外对粘盖牛肝菌属的药用活性报道较少，研究主要集中于点柄粘盖牛肝菌(Suillus granulatus(L.：Fr.)O.Kuntce)和褐环粘盖牛肝菌(Suillus luteus(L.：Fr.)Gray)。点柄粘盖牛肝菌和褐环粘盖牛肝菌的甲醇粗提物对鼠源性肿瘤细胞株L1210和3LL具有较强的体外抑制活性IC50＜20g/ml。
未见有关黄白粘盖牛肝菌的化学成分和药用活性研究报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供粘盖牛肝菌素(Suillin)的制备方法，该Suillin的分子式为C28H40O4，分子量为440，通过以下步骤实现：将原料黄白粘盖牛肝菌新鲜子实体1000g真空冻干粉碎后得干粉，置于棕色玻璃瓶中加乙酸乙酯室温浸提三次，过滤，合并滤液，旋转蒸发浓缩回收溶剂后得深褐色粘稠浸膏，干法将浸膏加到反相硅胶柱上，经80％-100％甲醇梯度洗脱，体外活性追踪，收集有活性洗脱峰溶剂溶解后上C8反相制备柱分离纯化，流动相为10％-96％甲醇梯度洗脱，再次收集细胞筛选有活性的洗脱峰，挥发溶剂后得淡黄色油状物(100mg)，即为目标化合物。
本发明的另一个目的是提供粘盖牛肝菌素(Suillin)与制剂允许的药物赋形剂或载体组合，在制备抗肿瘤药物中应用。
本发明所制备的含粘盖牛肝菌素(Suillin)的抗肿瘤药物，为抗乳腺癌药物、抗红白血病药物、抗宫颈癌药物、抗肝癌药物、抗结肠癌药物等。
本发明提供的药物，其制剂形式主要包括液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、软胶丸、软胶囊、滴丸剂或注射剂。
本发明提供的药物，制剂的给药形式主要包括口服给药或注射给药。
实验证明本发明提供的粘盖牛肝菌素(Suillin)，具有体外强烈抑制肿瘤细胞增殖的作用，经四甲基偶氮唑盐(简称MTT法)检测，对红白血病K562、乳腺癌BCAP37、乳腺癌MCF-7、宫颈癌HeLa、肝癌SMMC 7721、大肠癌SW620的平均半数抑制增值浓度IC50为6.71μg/ml，因此其与药用敷料组合，可在制备治疗恶性肿瘤药物中应用。本发明首次从我国云南黄白粘盖牛肝菌中分离纯化解析得到粘盖牛肝菌素(Suillin)，为进一步研制新的抗恶性肿瘤药物提供了科学依据，对开发利用我国真菌资源具有重要意义。
附图说明
图1粘盖牛肝菌素(Suillin)的液相色谱分析。
图2粘盖牛肝菌素(Suillin)化学结构。
图3不同浓度Suillin对六种肿瘤株的生长抑制曲线图。
图4为不同浓度Suillin杀伤宫颈癌HeLa细胞的显微图。
图5为不同浓度Suillin杀伤乳腺癌BCAP37细胞的显微图。
图6为不同浓度Suillin杀伤乳腺癌MCF-7细胞的显微图。
图7为不同浓度Suillin杀伤红白血病K562细胞的显微图。
图8为不同浓度Suillin杀伤结肠癌SW620细胞的显微图。
图9为不同浓度Suillin杀伤肝癌SMMC 7721细胞的显微图。
具体实施方式
以下将结合具体实施例和附图详细说明本发明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例一：从黄白粘盖牛肝菌中分离纯化抗肿瘤活性化合物及其结构鉴定
实验方法：
黄白粘盖牛肝菌[Suillus placidus(Bonord.)Singer]的新鲜子实体采自云南省昆明小河乡，由云南省农业科学院提供并鉴定。
1、提取和纯化：黄白粘盖牛肝菌新鲜子实体1000g真空冻干粉碎后得干粉100g，置于棕色玻璃瓶中加乙酸乙酯500ml室温浸提48小时后过滤，残渣再加4×500ml乙酸乙酯浸提合并滤液，旋转蒸发浓缩回收溶剂后得深褐色粘稠浸膏25g，取其中15g浸膏，干法将样品加到反相硅胶柱上(YMC-ODS-A，40250mm)，在洗脱时间30分钟内经80％-100％甲醇梯度洗脱，体外活性追踪，收集有活性洗脱峰(560mg)，取其中500mg溶剂溶解后上Hypersil BDS C8反相制备柱(20250mm)分离纯化，流动相为甲醇，在洗脱时间30分钟内经10％-96％甲醇梯度洗脱，再次收集细胞筛选有活性的洗脱峰，挥发溶剂后得淡黄色油状物(100mg)，即为目标化合物粘盖牛肝菌素(Suillin)。其液相色谱分析图参见附图1。
2.结构鉴定：核磁共振仪(INOVA-400)，质谱仪(Bruker Esquire 3000plus)，
实验结果：
粘盖牛肝菌素(Suillin)为淡黄色油状物，易溶于甲醇，分子式为C28H40O4化学名称为1，2，4-苯三醇，3-(3’，7’，11’，15’-四甲基)-2’，6’，10’，14’-十六稀；4-乙酰基(E，E，E)，属于聚异戊二稀苯酚类化合物。。ESI-MS：m/z 463.0[M+Na]+，479[M+K]+，458[M+NH4]+，439.2[M-H]-.
1H-NMR：1.59(6H，s)，1.60(3H，s)，1.68(3H，s)，1.78(3H，s)，1.96，(4H，m)，2.06(8H，m)，2.29(3H，s)，3.25(2H，m)，5.10(3H，d)，5.20(1H，d)，6.42(1H，d)，6.60(1H，d).
其一维和二维的核磁共振数据列于表1，Suillin的化学结构参见附图2。
表1 粘盖牛肝菌素(Suillin)的核磁数据
| 13C-NMRδ，ppm | DEPT 135 | HMBC | H-H COSY | |
| 1234567 | 142.181143.288120.429142.262113.711113.102170.937 | ssssdds | 5，66，1′1′5，1′658 | 65 |
| 81′2′3′4′5′6′7′8′9′10′11′12′13′14′15′16′17′18′19′20′ | 21.10024.048121.103138.49339.92926.965123.882135.82939.91126.820124.399135.21039.86526.594124.612131.49625.92517.90716.42016.26716.219 | qtdsttdsqtdsttdqqqqqq | 2’1′，4′，17′1′，4′，5′，17′2′，5′，6′，17′4′，6′4′，5′，18′5′，6′，8′，18′6′，9′，10′，18′8′，10′8′，9′，19′9′，10′，12′，19′10′，13′，14′，19′12′，14′12′，13′，16′，20′14′，16′，20′14′，20′2′，4′6′，8′10′，12′14′，16′ | 2′1′6′5′10′9′14′13′ |
实施例二：粘盖牛肝菌素(Suillin)对人肿瘤细胞株增殖抑制活性试验
实验方法：
1.人肿瘤细胞株及来源：六个肿瘤株系分别是红白血病K562，肝癌SMMC7721，乳腺癌BCAP37，MCF-7，宫颈癌HeLa，结肠癌SW620，均来自于浙江大学肿瘤研究所。
2.粘盖牛肝菌素(Suillin)、紫杉醇(四川太极制药有限公司产品)溶解在DMSO中配成20mg/ml母液，置于4℃冰箱，实验时用培养基分别稀释成不同的浓度梯度供用，确保稀释后溶液中DMSO含量小于0.2％。MTT(AMRESCO公司产品)用磷酸缓冲液(Phosphate-buffered Saline简称PBS)配成5mg/ml母液，置于4℃冰箱备用。
3.细胞培养：所有细胞均培养于RPMI 1640完全培养液，(SIGMA)，加10％体积的新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，100U/ml链霉素和100U/ml青霉素，37℃，5％CO2培养，培养48小时后用Olympus IX70万能显微镜(penguin 600CL CCD，Pixera)拍照记录。
4.采用四甲基偶氮唑盐(简称MTT法)检测受试药物对肿瘤细胞增殖的影响，选择对数生长期细胞，按5000-8000个/孔接种于96孔板中，每孔200ul，置37℃，5％CO2培养箱中培养4小时后按不同浓度加入离心除菌的供试药品及阳性对照，每个浓度设复孔6个，同时设6个空白对照孔(只含有完全培养基，不含药物)，继续培养至48小时，吸出孔板中培养液(贴壁细胞)，往每孔中加入浓度为5mg/ml的MTT 50ul，放入培养箱中孵育4小时后取出，2000rpm、4℃进行离心5min，轻轻吸出MTT溶液，每孔用PBS溶液2滴清洗多余的MTT，吸出PBS洗液，每孔加入150ul的DMSO，轻轻振荡孔板10min，待孔底部的结晶物充分溶解后，将孔板放入酶标仪中测波长在490nm处各孔的光吸收值，记录结果；实验重复三次，阳性对照使用紫杉醇。
取每一个浓度六孔OD值的平均值，按如下公式计算细胞增殖抑制率％：
抑制率％＝(OD空白-OD样品)/OD空白×100％。
实验结果见表2～表8，显微照片见附图4～附图9。
表2 紫杉醇对HeLa细胞的增殖抑制活性
| 受试样品 | 终浓度(μg/ml) | 测定次数(n) | 光密度(OD值)( X±SE) | 细胞增殖抑制率100％ |
| 空白紫杉醇 | 00.010.1110 | 66666 | 0.349±0.01030.318±0.01000.275±0.00900.162±0.01150.043±0.0026 | -9.0321.1153.5887.75 |
表3 Suillin对HeLa细胞的增殖抑制活性
| 受试样品 | 终浓度(μg/ml) | 测定次数(n) | 光密度(OD值)( X±SE) | 细胞增殖抑制率100％ |
| 空白Suillin | 02.5 | 66 | 0.374±0.02480.312±0.0086 | -16.49 |
| 5102040 | 6666 | 0.175±0.00610.155±0.00250.127±0.00760.08±0.0170 | 53.2158.4766.1378.61 |
表4 Suillin对Bcap-37细胞的增殖抑制活性
| 受试样品 | 终浓度(μg/ml) | 测定次数(n) | 光密度(OD值)( X±SE) | 细胞增殖抑制率100％ |
| 空白Suillin | 02.55102040 | 666666 | 0.383±0.01640.364±0.03720.173±0.02190.169±0.00640.137±0.01100.087±0.0235 | -4.9754.7055.7564.1177.35 |
表5 Suillin对MCF-7细胞的增殖抑制活性
| 受试样品 | 终浓度(μg/ml) | 测定次数(n) | 光密度(OD值)( X±SE) | 细胞增殖抑制率100％ |
| 空白Suillin | 02.55102040 | 666666 | 0.460±0.03310.305±0.07270.227±0.01650.195±0.02150.186±0.01160.137±0.0357 | -33.5750.5457.5059.6070.12 |
表6 Suillin对K562细胞的增殖抑制活性
| 受试样品 | 终浓度(μg/ml) | 测定次数(n) | 光密度(OD值)( X±SE) | 细胞增殖抑制率100％ |
| 空白Suillin | 02.55102040 | 666666 | 0.401±0.01410.281±0.02200.175±0.01390.155±0.01940.143±0.01500.089±0.0236 | -29.7556.3961.3064.2177.78 |
表7 Suillin对SW620细胞的增殖抑制活性
| 受试样品 | 终浓度(μg/ml) | 测定次数(n) | 光密度(OD值)( X±SE) | 细胞增殖抑制率100％ |
| 空白Suillin | 0255102040 | 666666 | 0.406±0.01290.374±0.03440.226±0.02890.188±0.00910.152±0.01550.097±0.0236 | -7.9644.4653.6562.6776.05 |
表8 Suillin对SMMC-7721细胞的增殖抑制活性
| 受试样品 | 终浓度(μg/ml) | 测定次数(n) | 光密度(OD值)( X±SE) | 细胞增殖抑制率100％ |
| 空白Suillin | 02.55102040 | 666666 | 0.376±0.01270.371±0.03540.233±0.05060.184±0.01160.149±0.01550.095±0.0236 | -1.4138.1851.0260.3274.76 |
表3～表8所示结果表明：Suillin对各种人的肿瘤细胞的抑制率呈明显的剂量依赖性关系，参见附图3，其中乳腺癌细胞Bcap37、MCF-7和宫颈癌HeLa细胞对该物质的毒性作用较敏感，IC50＜5g/ml。Suillin对受试的红白血病K562、乳腺癌Bcap37、MCF-7、宫颈癌HeLa、肝癌SMMC7721、结肠癌SW620等人肿瘤细胞株均具有强烈的抑制增殖活性，平均半数抑制增值浓度为6.71μg/ml(参见表9)，因此其与药用敷料组合，可在制备治疗恶性肿瘤药物中应用。本发明为进一步研制新的抗恶性肿瘤药物提供了科学依据，对开发利用我国真菌资源具有重要意义。
表9 suillin对不同人肿瘤细胞的半数增殖抑制浓度(IC50)结果
| 化合物 | IC50μg/ml±S.D. | |||||
| 紫杉醇Suillin | Bcap374.92±3.15 | K5628.24±3.64 | Hela0.58±0044.71±2.48 | MCF-74.94±1.48 | SMMC77219.84±3.21 | SW6207.65±1.62 |
本发明涉及的部分参考文献：
[1]丁明仁 文华安，中国的粘盖牛肝菌，菌物系统22(2)：182.
[2]Bong-Sik Yun，Hee-Chol Kang，Hiroyuki Koshino.et al，Suillusin，A Unique Benzofuran fromthe mushroom Suillus granulatus J.Nat.Prod 2001，64，1230-1231
[3]Tomasi S.，Lohezic L.，Devehat F.et al.Cytotoxic activity of methanol extracts fromBasidiomycete mushrooms on murine cancer cell lines.Pharmazie.2004，59(4)：290.
Claims (7)
1.一种粘盖牛肝菌素的制备方法，该粘盖牛肝菌素的分子式为C28H40O4，分子量为440，其特征是通过以下步骤实现：将原料黄白粘盖牛肝菌真菌真空冻干粉碎后得干粉，置于棕色玻璃瓶中加乙酸乙酯室温浸提，滤液经旋转蒸发浓缩回收后得深褐色粘稠浸膏，干法将浸膏加到反相硅胶柱上，经80％-100％甲醇梯度洗脱，收集有生物活性的洗脱峰溶剂溶解后上C8反相制备柱分离纯化，流动相为10％-96％甲醇梯度洗脱，再次收集细胞筛选有活性的洗脱峰，挥发溶剂后得淡黄色油状物，即为目标化合物。
2.根据权利要求1所述的一种粘盖牛肝菌素的制备方法，其特征是：获得的粘盖牛肝菌素与制剂允许的药物赋形剂或载体组合，在制备抗肿瘤药物中应用。
3.根据权利要求2所述的含粘盖牛肝菌素的组合物在制备抗乳腺癌药物中应用。
4.根据权利要求2所述的一种粘盖牛肝菌素的组合物在制备抗宫颈癌药物中应用。
5.根据权利要求2所述的一种粘盖牛肝菌素的组合物在制备抗肝癌药物中应用。
6.根据权利要求2所述的一种粘盖牛肝菌素的组合物在制备抗结肠癌药物中应用。
7.根据权利要求2所述的一种粘盖牛肝菌素的组合物在制备抗红白血病药物中应用。
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