CN102000120B - 一种从褐环粘盖牛肝菌中提取药用活性物质的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从褐环粘盖牛肝菌中提取药用活性物质的方法，以及提取物在抗氧化、抗肿瘤中的应用。所说的提取方法一：将褐环粘盖牛肝菌子实体干粉与石油醚混合、搅拌，收集上清液后减压浓缩，浓缩物真空干燥得石油醚提取物，将子实体粉末烘干。将石油醚提取物采用硅胶柱层析，获得单一组分ns7，分子式C₂₈H₄₀O₄，分子量440。还可以将石油醚萃取后的干粉与乙酸乙酯混合，重复方法一操作，获得乙酸乙酯提取物浸膏。还可以将乙酸乙酯萃取后的干粉与无水乙醇混合，重复方法一操作，获得乙醇提取物。获得的提取物均具较强的抗氧化、抗肿瘤功效，可做为抗氧化、抗肿瘤保健品及药物开发的原料或前体。

Description

一种从褐环粘盖牛肝菌中提取药用活性物质的方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种从褐环粘盖牛肝菌[Suillus luteus]中提取药用活性物质的方法，以及提取物在抗氧化、抗肿瘤保健产品、药品开发中的应用，属于医药制备技术领域。

背景技术

可食用大型真菌具有食用、药用双重功效，除含丰富的营养物质外，还含多糖、小分子次生代谢物等多种生理活性成分，具有提高免疫力、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗细菌等生理功效。大型真菌属于“创造系数”很高的生物资源，它所含的次生代谢产物化学结构多样且新颖，这种化学结构多样性对于现代保健品、药物和农药先导化合物的发现至关重要，近年来受到研究者广泛关注。目前对大型真菌天然活性物质的研究与开发主要集中在多糖领域，市场上以食药用菌多糖为原料的保健产品很多，其中，灵芝多糖、香菇多糖、茯苓多糖和裂褶菌多糖等注射液做为癌症患者治疗的辅助药物，已在临床上得到正式应用。国内外对大型真菌中小分子活性物质的研究多采用单一有机溶剂萃取，常用的有乙醇、甲醇、乙酸乙酯等，然后以获得的粗提物为材料，进行功效研究。由于小分子种类及结构的复杂性，单一有机溶剂获得的萃取物并不能全面反映小分子活性物质的种类。牛肝菌在大型真菌中是一个较大的家族，种类繁多，其中有著名的食用菌美味牛肝菌，也有一些有毒的种类。褐环粘盖牛肝菌(Suillus luteus)，中文别名：土色牛肝菌、褐环乳牛肝菌，是一种可食用牛肝菌，也是我国野生食用菌出口的主要品种之一。目前国内已

有对其人工驯化栽培的研究。资料记载此菌含有胆碱(choline)及腐胺(putrescine)等生物碱；对小鼠肉瘤180和艾氏癌的抑制率为90％和80％。该菌与落叶松、乔松、云南松、高山松等形成外生菌根。León F.等(2008)分析了该菌子实体的乙醇提取物，从中分离纯化到11种小分子化合物。国内未见对该菌的研究报道，只有以黄白粘盖牛肝菌(Suillus placidus)为材料的

《粘盖牛肝菌素的制备方法及应用》专利(申请号：200610053593.3)。因此，对褐环粘盖牛肝菌进行深入研究，寻找从褐环粘盖牛肝菌中提取药用活性物质的简单方法，进而开展活性提取物质的应用，对开发利用真菌资源具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种从褐环粘盖牛肝菌中提取药用活性物质的方法。

本发明的目的还在于提供上述方法获得的提取物在抗氧化、抗肿瘤保健产品及药物中的应用。

本发明采取的技术构思如下：在化学、生物化合物分离制备技术领域，液-固萃取法是利用溶剂对固体混合物中所需成分的溶解度大，对杂质的溶解度小的原理，把固体物质放于溶剂中长期浸泡而达到萃取的目的。本发明提供的方法是采用极性不同的三种有机溶剂，即非极性的石油醚、中极性的乙酸乙酯、极性的乙醇，分步萃取褐环粘盖牛肝菌的子实体，获得极性不同的萃取物，即药用活性物质。分析不同极性萃取物的抗氧化、抗肿瘤效果。然后，采用层析法，分离、纯化抗氧化、抗肿瘤单一组分，为抗氧化、抗肿瘤保健产品或药品的开发提供科学依据。层析法是利用不同的物质在固定相与流动相中不同的平衡分配系数来进行分离的一种方法。在层析分离中，试样混合物在固定相和流动相之间连续不断地进行分配平衡，不同的化合物由于它们之间的理化性质的差异，在两相中存在的量也各不相同因而得到分离。

具体的，本发明所说的从褐环粘盖牛肝菌中提取药用活性物质的方法一：

取烘干后的褐环粘盖牛肝菌子实体干粉，与石油醚按质量体积比(0.1～1)∶20(g∶mL)比例混合后，进行以下步骤(A)操作：搅拌2h，静置过夜，滤纸过滤收集上清液，重复操作3～5次，合并上清液，将合并后的上清液于40～45℃减压浓缩，得到褐色粘稠石油醚提取物；

然后用真空干燥箱干燥得石油醚提取物浸膏，称重，计算产率。将子实体粉末滤尽，烘干备用。

本发明还可以采取方法二：将方法一得到的石油醚提取物采用300-400目硅胶柱，石油醚与乙酸乙酯按体积比为8∶1混合液做洗脱液，三次层析后获得石油醚单一组分提取物，命名为ns7。经质谱、核磁分析，确定该单一组的分子式为C₂₈H₄₀O₄，分子量为440，结构式(见附图1)。该物质与粘盖牛肝菌素(Suillin)为同分异构体(见附图2)。

本发明还可以采取方法三：将方法一萃取后的子实体干粉与乙酸乙酯按质量体积比(0.1～1)∶20(g∶mL)比例混合后，重复方法一中的步骤(A)操作：搅拌2小时，静置过夜，滤纸过滤收集上清液，重复操作3～5次，合并上清液，将合并后的上清液于40～45℃减压浓缩，获得乙酸乙酯提取物浸膏，称重，计算产率。将子实体粉末滤尽，烘干备用。

本发明还可以采取方法四：将方法三萃取后的子实体干粉与无水乙醇按质量体积比(0.1～1)∶20(g∶mL)比例混合后，重复方法一中的步骤(A)操作：搅拌2小时，静置过夜，滤纸过滤收集上清液，重复操作3～5次，合并上清液；将合并后的上清液于40～45℃减压浓缩，获得乙醇提取膏状物，称重并计算产率。

各方法提取物的得率＝[每种提取物的质量(g)/子实体干粉的质量(g)]×100％

各提取方法得到的提取物的得率见表1。

表1 褐环粘盖牛肝菌子实体四种提取物的得率(％)

注：石油醚单一组分ns7的得率为100克石油醚提取物中的含量。

为实现本发明获得的活性物质应用的目的，申请人进行了以下实验研究：

(1)四种提取物的抗氧化活性测定

方法：采用清除DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基能力方法。

具体操作如下：

将褐环粘盖牛肝菌四种提取物分别用无水甲醇配置成20mg/mL的母液。随后，用无水甲醇稀释母液，得0.5mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL的样品溶液，用于清除DPPH自由基的检测。

取2mL不同浓度的样品溶液于试管中，向其中加入2mL无水乙醇配制的浓度为2×10^-4mol/L的DPPH自由基溶液，混合均匀后避光反应30min，于517nm处测定其吸光值(A)。同时测定2mL不同浓度样品溶液与2mL无水乙醇的吸光值；2mL DPPH自由基溶液和2mL无水甲醇的吸光值。以Vc作阳性对照。每个实验组重复3次，按下面公式计算样品的DPPH自由基清除率：

样品的DPPH清除率(％)＝[A₀-(Ai-Aj)]/A₀×100％

其中：A₀是2mL DPPH+2mL无水甲醇的吸光值；Ai是2mL DPPH+2mL样品液的吸光值；Aj是2mL DPPH+2mL无水乙醇的吸光值。

实验数据采用Statistica 6.0进行统计分析，IC₅₀软件计算提取物的IC₅₀值，结果见表2。

表2 褐环粘盖牛肝菌四种提取物清除DPPH自由基的IC₅₀比较

由表2可知：褐环粘盖牛肝菌的四种提取物均具有较强的清除DPPH自由基的能力，尤其是石油醚提取物和石油醚单一组分ns7，IC₅₀值接近或远小于阳性对照Vc，具有显著的体外抗氧化活性。以上实验表明，褐环粘盖牛肝菌的四种提取物可用于抗氧化保健产品及抗氧化药品的制备。

(2)四种提取物的抗肿瘤活性测定

方法：采用MTT法(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法)检测四种提取物对BGC人胃癌细胞的细胞毒活性。

具体操作如下：取对数生长期的BGC人胃癌细胞，以1×10⁵/mL细胞浓度接种于96孔培养板中，每孔加入100μL。空白组不接种细胞，只加入100μL含血清的RPMI(Roswell Park Memorial Institute)1640培养基。各提取物和抗肿瘤对照药物顺铂用二甲基亚砜(DMSO)配成终浓度为20mg/mL的母液。CO₂培养箱中培养24h后，每孔加入100μL各提取物(用无血清的RPMI 1640培养基稀释)，终浓度为25、50、100、200、400μg/mL。空白组和阴性对照组加入100μL不含药物的无血清培养基，每个处理4次重复。CO₂培养箱(37℃)培养48h后，2000r/min离心10min，弃去上清液，每孔加入100μL无血清培养基及MTT(3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑)20μL，继续培养4h，离心(2000r/min，10min)，弃上清，每孔加DMSO(二甲基亚砜)150mL，震荡10min，用酶标仪测波长570nm的OD值。根据下列公式计算各提取物对肿瘤细胞增殖的抑制率。

石油醚单一组分ns7对K562(人红白血病细胞)、Hela(人子宫颈癌细胞)、SMMC7721(人肝癌细胞)等肿瘤细胞的MTT法检测方法同上。

提取物对肿瘤细胞增殖的抑制率＝[1-(实验组OD/对照组OD)]×100％

实验数据采用Statistica 6.0进行统计分析，IC₅₀软件计算提取物的IC₅₀值，结果见表3。

表3 褐环粘盖牛肝菌四种提取物对BGC人胃癌细胞增殖的IC₅₀值比较

表4 石油醚单一组分ns7

对K562、Hela、SMMC7721肿瘤细胞增殖的IC₅₀值比较

由表3可知：褐环粘盖牛肝菌的四种提取物对BGC人胃癌细胞增殖具有不同程度的抑制作用。各有机相中，石油醚提取物的抑制效果最好，其次为乙酸乙酯提取物。而从石油醚提取物中分离纯化得到的单一组分ns7，对BGC人胃癌细胞增殖具有更显著的抑制作用。从表4可知，ns7还具有显著的抑制K562、Hela、SMMC7721肿瘤细胞增殖的作用，特别是对K562(人红白血病细胞)的增殖具很高的活性。ns7虽然与粘盖牛肝菌素(Suillin)为同分异构体，但其IC₅₀值相对于粘盖牛肝菌素(Suillin)更低，因此，具有更强的体外抗肿瘤活性。

以上实验表明，褐环粘盖牛肝菌的四种提取物可作为抗肿瘤保健产品的原料或抗肿瘤药物前体。

本发明取得的有益效果如下：(1)本发明属于纯天然活性物质的提取方法，提取过程中使用的溶剂残留极少，对人无害且不会造成环境污染，属于环境友好型；(2)本发明的方法简单易行、成本低；(3)本发明通过层析技术分离纯化得到的单一组分ns7，具有很高的抗氧化及抗肿瘤活性，可作为药物研发的前体，有效地减小药物的服用剂量和副作用。

附图说明

图1是褐环粘盖牛肝菌石油醚单一组分ns7的化学结构图。

图2是粘盖牛肝菌素(Suillin)化学结构图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明。

实施例1 褐环粘盖牛肝菌石油醚提取物的提取(制备)方法

(1)褐环粘盖牛肝菌新鲜子实体干燥后粉碎得干粉；

(2)褐环粘盖牛肝菌子实体干粉与石油醚按质量体积比(0.1～1)∶20(g∶mL)比例混合后，搅拌2h，静置过夜，用抽滤和倒吸的方法吸出滤液(上层清液用倒吸法，下层用抽滤法，滤器铺有滤纸)，合并滤液后于40-45℃减压浓缩；

(3)如此反复抽提3-5次，直到颜色非常浅。将子实体粉末滤尽，烘干备用；

(4)将浓缩得到的褐色粘稠石油醚提取物用真空干燥箱干燥得浸膏，称重，计算石油醚提取物产率：[产物(g)/干粉总重(g)]×100％＝3.90％。将产物置于-20℃冷冻保存备用。

实施例2 分子量为440单一组分的获得方法

(1)将石油醚提取物用石油醚溶解，用毛细管点样器吸取少量样品溶液，于硅胶板上点样，以不同梯度的展开剂在展缸内展开，用紫外照射，碘蒸气熏蒸和磷钼酸显色等方法检测，确定石油醚粗提物中主要物质的洗脱条件为石油醚∶乙酸乙酯8∶1。

(2)取300-400目柱层析硅胶，加入干硅胶体积一倍量的石油醚，用玻璃棒充分搅拌，直至将硅胶中的气泡赶净。

(3)向中压层析柱中加入约1/3体积石油醚，再将搅拌均匀的硅胶匀浆缓缓倒入层析柱中，让其自然沉降，同时用洗耳球轻轻敲打柱壁，使其沉降均匀。沉降完成后，将层析柱两端旋紧，连上恒流泵，调节流速为20ml/min，用石油醚加压充分压实柱床。柱床约被压缩至9/10体积。

(4)采用干法上样，将石油醚提取物用石油醚充分溶解，用微孔滤膜(0.22μm)过滤，除去其中不溶解的杂质。向石油醚溶液中加入少许100-200目的粗硅胶，搅拌均匀后在旋转蒸发器上去除石油醚，这样样品就会均匀的吸附在粗硅胶上。将拌有样品的粗硅胶小心的加到装好的柱床上，用玻璃棒轻轻搅拌以除去其中的气泡(注意在搅拌过程中不要触及下层的柱床，保持柱面平整)，在加好样品的柱面上加上一张与柱直径相同的滤纸，并压上少许玻璃珠，以免在洗脱过程中冲坏柱面。

(5)根据薄层层析结果，设计洗脱条件为石油醚∶乙酸乙酯8∶1，200mL收一馏分，每一个馏分用旋转蒸发器旋转浓缩至3-4mL置于收集管中。如此层析三次。用毛细管点样器吸取少量收集液，于硅胶板上点样，在展缸内展开，用紫外照射，碘蒸气熏蒸和磷钼酸显色等方法检测。

(6)将经上述三种方法检测为单一点的馏分收集，上样于高效液相色谱仪，乙腈和水作为洗脱剂梯度洗脱(由20％乙腈、80％水到纯乙腈)，检测样品为单一峰，确定为单一组分，命名为ns7。

(7)运用红外光谱(IR)、质谱(FAB-MS)、核磁共振(1H NMR、13C NMR、HMBC、HSQC)等现代波谱技术，参照有关文献图谱数据，确定单一组分ns7的分子式为C₂₈H₄₀O₄，分子量为440，结构式(见附图1)。通过对比发现，该物质与粘盖牛肝菌素(Suillin)为同分异构体。

以获得的ns7的质量与石油醚提取物的质量计算得率，为2.94％(见表1)。

实施例3 褐环粘盖牛肝菌乙酸乙酯提取物的(提取)制备方法

(1)将石油醚萃取后的子实体干粉与乙酸乙酯按质量体积比(0.1～1)∶20(g∶mL)混合，搅拌2h，静置过夜。用抽滤和倒吸的方法吸出滤液(上层清液用倒吸法，下层用抽滤法)，合并滤液后于40-45℃减压浓缩；

(2)如此反复抽提3-5次，直到颜色非常浅。将子实体粉末滤尽，烘干备用；

(3)将浓缩得到的粘稠浸膏用真空干燥箱干燥，称重，计算乙酸乙酯提取物产率：[产物(g)/干粉总重(g)]×100％＝3.27％。得到乙酸乙酯提取物浸膏，将产物置于-20℃冷冻保存备用。

实施例4 褐环粘盖牛肝菌乙醇提取物的制备方法

(1)将乙酸乙酯萃取后的子实体干粉与乙醇按质量体积比(0.1～1)∶20(g∶mL)混合，搅拌2h，静置过夜。用抽滤和倒吸的方法吸出滤液(上层清液用倒吸法，下层用抽滤法)，合并滤液后于40-45℃减压浓缩；

(2)如此反复抽提3-5次，直到颜色非常浅。将子实体粉末滤尽、烘干；

(3)将浓缩得到的粘稠浸膏用真空干燥箱干燥，称重，计算乙醇提取物产率：[产物(g)/干粉总重(g)]×100％＝4.23％。得到的乙醇提取物膏状物置于-20℃冷冻保存备用。

实施例5 褐环粘盖牛肝菌石油醚提取物清除DPPH自由基能力检测

(1)样品的制备：将褐环粘盖牛肝菌石油醚提取物用无水甲醇配置成20mg/mL的母液，4℃保存备用。母液用无水甲醇或蒸馏水稀释为浓度是0.5mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL的样品溶液，用于清除DPPH自由基的检测；

(2)取2mL不同浓度的样品溶液于试管中，向其中加入2mL乙醇配置的浓度为2×10^-4mol/L的DPPH自由基溶液，混匀，暗处反应30min后于517nm处测定其吸光值；同时测2mL不同浓度样品溶液与2mL无水乙醇的吸光值；2mL DPPH自由基溶液和2mL无水甲醇的吸光值。以Vc作为阳性对照。每个实验组重复3次，按以下公式计算样品的DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率(％)＝[A₀-(Ai-Aj)]/A₀×100％

其中：A₀是2mL DPPH+2mL无水甲醇的吸光值；Ai是2mL DPPH+2mL样品液的吸光值；Aj是2mL DPPH+2mL无水乙醇的吸光值；

(3)数据处理：实验数据用Statistica 6.0进行统计分析，并用IC₅₀软件计算提取物的IC₅₀值，为0.017mg/mL，而阳性对照Vc的IC₅₀值为0.015mg/mL。

实施例6 分子量440单一组分ns7清除DPPH自由基能力检测

(1)样品的制备：将分子量为440的单一组分ns7用无水甲醇配置成20mg/mL的母液，4℃保存备用。母液用无水甲醇或蒸馏水稀释为浓度是0.5mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL的样品溶液，用于清除DPPH自由基的检测；

(2)取2mL不同浓度的样品溶液于试管中，再向其中加入2mL乙醇配置的浓度为2×10^-4mol/L的DPPH自由基溶液，混合均匀，暗处反应30min后于517nm处测定其吸光值；同时测2mL不同浓度样品溶液与2mL无水乙醇的吸光值；2mL DPPH自由基溶液和2mL无水甲醇的吸光值。以Vc作为阳性对照。每个实验组重复3次，按以下公式计算样品的DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率(％)＝[A₀-(Ai-Aj)]/A₀×100％

其中：A₀是2mL DPPH+2mL无水甲醇的吸光值；Ai是2mL DPPH+2mL样品液的吸光值；Aj是2mL DPPH+2mL无水乙醇的吸光值；

(3)数据处理：实验数据用Statistica 6.0进行统计分析，并用IC₅₀软件计算单一组分ns7提取物的IC₅₀值为0.0044mg/mL，而阳性对照Vc的IC₅₀值为0.015mg/mL，远远低于阳性对照。

实施例7 褐环粘盖牛肝菌乙酸乙酯提取物清除DPPH自由基能力检测

(1)样品的制备：将褐环粘盖牛肝菌乙酸乙酯提取物用无水甲醇配置成20mg/mL的母液，4℃保存备用。母液用无水甲醇或蒸馏水稀释为浓度是0.5mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL的样品溶液，用于清除DPPH自由基的检测；

(2)取2mL不同浓度的样品溶液于试管中，再向其中加入2mL乙醇配置的浓度为2×10^-4mol/L的DPPH自由基溶液，混合均匀，暗处反应30min后于517nm处测定其吸光值；同时测2mL不同浓度样品溶液与2mL无水乙醇的吸光值；2mL DPPH自由基溶液和2mL无水甲醇的吸光值。以Vc作为阳性对照。每个实验组重复3次，按以下公式计算样品的DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率(％)＝[A₀-(Ai-Aj)]/A₀×100％

其中：A₀是2mL DPPH+2mL无水甲醇的吸光值；Ai是2mL DPPH+2mL样品液的吸光值；Aj是2mL DPPH+2mL无水乙醇的吸光值；

(3)数据处理：实验数据用Statistica 6.0进行统计分析，并用IC₅₀软件计算乙酸乙酯提取物的IC₅₀值为0.18mg/mL，而阳性对照Vc的IC₅₀值为0.015mg/mL。

实施例8 褐环粘盖牛肝菌乙醇提取物清除DPPH自由基能力检测

(1)样品的制备：将褐环粘盖牛肝菌乙醇提取物用无水甲醇配置成20mg/mL的母液，4℃保存备用。母液用无水甲醇或蒸馏水稀释为浓度是0.5mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL的样品溶液，用于清除DPPH自由基的检测；

(2)取2mL不同浓度的样品溶液于试管中，再向其中加入2mL乙醇配置的浓度为2×10^-4mol/L的DPPH自由基溶液，混合均匀，暗处反应30min后于517nm处测定其吸光值；同时测2mL不同浓度样品溶液与2mL无水乙醇的吸光值；2mL DPPH自由基溶液和2mL无水甲醇的吸光值。以Vc作为阳性对照。每个实验组重复3次，按以下公式计算样品的DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率(％)＝[A₀-(Ai-Aj)]/A₀×100％

其中：A₀是2mL DPPH+2mL无水甲醇的吸光值；Ai是2mL DPPH+2mL样品液的吸光值；Aj是2mL DPPH+2mL无水乙醇的吸光值；

(3)数据处理：实验数据用Statistica 6.0进行统计分析，并用IC₅₀软件计算乙醇提取物的IC₅₀值为0.26mg/mL，而阳性对照Vc的IC₅₀值为0.015mg/mL。

实施例9 褐环粘盖牛肝菌石油醚提取物抗肿瘤作用的四甲基偶氮唑盐(简称MTT法)检测

(1)取对数生长期BGC人胃癌细胞，用10％小牛血清的RPMI 1640培养基配成单细胞悬液，细胞浓度为1×10⁵个/mL，接种于96孔板中，每孔加100μL。

(2)空白组不接种细胞，只加入100μL含血清的RPMI 1640培养基。CO₂培养箱中37℃培养24h后，实验组每孔再加入100μL用无血清的RPMI1640培养基稀释的石油醚提取物，终浓度为25、50、100、200、400μg/mL。空白组和阴性对照组均加入100μL不含药物的无血清培养基。每组均做6个重复。培养48h后，2000r/min离心10min，弃去上清液，每孔加入100μL无血清培养基及20μL 5mg/mL MTT，继续培养4h，离心去上清，加入150μL DMSO，震荡10min，酶标仪测定570nm的A值。根据下列公式计算对肿瘤细胞的抑制率：

肿瘤细胞的抑制率％＝[(阴性对照组A-实验组A)/阴性对照组A]×100％

(3)数据处理：实验数据采用Statistica 6.0进行统计分析，IC₅₀软件计算提取物的IC₅₀值。石油醚提取物对BGC人胃癌细胞增殖抑制率的IC₅₀值为25.37μg/mL，阳性对照顺铂的IC₅₀值为3.25μg/mL。

实施例10 分子量440单一组分ns7抗肿瘤作用的MTT检测

(1)取对数生长期BGC人胃癌细胞，用10％小牛血清的RPMI 1640培养基配成单细胞悬液，细胞浓度为1×10⁵个/mL，接种于96孔板中，每孔加100μL。

(2)空白组不接种细胞，只加入100μL含血清的RPMI 1640培养基。CO₂培养箱中培养24h后，实验组每孔再加入100μL用无血清的RPMI1640培养基稀释单一组分，终浓度为25、50、100、200、400μg/mL。空白组和阴性对照组均加入100μL不含药物的无血清培养基。每组均做6个重复。培养48h后，2000r/min离心10min，弃去上清液，每孔加入100μL无血清培养基及20μL 5mg/mL MTT，继续培养4h，离心去上清，加入150μL DMSO，震荡10min，酶标仪测定570nm的A值。根据下列公式计算对肿瘤细胞的抑制率：

肿瘤细胞的抑制率％＝[(阴性对照组A-实验组A)/阴性对照组A]×100％

(3)数据处理：实验数据采用Statistica 6.0进行统计分析，IC₅₀软件计算提取物的IC₅₀值。分子量440的单一组分ns7对BGC人胃癌细胞增殖抑制率的IC₅₀值为7.91μg/mL，阳性对照顺铂的IC₅₀值为3.25μg/mL。

按上述相同方法测定ns7对K562、Hela、SMMC7721肿瘤细胞增殖抑制率的IC₅₀值，结果分别为1.12、14.68、15.52μg/mL(见表4)。

实施例11 褐环粘盖牛肝菌乙酸乙酯提取物抗肿瘤作用的MTT检测

(1)取对数生长期BGC人胃癌细胞，用10％小牛血清的RPMI 1640培养基配成单细胞悬液，细胞浓度为1×10⁵个/mL，接种于96孔板中，每孔加100μL。

(2)空白组不接种细胞，只加入100μL含血清的RPMI 1640培养基。CO₂培养箱中培养24h后，实验组每孔再加入100μL用无血清的RPMI1640培养基稀释的乙酸乙酯提取物，终浓度为25、50、100、200、400μg/mL。空白组和阴性对照组均加入100μL不含药物的无血清培养基。每组均做6个重复。培养48h后，2000r/min离心10min，弃去上清液，每孔加入100μL无血清培养基及20μL 5mg/mL MTT，继续培养4h，离心去上清，加入150μL DMSO，震荡10min，酶标仪测定570nm的A值。根据下列公式计算对肿瘤细胞的抑制率：

肿瘤细胞的抑制率％＝[(阴性对照组A-实验组A)/阴性对照组A]×100％

(3)数据处理：实验数据采用Statistica 6.0进行统计分析，IC₅₀软件计算提取物的IC₅₀值。乙酸乙酯提取物对BGC人胃癌细胞增殖抑制率的IC₅₀值为35.63μg/mL，阳性对照顺铂的IC₅₀值为3.25μg/mL。

实施例12 褐环粘盖牛肝菌乙醇提取物抗肿瘤作用的MTT检测

(1)取对数生长期BGC人胃癌细胞，用10％小牛血清的RPMI 1640培养基配成单细胞悬液，细胞浓度为1×10⁵个/mL，接种于96孔板中，每孔加100μL。

(2)空白组不接种细胞，只加入100μL含血清的RPMI 1640培养基。CO₂培养箱中培养24h后，实验组每孔再加入100μL用无血清的RPMI1640培养基稀释的乙醇提取物，终浓度为25、50、100、200、400μg/mL。空白组和阴性对照组均加入100μL不含药物的无血清培养基。每组均做6个重复。培养48h后，2000r/min离心10min，弃去上清液，每孔加入100μL无血清培养基及20μL 5mg/mL MTT，继续培养4h，离心去上清，加入150μL DMSO，震荡10min，酶标仪测定570nm的A值。根据下列公式计算对肿瘤细胞的抑制率：

肿瘤细胞的抑制率％＝[(阴性对照组A-实验组A)/阴性对照组A]×100％

(3)数据处理：实验数据采用Statistica 6.0进行统计分析，IC₅₀软件计算提取物的IC₅₀值。乙醇提取物对BGC人胃癌细胞增殖抑制率的IC₅₀值为85.54μg/mL，阳性对照顺铂的IC₅₀值为3.25μg/mL。

实施例13 褐环粘盖牛肝菌乙醇提取物的体内抗氧化实验

方法：采用D-半乳糖衰老模型。将健康雄性昆明小鼠(体重在23-26g)适应性饲养7d后，随机分为衰老组(M)，空白对照组(C)，阳性对照组(X1、X2、X3)和给药组(Y1、Y2、Y3)共4组，每组12只。将褐环粘盖牛肝菌乙醇提取物、阳性对照物Vc用生理盐水配制成所需的浓度。D-半乳糖的注射量为120mg/(kg·d)。各组处理方法如下：

衰老组(M)：每日皮下注射0.2mL D-半乳糖，灌胃等量的生理盐水。

空白对照组(C)：每日皮下注射等量的生理盐水。

给药组：每日皮下注射0.2mL D-半乳糖，分别以浓度为100mg/(kg·d)(Y1)、200mg/(kg·d)(Y2)、400mg/(kg·d)(Y3)的乙醇提取物灌胃。

阳性对照组：每日皮下注射0.2mL D-半乳糖，分别以浓度为100mg/(kg·d)(X1)、200mg/(kg·d)(X2)、400mg/(kg·d)(X3)的Vc灌胃。

每天灌胃小鼠1次，每次0.2mL，连续30d。各组均在室温(20-25℃)环境下常规饲养，自然光照12h白天、12h黑夜，自由饮水、进食。连续灌胃30d后，禁食24h。眼眶采血，低温离心分离血清(4℃，3000r/min，10min)，-20℃保存备用。将取血后的小鼠颈椎脱臼处死，取肝用预冷的PBS缓冲液(0.2mol/L，pH7.4)做成肝匀浆(1.0g湿组织加9.0mL缓冲液)，于4℃，6000r/min离心10min，分离上清，-20℃保存备用。采用黄嘌呤氧化酶法检测SOD(超氧化化物岐化酶)活力(参考试剂盒说明)，二硫代二硝基苯甲酸法检测GSH-px(谷胱甘肽过氧化物酶)活力(参考试剂盒说明)，硫代巴比妥酸法检测MDA(丙二醛)含量(参考试剂盒说明)。

结果1：乙醇提取物对小鼠血清和肝组织中SOD活性的影响

SOD在机体的氧化和抗氧化平衡过程中起着重要的作用。SOD能清除超氧阴离子(O^2-·)自由基，保护细胞免受损伤。乙醇提取物对小鼠血清和肝组织中SOD活性的影响结果见表5。

表5 褐环粘盖牛肝菌乙醇提取物对小鼠的血清和肝组织中SOD活性影响

注：每个值均为：x±SD，n＝12；字母a为与衰老模型组相比p＜0.05，b为与衰老模型组相比p＜0.01。

由表5可见，衰老模型组与空白对照组相比，血清和肝组织SOD活力分别下降了28.5％和22.8％，明显低于空白组(p＜0.05)，说明衰老模型的建立是成功的。以乙醇提取物灌胃的给药组，随着处理浓度的增高，血清和肝组织中SOD活性明显增强。在100mg/kg·d剂量时，血清和肝组织的SOD活力与衰老模型组相比提高了46.7％和30.3％，与空白组相比分别提高了4.9％和0.66％，与同剂量的Vc组血清和肝组织中SOD活性相比，给药组血清中SOD的活性明显要高，而肝组织中SOD活性与Vc组相差不明显(p＞0.05)。在400mg/kg·d剂量时血清和肝组织中的SOD活性明显增加，与衰老组相比分别提高了100％以上和66％，与空白组相比分别提高了81.6％和28.2％，但明显低于高剂量Vc组。由此可见，褐环粘盖牛肝菌牛肝菌乙醇相可提高小鼠体内的SOD活性，对清除体内的·O^2-，维持氧化和抗氧化的平衡起到具有十分重要的作用。

结果2：乙醇提取物对小鼠血清和肝组织中GSH-px活性的影响

GSH-px是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶。乙醇提取物对小鼠血清和肝组织中GSH-px活性的影响结果见表6。

表6褐环粘盖牛肝菌乙醇提取物对小鼠血清和肝组织中GSH-px活性影响

注：每个值均为：x±SD，n＝12；字母a为与衰老模型组相比p＜0.05，b为与衰老模型组相比p＜0.01。

由表6可见，衰老组血清和肝组织中GSH-px的活力值与空白组相比降低了36.1％和68.1％。以褐环粘盖牛肝菌乙醇相灌胃的给药组，随浓度的增加血清和肝组织GSH-px的含量都有明显增加。在100mg/kg·d剂量时血清和肝组织的GSH-px活力值与衰老组相比分别提高了51.8％和100％以上；与空白组相比，血清中GSH-px活力值与之相差不明显，而肝组织的酶活力提高了25.2％；与同剂量的Vc组相比分别提高了20％和100％以上。在400mg/kg·d剂量时血清和肝组织中GSH-px活力值，显著高于空白组、衰老组及同剂量Vc组。说明褐环粘盖牛肝菌乙醇相使GSH-px活性增加，GSH-px对活性氧和组织产生的·OH及H₂O₂有较强的清除能力，可减轻脂质过氧化对机体组织的损伤，在防止畸变，预防衰老方面有非常重要的作用。

结果3：乙醇提取物对小鼠血清和肝组织中MDA含量的影响

MDA是在脂质过氧化过程中产生的，因此MDA的量常常可反应机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞的损伤程度。MDA的测定常常与SOD的测定相互配合，SOD活力的高低间接反应了机体清除氧自由基的能力，而MDA的高低又间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重度。乙醇提取物对小鼠血清和肝组织中MDA含量的影响结果见表7。

表7 褐环粘盖牛肝菌乙醇提取物对小鼠的血清和肝组织中MDA含量影响

注：每个值均为：x±SD，n＝12；字母a为与衰老模型组相比p＜0.05，b为与衰老模型组相比p＜0.01。

由表7可见，在D-半乳糖的作用下，衰老组的血清和肝组织中的MDA的含量与空白组相比分别提高了10.3％和32.7％。以褐环粘盖牛肝菌乙醇相灌胃的给药组，在100mg/kg·d剂量时就表现出较好的抑制MDA产生的作用，血清和肝组织中MDA的含量与衰老组相比分别降低了22.9％和33.3％，与空白组相比分别降低了13％和11.6％；与同剂量的Vc组相比，血清中MDA含量降低了40.4％，但肝组织中MDA含量与之相差不明显(p＞0.05)。在400mg/kg·d剂量时，血清和肝组织中MDA的含量显著下降，与衰老组相比分别降低了45.7％和87.5％，与空白组相比分别降低了40.1％和83.4％，与同剂量Vc组的MDA含量相差不明显(p＞0.05)。MDA是氧自由基损伤组织或细胞导致脂质过氧化的代谢产物，含量高低反应了机体受自由基攻击的严重程度，由此表明，褐环粘盖牛肝菌乙醇相有抑制MDA产生，减少细胞膜脂质过氧化的作用。

Claims (5)

1.一种从褐环粘盖牛肝菌中提取药用活性物质的方法，其特征在于：取烘干后的褐环粘盖牛肝菌子实体干粉，与石油醚按质量体积比0.1～1∶20/g∶mL比例混合后，搅拌2h，静置过夜，滤纸过滤收集上清液，重复操作3～5次，合并上清液，将合并后的上清液于40～45℃减压浓缩，得到褐色粘稠石油醚提取物，然后用真空干燥箱干燥得石油醚提取物，将所述石油醚提取物采用300-400目硅胶柱，以石油醚与乙酸乙酯按体积比为8∶1的混合液做洗脱液，如此层析三次，获得单一组分，其分子式为C₂₈H₄₀O₄，分子量为440，化学结构上与粘盖牛肝菌素为同分异构体，结构式为：

2.如权利要求1所述方法获得的单一组分的应用，其特征在于：作为制备抗氧化药物的前体。

3.一种从褐环粘盖牛肝菌中提取获得的石油醚提取物的应用，其特征在于：所述石油醚提取物的提取方法为，取烘干后的褐环粘盖牛肝菌子实体干粉，与石油醚按质量体积比0.1～1∶20/g∶mL比例混合后，搅拌2h，静置过夜，滤纸过滤收集上清液，重复操作3～5次，合并上清液，将合并后的上清液于40～45℃减压浓缩，得到褐色粘稠石油醚提取物，然后用真空干燥箱干燥得石油醚提取物，所述石油醚提取物作为制备抗肿瘤保健产品及抗肿瘤药物的原料。

4.一种从褐环粘盖牛肝菌中提取获得的乙酸乙酯提取物的应用，其特征在于，所述乙酸乙酯提取物的提取方法为：取烘干后的褐环粘盖牛肝菌子实体干粉，与石油醚按质量体积比0.1～1∶20/g∶mL比例混合后，搅拌2h，静置过夜，滤纸过滤收集上清液，重复操作3～5次，将子实体粉末滤尽、烘干，将石油醚萃取后的子实体干粉与乙酸乙酯按质量体积比0.1～1∶20/g∶mL比例混合，搅拌2h，静置过夜，滤纸过滤收集上清液，重复操作3～5次，合并上清液，将合并后的上清液于40～45℃减压浓缩，获得乙酸乙酯提取物，所述乙酸乙酯提取物作为制备抗肿瘤保健产品及抗肿瘤药物的原料。

5.一种从褐环粘盖牛肝菌中提取获得的乙醇提取物的应用，其特征在于，所述乙醇提取物的提取方法为：取烘干后的褐环粘盖牛肝菌子实体干粉，与石油醚按质量体积比0.1～1∶20/g∶mL比例混合后，搅拌2h，静置过夜，滤纸过滤收集上清液，重复操作3～5次，将子实体粉末滤尽、烘干，将石油醚萃取后的子实体干粉与乙酸乙酯按质量体积比0.1～1∶20/g∶mL比例混合，搅拌2h，静置过夜，滤纸过滤收集上清液，重复操作3～5次，将子实体粉末滤尽、烘干，将乙酸乙酯萃取后的子实体干粉与无水乙醇按质量体积比0.1～1∶20/g∶mL比例混合，搅拌2h，静置过夜，滤纸过滤收集上清液，重复操作3～5次，合并上清液，将合并后的上清液于40～45℃减压浓缩，获得乙醇提取物，所述乙醇提取物作为制备抗肿瘤、体内抗氧化保健产品的原料，及抗肿瘤、体内抗氧化药物的原料。

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