CN1909896A - 调节血管生成和癌细胞增殖的方法 - Google Patents

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A·格林
S·阿马拉尔
G·希克利
S·L·布朗
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Abstract

公开了通过调节20－HETE活性来调控血管生成的方法。还公开了通过使癌症和肿瘤细胞接触20－HETE抑制剂来抑制癌症和肿瘤细胞生长的方法。

Description

调节血管生成和癌细胞增殖的方法
                    相关申请的交叉引用
本申请要求2003年11月14日提交的美国临时申请60/520,172的权益，在此完整引入以供参考。
               关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明在美国政府通过以下代理机构授予的基金：NIH EY014385和HL036279的支持下完成。美国政府对本发明享有特定的权利。
                        发明背景
得自花生四烯酸代谢作用的产物参与调节血管和细胞生长。当花生四烯酸的代谢由细胞色素P450催化时，主要的产物是区域和立体特异性的环氧二十碳三烯酸(EET)、它们相应的二羟基二十碳三烯酸(DHET)和20-羟基二十碳三烯酸(20-HETE)。细胞色素P450也可将花生四烯酸代谢为16-、17-、18-和19-HETE。在CYP450的所有同种型中，参与花生四烯酸ω-羟化为20-HETE的主要的酶是CYP4504A(CYP4A)和CYP4504F(CYP4F)家族(Roman RJ.，Physiol.Rev 82：131-185，2002)。
生理血管生成是涉及细胞、胞外基质分子与细胞迁移、增殖和内皮细胞的管分化中积累的可溶性因子之间相互作用的复杂过程。血管生成的过程与已经存在的血管有关，它长出毛细管枝芽以产生新血管(Hanahan D等，Science 277：48-50，1997)。几种细胞因子和生长因子，例如内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)已公认可在体外和体内调节血管生成，在这些因子中，VEGF认为是最有效的血管生成诱导物(Ferrara N，Am J Physiol Cell Physiol 280：C1358-C1366，2001)。近来的研究进一步支持了VEGF在骨骼肌中作为重要的血管生成调节物的作用，因为用VEGF-中和抗体处理阻断了针对电刺激和锻炼的血管生成应答(Amaral SL等，Microcirculation 8：57-67，2001；和Amaral SL等，Am JPhysiol Heart Circ Physiol 281：H1163-H1169，2001)。
花生四烯酸的环氧合酶(Epoxygenase)代谢物参与培养细胞中的内皮细胞迁移和管形成(Natarajan R等，Am J Physiol Heart Circ Physiol 273：H2224-H2231，1997；Natarajan R等，Proc Natl Acad Sci USA 90：4947-4951，1993；和Rieder MJ等，Microvasc Res 49：180-189，1995)。近来的一项研究提供了大鼠提睾肌中细胞色素P450A(CYP450)ω-羟化酶在骨骼肌细胞和小动脉中表达的证据(Kunert MP等，Am J Physiol Heart Circ Physiol 280：H1840-H1845，2001)。20-HETE显示在大脑和肾循环的小动脉的生肌活化中起作用(Harder DR等，J Vasc Res 34：237-243，1997；Harder DR等，ActaPhysiol Scand 168：543-549，2000；和Ma YH等，Am J Physiol Regul IntegrComp Physiol 267：R579-R589，1994)。Frisbee等(Am J Physiol Heart CircPhysiol 280：H1066-H1074，2001)和Kunert等(Microcirculation 8：435-443，2001)证实20-HETE导致针对骨骼肌抵抗小动脉中透壁压力升高和PO2的血管收缩应答。
近来的研究也表明去甲肾上腺素和血管紧张素II(ANG II)刺激20-HETE在血管平滑肌细胞中合成与释放(Muthalif MM等，J Biol Chem 271：30149-30157，1996)，并且细胞色素P-450抑制剂阻断MAPK系统活化与去甲肾上腺素和ANG II对培养的血管平滑肌(对M)细胞的促有丝分裂作用。有证据表明20-HETE作为ANG II的血管收缩作用的二级信使(Alonso-Garcia M等，Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 283：R60-R68，2002)并且局部肾素-血管紧张素系统在电刺激诱导的血管生成中起重要作用(Amaral SL等，Microcirculation 8：57-67，2001)。然而，20-HETE在肌肉的电刺激后介导Ang II的血管生成作用中的角色尚不清楚。
20-HETE也涉及在促进培养的各种类型正常细胞生长中起作用。例如，20-HETE增加VSM细胞(Muthalif等，Hypertension 36：604-609，2000；和Uddin等，Hypertension 31：242-247，1998)和近端小管肾上皮细胞(Lin等，Am.J.Physiol.269：F806-F816，1995)中的胸苷掺入。体外这两种细胞类型中，EGF的促有丝分裂作用与20-HETE生产增加有关(Muthalif MM等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998，95：12701-12706；和Lin F等，Am J Physiol 1995，269：F806-16)。阻断20-HETE的形成降低了对血清、去甲肾上腺素和EGF的生长应答(Lin F等，Am J Physiol 1995，269：F806-16；Roman RJ，Physiol Rev2002，82：131-85；Sacerdoti D等，Prostaglandins Other Lipid Mediat 2003，72：51-71；Zhao X和Imig JD，Curr Drug Metab 2003，4：73-84)。在各种细胞类型中，几种信号转导途径可能与20-HETE对细胞生长的刺激有关(MuthalifMM等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998，95：12701-12706；Uddin MR等，Hypertension 31：242-247，1998；Harder DR等，J Vasc Res 34：237-243，1997；Lange等，J Biol Chem 272：27345-27352，1997；Lin等，Am J Physiol RenalPhysiol 269：F806-F816，1995；和Sun等，Hypertension 33：414-418，1999)。Muthalif等报道了血管平滑肌中通过NE和血管紧张素II活化MAPK取决于20-HETE的形成，它是在经钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II刺激cPLA2后产生的。Ras/MAPK途径经20-HETE的活化，放大了cPLA2活性并通过正反馈机理额外释放花生四烯酸。Muthalif等提出该机理可能在调控其它参与细胞增殖和生长的细胞信号传递分子中起作用(Muthalif MM等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998，95：12701-12706)。
虽然花生四烯酸代谢物的生产由刺激血管生成的生长因子改变并且有证据表明20-HETE在体外促进一些类型的正常细胞生长中起作用，但在本申请所述工作之前没有证据表明20-HETE直接参与体内血管生成，也没有证据表明20-HETE在癌细胞增殖和癌性肿瘤生长中起作用。
                          发明概述
本发明一方面涉及将足够降低组织中血管生成的量的20-HETE合成抑制剂或20-HETE拮抗剂给予人或非人哺乳动物，来减少人或非人哺乳动物组织中血管生成的方法。
本发明的另一方面涉及通过充分增加组织中20-HETE活性从而诱导和促进组织中血管生成，来诱导和促进人或非人哺乳动物组织中血管生成的方法。
本发明还有另一方面涉及使癌症或肿瘤细胞与选自20-HETE合成抑制剂或20-HETE拮抗剂的药物接触来抑制癌症或肿瘤细胞增殖的方法，该药物的量足够抑制癌症或肿瘤细胞增殖。
                    附图的几种视角的简述
图1显示了代表性反向HPLC色谱，说明胫骨前(TA)肌样品中荧光标记的20-羟基二十碳四烯酸(20-HETE)的分离。WIT-002，20-5(Z)，14(Z)-羟基二十碳二烯酸用作内标。
图2显示用选择性细胞色素P-450A(CYP4A)抑制剂[N-羟基-N′-(4-丁基-2-甲基苯酚)-甲脒(HET0016)]处理对大鼠尿中20-HETE水平的作用。数值是用载体(卵磷脂)处理的5只大鼠和用HET0016处理的5只大鼠的平均值±SE。*P＜0.05对卵磷脂。
图3显示7天刺激方案后用选择性CYP4A抑制剂(HET0016)处理对大鼠肌肉中20-HETE形成的作用。PBS，磷酸缓冲盐。数值是用卵磷脂处理的5只大鼠和用HET0016处理的5只大鼠的平均值±SE。*P＜0.05对未刺激侧。
图4显示7天电刺激方案后对照大鼠(n＝4)、用选择性CYP4A抑制剂(卵磷脂配制的HET0016，2mg kg-1天-1，n＝4)处理的和用非选择性CYP4A抑制剂[PBS配制的1-氨基苯并三唑(ABT)，50mg kg-1天-1，n＝4]处理的大鼠的指长伸肌(EDL)和TA肌肉的血管密度变化。数值是平均值±SE。显著性：*P＜0.05对未刺激侧。
图5显示7天电刺激方案后，用卵磷脂、HET0016(卵磷脂配制，2mg kg-1天-1)和ABT(PBS配制，50mg kg-1天-1，n＝4)处理大鼠的未刺激(U)或电刺激(S)的TA肌肉中血管VEGF的表达。每份样品加样为50μg总蛋白。由于大量表达VEGF，用C6肿瘤细胞作为阳性对照。显示了7天电刺激方案后在对照组(n＝5)和用选择性CYP4A抑制剂HET0016(n＝7)处理组中VEGF蛋白质的定量密度显像测定。数值是平均值±SE。*P＜0.05对未刺激侧。
图6显示7天刺激方案后，用VEGF-中和抗体(PBS配制的VEGF Ab；0.6mg/100g体重，腹膜内(ip))处理对大鼠肌肉中20-HETE形成的作用。数值是用PBS(对照)处理的5只大鼠和用VEGF Ab处理的4只大鼠的平均值±SE。数值表达为在C6肿瘤细胞标准中观察到的VEGF表达的百分比。*P＜0.05对未刺激侧。
图7显示HET0016对培养的人血管内皮细胞(HUVEC)中VEGF的增殖性应答的作用。HUVEC单独与250ng/ml VEGF或在存在10μM HET0016时孵育，24小时后测定细胞增殖。HET0016消除了对VEGF的增殖性应答(n＝3，每次实验一式三份)，但未改变HUVEC的基础增殖率(未显示)。*p＜0.05，对照对VEGF；p＜0.05，VEGF对VEGF+HET0016。
图8A和8B显示HET0016对体内VEGF引发的血管生成应答的作用。用大鼠角膜袋(cornea pocket)血管生成试验检测新血管形成的改变。将单独含有VEGF(250ng/小球)或含有VEGF和HET0016(20μg)的小球植入大鼠角膜的基质。7天后处死大鼠并使用India墨水使新血管形成显现。通过追踪血管并使用图像分析软件以获得视野中所有血管长度的数值来定量估计血管生成应答。图8A显示了小球植入物区域中代表性的角膜载玻片(flat mount)。图8B显示了以平均值±SEM表示的所有实验的总血管长度。(p＜0.001，VEGF对VEGF+HET0016)。
图9A和9B显示HET0016对体内bFGF引发的血管生成应答的作用。单独含有bFGF(250ng/小球)或含有bFGF和HET0016(20μg)的小球植入大鼠角膜的基质。图9A显示了代表性的角膜载玻片。图9B显示了图8所示血管生成应答的变化。(n＝6；p＜0.001，bFGF对bFGF+HET0016)。
图10A和10B显示HET0016对体内EGF引发的血管生成应答的作用。单独含有EGF(250ng/小球)或含有EGF和HET0016(20μg)的小球植入大鼠角膜的基质。图10A显示了代表性的角膜载玻片，图10B显示了血管生成应答的变化。(n＝7；p＜0.001，EGF对EGF+HET0016)。
图11A和11B显示了化学性质和机理不同的20-HETE形成抑制剂，二溴十二碳烯基甲磺酰亚胺(DDMS，也称为N-甲基磺酰基-12，12-二溴十二烷基-11-烯酰胺)对体内VEGF的血管生成应答的作用。单独含有VEGF(250ng/小球)或含有VEGF和DDMS(10μg)的小球植入大鼠角膜的基质。图11A显示了代表性的例子，图11B显示了血管生成应答的变化。(n＝6；p＜0.001，VEGF对VEGF+DDMS)。
图12显示20-羟基二十碳-6(Z)，15(Z)-二烯酸(WIT003)，一种具有有效激动活性的20-HETE的更稳定类似物对培养的HUVEC增殖的作用。HUVEC单独与40μM棕榈酸(无活性脂肪酸对照)或乙醇(载体对照)孵育。二者无差别，因此合并该两组的对照数据。在实验组中，细胞与1μM WIT003孵育48小时并测定增殖。WIT003提高HUVEC的增殖(n＝3，每次实验一式三份；*p＜0.05和#p＜0.01，对照 对WIT003)。
图13A和13B显示20-HETE类似物WIT003在体内大鼠角膜袋中的血管生成作用。含有20μg WIT003的小球植入大鼠角膜的基质。7天后处死大鼠并检测新血管形成。图13A显示了代表性的载玻片。图13B显示对WIT003的血管生成应答(n＝6；p＜0.01，对照对WIT003)。
图14A和14B显示HET0016在体内对U251癌细胞的血管生成应答的作用。通过以低密度将单细胞悬浮液接种于0.8％琼脂层上产生人成胶质细胞瘤癌细胞系U251的球状体。总共5-8个球状体(每个约200μm)插入刻入双眼的角膜袋中。含有20μg HET0016或载体(乙醇)的小球置于球状体附近。植入癌细胞2周后处死大鼠并检测新血管形成应答。图14A显示了在连续实验中所有大鼠的球状体/小球植入物区域的角膜。图14B显示了血管生成应答的变化(n＝8；p＜0.01，对照球状体对球状体+HET0016)。
图15显示了20-HETE合成抑制剂，HET0016对体外生长的人U251成胶质细胞瘤癌细胞的生长模式和细胞周期特性的作用。A幅：涂布相同数量的U251细胞(0.75×104)铺板并在接触各种浓度的HET0016之前血清禁食1天，每24小时进行细胞计数；B幅：在对照培养物和用10μM HET0016处理的培养物中评估掺入DNA的[3H]胸苷。[3H]胸苷掺入数据计算为d.p.m./103个细胞并相对于EtOH对照定标；C幅：U251细胞铺板，并用EtOH配制的10μM HET0016或单用EtOH(对照)处理。用碘化丙锭(细胞增殖标记)染色细胞并通过FACS分析染色细胞的总DNA含量来确定它们的细胞周期分布。处于细胞周期的各种阶段的细胞百分比示于每幅图中。每幅图显示了一式三份进行的3到4个独立实验的平均值±SD。C幅显示了3个独立实验的代表性实验。箭头表示当HET0016加入培养物使的时间0点。
图16显示HET0016抑制EGF刺激培养物中U251癌细胞增殖和生长的作用。血清禁食U251细胞，然后用200ng/ml EGF、10μM HET0016或二者处理。48小时后评估细胞增殖。
图17比较了HET0016对HUVEC、初级角化细胞和U251生长的作用。HUVEC、初级人角化细胞和人U251成胶质细胞瘤癌细胞接种于96-孔板并用HET0016处理48小时。HET0016对正常的HUVEC或角化细胞无作用，而抑制约50％U251癌细胞增殖。(图中)给出了一式三份进行的3个独立实验的平均值±SD。***表示各自对照值的p＜0.001。
图18显示DDMS对生长于培养物中的人U251成胶质细胞瘤细胞增殖的作用。用DDMS(化学性质和机理与HET0016极为不同的第二种CYP4A和20-HETE合成抑制剂)处理U251细胞。DDMS以浓度依赖性方式抑制U251细胞的增殖。(图中)给出了一式三份进行的3个独立实验的平均值±SD。
图19显示WIT003，一种具有促效剂性能的20-HETE的稳定类似物对人U251成胶质细胞瘤癌细胞体外增殖的作用。在加入0.1μM和1μM的WIT003或已知对这些用于比较的细胞的增殖产生接近最大刺激的不同浓度EGF之前U251培养物血清禁食1天。结果显示1μM WIT003促进U251的生长与200ng/ml EGF的相当。48小时后进行细胞计数并依照在单用载体(EtOH)处理的对照培养物中观察到的数值定标。(图中)给出了一式三份进行的3个独立实验的平均值±SD。*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。
图20显示加入20-HETE促效剂(agonist)WIT003可从20-HETE合成抑制剂HET0016的抗增殖作用中拯救U251细胞。培养物血清禁食并单用10μMHET0016或与联用1μM WIT003处理。处理48小时后通过细胞计数来评估细胞增殖。(图中)给出了一式三份进行的3个独立实验的平均值±SD。
图21显示HET0016对9L胶质肉瘤细胞体外增殖的作用。A幅：相同数量的9L细胞(0.75×104)铺板，并在接触各种浓度的HET0016之前血清禁食1天，每24小时进行细胞计数；B幅：在用10μM HET0016处理的培养物中评估掺入DNA的[3H]胸苷。[3H]胸苷掺入数据计算为d.p.m./103个细胞并对EtOH对照定标。A-B幅图中的数据是一式三份进行的3个独立实验的平均值±SD。
图22显示DDMS对9L胶质肉瘤细胞体外增殖的作用。相同数量的9L细胞(0.75×104)铺板并在接触各种浓度的DDMS或载体之前血清禁食1天，24和48小时后进行细胞计数。(图中)给出了一式三份进行的3个独立实验的平均值±SD。
图23显示了HET0016对EGF-刺激9L增殖的作用。9L培养物经血清禁食，然后单用200ng/ml EGF或用EGF和10μM HET0016处理。。24和48小时后评估细胞增殖。
图24显示20-HETE促效剂WIT003对HET0019对体外生长9L胶质肉瘤细胞的抗增殖作用的作用。A幅：培养物血清禁食并用0.1μM或1μM WIT003处理。48小时后评估细胞数目。数据表示为对照％。B幅：单用10μM HET0016或联用1μM WIT003处理9L细胞。处理24小时和48小时后通过计数细胞来评估细胞增殖。数据表示为抑制％。给出了一式三份进行的3个独立实验的平均值±SD。
图25显示HET0016在体内对9L胶质肉瘤肿瘤生长的作用。9L细胞(1×104)注射入大鼠的大脑。经过2天确定有肿瘤后，用卵磷脂(载体)或HET0016(10mg/kg/天)处理大鼠15天。A幅：显示了注射卵磷脂(载体)的对照大鼠的大脑组织。B幅：显示了15天后用HET0016处理的大鼠的大脑组织。显示的图片是在5只对照动物和5只HET0016处理的动物中观察到的代表性图像。
图26显示HET0016慢性处理在体内对9L肿瘤生长的作用。A幅给出了用载体或HET0016处理的大鼠中沿着肿瘤中点的HE切片。B幅比较了在连续切片中用AIS图像分析系统软件检测的对照和HET1006大鼠的肿瘤体积。(图中)给出了每组5只大鼠的平均值±SE。
                          发明详述
本文公开了可通过调节20-HETE的活性来调控血管生成。本文还公开了可通过20-HETE及其促效剂来刺激以及通过20-HETE合成抑制剂和拮抗剂来抑制癌症和肿瘤细胞增殖。
本发明使用大鼠骨骼肌和大鼠角膜作为例子证实了用至少3种化学性质和机理不同的20-HETE合成抑制剂阻断20-HETE合成可降低各种生长因子诱导的血管生长。与该观察结果一致的是，本发明人也证实给予20-HETE促效剂可模拟生长因子诱导新血管生长的作用。这些发现提供了新的策略，从而通过阻断血管生成来治疗或预防异常或过度的血管生长相关疾病和病症，以及通过诱导和促进血管生成来治疗或预防与血管生长不足或血管衰退相关的疾病或病症。
本发明人使用人胶质瘤和大鼠胶质肉瘤癌细胞作为例子，显示了不同类型的化学性质和机理的20-HETE合成抑制剂在体外和体内均抑制癌细胞增殖并且该抑制作用可为20-HETE促效剂逆转。本发明人还发现20-HETE抑制剂不影响正常细胞的基础增殖。然而，用各种生长因子(EGF、bFGF和VEGF)异常刺激正常的人血管内皮细胞生长后，20-HETE抑制剂阻断这些细胞的异常增殖。这些发现为癌症治疗(包括辅助治疗)和预防提供新的策略。
20-HETE的活性与合成在哺乳动物中十分保守。例如，迄今为止研究的所有哺乳动物物种均表达CYP4A和CYP4F家族的酶并且20-HETE由白血球产生，存在于血管中(Roman RJ.，Physiol.Rev.82：131-85，2002)。因此，下文实施例使用大鼠、大鼠细胞和人细胞所示的观察结果可应用于所有哺乳动物，例如人、犬、大鼠、小鼠和家兔。
本发明一方面涉及通过充分抑制组织中20-HETE活性从而减少人或非人哺乳动物组织中血管生成的方法。
在一个实施方案中，本发明的方法用于减少生长因子诱导的血管生成。技术人员熟悉这种生长因子。例子包括，但不限于酪氨酸激酶依赖性生长因子，例如VEGF、bFGF、EGF；胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF-1)和PDGF；与G蛋白偶联的受体，例如肾上腺素能(受体)、胆碱能(受体)、催产素、内皮肽、血管紧张素、血管舒缓激肽、组胺、凝血酶和许多其它受体。
在另一个实施方案中，本发明方法用于减少肿瘤或癌细胞分泌的生长因子诱导的血管生成。在还有另一个实施方案中，本发明方法用于减少非肌肉组织(例如眼睛的非肌肉组织)中的血管生成(例如，新生儿与高浓度的氧接触后，受伤和炎症后以及在糖尿病(患者)中)。在还有另一个实施方案中，本发明方法用于减少处于炎症，例如哮喘、类风湿性关节炎、骨关节炎、皮肤感染和损伤、以及肺纤维化中的非肌肉组织的血管生成。
抑制人或非人哺乳动物的组织中20-HETE活性的一种合适的方法是给予人或非人哺乳动物以足够降低该组织中血管生成的量的20-HETE合成抑制剂。术语“20-HETE合成抑制剂”指参与将花生四烯酸转化为20-HETE的酶的抑制剂。这种酶是已知的并且包括CYP4A和CYP4F家族的酶，例如CYP4A11、CYP4F2和CYP4F3(Christmas P等，J.Biol.Chem.，276：38166-38172，2001)。
本领域已知许多类型的20-HETE合成抑制剂，它们均可用于本发明的方法。这些抑制剂包括以下文献公开的：U.S.20040110830；WO0236108；WO0132164；Nakamura T等，Bioorg Med Chem.12：6209-6219；2004；Nakamura T等，Bioorg Med Chem Lett.14：5305-5308，2004；Nakamura T等，Bioorg Med Chem Lett.14：333-336，2004；Nakamura T等，J Med Chem.46：5416-5427，2003；Sato M等，Bioorg Med Chem Lett.11：2993-2995，2001；Miyata N等，Br J Pharmacol.133：325-329，2001；Xu F等，J Pharmacol ExpTher.308：887-895，2004；Xu F等，Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol28：R710-720，2002；Roman RJ.，Physiol Rev.82：131-185，2002，所有这些文献全文纳入本文作为参考。
这些抑制剂的例子包括N-羟基-N-(4-丁基-2-甲基苯酚)-甲脒(HET0016)、N-(3-氯-4-吗啉-4-基)苯基-N′-羟基亚氨甲酰胺(TS-011)、二溴十二碳烯基甲磺酰亚胺(DDMS)、1-氨基苯并三唑(ABT，得自Sigma ChemicalCorp.，St.Louis，MO)、17-十八炔酸(17-ODYA)、咪康唑(得自Sigma ChemicalCorp.，St.Louis，MO)、酮康唑、氟康唑和硫酸10十一炔酯(10-SUYS)。HET0016、TS-011和DDMS是20-HETE的特异性抑制剂，17-ODYA、1-ABT和咪康唑是特异性较低的抑制剂(WO0236108)。HET0016、1-ABT和17-ODYA显示能在体内降低20-HETE水平(WO0236108；Dos Santos EA等，Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol.287：R58-68，2004；Hoagland KM等，Hypertension 42：669-673，2003；Cambj-Sapunar L等，Stroke 34：1269-1275，2003；和Hoagland KM等，Hypertension 41：697-702，2003)。WO0132164公开了一种合成HET0016的方法。还描述了合成具有抑制20-HETE合成的类似性能的大量HET0016类似物的方法(Nakamura T等，Bioorg Med Chem.12：6209-6219，2004；Nakamura T等，Bioorg Med Chem Lett.14：5305-5308，2004；Nakamura T等，Bioorg Med Chem Lett.14：333-336，2004；NakamuraT等，J Med Chem.46：5416-5427，2003；和Sato M等，Bioorg Med Chem Lett.11：2993-2995，2001)。17-ODYA、ABT和咪康唑得自Sigma Chemical Corp.，St.Louis，MO。用于本发明目的的优选抑制剂包括HET0016、TS-011和DDMS。
U.S.20040110830公开了能抑制从花生四烯酸合成20-HETE的羟基甲脒，所有这些衍生物可用于本发明。
由于当抗体施用入动物身体后一般能阻断靶蛋白的功能，抗20-HETE合成酶的抗体(单克隆或多克隆)也可用作20-HETE合成抑制剂(Dahly，A.J.，FASEB J.14：A133，2000；Dahly，A.J.，J.Am.Soc.Nephrology 11：332A，2000)。CYP4A和CYP4F家族的所有已知成员的DNA和蛋白质氨基酸序列均得到公布并且可用。因此，技术人员可制造包括20-HETE合成酶的人源化抗体的抗体。例如，已制造了抗CYP4A1和CYP4A10的抗体，并且这些抗体显示能抑制CYP4A1和CYP4A10的酶活性(Amet，Y.等，BiochemPharmacol.54(8)：947-952，1997；Amet，Y.等，Biochem.Pharmacol.53(6)：765-771，1997；Amet，Y.等，Alcohol Clin.Exp.Res.22(2)：455-462，1998)。某些这种抗体也可购得(例如，抗-CYP4A1得自Gentest Corp.，Woburn，Massachusetts)。
抑制人或非人哺乳动物组织中20-HETE活性的另一种合适的方法是给予人或非人哺乳动物以足够降低组织中血管生成的量的20-HETE拮抗剂。可用所有已知的20-HETE拮抗剂。这些拮抗剂包括公开于以下文献的：美国专利号6,395,781；Yu M等，Eur J Pharmacol.486：297-306，2004；Yu M等，Bioorg Med Chem.11：2803-2821，2003；和Alonso-Galicia M等，Am J Physiol.277：F790-796，1999；所有这些文献全文纳入作为参考。例子包括19羟基十九烷酸、20羟基二十碳-5(Z)，14(Z)，二烯酸和N-甲磺酰基-20-羟基二十碳-5(Z)，14(Z)-二烯酰胺。
可通过本发明的方法治疗或预防异常和过度的血管生长相关疾病和病症。“治疗疾病”指某种疾病发生后降低其严重性或使得某疾病的症状消失。“预防疾病”指防止疾病发展或在疾病开始时降低其严重性。可治疗或预防的疾病和病症的例子包括，但不限于癌症(例如，脑癌和其它实体组织肿瘤)、置于高氧孵育箱中新生儿的角膜血管化与受伤或感染后眼睛、皮肤或其它器官的血管化。除了作为受伤或感染的结果的血管化以外，也可治疗或预防其它眼病，例如不受控制的血管生成导致的新血管眼病。在该例子中，应该注意的是视网膜和脉络膜循环的病理性血管生成是许多眼病的严重后果。视网膜新血管化发生于糖尿病性视网膜病变、镰状红细胞性视网膜病变、视网膜静脉阻塞和早熟性视网膜病变(ROP)。中枢视网膜静脉或其一条支脉的阻塞可导致视力迅速降低并伴有视网膜新血管生成的后遗症。在前缺血性视神经病中衍生于脉络膜系统，供应视神经的血管可被阻断。产生自脉络膜毛细管的新血管导致在年龄相关的黄斑变性和基质黄斑疾病中脉络膜新血管化的发生。
不适当的血管生成还涉及动脉粥样硬化症和再狭窄、先天肺纤维化、急性成人呼吸窘迫综合征和哮喘中的有害重塑。此外，血管生成与关节炎症，例如类风湿性关节炎相关。所有这些疾病可用本发明的方法治疗或预防。除了上述疾病和病症之外，其它可治疗或预防的疾病和病症包括(但不限于)表1所列的(Carmeliet P，Nature Medicine 9：653-660，2003；和Carmeliet P，J.Intern.Med.255：538-561，2004，二者均全文纳入作为参考)。有关这些疾病的其它信息见Storgard CM等，J Clin Invest.103：47-54(1999)与Greene AS和AmaralSL，Curr Hypertens Rep.4：56-62(2002)，所有这些文献全文纳入本文作为参考。
     表1-以异常或过度的血管生成为特征或由其导致的疾病
  器官              小鼠或人的疾病
  许多器官血管脂肪组织皮肤眼肺肠生殖系统   癌症(癌基因的激活；肿瘤抑制基因的丧失)；感染性疾病(病原体表达血管生成基因，诱导血管生成进程或转化EC)；自身免疫疾病(肥大细胞和其它白细胞的激活)血管畸形(Tie-2突变)；迪乔治综合征(低VEGF和神经毡蛋白-1表达)；HHT(内皮糖蛋白或ALK-1突变)；海绵状血管瘤(Cx37和Cx40丧失)；动脉粥样硬化症；移植动脉病肥胖症(脂肪饮食诱导的血管生成；血管生成抑制剂导致的体重降低)银屑病、疣、过敏性皮炎、伤疤瘢痕瘤、化脓性肉芽肿、起泡性疾病(blistering disease)、AIDS患者中的卡波西肉瘤持续增生性玻璃体综合征(Ang-2或VEGF丧失)；糖尿病性视网膜病变；早熟性视网膜病变；脉络膜新血管化(TIMP-3突变)原发性肺动脉高压种系BMPR-2突变；体细胞EC突变)；哮喘；鼻息肉炎性肠病和牙周病、腹水、腹膜粘连子宫内膜异位症、子宫出血、卵巢囊肿、卵巢刺激过度
  骨骼，关节   关节炎、滑膜炎、骨髓炎、骨赘形成
本发明的另一方面涉及将足够降低组织中血管生成的量的HET0016或DDMS给予哺乳动物来减少人或非人哺乳动物组织中血管生成的方法。
本发明的另一方面涉及将足够降低组织中血管生成的量的TS-011给予哺乳动物来降低人或非人哺乳动物组织中血管生成的方法。
本发明的另一方面涉及通过充分增加组织中20-HETE活性从而诱导和促进血管生成来诱导和促进人或非人哺乳动物组织中血管生成的方法。在一个实施方案中，该方法用于诱导和促进非肌肉组织中的血管生成。
增加人或非人哺乳动物组织中20-HETE活性的一种合适的方法是给予人或非人哺乳动物以足够诱导和促进组织中血管生成的量的20-HETE或其促效剂之一。可用所有已知的20-HETE促效剂。这些促效剂包括公开于以下文献的：美国专利号6,395,781；Yu M等，Eur J Pharmacol.486：297-306，2004；和Alonso-Galicia M等，Am J Physiol.277：F790-796，1999。例子包括20羟基二十烷酸、20羟基二十碳-6(Z)，15(Z)-二烯酸(WIT003)和N-甲磺酰基-20-羟基二十碳-6(Z)，15(Z)-二烯酰胺。
可由本文提供的方法预防或治疗血管生成不足或血管退化相关的疾病或病症。例如，可预防或治疗与糖尿病和缺血性心脏病相关的周围血管疾病。治疗性血管生成有助于降低患周围血管疾病患者对截肢的需要，在心脏血管成形术的情况中，该疗法可提高心脏病发作后的存活率并可提高或者甚至替代旁路手术。类似地，给予20-HETE或其促效剂来增加血管生成可减轻缺血性中风后和大脑区域血管化降低相关病症(例如，阿尔茨海默病)中的细胞死亡和神经缺陷。其它可预防或治疗的疾病和病症包括(但不限于)下表2所列的(CarmelietP，J.Intern.Med.255：538-561，2004)。
       表2-血管生成不足或血管退化为特征或导致的疾病
  器官   小鼠或人的疾病  血管生成机理
  神经系统   阿尔茨海默病  通过淀粉样-β的EC毒性导致血管
血管胃肠皮肤生殖系统 肌萎缩性侧索硬化症；糖尿病性神经病变中风动脉粥样硬化症高血压糖尿病再狭窄胃或口腔溃疡克罗恩病脱发皮肤紫癜、毛细管扩张和静脉湖(venous lake)形成先兆子痫   收缩、微血管退化和大脑血管病VEGF生产不足导致灌流和神经保护受损，从而造成运动神经元或轴突退化存活率与大脑血管生成相关；动脉病导致的中风(Notch-3突变)特征为侧血管生长受损由于血管舒张或血管生成受损导致微血管稀疏化特征为局部缺血肢的侧面生长和血管生成受损，但随周细胞减少视网膜新血管化提高老年人动脉受伤后再内皮化受损由于病原体产生血管生成抑制剂导致愈合滞后特征为粘膜局部缺血血管生成抑制剂导致头发生长迟缓由于EC端粒变短造成血管数量和成熟(SMC减少)的年龄依赖性降低由于通过可溶性Flt-1除去VEGF
肺肾骨骼 月经过多(子宫出血)新生儿呼吸窘迫肺部纤维化、肺气肿肾病骨质疏松症、骨折愈合受影响   造成EC功能障碍从而导致器官衰竭、血栓形成和高血压由于Ang-1产量低造成SMC-不良血管易碎由于HIF-2α和VEGF产量降低导致早熟小鼠的肺成熟不完全且表面活性剂生产不足基于VEGF抑制的蜂窝状EC凋亡由于TSP-1产生导致年龄血管的血管丧失VEGF驱动血管生成的年龄依赖性减少导致骨形成受损；血管生成抑制剂阻止骨折愈合
本发明的另一方面涉及通过给予哺乳动物以足够诱导或促进组织中血管生成的量的20羟基二十碳-6(Z)，15(Z)-二烯酸来诱导和促进人或非人哺乳动物组织中血管生成的方法。
本发明另一方面涉及通过使肿瘤或癌细胞与选自20-HETE合成抑制剂或20-HETE拮抗剂的药物接触来抑制肿瘤或癌细胞增殖的方法，所述药物的量足够抑制肿瘤或癌细胞增殖。在一个实施方案中，该药物给予患癌症或肿瘤的人或非人哺乳动物以治疗癌症或肿瘤。在另一个实施方案中，给予该药物以预防癌症或肿瘤发生。
已知癌细胞能产生造成它们异常生长的自分泌生长因子。在以下实施例中，本发明人证实20-HETE在介导响应生长因子的细胞促有丝分裂应答中起作用。不想受限于任何理论，本发明人相信20-HETE合成抑制剂和20-HETE拮抗剂通过抑制生长因子的信号转导途径来抑制癌症或肿瘤细胞增殖。此外，以上癌症或肿瘤细胞生长也取决于生长因子的分泌来刺激血管生成并向肿瘤供血。本公开内容证实20-HETE的合成与作用抑制剂在至少两种不同的体内模型系统中阻止生长因子诱导的血管生成。因此，可进一步推理通过20-HETE合成抑制剂和拮抗剂对肿瘤诱导的血管生成的这种抑制作用也有助于它们的体内抗癌症活性。在一优选的实施方案中，20-HETE合成抑制剂和20-HETE拮抗剂用于预防或治疗神经胶质细胞来源(神经胶质瘤)和星形细胞来源(星形细胞瘤)的脑癌以及上皮组织(恶性肿瘤)的癌症，例如某些类型的肠癌、乳腺癌(例如，导管乳腺癌)、皮肤癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、甲状腺癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、结肠癌和卵巢癌。在一更优选的实施方案中，预防或治疗乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、皮肤癌和胰腺癌的胶质瘤和恶性肿瘤。合适且优选的20-HETE合成抑制剂和20-HETE拮抗剂如上所述。
本发明的另一方面涉及通过使肿瘤或癌细胞与HET0016或DDMS接触来抑制肿瘤或癌细胞增殖的方法，其中HET0016或DDMS的量足够抑制肿瘤或癌细胞增殖。在一个实施方案中，HET0016或DDMS给予患癌症或肿瘤的人或非人哺乳动物以治疗癌症或肿瘤。在另一个实施方案中，给予HET0016或DDMS以预防癌症或肿瘤发生。
本发明的另一方面涉及通过使肿瘤或癌细胞与TS-011接触来抑制肿瘤或癌细胞增殖的方法，其中TS-011的量足够抑制肿瘤或癌细胞增殖。在一个实施方案中，TS-011给予患癌症或肿瘤的人或非人哺乳动物以治疗癌症或肿瘤。在另一个实施方案中，给予TS-011S以预防癌症或肿瘤发生。
就本发明的具体应用而言，例如预防或治疗具体的疾病或病症，技术人员易于确定特定给药途径的某种20-HETE合成抑制剂或20-HETE促效剂或拮抗剂的最优剂量。本发明不受限于特定的给药途径。合适的给药途径包括(但不限于)口服、静脉内、皮下、肌肉内和注射入特定的器官或组织。
基于以下非限制性实施例可更完全地理解本发明。
                         实施例1
               通过20-HETE调节骨骼肌血管生成
本实施例证实20-羟基二十碳四烯酸(20-HETE)对骨骼肌中电刺激诱导的血管生成是重要的。刺激大鼠的胫骨前肌肉和指长伸肌7天。电刺激显著增加了肌肉中20-HETE形成和血管生成，它被N-羟基-N′-(4-丁基-2-甲基苯酚)甲脒(HET0016)或1-氨基苯并三唑(ABT)的慢性处理阻断。用HET0016或ABT慢性处理未阻断VEGF蛋白质在两种肌肉中表达的增加。为分析VEGF对20-HETE形成的作用，用VEGF中和抗体(VEGF Ab)处理其它大鼠。VEGF Ab阻断刺激诱导的20-HETE形成。这些结果证明20-HETE与血管生成的下游信号传递途径(VEGF的下游)有关。
材料与方法
动物外科手术：所有方案得到Wisconsin医学院的动物实验管理委员会(Institutional Animal Care and Use Committee of the Medical College ofWisconsin)的批准。大鼠安置于Wisconsin医学院的动物研究中心(AnimalResource Center of the Medical College of Wisconsin)并随意给予食物和水。通过肌肉内注射开他敏(100mg/kg)和乙酰丙嗪(2mg/kg)的混合物麻醉7-8周龄的32只雄性Sprague-Dawley大鼠。在胸腰部以上进行皮下切割并植入以前设计并证实对慢性研究有效的小型电池驱动的刺激器(Linderman JR等，Microcirculation 7：119-128，2000)，适当固定。在覆盖右后肢膝关节(在腓总神经的区域之上)侧面的皮肤与筋膜中切另一个开口。一对电极在皮肤下从刺激器引出并固定于接近腓总神经的包围膝盖的肌肉上(Ma YH等，Am J PhysiolRegul Integr Comp Physiol 267：R579-R589，1994)。用生物相容的丙烯酸粘固剂(Loctite；Rocky Hill，CT)局部固定而远端用细缝合线(规格5-0，Ethicon；Somerville，NJ)固定电极。缝合两处切口的皮肤，并且第二天允许大鼠在刺激时期开始之前恢复。
实验方案与组织制备：24小时恢复期后，使用小的手提式磁铁瞬间闭合磁性弹簧开关来激活植入的刺激器。刺激器通过以0.3-ms持续时间的方波脉冲、10-Hz频率和3-V电位刺激腓总神经从而在小腿肌肉中产生电诱导的肌肉收缩(Linderman JR等，Microcirculation 7：119-128，2000)。指长伸肌(EDL)和胫前(TA)肌肉于每天早上9点自动收缩并持续8h/天，连续7天。在刺激期结束时，以过量的戊巴比妥钠(100mg/kg ip)无痛处死大鼠，收集EDL和TA肌肉以进行前述分析(Greene AS等，Hypertension 15：779-783，1990；和Parmentier JH等，Hypertension 37：623-629，2001)。
大鼠分为4组。为评价20-HETE在VEGF蛋白表达和骨骼肌血管生成中的作用，组1的9只大鼠在电刺激期间每天接受腹膜内注射有效和选择性的CYP4A酶抑制剂[N-羟基-N′-(4-丁基-2-甲基苯酚)甲脒(HET0016)，TaishoPharmaceutical(Miyata N等，Br J Pharmacol 133：925-929，2001)]两次，每次注射的剂量为1mg/kg。该剂量是基于以前研究结果选择的(Kehl F等，AmJ Physiol Heart Circ Physiol 282：H1556-H1565，2002)。在该项研究中，10mg/kg静脉内的剂量在多个小时期间产生的血浆浓度远超过(高10倍)HET0016在血浆中的有效抑制浓度。
为比较HET0016与更常用，但特异性较低的抑制剂的作用，在电刺激期间用1-氨基苯并三唑(ABT；组2)以50mg·kg-1·天-1腹膜内(ip)的剂量处理4只大鼠。
为确定VEGF对电刺激诱导的血管生成的作用，组3的6只大鼠在电刺激期间以3mg/kg ip注射单克隆VEGF-中和抗体(Texas Biotechnology；Houston，TX)来处理。VEGF-中和抗体的给药方案是Zheng W等，(Circ Res85：192-198，1999)的改进方案，该剂量是基于我们以前研究的结果(Amaral SL等，Microcirculation 8：57-67，2001)。刺激时期开始后，大鼠在第3、5和7天接受腹膜内注射(0.6mg/100g)。
组4的大鼠用HET0016的载体卵磷脂(n＝9)或用用于VEGF抗体的盐水，PBS(n＝4)处理。由于在用每种载体处理的大鼠中获得的结果无明显差异，合并这些组的结果。
检测20-HETE的尿液排泄：在电刺激的最后一天，大鼠置于有效分开尿液和食物的代谢笼中。就在开始收集尿液之前取走食物以免污染尿样，并将24-小时对照和处理的尿液样品收集入包裹有冰的玻璃瓶中。使用前述的荧光HPLC测定(Maier KG等，Am J Physiol Heart Circ Physiol 279：H863-H871，2000)来检测尿液样品中20-HETE的浓度。加入25ng内标[20-5(Z)，14(Z)-羟基二十碳二烯酸(WIT-002)，Taisho Pharmaceutical；Saitama，Japan]后，用甲酸将样品酸化至pH 4，用1ml乙酸乙酯提取并用氩气干燥有机相。样品重新溶解于1ml的20％乙腈并上样于Sep-Pak Vac柱(Waters；Milford，MA)。用1ml的30％乙腈洗涤柱两次，用400μl的90％乙腈洗脱含有HETE和EET的部分。样品稀释于水中，上Sep-Pak Vac柱，用500μl乙酸乙酯洗脱然后干燥。脂质部分用含有36.4mM三氟甲磺酸2-(2，3-萘亚氨基)乙酯的20μl乙腈标记。加入N，N-二异丙基乙胺(10μl)以催化反应。使用Sep-PakVac提取(Maier KG等，Am J Physiol Heart Circ Physiol 279：H863-H871，2000)除去过量的染料，在氩气环境中干燥样品，悬浮于100μl甲醇并通过使用荧光检测器(型号L-7480；Hitachi，Naperville，IL)的反向HPLC(Waters)分析。通过比较20-HETE峰面积与内标的峰面积确定样品中20-HETE的量。
组织收集和血管密度的形态学分析：取下经刺激的和对侧的肌肉，称重并在生理盐溶液中清洗。从TA肌肉向头的部分取300-mg样品并冷冻于液氮用于Western印迹(100mg)和HPLC(200mg)分析，分别检测VEGF蛋白表达和20-HETE形成。剩余的TA和EDL肌肉轻轻地固定于0.25％福尔马林溶液过夜。用手动切片机通过固定肌腱并平行于肌肉纤维的纵向切片将肌肉切为约100μm厚。每只动物制备两个EDL肌肉切片和3个TA肌肉切片。这些切片浸于25μg/ml罗丹明标记的Griffonia simplicifolia I(GS-I)卵磷脂(Sigma；St.Louis，MO(Greene AS等，Hypertension 15：779-783，1990))溶液中2小时。接触GS-I卵磷脂2小时后立即在生理溶液中漂洗肌肉。15和30分钟后重复该清洗过程，并将肌肉在生理盐水溶液中漂洗12小时(过夜，4℃)。第二天，切片用含有甲苯和丙烯酸树脂的水溶性封固培养基(SP ACCU-MOUNT 280，Baxter Scientific)封固于显微镜载玻片上。
如前所述，标记的切片使用反射照明的影像荧光显微镜系统(OlympusULWD CD Plan，×20物镜，1.6cm工作距离和0.4数值的口径)目测(Parmentier JH等，Hypertension 37：623-629，2001)。在本项研究中，分别选择10-15和20-25个代表性视野来研究每个EDL和TA肌肉切片。每个视野转化为数字化图像(DT2801 Data Translation；Marlboro，MA)并以分辨率为512×512像素的8-位/像素图像文件保存。扫描的组织化学切片的形态计量分析如前所述进行(Parmentier JH等，Hypertension 37：623-629，2001)。以前已证实血管-网格交叉(Vessel-grid intersection)可精确且定量地估计血管密度(Parmentier JH等，Hypertension 37：623-629，2001)。
Western印迹分析以检测VEGF蛋白的存在：匀浆100-mg TA肌肉样品，蛋白质悬浮于钾缓冲液中(10mM)。在12％变性的聚丙烯酰胺凝胶上从TA和已知高水平表达VEGF的肿瘤细胞系(C6，美国模式培养物保藏所，107-CCL)分离5微克蛋白质(由蛋白质测定试剂盒测定，Bio-Rad；Hercules，CA)。将凝胶转移至在稀释于Tris-缓冲盐水(50mM Tris和750mM NaCl，pH 8)的5％脱脂奶粉和0.08％吐温20(Bio-Rad)中封闭过夜的硝酸纤维素膜上。印迹然后与来源于人VEGF序列的肽的多克隆抗体(1∶1,000稀释，克隆G143-850，Pharmingen)于室温孵育2小时。洗涤印迹，然后以1∶1,000稀释度与山羊抗-小鼠二抗于室温孵育1小时，再经SuperSignal West Dura化学荧光底物(Pierce；Rockford，IL)检测系统(检测)。膜对X-射线胶卷(FujiMedical；Stamford，CT)曝光15-30秒并用Kodak M35 X-Omat处理器显影。为定量分析VEGF，薄膜总是曝光一段时间以保证所有信号在膜检测的线性范围内。使用形态计量成像系统(Metamorph，Universal Imaging；WestChester，PA)定量VEGF区带强度并将数值表示为C6肿瘤细胞标准物的百分比。
用于检测20-HETE的肌肉制备物：100-200mg冷冻的TA肌肉在含有1ml酸化水和由Taisho Pharmaceutical合成并惠赠的50μl内标，WIT-002的溶液中匀浆。向混合物中加入乙酸乙酯(3ml，Fisher Scientific；Pittsburgh，PA)并小心搅拌。匀浆的组织然后以3,000转/分钟离心2分钟。使用玻璃巴斯德移液管移去上层并转移至无菌的玻璃小瓶，样品在氮气环境中干燥并保存于-80℃。
样品标记和20-HETE的荧光检测：如前所述检测20-HETE(Ma YH等，Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 267：R579-R589，1994)。提取样品并在氩气环境中干燥，将其重悬于含有36.4mM 2-(2，3-萘亚氨基)乙基三氟甲磺酸酯的20μl乙腈中，并加入N，N-二异丙基乙胺(10μl)作为催化剂。样品于室温反应30分钟，在氩气环境中干燥，重悬于1ml的40％乙腈-水，上Sep-Pak Vac柱。用6ml的50％乙腈-水溶液洗涤柱以除去未反应的染料，500μl乙酸乙酯洗脱，氩气环境中干燥并重悬于100μl的HPLC流动相中[甲醇-水-乙酸，82∶18∶0.1(体积/体积)]。25-μl等份衍生的样品在4.6×250-mmSymmetry C18反向HPLC柱(Waters)上使用甲醇-水-乙酸，82∶18∶0.1(体积/体积)作为流动相以1.3ml/分钟的流速等度分离。使用串联的荧光检测器(型号L-7480，Hitachi；Naperville，IL)以中等增益灵敏度检测荧光强度。通过比较20-HETE峰面积和内标(WIT-002)的峰面积确定样品中20-HETE的量。
数据分析和统计：就每份肌肉而言，所有选择的视野(每份EDL肌肉是10-15次扫描×2片；每份TA肌肉是20-25次扫描×3片)的血管计数取单个血管密度的平均值。血管密度表示为每个显微镜视野(0.224mm2)的血管-网格交叉的平均数。就每个实验组而言，将受刺激肌肉的检测到的血管密度和20-HETE形成与其未刺激的对应部分以及年龄匹配的对照相比较。所有数值表示为平均值±SE。使用具有一个因子(刺激)的重复测量值的双因子ANOVA(药物×刺激)评估同一动物中检测值差异的显著性。使用事后测试(post hoc test)(Tukey′s)进一步调查显著的差异。
结果
为评估阻断CYP4A酶的作用，我们检测了用HET0016处理7天的大鼠中的尿液20-HETE排泄。图1给出了阐述20-HETE分离的代表性HPLC色谱。如图1所示，在非常接近20-HETE处有其它峰。基于标准品的共迁移，我们鉴定了色谱图中前一个峰是19-HETE，20-HETE后一个峰是18-HETE。下一个峰是16-HETE，其后是15-HETE。如材料与方法所述，为分析每个峰的面积，我们通过去褶合方法(Hitachi软件)扣除了肩峰。
如图2所示，与用卵磷脂处理的对照组相比，用HET0016慢性处理显著降低了(36％)24-小时的尿液20-HETE排泄(P＜0.05)。
如图3所示，7天的电刺激显著增加骨骼肌中20-HETE形成(未刺激和刺激的肌肉分别是从69.52±31.3到177.58±54.4ng/g肌肉，P＜0.05)。用HET0016处理7天未改变骨骼肌中20-HETE的基础形成量(处理和对照的分别是110.26±28.36和69.52±31.3ng/g肌肉，P＞0.05；图3)；然而，用HET0016慢性处理完全阻断了由电刺激诱导的骨骼肌中20-HETE形成的增加(未刺激和刺激侧分别是从110.26±28.3到102.1±22.3ng/g肌肉；图3)。
如前所示，电刺激导致用卵磷脂处理的对照组中血管密度增加(EDL和TA的血管交叉数量分别是从107.0±1.6到121.0±4.5和从100.4±8.4到132.0±9.9，P＜0.05)。如图4所示，用HET0016慢性处理完全阻断了7天电刺激诱导的骨骼肌中血管密度的增加(EDL和TA的血管交叉数量分别是从116.0±1.0到118.0±10.1和从105.7±4.9到110.5±1.1)。使用ABT慢性抑制20-HETE形成也减缓了电刺激诱导的骨骼肌中血管密度的增加(EDL和TA的血管交叉数量分别是从111±7.4到121±4.35和从99.7±4.72到119.5±4.51)。
由于VEGF显示在骨骼肌血管生成中起重要作用，我们进行了Western印迹分析以确认HET0016或ABT对VEGF蛋白表达的作用。图5显示了Western印迹分析的定量光密度测定，用于比较7天刺激后所有用HET0016处理的动物或对照组中VEGF蛋白表达响应。如图5所示，在对照组中，电刺激显著增加了VEGF蛋白水平(P＜0.05)。为比较HET0016和另一种CYP4A抑制剂的作用，我们在电刺激期间用ABT处理动物组7天，结果示于图5。HET0016或ABT对基线VEGF表达均无任何作用。HET0016或ABT未阻断电刺激诱导VEGF蛋白表达的增加。
在一个补充实验中，用VEGF-中和抗体或PBS(对照)处理大鼠来分析VEGF对20-HETE形成的作用。如图6所示，用VEGF抗体处理完全阻断了由于7天电刺激诱导的20-HETE形成的增加。
                        实施例2
        通过20-HETE调节大鼠角膜中生长因子诱导的血管生成
CYP4A酶将花生四烯酸代谢为20-HETE。在该实施例中，我们证实20-HETE在体外的内皮细胞中体外是促有丝分裂的，体内是血管生成性的。我们还证实高选择性的CYP4A酶抑制剂HET0016阻断VEGF在内皮细胞中的促有丝分裂活性。DDMS是CYP4A的另一种选择性抑制剂。我们证实HET0016和DDMS抑制体内VEGF的血管生成响应。我们还证实HET0016阻断bFGF和EGF的血管生成响应。我们也证实HET0016降低U251，一种人成胶质细胞瘤细胞系诱导的血管生成。
材料与方法
试剂：
如Miyata N等，(Br J Pharmacol 2001，133：325-9)和Sato M等，(BioorgMed Chem Lett 2001，11：2993-5)所述(全文纳入作为参考)合成HET0016[N-羟基-N′-(4-丁基-2甲基苯基)甲脒]，并由Taisho Pharmaceuticals Corp(Satiama，Japan)提供。CYP4A抑制剂DDMS和稳定的20-HETE促效剂，WIT003[20-羟基二十碳-6(Z)，15(Z)-二烯酸]由德克萨斯大学西南医学中心(University of Texas Southwestern Medical Center)的JR Falck博士合成(Capdevila JH和Falck JR，Prostaglandins Other Lipid Mediat 2002，68-69：325-44)并且在以前使用过(Alonso-Galicia M等，Am J Physiol 1999，277：F790-6；Wang MH等，J Pharmacol Exp Ther 1998，284：966-73；和YuM等，Eur J Pharmacol 2004，486：297-306)。VEGF、bFGF和EGF购自R&DSystems(Minneapolis，MN)，NCC型Hydron得自Interferon(New Brunswick，NJ)。PCR引物由Qiagen(Valencia，CA)合成。人血管内皮细胞(HUVEC)和相关的培养试剂购自Cambrex(Walkerville，MD)。所有其它的培养试剂购自Invitrogen(Carlsbad，CA)。棕榈酸和所有其它的试剂购自Sigma ChemicalCorp(St.Louis，MO)。
动物：
使用体重200-225g、7-8周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles RiverLaboratories，Wilmington，MA)进行实验。大鼠安置于12小时/12小时白天/夜晚循环环境中，供给食物并随意饮水。所有方法符合在眼科和视觉研究中使用动物的ARVO声明。使用动物得到亨利福特健康系统(Henry FordHealth System)的动物实验管理委员会(Institutional Animal Care and UseCommittee)(IACUC)，Detroit，MI的批准。
HUVEC增殖测定：
HUVEC以1×104细胞/孔接种于96-孔板。培养物生长过夜，然后单独接触10μM HET0016、1μM WIT003或250ng/ml VEGF或联合HET0016或WIT003共同接触。HET0016和WIT003均溶解于乙醇。有机溶剂浓度切勿超过总培养物体积的0.1％。24小时后，使用CellTiter96AQueous One试剂(Promega，Madison，WI)，一种用于测定增殖的存活细胞数量的可靠比色方法来检测细胞增殖。20μl Aqueous One试剂加入每孔的100μl培养基中。板在增湿孵育箱中于37℃孵育2小时。使用96-孔BioKinetics Reader EL340(Bio-TEK，Winooski，VT)记录490nm的吸光度。数据表示受处理的培养物与对照细胞相比吸光度变化百分数。进行了3个不同的实验，并且每点均进行一式三份的测定。
角膜袋血管生成测定：
(i)制备缓释聚合物：通过制备1∶1的12％聚合物(Hydron聚羟基乙基甲基丙烯酸酯)乙醇溶液和含有生长因子的盐水的混合物来制备缓释聚合物小球。生长因子bFGF、VEGF和EGF以浓度125ng/μl溶解。HET0016和WIT003(Yu M等，Eur J Pharmacol 2004，486：297-306)以浓度为10μg/μl溶解于乙醇，DDMS以浓度为5μg/μl溶解于乙醇。向每个小球加入2μl的这些溶液。因此，含有250ng单一生长因子的小球随机植入右眼或左眼。另一只眼睛中植入同一剂量的含有生长因子+HET0016的小球。在一些大鼠中，小球含有单一的VEGF和VEGF+DDMS。在一只眼睛内植入20μg稳定的20-HETE促效剂类似物WIT003以确定它是否诱导血管生成。由于乙醇是HET0016、DDMS和WIT003的载体，加入乙醇作为所有其它小球的对照。9μl的1∶1 Hydron/处理混合物置于1.5-cm杆的末端。每个小球含有250ng其各自的生长因子。就bFGF而言，我们使用硫糖铝来稳定并维持该生长因子缓释(Volkin DB等，Biochim Biophys Acta 1993，1203：18-26)。小球干燥1小时后，可立即用于植入大鼠的角膜。
(ii)小球植入：用开他敏(80mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)经IM麻醉大鼠。眼睛用0.5％丙氧苯卡因(Ophthetic，Alcon，TX)局部麻醉并用珠宝镊子使眼球突出。使用手术显微镜在平行于插入侧向直肌的方向用手术刀(Bard-Parker #11；Becton Dickinson，Franklin Lake，NY)进行约1.5mm长的中心基质内线形角膜切开术。约1.5mm宽、5mm长的弯曲虹膜刮刀(No.10093-13，Fine Science Tools，Belmont，CA)插入切口的边缘下并将其朝眼睛的颞颥角膜缘(temporal limbus)小心地推过基质。角膜缘和袋之间的距离维持于1.0±0.1mm。小球伸到袋的颞颥(temporal)末端。抗生素软膏(红霉素)涂在眼睛的前表面。
(iii)U251人胶质瘤细胞球状体：U251人胶质瘤细胞由Stephen Brown博士(辐射肿瘤学部门，Henry Ford Health System，Detroit，MI)馈赠。细胞维持于补加了10％热灭活的胎牛血清、青霉素(10IU/ml)、链霉素(10μg/ml)和10％非必需氨基酸的DMEM(Invitrogen)中并于37℃生长在含有5％CO2的增湿孵育箱中。按照Carlsson和Yuhas(Carlsson J和Yuhas JM，RecentResults Cancer Res 1984，95：1-23)的改进方法获得U251球状体。简言之，通过在一层0.8％Noble琼脂(Difco，Livonia，MI)上接种单细胞悬浮液(5×106个细胞)来制备肿瘤细胞球状体。细胞生长2-3天直至球状体形成。选择直径相似的球状体，然后转移到细胞培养皿上并用PBS洗涤以除去痕量的血清。使用安装了标尺的解剖显微镜测量球状体直径。5-8个直径约200μm的球状体吸入装有钝头27规格针头的注射器并插入角膜袋。在该实验中，一只眼睛含有球状体和含有乙醇(HET0016溶剂)的小球，而另一只眼睛接受球状体和含有20μg HET0016的小球。
(iv)定量角膜新血管化：小球植入7天后，大鼠如前述用开他敏和甲苯噻嗪深度麻醉杀死。左心室插入导管并用20-25ml盐水经作心室灌注动物，然后用20-25ml India墨水(防水的绘图墨水，Sanford，Bellwood，IL)灌注。眼睛作朝向标记、摘下并置于4％福尔马林中24小时。将角膜与周围的眼球和其下的虹膜切开，对切并松散地安放于两块玻璃载玻片之间从而轻柔地铺平角膜。使用装了CCD影像照相机的Nikon Diaphot Epi-fluor 2显微镜显微检查这些平坦的固定物，使用计算机数字化图像并保存。
通过比较对照和实验眼睛中总的血管长度测定新血管化。通过追踪角膜缘到小球的每根血管来确定血管长度。总长度是以像素计的这些值的和，并使用常规图像分析软件(Sigma Scan Pro，SPSS，Chicago，IL)确定。
组：
在所有情况中，两只眼睛均植入小球。一只眼睛作为对照，另一只是实验组。研究了下列组。
组1.对照
仅含有2μl乙醇的小球植入大鼠角膜。在一些实验中，我们测试了小球中仅存在脂肪酸所导致的非特异性作用。在这些实验中，小球含有40μg棕榈酸(n＝4)。在仅用乙醇处理和用含有棕榈酸的乙醇处理的眼睛之间VEGF的血管生成响应没有差异。
组2.CYP4A抑制剂HET0016的作用
对照对20μg HET0016或10μg DDMS.基于下述的剂量-应答研究选择这些剂量(n＝6)。包括该组是为确定抑制剂是否具有任何明显的毒性或促血管生成作用。在一些大鼠中也测试了DDMS(10μg/小球)的作用。
组3.HET0016抑制VEGF血管生成应答的剂量应答
a.VEGF对VEGF+5μg HET0016(n＝4)
b VEGF对VEGF+20μg HET0016(n＝4)
c.VEGF对VEGF+40μg HET0016(n＝4)
组4.HET0016的抗血管生成作用。
在这些大鼠中，我们测试了HET0016在VEGF、bFGF和EGF的新血管化应答中的作用。
a.VEGF对VEGF+20μg HET0016(n＝6)
b.bFGF对bFGF+20μg HET0016(n＝6)
c.EGF对EGF+20μg HET0016(n＝8)。
组5.第二种CYP4A抑制剂的抗血管生成作用。
在这些大鼠中，我们测试了DDMS对VEGF的新血管化应答的作用。
VEGF对VEGF+10μg DDMS(n＝7)。该剂量在导向性实验后选择，表明20μg HET0016是有效的。
组6.20-HETE的促血管生成作用。
在这些大鼠中，我们测试了稳定的20-HETE类似物WIT003是否是血管生成性的。
对照对20μg WIT003(n＝7)
组7.HET0016的抗血管生成作用
在这些大鼠中，我们研究了HET0016对癌症诱导的血管生成应答的作用。就这些实验而言，我们使用已知为血管生成性的人成胶质细胞瘤癌细胞系U251(Hsu SC等，Cancer Res 1996，56：5684-91)。球状体和含有HET0016的小球一起植入同一角膜袋。植入球状体14天后评估血管生成应答。
U251细胞球状体对U251球状体+20μg HET0016(n＝8)。
角膜CYP4A1 mRNA表达：
(i)mRNA提取和cDNA合成：使用RT-PCR检测新血管化期间角膜中CYP4A1 mRNA的表达。快速取下角膜并在液氮中快速冷冻。稍后融化角膜并在TRIzol中匀浆。按照生产商的方案(Invitrogen)从TRIzol中提取总RNA。使用260/280nm吸光度之比评价RNA的质量。只有1.8-2.0范围内的样品可用。使用FirstStrand synthesis kit(Invitrogen)逆转录总共1-3μg mRNA。1μg cDNA通过PCR扩增。
(ii)PCR分析：我们使用以下特异性CYP4A1 mRNA引物扩增CYP4A1mRNA：有义：TTCCAGGTTTGCACCAGACTCT(SEQ ID NO：1)和反义：TTCCTCGCTCCTCCTGAGAAG(SEQ ID NO：2)。扩增的β-肌动蛋白用作内标。使用Applied Biosystems(Foster City，CA)的引物表达软件设计引物。CYP4A1的mRNA序列得自GeneBank(登录号NM 175837)，大鼠β-肌动蛋白的登录号是NM 031144。
用于扩增CYP4A1和β-肌动蛋白的PCR条件包括预循环95℃3分钟，其后是由95℃45秒，57℃1分钟和72℃1分钟组成的35轮循环，然后是72℃10分钟的最终延伸。PCR产物经10％丙烯酰胺凝胶电泳并通过溴化乙锭显像。使用合适的对照来保证扩增的样品不含基因组DNA。
统计学分析：
通过配对t-测试确定大鼠中对照和实验眼睛的差异的统计学意义。通过ANOVA，然后事后测试确定各组之间应答的差异。p＜0.05认为是显著的。
结果
VEGF对HUVEC生长的作用示于图7。VEGF刺激这些细胞增殖，而该应答在同时用HET0016处理的培养物中被消除。HET0016未改变HUVEC的基础增殖速率(未显示)。
我们接着使用大鼠角膜袋血管生成测定研究了HET0016在体内对VEGF的血管生成应答的作用。单用HET0016或DDMS都不能引发异于使用盐水的应答(图8B和11B)。为确定HET0016的最佳剂量，我们进行了剂量-应答研究，其中将同时含有不同剂量的HET0016和VEGF的小球植入角膜。剂量为20μg和40μg/小球的HET0016几乎完全消除了VEGF的血管生成应答。5μgHET0016使VEGF的血管生成应答降低约50％。由于所有化合物具有相当的分子量和溶解性，我们选择每个小球20μg的HET0016或其它相关化合物。在一些实验中我们使用棕榈酸作为脂肪酸非特异性作用的对照。棕榈酸本身无作用并且显示不能影响VEGF或其它所研究的血管生成因子的血管生成应答(未显示)。
小球中含有VEGF导致显著的新血管化应答，该应答可被HET0016消除。图8A显示单用VEGF和用VEGF+HET0016处理的代表性角膜显微照片，而图8B是以图示形式显示的结果。在其它实验中，我们检查了阻断CYP4A活性对其它生长因子的血管生成应答的作用。我们研究了HET0016的抗血管生成作用是否仅限于VEGF或也可抑制bFGF和EGF的应答。小球中含有HET0016极大降低了bFGF(图9A和9B)和EGF(图10A和10B)的血管生成应答。
这些数据提示CYP4A活性是血管生成生长因子引发血管生成应答所需的。为巩固该观点，我们测试了CYP4A的化学性质相异的抑制剂，DDMS在大鼠角膜袋血管生成试验中是否也抑制VEGF的血管生成应答。这些实验的结果示于图11A和11B，并且表明DDMS也完全抑制VEGF的血管生成应答。
由于CYP4A是从花生四烯酸合成20-HETE的ω-羟化酶，HET0016可能通过抑制20-HETE合成来起作用。为确定20-HETE是否有助于CYP4A抑制剂的抗血管生成活性，我们测试了稳定的20-HETE类似物WIT003在体外对HUVEC增殖和在体内对新血管生长的作用。WIT003增加HUVEC(图12)的增殖速率并且在大鼠角膜袋血管生成测定中诱导血管生成应答(图13A和13B)。
我们也研究了HET0016是否抑制肿瘤细胞诱导的血管生成。植入角膜袋的人成胶质细胞瘤细胞系U251的三维球状体在两周后导致显著的血管生成。在存在HET0016时，角膜的新血管化显著受抑制(p＜0.01)(图14A和14B)。
评价CYP4A mRNA在大鼠角膜中表达的实验的结果显示在对照角膜中检测到预期大小的区带。在VEGF-处理的角膜中无可检测的变化。
总之，本项研究检验了CYP4A抑制剂对HUVEC的VEGF的促有丝分裂应答和在体内对角膜中的生长因子诱导血管生成的作用。结果表明用HET0016阻断CYP4A活性阻断了HUVEC中VEGF的已知增殖性应答(Kurzen H等，“通过非毒性剂量的替莫唑胺抑制血管生成”(Inhibition ofangiogenesis by non-toxic doses of temozolomide)，Anticancer Drugs 2003，14：515-22)。使用稳定的20-HETE类似物WIT003的实验提示了花生四烯酸代谢物在VEGF诱导的增殖中可能有作用的其它证据。用WIT003处理HUVEC以与用VEGF处理内皮细胞后发生的变化类似的方式增加细胞增殖。
体内血管生成应答涉及远不止内皮细胞增殖的增加一种，因为它还涉及包括细胞迁移、基质降解、内皮细胞分化和perimural细胞募集的其它过程。考虑血管生成过程的复杂性，必需要证实的是血管生成的任何可能的抑制剂能影响体内完全成形血管的形成。由于我们假定对CYP4A的抑制可改变体内血管生成应答，我们在大鼠角膜袋血管生成试验，一种体内血管生成模型中测试了该假设。该测定涉及将含有血管生成诱导物(在我们的实验中是血管生成生长因子或癌细胞)的小球置于刻入角膜基质的袋中。小球缓慢而持续地释放血管生成因子，进而刺激周围脉管系统缘依浓度梯度向小球生长。由于角膜最初是无血管且透明的(Kenyon BM等，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.1996，37：1625-1632)，与其它体内测定相比，仅检测新血管更有利。
当VEGF、bFGF或EGF植入大鼠角膜时观察到强有力的血管生成应答。HET0016的存在消除了所有这些生长因子的血管生成应答。由于存在有效的CYP4A抑制剂时血管生成应答实际上被消除，这表明CYP4A是血管生成的关键调控物。已报道烯烃化合物DDMS是有效和高度选择性的CYP4A抑制剂，其结构和作用机理与HET0016无关(Wang MH等，JPharmacol Exp Ther 1998，284：966-73)。DDMS也消除了VEGF对角膜新血管化的作用。因此，两种不同的CYP4A抑制剂消除了VEGF诱导的血管生成应答，从而加强了这些抑制剂影响血管生成过程中的主要步骤的观点。由于抑制CYP4A明显是HET0016和DDMS之间的共同点，我们得出结论：CYP4A酶活性的一种产物是血管生成过程进行的介体或所需组分，缺少其血管生成过程就无法进行。
血管生成是生理状况，例如伤口愈合与女性生殖周期中的关键现象，并且也是病理情况，例如糖尿病性视网膜病变、黄斑变性和慢性炎症中的关键现象。特别是，肿瘤扩张依赖于血管生成，这对于超过1-2mm以上的肿瘤生长是至关重要的。因此，抑制肿瘤生成新血管的能力是有吸引力的治疗目标。
因此，我们研究了HET0016是否可影响肿瘤诱导的血管生成。为此目的，我们选择了已知是高度血管生成的恶性成胶质细胞瘤细胞模型，成胶质细胞瘤细胞系U251。由于成胶质细胞瘤的多种形态由强烈的血管生成所区分(Hsu SC等，Cancer Res 1996，56：5684-91)，这是临床相关的。我们将U251球状体连同含有HET0016或对照(棕榈酸或盐水)的小球一起植入大鼠角膜基质。所有的对照眼睛显示显著的角膜新血管化；然而，HET0016显著降低约70％的血管生成应答。
                        实施例3
         HET0016抑制人胶质瘤癌细胞中的细胞增殖
该实施例显示20-HETE对人癌细胞生长重要。1μm的20-羟基二十碳-5(Z)，14(Z)-二烯酸，一种稳定的20-HETE促效剂使人胶质瘤U251细胞增殖增加约20％。剂量-应答研究表明用10μM HET0016处理48小时抑制约60％的U251细胞增殖，同时[3H]胸苷摄取降低65％。二溴十二碳烯基甲磺酰亚胺(DDMS，也称为N-甲磺酰基-12，12-二溴十二烷基-11-烯酰胺)，一种结构不同的CYP4A抑制剂也阻断约60％的细胞增殖。DDMS和HET0016均对正常人血管内皮细胞或角化细胞的基础生长无作用。流式细胞计数研究证实HET0016通过使细胞周期停滞于G0/G1来特异性抑制人U251癌细胞的增殖。加入20-HETE促效剂(1μM)逆转HET0016对细胞增殖的阻断约70％。Western印迹实验表明HET0016改变U251癌细胞的酪氨酸磷酸化从而导致在HET0016处理24和48小时后观察到的抑制作用。进一步研究显示加入HET0016特异性抑制p42/p44 MAPK和SAPK/JNK的磷酸化。
材料与方法
细胞系与试剂：U251人胶质瘤细胞得自Stephen L.Brown博士(辐射肿瘤学部门，Henry Ford Health System，Detroit，MI)。人血管内皮细胞(HUVEC)购自Cambrex(East Rutherford，NJ)。原代人角化细胞得自George Murakawa博士(皮肤病学系，Wayne State University，Detroit，MI)。HET0016[N-羟基-N′-(4-丁基-2甲基苯基)甲脒]由Taisho Pharmaceuticals(Japan)馈赠。DDMS、棕榈酸和EGF购自Sigma(St.Louis，MO)。WIT003[20-羟基二十碳-6(Z)，15(Z)-二烯酸]，一种20-HETE促效剂由德克萨斯大学西南医学中心生物化学系(Dallas，Texas)的John R Falck博士合成。所有其它细胞培养试剂购自Invitrogen(Carlsbad，CA)。
培养条件：细胞常规维持于补充有10％热灭活的胎牛血清(FBS)、青霉素(10IU/ml)、链霉素(10μg/ml)和10％非必需氨基酸的DMEM中(均购自Invitrogen)。细胞于37℃维持在含有5％CO2的增湿孵育箱中。细胞生长在含有10％FBS的培养基中，然后用使U251细胞对数生长的无血清培养基替换FBS。除去血清一天后开始处理。
细胞增殖测定：用以至少保证对数生长5天的密度涂布的培养物进行增殖研究。涂布24小时后，用无血清培养基替换生长培养基。如方法中所述，用各种浓度的给定化合物处理细胞24或48小时。HET0016、DDMS和WIT003均用乙醇(EtOH)溶解并稀释。有机溶剂切勿超过总培养物体积的0.1％。通过与0.05％胰蛋白酶/EDTA接触来收集细胞并用血球计数器计数。
[3H]胸苷掺入研究：使用生长于35-mm培养皿中的细胞进行胸苷掺入研究。用HET0016处理1小时后，培养物在各时间用[甲基-3H]胸苷(1μCi/ml培养基)脉冲。棕榈酸和EtOH分别用作脂肪酸和载体对照。脉冲结束时，吸去培养基并用冷的1×磷酸缓冲盐水(PBS)清洗细胞两次。清洗的培养物通过在4℃与冷的5％三氯乙酸接触过夜固定，然后按照前述提取固定的细胞(Scholler等，Mol.Pharmacol.45：944-954，1994)。第二组未固定的培养皿用0.05％胰蛋白酶/EDTA处理来估计细胞数目。通过闪烁计数检测[3H]胸苷并表示为dpm/103细胞。
流式细胞计数：细胞以能保证在收集时为对数生长的密度培养于100-mm培养皿中。先前描述过通过使用碘化丙锭(PI)的流式细胞计数检测DNA的收集和加工方案(Reiners等，Carcinogenesis 20：1561-1566，1999)。在Wayne State University Flow Cytometry Core Facility，Detroit，MI用Becton Dickinson FACScan分析细胞。用DNA直方图拟合程序(MODFIT；Verity Software，Topsham，ME)确定处于细胞周期G0/G1、S和G2/M期的细胞百分比。至少收集104种情况/样品。
DNA片断化和TUNEL实验：HET0016-处理的培养物用1×PBS洗涤两次并与裂解缓冲液[20mM Tris-HCl、10mM EDTA、0.3％Triton X-100]一起孵育。提取基因组DNA并在2％琼脂糖凝胶上分离。通过用溴化乙锭(EtBr)染色凝胶来使分离的DNA显像。同时将U251培养物接种于盖玻片上并用HET0016处理来进行TUNEL测定。盖玻片用3×PBS洗涤，风干。然后用新鲜配制的固定溶液(4％PBS配制的低聚甲醛，pH 7.4)于室温固定样品1小时，接着在新鲜的渗透化溶液(0.1％柠檬酸钠配制的0.1％TritonX-100)中于冰上孵育2分钟。最后根据生产商的建议使用原位细胞死亡检测试剂盒，AP(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)加工样品。
RNA分离和逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)：培养物分别用10μMHET0016或100μM DDMS处理24和48小时。乙醇处理的培养物用作溶剂对照。简言之，用Trizol试剂(Invitrogen)分离总RNA并使用首链合成试剂盒(Invitrogen)用1-2μg RNA来合成cDNA。我们使用特异识别CYP4A的PCR引物和β-肌动蛋白-特异性引物。向Platinum PCR Supermix(Invitrogen)中加入1μCi 32P/样品。用于扩增CYP4A和β-肌动蛋白的PCR条件包括95℃、3分钟的预循环；然后是95℃、45秒，52℃、30秒和72℃、2分钟的35轮循环；和72℃、10分钟的最终延伸。所用的引物是：β-肌动蛋白正向引物，5’-TGC GTG ACA TTA AGG AGA AG-3’(SEQ IDNO：3)；β-肌动蛋白反向引物，5’-GCT CGT AGC TCT TCT CCA-3’(SEQ IDNO：4)；CYP4A11正向引物，5’-CCA CCT GGA CCA GAG GCC CTA CACCAC C-3’(SEQ ID NO：5)；CYP4A11反向引物，5’-AGG ATA TGG GCAGAC AGG AA-3’(SEQ ID NO：6)。PCR产物经5％双-丙烯酰胺凝胶电泳并通过放射自显影显像。
制备核提取物和Western印迹：用10μM HET0016处理细胞不同时间并用冰冷却的1×PBS洗涤两次。然后于4℃以1,000g离心细胞5分钟得到沉淀。加入RIPA缓冲液[20mM HEPES(pH 7.4)，100mM NaCl，1％Nonidet P-40，0.1％SDS，1％脱氧胆酸，10％甘油，1mM EDTA，1mMNaVO3，50mM NaF和蛋白酶抑制剂Set 1(Calbiochem，La Jolla，CA)]裂解细胞。然后刮板并将细胞收集在1.5-ml离心管中，再于冰上孵育30分钟。细胞悬浮液的匀浆液于4℃以14,000g离心10分钟，弃去沉淀并通过二辛可宁酸(bicinchoninic acid)(BCA)蛋白质实验确定上清液中的蛋白质浓度。
20μg蛋白质一般在14％三甘氨酸凝胶(Invitrogen)上分离并电印迹至PVDF膜(Biotrace，Bothell，WA)。膜在与封闭缓冲液[1×PBS配制的0.2％I-封闭试剂(Tropix，Bedford，MA)，0.1％吐温-20]配制的一抗孵育(4℃过夜)前，用封闭缓冲液于室温封闭1小时。磷酸-酪氨酸(Y102)、磷酸-丝氨酸/苏氨酸-Pro MPM2、磷酸-p42/p44 MAPK(T202/Y204)(20G11)和磷酸-SAPK/JNK(T183/Y185)(98F2)单克隆抗体购自Upstate，Waltham，MA。此外，CYP4A多克隆抗体购自Research Diagnostics(Flanders，NJ)和Chemicon(Ternecula，CA)来检测CYP4A蛋白。使用1∶2000稀释的对应抗体检测磷酸-酪氨酸(Y102)和磷酸-丝氨酸/苏氨酸-Pro MPM2，使用1∶1000稀释的抗体检测磷酸-p44/p42MAPK和磷酸-SAPK/JNK。CYP4A抗体以1∶100稀释度使用。膜在洗涤缓冲液(1×TBS和0.1％吐温-20)中洗涤3次后，于室温和过氧化物酶偶联的山羊抗-小鼠或抗-家兔抗体(Upstate，Waltham，MA)(在封闭缓冲液中以1∶4000稀释)孵育1小时。然后在洗涤缓冲液中洗涤膜3次，并根据生产商的方案用改善的化学发光试剂盒(Upstate)进行化学发光检测。肌动蛋白用作加样对照。
统计学分析：数据通过Tukey HSD测试分析。用Statistica 5.0软件包(StaSoft，Tulsa，OK)进行这些计算。p＜0.05处的差异认为是统计学显著的。
结果
CYP4A抑制对细胞增殖的作用：为评价20-HETE在调节U251细胞生长中的作用，我们研究了CYP4A抑制剂HET0016在体外对人U251胶质瘤癌细胞增殖和生长的作用。我们用各种浓度的HET0016处理细胞2天，然后计数细胞。HET0016以浓度依赖性的方式抑制U251细胞的基础增殖(图15A)。由于台盼蓝排除显示细胞的存活率未受HET0016影响，这认为是细胞抑制作用。此外，HET0016也抑制EGF诱导的增殖(图16)。剂量-应答研究显示10μM HET0016抑制约60％的U251细胞增殖，该浓度用作我们所有随后研究的工作浓度。进行DNA片断化和TUNEL实验来检测HET0016是否在U251细胞中诱导凋亡。由于两种结果均是阴性(数据未显示)，我们的结论是HET0016未在这些细胞中诱导凋亡。为确定HET0016对正常细胞是否有对U251癌细胞相同的作用，我们用10μM HET0016处理HUVEC和人基础角化细胞。HET0016对两种正常类型人细胞的生长或增殖均无作用(图17)。
[3H]胸苷掺入的分析显示向培养基中加入HET0016约24和48小时后，50％和60％的DNA合成受到抑制(图15B)。与HET0016相同的是，DDMS，一种结构不同的20-HETE合成抑制剂也以剂量依赖性方式抑制U251癌细胞增殖(图18)。
流式细胞术：进行细胞DNA含量的流式细胞术来确定HET0016的抗增殖作用是否反映了细胞周期停滞在某一特定位置(图15C)。含有G0/G1DNA的细胞在HET0016处理的24和48小时处积累，伴有S和G2/M期细胞的丧失。
CYP4A在mRNA和蛋白质水平的表达：我们进行了RT-PCR和Western印迹实验来确定CYP4A是否在U251细胞中表达。DNA测序证实CYP4A11mRNA在对照U251培养物中表达。用10μM HET0016处理细胞24小时后转录水平下降，而在用100μM DDMS处理的培养物中未受影响。因此，CYP4A基因得到转录并在U251培养物中表达信息。此外，使用得自两种商业来源的两种不同CYP4A多克隆抗体的Western印迹实验显示两种抗体检测到与CYP4A的预期分子量一致的约55kDa的免疫活性蛋白质。因此，人U251癌细胞在mRNA和蛋白质水平表达CYP4A。
具有促效剂活性的20-HETE类似物对U251癌细胞增殖的作用：我们测试了具有促效剂特征的稳定的20-HETE类似物WIT003对生长于培养基中的U251癌细胞增殖的作用。用0.1和1.0μM的20-HETE促效剂处理血清禁食培养物48小时，然后计数细胞。由于已知EGF能导致U251细胞最大增殖，它用作阳性对照。浓度为0.1μM的WIT003对U251细胞增殖的刺激作用不比50ng/ml EGF强，但1.0μM WIT003刺激约20％U251癌细胞增殖。作用的强度与200ng/ml EGF诱导的生长刺激作用相当(图19)。
20-HETE促效剂逆转HET0016的抗增殖作用：我们检测了外源性添加20-HETE促效剂WIT003是否可逆转用HET0016阻断内源性20-HETE合成所诱导的U251细胞增殖抑制。在该实验中，用1μM WIT003、10μMHET0016或同时用两种化合物处理U251培养物。处理2天后计数细胞。在存在WIT003和HET0016时，U251增殖增加至70％，超过了在单用HET0016处理的培养物中观察到的(图20)。这些结果说明加入稳定的20-HETE促效剂WIT003逆转了HET0016抑制U251癌细胞增殖的作用。
CYP4A抑制对U251细胞中信号转导蛋白的磷酸化的作用：为阐明与HET0016在U251细胞中对20-HETE形成抑制相关的下游信号传递作用，从用HET0016处理不同时间的U251培养物中分离蛋白质提取物。为检测HET0016在U251细胞的蛋白质的酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸化状态中诱导的变化，使用磷酸-酪氨酸(Y102)抗体和磷酸-Ser/Thr-Pro MPM2抗体进行Western印迹。我们发现HET0016在U251细胞中改变了酪氨酸磷酸化，导致其在加入HET0016后24和48小时显著降低。然而，用HET0016处理的U251细胞中蛋白质的丝氨酸/苏氨酸磷酸化未见有明显变化。其它两种抗体用于检测HET0016如何如何影响p42/p44 MAPK和SAPK/JNK磷酸化。HET0016在24和48小时抑制p42/p44 MAPK和SAPK/JNK磷酸化。因此，MAPK和SAPK/JNK途径可在CYP4A抑制导致的信号转导中起作用。
                        实施例4
     20-HETE抑制剂在体外和体内抑制大鼠胶质肉瘤细胞增殖
该实施例显示CYP4A的选择性抑制剂HET0016在体外对9L生长和体内在大鼠的9L诱导大脑肿瘤中的作用。RT-PCR确定CYP4A基因在9L细胞中高度表达。用高度选择性的抑制剂，HET0016抑制CYP4A活性以剂量相关的方式降低9L细胞增殖。加入10μM HET0016 48小时后使9L细胞增殖降低60％。1μM的稳定的20-HETE促效剂WIT003拯救HET0016抑制的细胞增殖约70％。EGF(200ng/ml)使生长于体外的9L细胞增殖增加约30％。用1μM WIT003获得类似的刺激程度。HET0016几乎消除了EGF-诱导的9L细胞生长。Western印迹分析显示HET0016降低p42/p44 MAPK和SAPK/JNK的磷酸化。在大鼠中，通过将9L细胞直接注射入前脑诱导体内大脑肿瘤。用HET0016(1mg/Kg/天，ip)处理大鼠约2周使大脑肿瘤体积降低80％。这是因为注射的9L细胞的有丝分裂降低一级凋亡增加。
材料和方法
培养条件：9L大鼠胶质肉瘤细胞购自ATC(Gaithersburg，MD)并维持于DMEM(Invitrogen)中，其中DMEM补加了10％热灭活的胎牛血清(FBS)、青霉素(10IU/ml)、链霉素(10μg/ml)和10％非必需氨基酸(均购自Invitrogen)。细胞于37℃维持在含有5％CO2的增湿孵育箱中。细胞生长在含有10％FBS的培养基中，然后用使9L细胞对数生长的无血清培养基(给出类型和来源)替换FBS。
细胞增殖实验：用以至少保证对数生长5天的密度涂布的培养物进行增殖研究。涂布24小时后，一般用无血清培养基替换生长培养基。用HET0016(Taisho Pharmaceuticals，Japan)、DDMS、棕榈酸(非特异性脂肪酸对照)、EGF(Sigma，St.Louis，MO)或WIT003(20-HETE促效剂)处理细胞24或48小时。HET0016、DDMS和WIT003均用乙醇(EtOH)溶解并稀释。加入培养基的乙醇浓度切勿超过0.1％。通过与0.05％胰蛋白酶/EDTA溶液接触来收集细胞并用血球计数器计数。
[3H]胸苷掺入研究：使用生长于35-mm培养皿中的细胞进行胸苷掺入研究。用HET0016处理1小时后，培养物在各时间用[甲基-3H]胸苷(1μCi/ml培养基)脉冲。棕榈酸和EtOH分别用作非特异性脂肪酸和载体对照。脉冲结束时，吸去培养基并用冷的1×磷酸缓冲盐水(PBS)清洗细胞两次。清洗的培养物通过在4℃与冷的5％三氯乙酸接触过夜固定，然后按照前述提取固定的细胞(Scholler等，Mol.Pharmacol.45：944-954，1994)。第二组未固定的培养皿用0.05％胰蛋白酶/EDTA处理来估计细胞数目。通过闪烁计数检测[3H]胸苷并表示为dpm/103细胞。
DNA片断化和TUNEL实验：HET0016-处理的9L培养物用1×PBS洗涤两次并与裂解缓冲液[20mM Tris-HCl、10mM EDTA、0.3％TritonX-100]一起孵育。提取基因组DNA并在2％琼脂糖凝胶上分离。分离的DNA通过用溴化乙锭(EtBr)染色凝胶来目测。同时将9L培养物接种于盖玻片上并用HET0016处理来进行TUNEL实验。盖玻片用3×PBS洗涤，风干。然后用新鲜配制的固定溶液(4％PBS配制的低聚甲醛，pH 7.4)于室温固定样品1小时，接着在新鲜的渗透化溶液(0.1％柠檬酸钠配制的0.1％TritonX-100)中于冰上孵育2分钟。最后根据生产商的建议使用原位细胞死亡检测试剂盒，AP(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)加工样品。
RNA分离和逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)：培养物分别用10μMHET0016或100μM DDMS处理48小时。EtOH处理的培养物用作溶剂对照。然后用Trizol试剂(Invitrogen)分离总RNA并使用首链合成试剂盒(Invitrogen)用1-2μg RNA来合成cDNA。我们使用特异识别CYP4A的PCR引物和β-肌动蛋白-特异性引物。Platinum PCR Supermix(Invitrogen)用作反应混合物。用于扩增CYP4A1/2/3和β-肌动蛋白的PCR条件包括95℃、3分钟的预循环；然后是95℃、45秒，52℃、30秒和72℃、2分钟的35轮循环；和72℃、10分钟的最终延伸。所用的引物是：β-肌动蛋白正向引物，5’-TTC AAC ACC CCA GCC ATG T-3’(SEQ ID NO：3)；β-肌动蛋白反向引物，5’-GTG GTA CGA CCA GAG GCA TAC A-3’(SEQ ID NO：4)；CYP4A1/2/3正向引物，5’-TTC CAG GTT TGC ACC AGA CTC T-3’(SEQID NO：5)；CYP4A1/2/3反向引物，5’-TTC CTC GCT CCT CCT GAG AAG-3’(SEQ ID NO：6)。PCR产物经5％双-丙烯酰胺凝胶电泳并通过放射自显影显像。
制备核提取物和Western印迹：用10μM HET0016处理9L细胞各种时间并用冰冷却的PBS洗涤两次。然后于4℃以1,000g离心细胞5分钟得到沉淀。加入RIPA缓冲液[20mM HEPES(pH 7.4)，100mM NaCl，1％Nonidet P-40，0.1％SDS，1％脱氧胆酸，10％甘油，1mM EDTA，1mMNaVO3，50mM NaF和蛋白酶抑制剂Set 1(Calbiochem，La Jolla，CA)]裂解细胞。然后刮板并将细胞收集在1.5-ml离心管中，再于冰上孵育30分钟。细胞悬浮液的匀浆液于4℃以14,000g离心10分钟，弃去沉淀并通过二辛可宁酸(BCA)蛋白质实验确定上清液中的蛋白质浓度。
得自细胞匀浆液的20μg蛋白质一般在14％三甘氨酸凝胶(Invitrogen)上分离并转移至PVDF膜(Biotrace，Bothell，WA)。膜用封闭缓冲液[1×PBS配制的0.2％I-Block试剂(Tropix，Bedford，MA)，0.1％吐温-20]于室温封闭1小时，然后于4℃与封闭缓冲液配制的一抗孵育过夜。磷酸-p42/p44MAPK(T202/Y204)(20G11)和磷酸-SAPK/JNK(T183/Y185)(98F2)单克隆抗体购自Upstate(Waltham，MA)。此外，购自Research Diagnostics(Flanders，NJ)和Chemicon(Ternecula，CA)的CYP4A多克隆抗体用于检测CYP4A蛋白。使用1∶1000稀释的抗体检测磷酸-p44/p42MAPK和磷酸-SAPK/JNK。CYP4A抗体以1∶100稀释度使用。膜在洗涤缓冲液(1×TBS和0.1％吐温-20)中洗涤3次后，于室温和过氧化物酶偶联的山羊抗-小鼠或抗-家兔抗体(Upstate)(在封闭缓冲液中以1∶4000稀释)孵育1小时。然后洗涤膜3次，并使用改善的化学发光试剂盒(Upstate)显影。然后剥下膜并用作为加样对照的β肌动蛋白一抗再次探查。
肿瘤植入：植入前，90％汇合的9L细胞经胰蛋白酶化并离心。细胞沉淀重悬于DMEM+10％FBS并用血球计数器计数。9L细胞的浓度调整为1×104细胞/5μl培养基。
按照下述通过将9L细胞悬浮液注射入购自Charles River Laboratories(Wilmington，MA)的Fisher 344大鼠的前脑皮层来接种大脑肿瘤。用开他敏(80mg/Kg，im)和甲苯噻嗪(13mg/Kg)麻醉大鼠，将头部固定于立体定向框架(David Kopf Instruments，Tujunga，CA)并暴露颅骨。在颅骨中前囱的侧面2mm和前部2.5mm处钻一小孔，使用装有26规格针头的10μlHamilton(#2701)注射器在5分钟期间将5μl 9L胶质肉瘤细胞悬浮液注射入大脑皮层内3.5mm处。用骨蜡封闭该孔并闭合切口。让肿瘤生长2天并形成后，大鼠每天以10mg/kg/天的剂量皮下(sc)注射HET0016或载体卵磷脂两次。用HET0016或载体处理15天后，用80mg/Kg(开他敏)麻醉杀死大鼠并用250ml无菌的0.9％盐水溶液经心脏穿刺冲洗，然后用生理盐溶液配制的10％福尔马林灌注固定。取出大脑并保存于10％福尔马林中。
评价肿瘤体积：福尔马林固定的大脑置于Coronal大鼠大脑基质中并切为3毫米小块。然后将这些块包埋于石蜡中并制备6μM厚的切片。制备用于H&E染色的切片放于无涂层的载玻片上。用于免疫组织化学分析的切片放于带正电的超磨砂载玻片上。该系列切片用H&E染色来评价肿瘤大小并通过Ki-67抗原的免疫组织化学方法来评价增殖程度。
使用2×物镜的SONY CCD照相机拍下含有肿瘤的H&E染色切片的图像。使用AIS图像分析系统(Imaging Research，St.Catherine，ON，Canada)软件手工绘出每个切片中肿瘤的面积并以mm2测量。然后面积乘以切片的厚度来计算切片体积。然后将所有切片的体积取和得到每只大鼠的总肿瘤体积。
制备用于免疫组织化学分析的切片通过于加热板上在柠檬酸缓冲液(pH 6.0)煮沸10分钟来除去石蜡。切片冷至室温，置于封闭缓冲液[PBS配制的2％常规血清、1％BSA]中1小时，在洗涤缓冲液中[PBS配制的0.05吐温-20]洗涤两次，用过氧化氢封闭10分钟并在洗涤缓冲液中漂洗。然后将切片与家兔多克隆抗-ki67抗体(Abcam Inc.，Cambridge，MA；在PBS配制的1.0％BSA中以1∶200稀释)孵育30分钟。切片在洗涤缓冲液中洗涤，与生物素化的山羊抗-家兔IgG(Vector Laboratories，Inc.，Burlingame，CA；PBS配制为1∶500)孵育30分钟并再次洗涤。切片然后与HRP-链霉抗生物素蛋白(Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.，West Grove，PA；PBS配制为1∶500)孵育30分钟并洗涤。DAB底物(Vector Laboratories，Inc.，Burlingame，CA；2滴底物缓冲液，4滴DAB，2滴用5ml蒸馏水配制的过氧化物)涂布于切片8分钟。然后洗涤切片，在Meyer苏木精中复染5秒，在氨水中染蓝，在水中漂洗，干燥，清洁并固定。
原位凋亡分析：其它切片如上述除去石蜡并用ApopTag过氧化物酶检测试剂盒(Chemicon International Inc.，Temecula，CA)分析凋亡情况。简言之，用蛋白酶(20μg/ml)于室温消化复水的切片15分钟，然后在3.0％H2O2中猝灭5分钟并洗涤。然后于37℃用TdT酶在增湿室中标记1小时并于室温施用抗-洋地黄毒苷偶联物30分钟。洗涤切片、在过氧化物酶底物中显影、在5％甲基绿中复染10分钟，干燥并固定用于光显微镜检测。
统计学分析：使用ANOVA，再用Tukeys测试分析数据。p＜0.05处的差异认为是统计学显著的。
结果
CYP4A的RT-PCR：由于据报道HET0016是CYP4A和4F酶催化的20-HETE合成的高度选择性抑制剂，我们首先通过RT-PCR检测CYP4AmRNA是否在9L胶质肉瘤细胞中表达。我们观察到CYP4A的mRNA在体外生长的9L细胞中表达。
抑制CYP4A在体外对9L胶质肉瘤细胞增殖的作用：各种浓度的HET016对9L胶质肉瘤细胞生长的作用示于图21。根据细胞计数直接评估，HET0016对生长在培养物中的9L细胞产生剂量依赖性抑制(图21A)。即使在非常低的10nM浓度(接近该化合物抑制CYP4A一些同种型的报道IC50)，虽然与对照的差异不显著(p＝0.056)，对细胞生长一定程度的抑制也是明显的。1和10μM浓度的HET0016在24和48小时明显使细胞数量降低30-40％。
在其它实验中，我们测试了高浓度(100μM)的HET0016对9L细胞生长的作用。这导致细胞数量显著降低。然而，我们也观察到细胞实质性的解离和培养基中漂浮有死细胞，这提示此浓度的HET0016可能具有直接的细胞毒性作用。因此，我们决定在以后所有的实验中使用10μM浓度的HET0016。如图21B所示，HET0016(10μM)在9L胶质肉瘤细胞的培养物中使胸苷掺入降低60％。图21B所示生长曲线的检测表明HET0016改变该特性曲线的斜率，这表明其是对细胞增殖起作用而非杀死一群细胞进而导致特性曲线中预期的基线偏移。
DDMS在体外对9L细胞增殖的作用：DDMS是CYP4A的一种高度选择性的自杀底物抑制剂，但其化学结构和作用机理与HET0016极为不同。各种浓度的DDMS在体外对9L细胞的生长速率的作用示于图22。这些结果与用HET0016观察到的相当。在接近抑制CYP4A酶的IC50的10μM浓度时，DDMS明显降低细胞数量。在较高浓度(100μM)，DDMS降低这些细胞增殖的作用和HET0016(10μM)的相似。
HET0016在体外对EGF刺激的9L细胞生长的作用：9L细胞与EGF(200ng/ml)接触在24和48小时增加细胞数量(图23)。加入HET0016(10μM)防止EGF在24小时对细胞生长的作用并在48小时降低细胞数量(图23)。比较生长曲线的斜率提示HET0016的抑制作用在24-48小时间变弱。
20-HETE类似物对HET0016的生长抑制作用的作用：为确定HET0016对9L胶质肉瘤细胞生长的抗增殖作用是否与抑制20-HETE合成相关，我们检测了外源性加入WIT003，一种稳定的20-HETE促效剂是否可阻止HET0016的抗增殖作用。示于图24的结果表明向培养基中加入WIT003(1μM)部分拯救了9L细胞免遭HET0016的抑制作用。将单用HET0016诱导的抑制视为100％，用HET0016+WIT003处理的细胞显示仅使增殖有60％的提高。
HET0016对MAPK和JNK的酪氨酸磷酸化的作用：为进一步理解HET0016可抑制9L细胞生长的机理，我们检测了HET0016对有丝分裂原激活的蛋白质激酶(MAPK)的磷酸化和激活的作用，该激酶已知在9L细胞的细胞生长和增殖中起作用。用HET0016(10μM)处理9L细胞4小时明显降低了p42/p44MAPK和SAPK/JNK的磷酸化。p42/p44MAPK磷酸化的降低甚至高于接触HET001624小时后的。JNK的磷酸化也观察到相同的趋势，虽然抑制在48小时达到最高而非在接触HET0016的24小时时。
CYP4A和4F抑制剂在大鼠体内对大鼠9L胶质肉瘤大脑肿瘤生长的作用：9L细胞植入正常、免疫活性大鼠的前脑后，它们形成具有明确边界的快速生长的肿瘤。在现有实验条件下，如果不处理动物通常在2-3周后死亡。在本项研究中，植入肿瘤17天后，我们发现用HET0016处理的大鼠看起来更健康并且在尸检时显示比在未处理对照大鼠中所观察到的小得多的肿瘤(图25)。对照和HET0016处理大鼠通过肿瘤中面的代表性切片连同对肿瘤体积的比较示于图26。与对照动物中观察到的相比，HET0016处理大鼠的肿瘤体积降低了80％(图26)。
原位凋亡分析的结果：9L肿瘤的切片用抗体免疫染色来确定细胞增殖和凋亡的面积。用HET0016慢性处理的大鼠9L肿瘤中用Ki67抗体阳性染色的有丝分裂细胞数量极大降低。相反，用载体或HET0016处理的大鼠9L肿瘤中阳性染色的凋亡细胞数量上无明显差异。这些结果表明用HET0016抑制20-HETE的合成通过使细胞增殖停滞来抑制肿瘤生长而非刺激癌细胞的凋亡和程序性死亡。
本发明不受上述实施例的限制，但包括附加的权利要求范围内的所有改进和变化形式。
                                 序列表
<110>R.J.罗曼(Roman，Richard J.)
     A.格林(Greene，Andrew)
     S.阿马拉尔(Amaral，Sandra L.)
     G.希克利(Scicli，Alfonso Guillermo)
     S.L.布朗(Brown，Stephen)
     P.陈(Chen，Ping)
     M.郭(Guo，Meng)
<120>调节血管生成和癌细胞增殖的方法
<130>650053.00031
<150>60/520,172
<151>2003-11-14
<160>6
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的PCR引物
<400>1
ttccaggttt gcaccagact ct                                          22
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的PCR引物
<400>2
ttcctcgctc ctcctgagaa g                                           21
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的PCR引物
<400>3
tgcgtgacat taaggagaag                                            20
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的PCR引物
<400>4
gctcgtagct cttctcca                                              18
<210>5
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的PCR引物
<400>5
ccacctggac cagaggccct acaccacc                                  28
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的PCR引物
<400>6
aggatatggg cagacaggaa                                            20

Claims (28)

1.一种减少人或非人哺乳动物组织中血管生成的方法，该方法包括以下步骤：
给予人或非人哺乳动物以足够减少组织中血管生成量的选自20-HETE合成抑制剂或20-HETE拮抗剂的药物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述药物是20-HETE合成抑制剂。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述20-HETE合成抑制剂选自N-羟基-N-(4-丁基-2-甲基苯酚)-甲脒(HET0016)、二溴十二碳烯基甲磺酰亚胺(DDMS)、N-(3-氯-4-吗啉-4-基)苯基-N′-羟基亚氨甲酰胺(TS-011)、1-氨基苯并三唑(ABT)、17-十八炔酸(17-ODYA)、酮康唑、咪康唑、氟康唑或10十一炔基硫酸酯(10-SUYS)。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述20-HETE合成抑制剂是HET0016或TS-011。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述药物是20-HETE拮抗剂。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法用于减少生长因子诱导的血管生成。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述生长因子选自血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法用于减少癌症或肿瘤细胞诱导的血管生成。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法用于减少非肌肉组织中的血管生成。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法用于治疗或预防与人或非人哺乳动物中异常、过度血管生长相关的疾病或病症。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述疾病是癌症。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述疾病是与异常、过度血管生长相关的眼病。
13.一种用于减少人或非人哺乳动物组织中血管生成的方法，该方法包括以下步骤：
给予所述哺乳动物以足够降低组织中血管生成的量的N-(3-氯-4-吗啉-4-基)苯基-N′-羟基亚氨甲酰胺(TS-011)、N-羟基-N-(4-丁基-2-甲基苯酚)-甲脒(HET0016)或二溴十二碳烯基甲磺酰亚胺(DDMS)。
14.一种用于诱导和促进人或非人哺乳动物组织中血管生成的方法，该方法包括以下步骤：
给予人或非人哺乳动物以足够促进组织中血管生成的量的选自20-HETE或20-HETE促效剂的药物。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述药物是20-HETE促效剂。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法用于促进非肌肉组织中的血管生成。
17.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法用于治疗或预防与人或非人哺乳动物中血管生长不足或血管退化有关的疾病或病症。
18.一种用于诱导和促进人或非人哺乳动物组织中血管生成的方法，该方法包括以下步骤：
给予所述哺乳动物以足够在组织中诱导和促进血管生成的量的20羟基二十碳-6(Z)，15(Z)-二烯酸。
19.一种抑制癌症或肿瘤细胞增殖的方法，该方法包括以下步骤；
将癌症或肿瘤细胞暴露于足够抑制癌症或肿瘤细胞增殖的量的选自20-HETE合成抑制剂或20-HETE拮抗剂的药物。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述药物是20-HETE合成抑制剂。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述20-HETE合成抑制剂选自N-羟基-N-(4-丁基-2-甲基苯酚)-甲脒(HET0016)、二溴十二碳烯基甲磺酰亚胺(DDMS)、N-(3-氯-4-吗啉-4-基)苯基-N′-羟基亚氨甲酰胺(TS-011)、1-氨基苯并三唑(ABT)、17-十八炔酸(17-ODYA)、酮康唑、咪康唑、氟康唑或10十一炔基硫酸酯(10-SUYS)。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述20-HETE合成抑制剂是HET0016或TS-011。
23.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述药物是20-HETE拮抗剂。
24.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述癌症或肿瘤细胞是人或大鼠胶质瘤细胞。
25.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述方法用于通过给予人或非人哺乳动物所述药物来治疗或预防人或非人哺乳动物的癌症或肿瘤。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述癌症选自胶质瘤、星形细胞瘤、肠癌、乳腺癌、皮肤癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、甲状腺癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、结肠癌或卵巢癌。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述癌症选自胶质瘤、乳腺癌、皮肤癌、前列腺癌、胰腺癌或结肠癌。
28.一种抑制肿瘤或癌细胞增殖的方法，该方法包括以下步骤；
使肿瘤或癌细胞暴露于足够抑制肿瘤或癌细胞增殖的量的N-(3-氯-4-吗啉-4-基)苯基-N′-羟基亚氨甲酰胺(TS-011)、N-羟基-N-(4-丁基-2-甲基苯酚)-甲脒(HET0016)或二溴十二碳烯基甲磺酰亚胺(DDMS)。
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