CN1285598C - 轮枝孢菌素a的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供轮枝孢菌素A的制备方法及在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明提供的轮枝孢菌素A的分子式为C30H28N6O6S4，分子量为695[M-H]-，是将原料黄赭鹅膏菌真空冻干粉碎后得干粉，加乙酸乙酯室温浸提，滤液蒸发浓缩回收，上C8或C18反相制备柱分离纯化得到。本发明提供的轮枝孢菌素A具有广谱抗肿瘤活性，经体外抗肿瘤活性检测，对10种肿瘤株均有强烈的抑制效应，对K562红白血病半数抑制增值浓度IC50为1.4×10-3ug/ml，因此其与药用敷料组合，可在制备抗肿瘤活性药物中应用。本发明为研究开发轮枝孢菌素A新的用途提供了科学依据，对开发我国真菌资源具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地说是从天然菌物中提取有效成分及其用途，尤其是从黄赭鹅膏菌(Amanita flavorubescens Alk.)上寄生菌歪孢菌(Hypomyces hyalines(Schw.)Tul.)中提取有效成分轮枝孢菌素A的方法，及在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
黄赭鹅膏菌(Amanita flavorubescens Alk.)属鹅膏菌科鹅膏菌属树木外生菌根菌，分布于西藏墨脱境内，记载有毒，对苍蝇等昆虫毒杀速度快，可用于农林业毒杀害虫(卯晓岚，中国大型真菌，河南科学技术出版社，2000年)。菌寄生菌歪孢菌(Hypomyces hyalines(Schw.)Tul.)为寄生菌属真菌，仅寄生于鹅膏菌属上(Rogerson，C.T.，and Samuels，G.J.，1994，Mocologial，86：839-866).迄今为止，未见有关这两种真菌的化学成分及医药用途报道。恶性肿瘤是当今威胁人类身心健康最严重的疾病，死亡率高，目前尚无治愈率较高的药物报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供轮枝孢菌素A(Verticillin A)的制备方法，该轮枝孢菌素A的分子式为C30H28N6O6S4，分子量为695[M-H]-，属于轮枝孢菌素类，通过以下步骤实现：将原料黄赭鹅膏菌(含菌寄生菌歪孢菌)真空冻干粉碎后得干粉，置于棕色玻璃瓶中加乙酸乙酯室温浸提，搅拌，过滤，残渣再加(4×500ml)乙酸乙酯浸提，合并滤液，旋转蒸发浓缩回收溶剂后得深褐色粘稠浸膏，取浸膏溶剂溶解后上C8或C18反相制备柱(20*250mm)分离纯化，流动相为10％-100％的乙腈或甲醇梯度洗脱，收集细胞筛选有活性的洗脱峰，挥发溶剂后得白色晶体(10.5mg)，即得目的化合物。
本发明的另一个目的是提供轮枝孢菌素A与药用敷料组合，可在制备抗肿瘤药物中应用。
本发明所制备的轮枝孢菌素A药物，可在制备治疗红白血病药物、制备治疗乳腺癌药物、制备治疗宫颈癌药物、制备治疗肝癌药物、制备治疗肺腺癌药物、制备治疗前列腺癌药物、制备治疗大肠癌药物、制备治疗淋巴癌等药物中的应用。
本发明提供的药物，其制剂形式主要包括液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、软胶丸、软胶囊、滴丸剂或注射剂。
本发明提供的药物，制剂的给药形式主要包括口服给药或注射给药。
实验证明本发明提供的轮枝孢菌素A，具有体外强烈抑制肿瘤细胞增殖的作用，经四甲基偶氮唑盐(简称MTT法)检测，对红白血病K562的半数抑制增值率IC50约为0.01ug/ml，对乳腺癌BCAP37、乳腺癌MCF-7、宫颈癌HeLa、肝癌SMMC 7721、肝癌HepG2、淋巴癌Jurkat半数抑制增值率IC50约为0.1ug/ml，对肺腺癌SPC-A1、前列腺癌DU145、大肠癌SW620半数抑制增值率IC50约为0.01-0.1ug/ml，比阳性对照紫杉醇强10倍以上，因此其与药用敷料组合，可在制备治疗恶性肿瘤药物中应用。本发明为进一步研制新的抗恶性肿瘤药物提供了科学依据，对开发利用我国真菌资源具有重要意义。本发明从被寄生菌歪孢菌(Hypomyces hyalines(Schw.)Tul.)侵染的黄赭鹅膏菌(Amanita flvorubescens Alk.)子实体中分离得到轮枝孢菌素A，改变了以往只能从轮枝孢菌中分离得到，为获得轮枝孢菌素A提供新的来源。
附图说明
图1轮枝孢菌素A的液相色谱分析；
图2轮枝孢菌素A的(A)化学结构；
图3轮枝孢菌素A的(A)绝对构型；
图4为不同浓度轮枝孢菌素A杀伤红白血病K562细胞的显微图；
图5为不同浓度轮枝孢菌素A杀伤乳腺癌BCAP37细胞的显微图；
图6为不同浓度轮枝孢菌素A杀伤乳腺癌MCF-7细胞的显微图；
图7为不同浓度轮枝孢菌素A杀伤宫颈癌HeLa细胞的显微图；
图8为不同浓度轮枝孢菌素A杀伤肝癌SMMC 7721细胞的显微图；
图9为不同浓度轮枝孢菌素A杀伤肝癌HepG2细胞的显微图；
图10为不同浓度轮枝孢菌素A杀伤肺腺癌SPC-A1细胞的显微图；
图11为不同浓度轮枝孢菌素A杀伤前列腺癌DU145细胞的显微图；
图12为不同浓度轮枝孢菌素A杀伤大肠癌SW620细胞的显微图；
图13为不同浓度轮枝孢菌素A杀伤淋巴癌Jurkat细胞的显微图。
具体实施方式
以下将结合具体实施例和附图详细说明本发明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例一：从寄生菌歪孢菌侵染的黄赭鹅膏菌中分离提取纯化抗肿瘤活性化合物及其结构鉴定
实验方法：
1.提取和纯化：黄赭鹅膏菌真菌(含菌寄生菌歪孢菌)湿重1500g，真空冻干粉碎后得120g干粉，置于棕色玻璃瓶中加600ml乙酸乙酯室温浸提，不时搅拌，24h后过滤，残渣再加4×500ml乙酸乙酯浸提，合并滤液，旋转蒸发浓缩回收溶剂后得深褐色粘稠浸膏4.55g，取其中的1.38g浸膏溶剂溶解后上C8反相制备柱(20*250mm)分离纯化，流动相为10％-100％的乙腈或甲醇梯度洗脱，收集细胞筛选有活性的洗脱峰，挥发溶剂后得白色晶体10.5mg，其液相色谱分析图见附图1。
2.结构鉴定：核磁共振仪(INOVA-400)，质谱仪(Bruker Esquire 3000plus)，X-晶体衍射仪(P4型四园单晶衍射仪)
实验结果：
轮枝孢菌素A为无色晶体，分子式为C30H28N6O6S4。ESI-MS：m/z 695[M-H]-。其一维和二维的核磁共振数据列于表1，轮枝孢菌素A的化学结构见附图2及其绝对构型见附图3。
表1轮枝孢菌素A的核磁数据
| Atom | 13C NMRδ，ppm | DEPTa | HMQCδ，ppm | HMBCcorrelation with | H-HCOSY |
| 13457891010a10b11 | 166.44173.066162.53583.16111.011130.18120.65128.389129.56266.03282.23 | qbqqCHCHCHCHCHqqCH | 5.67(1H，s)6.66(1H，d，J＝7.80Hz)6.82(1H，d，J＝7.55Hz)6.82(1H，m)7.83(1H，m)5.73(1H，s) | 1313，141411910785，7，9，11，6-NH5，10，11，6-NH，11-OH11-OH | 898，107，9 |
| 1213141′3′4′5′6a6a′7′8′9′10′10a′10b′11′12′13′14′6-NH，6′NH11-OH，11′-OH | 76.68327.35317.666166.44173.066162.53583.16148.842148.842111.011130.18120.65128.389129.56266.03282.2376.68327.35317.666 | qCH3CH3qqqCHqqCHCHCHCHqqCHqCH3CH3 | 3.00(3H，s)1.89(3H，s)5.67(1H，s)6.66(1H，d，J＝7.80Hz)6.82(1H，d，J＝7.55Hz)6.82(1H，m)7.83(1H，m)5.73(1H，s)3.00(3H，s)1.89(3H，s)5.10(1H，s)5.67(1H，s) | 5，11，11-OH141313′13′，14′14′11′10′，8′，9′，6′-NH10′，8′，9′，6′-NH9′10′7′8′5′，7′，9′，11′，6′-NH5′，10′，11′，6′-NH，11′-OH11′-OH5′，11′，11′-OH14′13′ | 8′9′8′，10′7′，9′ |
a DEPT 90 and DEPT 135 experiments.
b Quaternary carbon.
实施例二：轮枝孢菌素A对人肿瘤细胞株增殖抑制活性试验
实验方法：
1.人肿瘤细胞株及来源：共做十个肿瘤株分别是红白血病K562、乳腺癌BCAP37、乳腺癌MCF-7、宫颈癌HeLa、肝癌SMMC 7721、肝癌HepG2、肺腺癌SPC-A1、前列腺癌DU145、大肠癌SW620、淋巴癌Jurkat，均来自于浙江大学肿瘤研究所。
2.轮枝孢菌素A、紫杉醇(四川太极制药有限公司产品)溶解在DMSO中配成1mg/ml母液，置于4℃冰箱，实验时用培养液稀释成终浓度分别为0、0.01、0.1、1、10ug/ml供用，MTT(AMRESCO公司产品)用磷酸缓冲液(Phosphate-buffered Saline简称PBS)配成5mg/ml母液，置于4℃冰箱备用。
3.细胞培养：所有细胞均培养于RPMI 1640完全培养液，(SIGMA)，加10％体积的新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，100U/ml链霉素和100U/ml青霉素，选择对数生长期细胞，以2×105的密度接种于96孔板中按浓度加入药物，置37℃，5％CO2培养箱中，培养48小时后用Olympus IX70万能显微镜(penguin 600CL CCD，Pixera)拍照记录。
4.采用四甲基偶氮唑盐(简称MTT法)检测药物对肿瘤细胞增殖的影响，选择对数生长期细胞，以2×105密度接种于96孔板中，每孔200ul，置37℃培养4小时后按浓度加入药物及阳性对照，每个浓度设复孔6个，同时设空白对照，置37℃，5％CO2培养箱中培养48小时，吸出孔板中培养液(贴壁细胞)，往每孔中加入浓度为5mg/ml的MTT 50ul，放入培养箱中继续培养4小时，取出加过MTT的96孔板，2000rpm、4℃进行离心5min，轻轻吸出MTT溶液，每孔用PBS溶液2滴清洗多余的MTT，吸出PBS洗液，每孔加入150ul的DMSO，轻轻振荡孔板10min，待孔底部的结晶物充分溶解后，将孔板放入酶标仪中测波长在490nm处各孔的光吸收值，记录结果；实验分上午、下午及晚上重复三次，阳性药物使用紫杉醇。
取每一个浓度复孔OD值的平均值，按如下公式计算细胞增殖抑制率：
抑制率＝(OD空白-OD样品)/OD空白×100％。
实验结果见表2～表13，显微照片见附图4～附图13。
表2轮枝孢菌素A对K562细胸的增殖抑制活性
| 受试样品 | 终浓度(ug/ml) | 测定次数(n) | 光密度(OD值)( X±SE) | 细胞增殖抑制率100％ |
| 空白轮枝孢菌素A | 00.010.1110 | 66666 | 0.418±0.01240.146±0.01320.122±0.00790.069±0.00670.038±0.0006 | -65.1970.7783.4390.99 |
表3轮枝孢菌素A对Bcap-37细胞的增殖抑制活性
| 受试样品 | 终浓度(ug/ml) | 测定次数(n) | 光密度(OD值)( X±SE) | 细胞增殖抑制率100％ |
| 空白轮枝孢菌素A | 00.010.1110 | 66666 | 0.469±0.02450.403±0.02630.202±0.02160.054±0.00460.020±0.0012 | -14.1156.9788.4495.66 |
表4紫杉醇对Bcap-37细胞的增殖抑制活性
| 受试样品 | 终浓度(ug/ml) | 测定次数(n) | 光密度(OD值)( X±SE) | 细胞增殖抑制率100％ |
| 空白紫杉醇 | 00.010.1110 | 66666 | 0.580±0.01160.540±0.00790.479±0.01880.348±0.01630.214±0.0150 | -6.9017.4139.9663.06 |
表5轮枝孢菌素A对MCF-7细胞的增殖抑制活性
| 受试样品 | 终浓度(ug/ml) | 测定次数(n) | 光密度(OD值)( X±SE) | 细胞增殖抑制率100％ |
| 空白轮枝孢菌素A | 00.010.1110 | 66666 | 0.404±0.00850.289±0.02800.183±0.00740.035±0.00360.034±0.0029 | -28.4254.7091.3491.71 |
表6轮枝孢菌素A对HeLa细胞的增殖抑制活性
| 受试样品 | 终浓度(ug/ml) | 测定次数(n) | 光密度(OD值)( X±SE) | 细胞增殖抑制率100％ |
| 空白轮枝孢菌素A | 00.010.1110 | 66666 | 0.620±0.02660.554±0.04990.301±0.02300.029±0.00150.025±0.0021 | -10.7051.5195.2895.91 |
表7紫杉醇对HeLa细胞的增殖抑制活性
| 受试样品 | 终浓度(ug/ml) | 测定次数(n) | 光密度(OD值)( X±SE) | 细胞增殖抑制率100％ |
| 空白紫杉醇 | 00.010.1110 | 66666 | 0.349±0.01030.318±0.01000.275±0.00900.162±0.01150.043±0.0026 | -9.0321.1153.5887.75 |
表8轮枝孢菌素A对SMMC7721细胞的增殖抑制活性
| 受试样品 | 终浓度(ug/ml) | 测定次数(n) | 光密度(OD值)( X±SE) | 细胞增殖抑制率100％ |
| 空白轮枝孢菌素A | 00.010.1110 | 66666 | 0.599±0.02430.495±0.02640.257±0.01430.030±0.00260.020±0.0086 | -17.4557.1595.0696.72 |
表9轮枝孢菌素A对HepG2细胞的增殖抑制活性
| 受试样品 | 终浓度(ug/ml) | 测定次数(n) | 光密度(OD值)( X±SE) | 细胞增殖抑制率100％ |
| 空白轮枝孢菌素A | 00.010.1110 | 66666 | 0.353±0.01630.200±0.01480.169±0.00690.161±0.01450.134±0.0100 | -43.3052.0854.3462.15 |
表10轮枝孢菌素A对SPC-A1细胞的增殖抑制活性
| 受试样品 | 终浓度(ug/ml) | 测定次数(n) | 光密度(OD值)( X±SE) | 细胞增殖抑制率100％ |
| 空白轮枝孢菌素A | 00.010.1110 | 66666 | 0.247±0.01050.160±0.00550.074±0.00150.020±0.00200.014±0.0008 | -35.0970.1891.9894.25 |
表11轮枝孢菌素A对DU145细胞的增殖抑制活性
| 受试样品 | 终浓度(ug/ml) | 测定次数(n) | 光密度(OD值)( X±SE) | 细胞增殖抑制率100％ |
| 空白轮枝孢菌素A | 00.010.1110 | 66666 | 0.407±0.03170.235±0.01690.066±0.00470.044±0.00350.018±0.0012 | -42.3883.7289.2795.58 |
表12轮枝孢菌素A对SW620细胞的增殖抑制活性
| 受试样品 | 终浓度(ug/ml) | 测定次数(n) | 光密度(OD值)( X±SE) | 细胞增殖抑制率100％ |
| 空白轮枝孢菌素A | 00.010.1110 | 66666 | 0.549±0.03180.377±0.01880.180±0.01800.129±0.01180.104±0.0066 | -31.3667.2176.4781.06 |
表13轮枝孢菌素A对Jurkat细胞的增殖抑制活性
| 受试样品 | 终浓度(ug/ml) | 测定次数(n) | 光密度(OD值)( X±SE) | 细胞增殖抑制率100％ |
| 空白轮枝孢菌素A | 00.010.1110 | 66666 | 0.181±0.01730.099±0.00110.081±0.00420.039±0.00310.018±0.0010 | -45.1955.4378.2790.06 |
表2～表13所示结果表明：轮枝孢菌素A对受试的K562、Bccap37、MCF-7、Hela、SMMC7721、HepG2、SPC-A1、DU145、SW620、Jurkat等人肿瘤细胞株均具有强烈的抗肿瘤活性，半数抑制增值浓度基本为0.1ug/ml，比阳性对照紫杉醇强10倍以上(见表14)，因此其与药用敷料组合，可在制备治疗恶性肿瘤药物中应用。本发明为进一步研制新的抗恶性肿瘤药物提供了科学依据，对开发利用我国真菌资源具有重要意义。
表14受试药品对不同肿瘤株半数致死浓度
| 受试药品 | 肿瘤株 | 半数致死浓度IC50(ug/ml) |
| 紫杉醇 | 乳腺癌BCAP37宫颈癌HeLa | 1-101 |
| 轮枝孢菌素A | 红白血病K562乳腺癌BCAP37乳腺癌MCF-7宫颈癌HeLa肝癌SMMC7721肝癌HepG2肺腺癌SPC-A1前列腺癌DU145大肠癌SW620淋巴癌Jurkat | 小于0.010.10.10.10.10.10.01-0.10.01-0.10.01-0.10.1 |
本发明涉及的部分参考文献：
1.卯晓岚，中国大型真菌，河南科学技术出版社，2000年；
2.Rogerson，C.T.，and Samuels，GJ.，1994，Mocologial，86：839-866；
3.Hitoshi Minato，Makoto Matsumoto，and Teruaki Katayama，1973，J.C.S.PerkinI，1819-1825。
Claims (9)
1.一种轮枝孢菌素A的制备方法，该轮枝孢菌素A分子式为C30H28N6O6S4，分子量为695[M-H]-，属于轮枝孢菌素类，其特征是通过以下步骤实现：将原料含菌寄生菌歪孢菌的黄赭鹅膏菌真菌真空冻干粉碎后得干粉，置于棕色玻璃瓶中加乙酸乙酯室温浸提，滤液经旋转蒸发浓缩回收后得深褐色粘稠浸膏，取浸膏溶解后上C8或C18反相制备柱分离纯化，流动相为10％-100％的乙腈或甲醇梯度洗脱，收集细胞筛选有活性的洗脱峰，挥发溶剂后得白色晶体，即为目的化合物轮枝孢菌素A。
2.一种制备抗肿瘤药物的方法，其特征是：按权利要求1所述的方法制备得到轮枝孢菌素A，然后将其与药用敷料组合。
3.根据权利要求2所述的制备抗肿瘤药物的方法，其特征是：其中的抗肿瘤药物为抗乳腺癌药物。
4.根据权利要求2所述的制备抗肿瘤药物的方法，其特征是：其中的抗肿瘤药物为抗宫颈癌药物。
5.根据权利要求2所述的制备抗肿瘤药物的方法，其特征是：其中的抗肿瘤药物为抗肝癌药物。
6.根据权利要求2所述的制备抗肿瘤药物的方法，其特征是：其中的抗肿瘤药物为抗肺腺癌药物。
7.根据权利要求2所述的制备抗肿瘤药物的方法，其特征是：其中的抗肿瘤药物为抗前列腺癌药物。
8.根据权利要求2所述的制备抗肿瘤药物的方法，其特征是：其中的抗肿瘤药物为抗大肠癌药物。
9.根据权利要求2所述的制备抗肿瘤药物的方法，其特征是：其中的抗肿瘤药物为抗淋巴癌药物。
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| PB01 | Publication | ||
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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Granted publication date: 20061122 Termination date: 20100329 |