CN1436241A - 鞘氨醇激酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明一般涉及调节细胞生长的方法，且更具体地说，本发明涉及对赘生性细胞生长进行减量调节的方法。本发明特别用于治疗和/或预防性治疗癌症，诸如但不限于：实体癌，诸如结肠癌、胃癌、肺癌、脑癌、骨癌、食道癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌或子宫癌。

Description

鞘氨醇激酶及其应用
发明领域
本发明一般涉及调节细胞生长的方法，且更具体地说，本发明涉及对赘生性细胞生长进行减量调节的方法。本发明特别用于治疗和/或预防性治疗癌症，诸如但不限于：实体癌，诸如结肠癌、胃癌、肺癌、脑癌、骨癌、食道癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌或子宫癌。
发明背景
将作者在本说明书中引用的公开出版物的详细目录收集在本说明书中的结尾部分。
在本说明书中对任何现有技术的引用并非是且不应被看作是对在澳大利亚该现有技术构成一般性常识的一部分的一种认可或任何形式的提示。
鞘氨醇激酶是不同细胞反应中的关键调节酶。已知鞘氨醇-1-磷酸是信号转导过程中的重要第二信使(Meyer等，1997)。它在各种细胞类型中促进有丝分裂(Alessenko，1998)且看起来可引起不同范围的重要调节途径，包括防止神经酰胺诱导的编程性细胞死亡(Culliver等，1996)、IP3-非依赖性途径对胞内钙的转移、刺激DNA合成、激活促分裂原活化蛋白(MAP)激酶途径、磷酸酯酶D的活化和对细胞运动性的调节(就综述而言，例如参见(Meyer等，1997；Spiegal等，1998；Igarashi，1997))。
近期研究(Xia等，1998)已经证实鞘氨醇-1-磷酸是血管内皮细胞对肿瘤坏死因子-α(TNFα)的炎症反应的必须信号中间体。尽管它显然很重要，但是几乎不了解其控制细胞鞘氨醇-1-磷酸水平的机理。已知细胞中的鞘氨醇-1-磷酸水平主要通过其经鞘氨醇激酶而由鞘氨醇形成来介导且在较低的程度上通过其由与内质网相关的鞘氨醇-1-磷酸裂合酶和鞘氨醇-1-磷酸磷酸酶降解而介导(Spiegal等，1998)。鞘氨醇-1-磷酸在细胞中的基础水平一般较低，而当细胞与促分裂剂接触时这种水平可以迅速而短暂提高。这种反应看起来与细胞溶胶中鞘氨醇激酶活性提高有关且可以通过添加鞘氨醇激酶抑制分子N，N-二甲基鞘氨醇和DL-苏型-二氢鞘氨醇来防止这种反应发生。这一结果表明鞘氨醇激酶是调节细胞鞘氨醇-1-磷酸水平所必不可少的重要分子。这使得鞘氨醇激酶在介导由细胞中鞘氨醇-1-磷酸产生的作用中起重要的和必须的作用。
据推断鞘氨醇激酶在包括炎症、钙转移、细胞运动性和粘着分子表达在内的许多细胞活性方面起作用。然而，如此调节的细胞活性的确切性质以及鞘氨醇激酶在这方面的作用和作用机制仅刚开始得到理解。导致对各种细胞活性调节的许多信号尚未得到确切确定。阐明这些细胞信号传输机理对开发针对涉及异常或其它不需要的细胞活性的疾病病症的治疗和预防策略而言是必不可少的。
在完成本发明的过程中，本发明者已经确定由脂质激酶即鞘氨醇激酶刺激的信号传输级联在肿瘤发生过程中起主要作用且实际上在其活性水平过高时单独地致癌。甚至根据证明鞘氨醇激酶对各种细胞活性的作用的初步数据可以看出，鞘氨醇激酶的致癌活性是这种分子产生的令人意外和完全意想不到的功能。对鞘氨醇激酶与肿瘤发病机制之间的联系的确定使得能够合理地设计用于调节细胞生长的治疗和/或预防方案并进一步确定用于调节细胞生长的分子的范围。
发明概述
在下面的本说明书和权利要求中，除非上下文中另有说明，应将术语“包括”和诸如“包含”和“含有”这样的变化形式理解为指的是包含所述的整体或步骤或整体组或步骤组，但不排除任何其它的整体或步骤或整体组或步骤组。
本发明的一个方面提供了一种调节细胞生长的方法，所述的方法包括在足以调节鞘氨醇激酶的功能活性的时间和条件下使所述细胞与有效量的活性剂接触的步骤。
本发明的另一个方面提供了一种调节细胞生长的方法，所述的方法包括在足以调节鞘氨醇激酶的功能活性水平的时间和条件下使所述细胞与有效量的活性剂接触的步骤。
本发明的另一个方面提供了一种调节细胞增殖的方法，所述的方法包括在足以调节鞘氨醇激酶的功能活性的时间和条件下使所述细胞与有效量的活性剂接触的步骤。
本发明的另一个方面提供了一种减量调节细胞增殖的方法，所述的方法包括在足以减量调节鞘氨醇激酶的功能活性的时间和条件下使所述细胞与有效量的活性剂接触的步骤。
本发明的另一个方面提供了一种增量调节细胞增殖的方法，所述的方法包括在足以增量调节鞘氨醇激酶的功能活性的时间和条件下使所述细胞与有效量的活性剂接触的步骤。
本发明在另一个方面中提供了一种减量调节赘生性细胞增殖的方法，所述的方法包括在足以减量调节鞘氨醇激酶的功能活性的时间和条件下使所述赘生性细胞与有效量的活性剂接触的步骤。
本发明在另一个方面中提供了一种增量调节细胞增殖的方法，所述的方法包括在足以增量调节鞘氨醇激酶的功能活性的时间和条件下使所述细胞与有效量的活性剂接触的步骤。
本发明的另一个进一步的方面提供了一种用于治疗和/或预防特征在于自由的细胞增殖的哺乳动物疾病的方法，所述的方法包括在足以减量调节鞘氨醇激酶的功能活性的时间和条件下对所述哺乳动物给予有效量的活性剂的步骤。
本发明的另一个进一步的方面涉及哺乳动物赘生性疾病的治疗和/或预防方法，所述的方法包括在足以减量调节鞘氨醇激酶的功能活性的时间和条件下对所述哺乳动物给予有效量的活性剂的步骤。
本发明的另一个进一步的方面涉及能够调节鞘氨醇激酶的功能活性的活性剂在制备用于调节哺乳动物细胞生长的药物中的应用，其中对所述鞘氨醇激酶的功能活性的减量调节对受治疗者的细胞生长进行了减量调节，而对所述鞘氨醇激酶的功能活性的增量调节对受治疗者的细胞生长进行了增量调节。
另一个方面涉及用于调节鞘氨醇激酶功能活性的活性剂，其中对鞘氨醇激酶功能活性的调节调节了细胞生长。
本发明在另一个方面中涉及一种包括如上文所定义的调节剂和一种或多种药物上可接受的载体和/或稀释剂的药物组合物。所述的调节剂称作活性组分。
本发明的另一个方面涉及在本发明方法中使用时如上文所定义的调节剂。
本发明的另一个方面涉及诊断方法，该方法基于筛选个体体内存在的鞘氨醇激酶或mRNA或蛋白质或由指定细胞群体转录和/或翻译的特定形式的鞘氨醇激酶。这种筛选方法可以用于定性和/或定量鞘氨醇激酶分析。这种方法例如在确定给定的个体对异常的、不需要的或其它不适当的细胞生长是病情的因素的疾病/疾患是易感染的还是有抵抗力的和/或对某些形式的异常的、不需要的或其它不适当的细胞生长的发展是易感染的还是有抵抗力的方面特别有用。
附图简述
附图1是NIH 3T3细胞中SphK超表达的图示。(A)在用pcDNA3-SphK-FLAG(SK-3T3)或单独的空载体(N-3T3)稳定转染的细胞中测定胞质SphK活性。(B)在[3H]鞘氨醇-标记的SK-3T3或N-3T3细胞库中测定胞内S1P水平。(C)用抗-FLAG单克隆抗体(M2，Kodak)探测来自可溶性细胞溶胞产物的蛋白质。
附图2是SphK超表达加速在NIH 3T3细胞中的增殖的图示。(A)生长曲线显示SK-3T3细胞(右图)的增殖速度快于N-3T3细胞(左图)。数值是一式三份测定数值的平均值且在三次独立的实验中获得了相似的结果。(B)在饱和密度下的细胞生长。分别在绝对融合(空心条形图)和融合后24小时(灰色条形图)时对细胞进行计数。(C)DMS抑制SphK超表达诱导的增殖。在有或没有DMS(2.5μM)存在的情况下在含有10％血清的DMEM中将相等数量的N-3T3和SK-3T3细胞培养5天。每天更换培养基。(B)和(C)中的数据是来自按照一式三份进行的三次独立实验的平均值±S.D.。
附图3是SphK诱导的NIH 3T3细胞转化超表达的影像。(A)NIH3T3细胞转染子的转化灶形成。在转染后12天拍照用SphK(SK-3T3)或单独的载体(N-3T3)转染的培养物(40x放大倍数)。(B)在软琼脂中的集落形成。在含有0.33％琼脂的生长培养基中培养N-3T3和SK-3T3细胞且每隔2天添加一次含有不同浓度的DMS的培养基。在培养2周后进行拍照且随后用MTT染色。(C)用V12-Ras或v-Src转染NIH 3T3细胞，在转染48小时后测定SphK活性。(D)在2周内在有或没有DMS(2.5μM)存在的情况下在V12-Ras、v-Src或SphK转染的NIH 3T3细胞中进行转化灶形成测定试验。
附图4是超表达SphK的细胞是致肿瘤的影像。(A)注射SphK-转染的NIH 3T3细胞的NOD/SCID小鼠体内肿瘤的照片。(B)肿瘤形态(插入照片)和石蜡固定的用苏木精和伊红染色的切片(60x放大倍数)。(C)通过蛋白质印迹分析来自三个个体肿瘤(泳道4-6)及其外周组织(泳道1-3)和N-3T3(泳道7)或SK-3T3细胞(泳道8)的完整的细胞提取物。用抗-FLAG抗体探测上部印迹且用抗-肌动蛋白抗体(Santa Cruz)探测下部印迹。
发明详述
本发明部分地基于对细胞生长、特别是肿瘤发生与调节鞘氨醇激酶活性水平的相关性的确定。对这种相关性的确定使得能够确定并合理地设计用于治疗、预防和诊断疾病病症的方法和产品，其中所述的疾病病症的特征在于异常的、不需要的或其它不适当的细胞生长、特别是自由的癌基因诱导的增殖。
因此，本发明的一个方面提供了一种调节细胞生长的方法，所述的方法包括在足以调节鞘氨醇激酶的功能活性的时间和条件下使所述细胞与有效量的活性剂接触的步骤。
应将所谓的“鞘氨醇激酶”理解为包括所有形式的鞘氨醇激酶或其衍生物、同源物、类似物、等同物或模拟物或具有鞘氨醇激酶功能的其它分子且包括编码鞘氨醇激酶衍生物、其同源物、类似物、等同物或模拟物的核酸分子。例如，该术语包括所有蛋白质或核酸形式的鞘氨醇激酶或其功能衍生物、同源物、类似物、等同物或模拟物，例如包括由对鞘氨醇激酶mRNA或鞘氨醇激酶突变体或多态变体的可选择剪接产生的任何同种型。还应理解所谓的“核酸形式的鞘氨醇激酶”指的是编码鞘氨醇激酶的核酸且包括调节鞘氨醇激酶表达的任何鞘氨醇激酶调节元件(诸如启动子或增强子)且包括位于非鞘氨醇激酶基因组DNA转录起始与决定位点之间位置上的调节元件。还应将“鞘氨醇激酶”理解为包括表现出鞘氨醇激酶功能活性的任何其它分子。这类分子例如包括表现出鞘氨醇激酶功能活性的内源性表达分子或已经导入体内并模拟至少一种鞘氨醇激酶功能的分子。这些分子可以是重组的、合成的或天然存在的。在未作出规定的程度上，任何所提及的对鞘氨醇激酶活性的调节包括调节编码鞘氨醇激酶的核酸分子的表达或鞘氨醇激酶表达产物的功能活性且还应将所述的调节理解为包括对表达或功能活性或鞘氨醇激酶功能等同物或衍生物的调节。
应将所谓的对鞘氨醇激酶“功能活性的调节”理解为指的是增量调节、减量调节或者以别的方式对任何一种或多种功能活性或鞘氨醇激酶的改变。该术语例如包括调节一种或多种鞘氨醇激酶功能活性的发生、调节实现给定活性的速率、调节活性发生的水平、调节能够发生的活性的数量或调节任何活性发生的作用或程度或活性的性质。鞘氨醇激酶活性的改变可以受到许多方式之任一种影响，所述的方式包括但不限于翻译后修饰、相关蛋白质或其它分子或翻译。还应将调节所述活性理解为包括提高或降低鞘氨醇激酶的浓度水平(例如通过调节鞘氨醇激酶的表达)。在一个优选的实施方案中，所述对象的功能活性是鞘氨醇激酶的活性水平。
因此，本发明更优选提供了一种调节细胞生长的方法，所述的方法包括在足以调节鞘氨醇激酶的功能活性水平的时间和条件下使所述细胞与有效量的活性剂接触的步骤。
如上所述，本发明基于对鞘氨醇激酶活性与细胞生长、特别是致癌细胞增殖之间的相关性的确定。在不将本发明限制到任何一种理论或作用方式的情况下，本发明者已经发现由脂质激酶即鞘氨醇激酶刺激的信号传输级联在肿瘤发生中具有主要作用。具体地说，细胞中超表达对鞘氨醇激酶的组成型活化导致细胞转化和肿瘤形成，由此表明人的野生型脂质激酶单独地致癌。此外，在Ras而非v-Src诱导的转化中也涉及到鞘氨醇激酶。最后，使用鞘氨醇激酶抑制剂对鞘氨醇激酶活性的抑制不仅使超表达鞘氨醇激酶的细胞中的转化逆转，而且这种情况还发生在Ras转化的细胞中。在这方面，应将所谓的对细胞生长的“调节”理解为指的是对细胞生长进行增量调节或减量调节。更具体地说，应将所谓的“减量调节”理解为指的是预防、缓解或者抑制细胞生长的一个或多个方面(包括诱导编程性细胞死亡或者杀伤细胞)，而应将所谓的“增量调节”理解为具有相反的含义。在广义上应将所谓的细胞“生长”理解为包括细胞分裂/增殖和/或分化的所有方面。在一个特别优选的实施方案中，所述对象的生长是增殖。
这种优选的实施方案提供了一种调节细胞增殖的方法，所述的方法包括在足以调节鞘氨醇激酶的功能活性的时间和条件下使所述细胞与有效量的活性剂接触的步骤。
更优选提供了一种减量调节细胞增殖的方法，所述的方法包括在足以减量调节鞘氨醇激酶的功能活性的时间和条件下使所述细胞与有效量的活性剂接触的步骤。
另一个优选的实施方案提供了一种增量调节细胞增殖的方法，所述的方法包括在足以增量调节鞘氨醇激酶的功能活性的时间和条件下使所述细胞与有效量的活性剂接触的步骤。
在一个最优选的实施方案中，所述的增殖是自由的增殖诸如由细胞转化导致的增殖。优选所述的转化由对诸如Ras这样的癌基因的增量调节所导致或由鞘氨醇激酶超表达致癌活性所导致。
优选所述的功能活性是鞘氨醇激酶功能活性的水平。
应理解的是在本发明上下文中提及的“细胞”指的是任何形式或类型的细胞而与其来源无关。例如，所述的细胞可以是天然存在的正常或异常细胞或可以将其操作、修饰或以别的方式在体外或体内进行处理，诸如已经冷冻/解冻或以遗传、生化或别的方式在体外或体内修饰的细胞(例如包括作为两种不同细胞类型融合体的结果的细胞)。优选所述的细胞是赘生性细胞。所谓的“赘生性细胞”指的是表现出自由的增殖的细胞。这种赘生性细胞可以是良性细胞或恶性细胞。优选所述的细胞是恶性细胞。在一个特定的实施方案中，所述的赘生性细胞是恶性细胞，其增殖将会形成诸如来源于结肠、胃、肺、脑、骨、食道或胰腺的恶性细胞这样的实体瘤。
这种最优选的实施方案提供了一种减量调节赘生性细胞增殖的方法，所述的方法包括在足以减量调节鞘氨醇激酶的功能活性的时间和条件下使所述赘生性细胞与有效量的活性剂接触的步骤。
优选所述的赘生性细胞是来源于结肠、胃、肺、脑、骨、食道、胰腺、乳腺、卵巢或子宫的恶性细胞。
更优选所述的恶性细胞已经因对诸如Ras这样的癌基因的增量调节或因鞘氨醇激酶超表达致癌活性而得到转化。
甚至更优选所述的功能活性是鞘氨醇激酶功能活性的水平。
应理解按照本发明方法处理的细胞可以位于体外或体内。所谓“体外”指的是细胞已经从受治疗者体内取出，其中对其生长的调节在体外完成。例如，所述的细胞可以是欲通过增量调节鞘氨醇激酶活性而得到无限增殖化的非赘生性细胞。按照本发明的优选方面，所述的细胞可以是诸如位于体内(诸如结肠内)的恶性细胞这样的赘生性细胞且将通过在体内应用本发明的方法以减量调节鞘氨醇激酶功能活性水平来对其生长进行减量调节。还应理解如果提到位于体内的特定细胞类型，诸如恶性结肠直肠细胞，那么该细胞可以位于患者的结肠直肠区域内。如果结肠直肠原发恶性肿瘤已经转移，那么受治疗者的结肠直肠细胞可以位于该患者体内的另一个区域内。例如，它可以形成一部分例如位于肝脏、淋巴结或骨内的继发性肿瘤(转移瘤)。
尽管所述的优选方法是例如作为癌症治疗手段的对赘生性细胞增殖进行减量调节，但是也可能需要对细胞生长进行增量调节。例如，可能需要在体外使细胞群体无限增殖化以利于在体外长期使用它们或例如促进诸如皮肤这样的组织在体外生长。在另一个实例中，使细胞系适合于不太苛刻的生长条件诸如能够在低血清条件下生长可能是有益的。
按照这种优选的实施方案，本发明提供了一种对细胞增殖进行增量调节的方法，所述的方法包括在足以增量调节鞘氨醇激酶的功能活性的时间和条件下使所述细胞与有效量的活性剂接触的步骤。
优选所述的功能活性是鞘氨醇激酶功能活性的水平。
在不将本发明的该方面限制到任何一种理论或作用方式的情况下，所述对细胞增殖的增量调节优选是通过对鞘氨醇激酶致癌活性的增量调节来转化所述细胞。
在这方面，“有效量”指的是至少部分达到所需作用或延缓所治疗疾病病症的发作、抑制其发展或使其发作或发展完全停止所必不可少的用量。当然，这样的用量取决于所治疗的具体病症、所述疾病的严重程度和个体患者的参数，包括年龄、身体情况、身材、体重和同时使用的治疗手段。这些因素对本领域普通技术人员而言是众所周知的且可以使用常规范围内的实验手段寻找到。一般优选使用最高剂量，即根据合理的医学判断得出的最高安全剂量。不过，本领域普通技术人员应理解因医学原因、心理学原因或实际的任何其它原因而可以给予较低剂量或可耐受剂量。
通过对细胞给予活性剂来调节鞘氨醇激酶的活性可以由几种技术之一来完成，这些技术包括但不限于将活性剂导入所述的细胞(所述的活性剂是蛋白质或非蛋白质分子)，该活性剂直接或间接地：
(i)调节鞘氨醇激酶的表达；或
(ii)调节鞘氨醇激酶表达产物的功能活性。
在这方面，调节鞘氨醇激酶的活性可以由几种技术中的任何一种来完成，这些技术包括但不限于将蛋白质或非蛋白质分子导入所述的细胞，所述分子直接或间接地：
(i)调节所述鞘氨醇激酶的合成；
(ii)对所述的鞘氨醇激酶起拮抗剂的作用；
(iii)对所述的鞘氨醇激酶起激动剂的作用(包括给予鞘氨醇激酶表达产物本身或其功能等同物、衍生物、同源物、类似物或模拟物)。
所述的蛋白质分子可以来源于天然、重组或合成的来源，包括融合蛋白或例如下列天然产物的筛选。所述的非蛋白质分子可以来源于诸如例如天然产物筛选这样的天然来源或可以以化学方式合成。本发明期望能够起所述鞘氨醇激酶激动剂或拮抗剂作用的所述鞘氨醇激酶的化学类似物。化学激动剂可能并非必须来源于所述的鞘氨醇激酶，但是可以共有某些构象相似性。另一方面，可以对化学激动剂进行特别设计以便模拟所述鞘氨醇激酶的某些生理化学特性。拮抗剂可以是能够阻断、抑制或以别的方式预防所述鞘氨醇激酶发挥其正常生物学功能的任何化合物(例如N，N-二甲基鞘氨醇或DL-苏型-二氢鞘氨醇)。拮抗剂包括对所述鞘氨醇激酶或所述鞘氨醇激酶的部分具有特异性的单克隆抗体和防止受治疗者细胞中基因或mRNA转录或翻译的反义核酸。还可以使用抗原、RNA、核糖体、DNA酶、RNA适体、抗体或适用于共抑制的分子来调节表达。
所述的蛋白质或非蛋白质分子可以直接或间接起作用以调节鞘氨醇激酶的表达或鞘氨醇激酶表达产物的活性。所述的分子直接起作用，条件是它与鞘氨醇激酶核酸分子或表达产物结合以调节表达或活性。所述的分子间接起作用，条件是它与非鞘氨醇激酶核酸分子或表达产物的分子结合，这另一种分子直接或间接调节鞘氨醇激酶核酸分子或表达产物的表达或活性。因此，本发明的方法包括通过诱导一系列调节步骤来调节鞘氨醇激酶核酸分子的表达或表达产物的功能活性。
仍然在不将本发明的作用限制到任何一种理论或作用方式，已知鞘氨醇激酶通过通常称作为鞘氨醇激酶信号传输途径的信号传输途径起作用。将“鞘氨醇激酶信号传输途径”定义为应用鞘氨醇激酶的信号传输途径。就间接调节鞘氨醇激酶功能活性而言，应理解本发明的目的可以通过调节在鞘氨醇激酶上游或下游起作用的鞘氨醇激酶信号传输途径成分的活性至它构成该途径的一部分的程度来实现。例如，可以通过下列步骤来调节所述的“鞘氨醇激酶活性”：
(i)通过与底物(例如鞘氨醇或ATP)竞争来调节鞘氨醇激酶的催化活性；
(ii)通过变构机理(结合到该分子上的位点而非底物结合位点上)来干扰鞘氨醇激酶的催化活性；或
(iii)诸如通过改变下列步骤干扰酶的活化：
-翻译后的共价修饰，诸如磷酸化、脂质修饰；
-与诸如蛋白质、脂质或铁这样的所需辅激活物非共价偶联；
-酶的亚细胞定位。
“衍生物”包括来自天然、合成或重组来源(包括融合蛋白)的片段、部分、突变体、变体和模拟物。部分或片段例如包括鞘氨醇激酶的活性区域。衍生物可以来源于氨基酸的插入、缺失或取代。氨基酸插入衍生物包括氨基和/或羧酸末端融合体以及单或多氨基酸的序列内插入物。插入氨基酸序列变体是那些将一个或多个氨基酸残基引入所述蛋白质中的预定位点的氨基酸序列变体，不过，通过对所得产物进行适当筛选也能够进行随机插入。缺失变体的特征在于从所述序列中除去一个或多个氨基酸。取代氨基酸变体是那些在所述序列中的至少一个残基已经被除去并在其位置上插入了不同残基的氨基酸变体。取代氨基酸变体的实例是保守氨基酸取代。保守氨基酸取代一般包括在下列组中的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。向氨基酸序列中添加包括与其它肽类、多肽类或蛋白质融合。
应将所谓的“同源物”理解为指的是来源于非待治疗物种的鞘氨醇激酶核酸分子或蛋白质。
应将鞘氨醇激酶核酸或蛋白质分子的化学和功能等同物理解为表现出这些分子的任何一种或多种功能活性且可以来源于任何来源的分子，所述的任何来源诸如通过化学方式合成或通过诸如天然产物筛选这样的筛选方法鉴定。
衍生物包括具有与肽类、多肽类或其它蛋白质或非蛋白质分子融合的完整蛋白质的特定表位或部分的片段。
本文期望的类似物包括但不限于对侧链的修饰在肽、多肽或蛋白质合成和对蛋白质分子或其类似物施加构象限制的交联剂和其它方法的应用过程中非天然氨基酸和/或其衍生物掺入。
核酸序列的衍生物可以类似地来源于单或多核苷酸取代、缺失和/或添加，包括与其它核酸分子融合。本发明核酸分子的衍生物包括寡核苷酸、PCR引物、反义分子、适用于共抑制的分子和核酸分子的融合体。核酸序列的衍生物还包括简并变体。
本发明期望的侧链修饰的实例包括诸如通过下列方法对氨基的修饰：通过与醛反应，随后用NaBH4还原进行还原烷基化；用乙酰亚氨酸甲酯脒化；用乙酐酰化；用氰酸酯使氨基甲氨酰化；用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)使氨基三硝基苄化；用琥珀酸酐和四氢化邻苯二甲酸酐使氨基酰化；和用吡多醛-5-磷酸使赖氨酸吡多酸化，随后用NaBH4还原。
可以通过与诸如2，3-丁二酮、苯基乙二醛和乙二醛这样的试剂形成杂环稠合产物来修饰精氨酸残基中的胍基。
可以通过经O-酰基异脲形成的碳化二亚胺活化，随后例如衍生成相应的酰胺来修饰羧基。
可以通过下列方法来修饰巯基，所述的方法诸如与碘乙酸或碘乙酰胺的羧甲基化；过甲酸氧化成半胱磺酸；与其它硫羟基化合物形成混合的二硫化物；与马来酰亚胺、马来酐或其它取代的马来酰亚胺反应；使用4-氯汞苯甲酸、4-氯汞苯磺酸、苯基氯化汞、2-氯汞基-4-硝基苯酚和其它汞化合物形成汞衍生物；在碱性pH下使用氰酸酯进行甲氨酰化。
例如，可以通过用N-溴琥珀酰亚胺氧化或使用2-羟基-5-硝基苄基溴或氧硫基卤使吲哚环烷基化来修饰色氨酸残基。另一方面，可以通过用四硝基甲烷硝化来改变酪氨酸残基形成3-硝基酪氨酸衍生物。
可以通过用碘乙酸衍生物烷基化或用二乙基焦碳酸酯N-乙酯基化来修饰组氨酸残基的咪唑环。
在蛋白质合成过程中掺入非天然氨基酸和衍生物的实例包括但不限于使用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体。本文期望的非天然氨基酸的目录如表1中所示。
                    表1非常用氨基酸          代码            非常用氨基酸         代码α-氨基丁酸           Abu             L-N-甲基丙氨酸      Nmalaα-氨基-α-甲基丁酸   Mgabu           L-N-甲基精氨酸      Nmarg氨基环丙烷羧酸        Cpro            L-N-甲基天冬酰胺    Nmasn
                                    L-N-甲基天冬氨酸    Nmasp氨基异丁酸            Aib             L-N-甲基半胱氨酸    Nmcys氨基降冰片基-羧酸     Norb            L-N-甲基谷氨酰胺    Nmgln
                                    L-N-甲基谷氨酸      Nmglu环己基丙氨酸          Chexa           L-N-甲基组氨酸      Nmhis环戊基丙氨酸          Cpen            L-N-甲基异亮氨酸    NmileD-丙氨酸              Dal             L-N-甲基亮氨酸      NmleuD-精氨酸              Darg            L-N-甲基赖氨酸      NmlysD-天冬氨酸            Dasp            L-N-甲基甲硫氨酸    NmmetD-半胱氨酸            Dcys            L-N-甲基正亮氨酸    NmnleD-谷氨酰胺            Dgln            L-N-甲基正缬氨酸    NmnvaD-谷氨酸              Dglu            L-N-甲基鸟氨酸      NmornD-组氨酸              Dhis            L-N-甲基苯丙氨酸    Nmphe  D-异亮氨酸           Dile      L-N-甲基脯氨酸                NmproD-亮氨酸             Dleu      L-N-甲基丝氨酸                NmserD-赖氨酸             Dlys      L-N-甲基苏氨酸                NmthrD-甲硫氨酸           Dmet      L-N-甲基色氨酸                NmtrpD-鸟氨酸             Dorn      L-N-甲基酪氨酸                NmtyrD-苯丙氨酸           Dphe      L-N-甲基缬氨酸                NmvalD-脯氨酸             Dpro      L-N-甲基乙基甘氨酸            NmetgD-丝氨酸             Dser      L-N-甲基-叔丁基甘氨酸         NmtbugD-苏氨酸             Dthr      L-正亮氨酸                    NleD-色氨酸             Dtrp      L-正缬氨酸                    NvaD-酪氨酸             Dtyr      α-甲基-氨基异丁酸            MaibD-缬氨酸             Dval      α-甲基-氨基丁酸              MgabuD-α-甲基丙氨酸      Dmala     α-甲基环己基丙氨酸           MchexaD-α-甲基精氨酸      Dmarg     α-甲基环戊基丙氨酸           McpenD-α-甲基天冬酰胺    Dmasn     α-甲基-α-萘基丙氨酸         ManapD-α-甲基天冬氨酸    Dmasp     α-甲基青霉胺                 MpenD-α-甲基半胱氨酸    Dmcys     N-(4-氨基丁基)甘氨酸          NgluD-α-甲基谷氨酰胺    Dmgln     N-(2-氨基乙基)甘氨酸          NaegD-α-甲基组氨酸      Dmhis     N-(3-氨基丙基)甘氨酸          NornD-α-甲基异亮氨酸    Dmile     N-氨基-α-甲基丁酸            NmaabuD-α-甲基亮氨酸      Dmleu     α-萘基丙氨酸                 AnapD-α-甲基赖氨酸      Dmlys     N-苄基甘氨酸                  NpheD-α-甲基甲硫氨酸    Dmmet     N-(2-氨基甲酰基乙基)甘氨酸    NglnD-α-甲基鸟氨酸      Dmorn     N-(氨基甲酰基甲基)甘氨酸      NasnD-α-甲基苯丙氨酸    Dmphe     N-(2-羧基乙基)甘氨酸          NgluD-α-甲基脯氨酸      Dmpro     N-(羧甲基)甘氨酸              NaspD-α-甲基丝氨酸      Dmser     N-环丁基甘氨酸                NcbutD-α-甲基苏氨酸      Dmthr     N-环庚基甘氨酸                NchepD-α-甲基色氨酸      Dmtrp     N-环己基甘氨酸                Nchex D-α-甲基酪氨酸       Dmty       N-环癸基甘氨酸                      NcdecD-α-甲基缬氨酸       Dmval      N-环十二烷基甘氨酸                  NcdodD-N-甲基丙氨酸        Dnmala     N-环辛基甘氨酸                      NcoctD-N-甲基精氨酸        Dnmarg     N-环丙基甘氨酸                      NcproD-N-甲基天冬酰胺      Dnmasn     N-环十一烷基甘氨酸                  NcundD-N-甲基天冬氨酸      Dnmasp     N-(2，2-二苯基乙基)甘氨酸           NbhmD-N-甲基半胱氨酸      Dnmcys     N-(3，3-二苯基丙基)甘氨酸           NbheD-N-甲基谷氨酰胺      Dnmgln     N-(3-胍基丙基)甘氨酸                NargD-N-甲基谷氨酸        Dnmglu     N-(1-羟基乙基)甘氨酸                NthrD-N-甲基组氨酸        Dnmhis     N-(羟基乙基）甘氨酸                 NserD-N-甲基异亮氨酸      Dnmile     N-(咪唑基乙基)甘氨酸                NhisD-N-甲基亮氨酸        Dnmleu     N-(3-吲哚基乙基)甘氨酸              NhtrpD-N-甲基赖氨酸        Dnmlys     N-甲基-γ-氨基丁酸                  NmgabuN-甲基环己基丙氨酸    Nmchexa    D-N-甲基甲硫氨酸                    DnmmetD-N-甲基鸟氨酸        Dnmorn     N-甲基环戊基丙氨酸                  NmcpenN-甲基甘氨酸          Nala       D-N-甲基苯丙氨酸                    DnmpheN-甲基氨基异丁酸      Nmaib      D-N-甲基脯氨酸                      DnmproN-(1-甲基丙基)甘氨酸  Nile       D-N-甲基丝氨酸                      DnmserN-(2-甲基丙基)甘氨酸  Nleu       D-N-甲基苏氨酸                      DnmthrD-N-甲基色氨酸        Dnmtrp     N-(1-甲基乙基)甘氨酸                NvalD-N-甲基酪氨酸        Dnmtyr     N-甲基-α-萘基丙氨酸                NmanapD-N-甲基缬氨酸        Dnmval     N-甲基青霉胺                        Nmpenγ-氨基丁酸           Gabu       N-(对羟基苯基)甘氨酸                NhtyrL-叔丁基甘氨酸        Tbug       N-(硫代甲基)甘氨酸                  NcysL-乙基甘氨酸          Etg        青霉胺                              PenL-高苯丙氨酸          Hphe       L-α-甲基丙氨酸                     MalaL-α-甲基精氨酸       Marg       L-α-甲基天冬酰胺                   MashL-α-甲基天冬氨酸     Masp       L-α-甲基-叔丁基甘氨酸              MtbugL-α-甲基半胱氨酸     Mcys       L-甲基乙基甘氨酸                    Metg  L-α-甲基谷氨酰胺      Mgln    L-α-甲基谷氨酸                 MgluL-α-甲基组氨酸        Mhis    L-α-甲基高苯丙氨酸             MhpheL-α-甲基异亮氨酸      Mile    N-(2-甲硫基乙基)甘氨酸          NmetL-α-甲基亮氨酸        Mleu    L-α-甲基赖氨酸                 MlysL-α-甲基甲硫氨酸      Mmet    L-α-甲基正亮氨酸               MnleL-α-甲基正缬氨酸      Mnva    L-α-甲基鸟氨酸                 MornL-α-甲基苯丙氨酸      Mphe    L-α-甲基脯氨酸                 MproL-α-甲基丝氨酸        Mser    L-α-甲基苏氨酸                 MthrL-α-甲基色氨酸        Mtrp    L-α-甲基酪氨酸                 MtyrL-α-甲基缬氨酸        Mval    L-N-甲基高苯丙氨酸              NmhpheN-(N-(2，2-二苯基乙基) Nnbhm   N-(N-(3，3-二苯基丙基)氨基甲    Nnbhe氨基甲酰基甲基)甘氨酸                酰基甲基）甘氨酸1-羧基-1-(2，2-二苯基- Nmbc乙氨基)环丙烷
例如，可以将交联剂用于使3D构象保持稳定，对所述的3D构象使用同双官能交联剂，诸如带有(CH2)n间隔基、n＝1-n＝6的双官能亚氨基酯类、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯类和通常含有诸如N-羟基琥珀酰亚胺这样的氨基反应性部分和另一种基团特异性的反应性部分的杂双官能试剂。
还可以使按照本发明对哺乳动物给予的分子与诸如单克隆抗体这样的可将这些分子特异性转运至靶细胞的导向剂连接。
本发明的另一个方面涉及与治疗和/或预防疾病病症相关的本发明的应用。在不将本发明限制到任何一种理论或作用方式的情况下，本发明者不仅已经确定鞘氨醇激酶的组成型活化导致细胞转化和肿瘤发育，由此表明鞘氨醇激酶单独地致癌，而且鞘氨醇激酶抑制作用还可有效地对赘生性细胞增殖进行减量调节，其中受治疗者的细胞已经由某些不相关的癌基因所转化诸如Ras诱导的转化。因此，本发明的方法特别但并不限于用于治疗原发性和继发性恶性肿瘤，诸如那些与结肠、胃、肺、脑、骨、食道和胰腺的实体瘤且特别是因Ras转化细胞增殖而产生的肿瘤相关的那些原发性和继发性恶性肿瘤。尽管优选的方法是减量调节受治疗者体内自由的细胞增殖，但是增量调节细胞生长在某些情况中也是需要的，诸如用于促进伤口愈合、血管生成或其它愈合过程。
因此，本发明期望一种用于治疗和/或预防特征在于哺乳动物体内异常的、不需要的或其它不适当的细胞生长的疾病的方法，所述的方法包括在足以调节鞘氨醇激酶的功能活性的时间和条件下对所述的哺乳动物给予有效量的活性剂的步骤，其中对所述鞘氨醇激酶功能活性的减量调节对受治疗者的细胞生长进行了减量调节，而对所述鞘氨醇激酶功能活性的增量调节对受治疗者的细胞生长进行了增量调节。
应将所谓的“异常的、不需要的或其它不适当的”细胞生长理解为指的是过度活跃的细胞生长、生理上正常的细胞生长，但因为它是不需要的，故为不适当的，或者是不充分的细胞生长。优选所述的不适当的细胞生长是自由的细胞增殖。
这种优选的实施方案提供了一种用于治疗和/或预防特征在于哺乳动物体内自由的细胞增殖的疾病的方法，所述的方法包括在足以减量调节鞘氨醇激酶的功能活性的时间和条件下对所述的哺乳动物给予有效量的活性剂的步骤。
优选所述的自由的细胞增殖是因通过癌基因增量调节而转化细胞或因鞘氨醇激酶超表达致癌活性所导致的。
更优选所述的细胞是形成结肠、胃、肺、脑、骨、食道、胰腺、乳腺、卵巢或子宫的实体瘤的恶性细胞。
优选所述的活性剂是N，N-二甲基鞘氨醇或DL-苏型-二氢鞘氨醇。
本发明的方法优选有利于使受治疗者的增殖得到减少、阻止或者以别的方式得到抑制。应将所谓的“减少、阻止或者以别的方式得到抑制”理解为指的是诱导或有利于细胞增殖部分或完全得到抑制。所述的抑制可以通过直接或间接机制发生且包括诱导细胞编程性细胞死亡或其它细胞杀伤机制。
治疗或预防的受治疗者一般是哺乳动物，诸如但不限于人、灵长类、家畜动物(例如绵羊、母牛、马、驴、猪)、陪伴动物(例如狗、猫)、实验室的试验动物(例如小鼠、家兔、大鼠、豚鼠、仓鼠)、被俘获的野生动物(例如狐狸、鹿)。优选所述的哺乳动物是人或灵长类。最优选所述的哺乳动物是人。尽管本发明使用鼠模型作为例子，但是这并不意味着要限制将本发明的方法应用于其它物种、特别是人。
本发明的另一个方面涉及对哺乳动物体内赘生性疾病的治疗和/或预防方法，所述的方法包括在足以减量调节鞘氨醇激酶的功能活性的时间和条件下对所述的哺乳动物给予有效量的活性剂的步骤。
优选所述的赘生性疾病是恶性疾病且更优选是实体恶性肿瘤，诸如结肠、胃、肺、脑、骨、食道或胰腺的肿瘤。
更优选所述的受治疗者恶性肿瘤是因通过癌基因增量调节而转化细胞或因鞘氨醇激酶超表达致癌活性所导致的。
更优选所述的活性剂是N，N-二甲基鞘氨醇或DL-苏型-二氢鞘氨醇。
应将本文提及的“治疗”和“预防”看作是最广泛的含义。术语“治疗”并非必须指将哺乳动物治疗至完全恢复。类似地，“预防”并非必须指受治疗者最终不感染疾病。因此，治疗和预防包括缓解特定疾病的症状或预防或以别的方式降低特定疾病发展的危害。可以将术语“预防”看作减轻特定疾病的严重程度或减少其发作。“治疗”还可以减轻现存疾病的严重程度。
可以通过任何便利的方式来给予药物组合物形式的所述活性剂(包括鞘氨醇激酶或其功能等同物、衍生物、同源物、类似物或模拟物或鞘氨醇激酶核酸分子)[本文称作“调节剂”]。当以依赖于特定病例的用量给药时，期望药物组合物中的调节剂表现出治疗活性。例如，变化形式取决于人或动物和所选择的调节剂。可以应用宽范围的剂量。例如，考虑到患者的情况，可以给予约0.1mg-约1mg/千克体重/天的调节剂。可以将剂量方案进行调节以便产生最佳治疗反应。例如，可以每天、每周、每月或其它合适的时间间隔给予几个分次剂量或可以根据情况的紧迫性的表现将剂量按比例减少。可以按照便利的方式给予所述的调节剂，诸如通过口服、静脉内(如果是水溶性的)、腹膜内、肌内、皮下、真皮内或栓剂途径或植入(例如使用缓释分子)方式给予所述的调节剂。可以给予药物上可接受的无毒性盐形式的所述调节剂，所述的盐诸如是酸加成盐或例如与锌、铁等的金属配合物(看作是用于本申请目的的盐)。这类酸加成盐的说明性实例是盐酸盐、氢溴化物、硫酸盐、磷酸盐、马来酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、抗坏血酸盐、酒石酸盐等。如果以片剂形式给予所述的活性组分，那么该片剂可以含有：粘合剂，诸如黄蓍胶、玉米淀粉或明胶；崩解剂，诸如藻酸；和润滑剂，诸如硬脂酸镁。
给药途径包括但不限于呼吸道、气管内、鼻咽、静脉内、腹膜内、皮下、颅内、真皮内、肌内、眼内、鞘内、大脑内、鼻内、输注、口服、经直肠、通过IV滴注、膏药和植入物。
本发明在另一个方面中涉及能够调节鞘氨醇激酶功能活性的活性剂在制备用于调节哺乳动物细胞生长的药物中的应用，其中对所述鞘氨醇激酶功能活性的减量调节对受治疗者细胞生长进行了减量调节，而对所述鞘氨醇激酶功能活性的增量调节对受治疗者的细胞生长进行了增量调节。
优选所述的细胞生长是增殖。甚至更优选所述的增殖是得到减量调节的自由的细胞增殖。
优选所述的自由的细胞增殖是因通过癌基因增量调节来转化细胞或因鞘氨醇激酶超表达致癌活性所导致的。
更优选所述的细胞是形成结肠、胃、肺、脑、骨、食道、胰腺、乳腺、卵巢或子宫的实体瘤的恶性细胞。
另一个方面涉及用于调节鞘氨醇激酶功能活性的活性剂，其中调节鞘氨醇激酶功能活性这一过程调节了细胞生长。
优选所述的功能活性得到减量调节，由此减量调节了细胞生长。
在另一个优选的实施方案中，所述的鞘氨醇激酶功能活性得到增量调节，由此增量调节了细胞生长。
甚至更优选所述的细胞生长是细胞增殖。
更优选所述的细胞是赘生性细胞且所述的增殖得到减量调节。
优选所述的细胞增殖是因通过癌基因增量调节来转化细胞或因鞘氨醇激酶超表达致癌活性所导致的。
更优选所述的细胞是形成结肠、胃、肺、脑、骨、食道、胰腺、乳腺、卵巢或子宫的实体瘤的恶性细胞。
本发明在另一个方面中涉及一种药物组合物，它包括如上文定义的调节剂和一种或多种药物上可接受的载体和/或稀释剂。所述的调节剂称作活性组分。
适合于注射用的药物剂型包括无菌水溶液(如果是水溶性的)或分散液或用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末或可以是霜剂或其它适合于局部涂用的剂型的形式。它必须在生产和储存条件下保持稳定且必须防止受到诸如细菌和真菌这样的微生物的污染作用。载体可以是溶剂或例如含有水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油的分散介质。例如，可以通过应用诸如卵磷脂这样的包衣材料、通过维持分散液所需的颗粒大小和通过应用表面活性剂来维持适宜的流动性。可以用例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等这样的各种抗细菌剂和抗真菌剂来预防微生物的作用。在许多情况中，优选包括例如糖类或氯化钠这样的等渗剂。可以通过在组合物中应用例如单硬脂酸铝和明胶这样的延缓吸收剂来延长可注射组合物的吸收。
如果需要，通过将所需量的活性化合物在适当的溶剂中与上面列举的各种其它组分混合、随后进行过滤除菌来制备无菌注射溶液。一般来说，通过将各种灭菌的活性组分混入含有碱性分散介质和来自上述列举的所需其它组分的无菌赋形剂来制备分散液。就用于制备无菌注射溶液的无菌粉末而言，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，这些技术可以产生活性组分与来自其预先无菌过滤的溶液的任何另外的所需组分的粉末。
当适当保护活性组分时，可以将它们口服，例如，与惰性稀释剂或可同化可食用的载体一起服用或可以将它们封装在硬壳明胶胶囊或软壳明胶胶囊中或可以将它们压制成片剂或可以将它们直接与膳食中的食物混合。为了口服治疗给药，可以将活性化合物与赋形剂混合并以可吞咽的片剂、含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆剂、糯米纸囊剂等的形式使用。这类组合物和制剂应含有至少1％(重量)的活性化合物。当然，该组合物和制剂中的百分比可以改变且便利的是可以在约5-约80％(重量)的范围。活性化合物在这类治疗用组合物中的用量应使得可以获得合适的剂量。按照本发明制备优选的组合物或制剂，使得口服单位剂型中含有约0.1μg-2000mg的活性化合物。
片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可以含有下列成分：粘合剂，诸如树胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，诸如磷酸二钙；崩解剂，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂，诸如硬脂酸镁；且可以加入诸如蔗糖、乳糖或糖精这样的增甜剂或诸如薄荷、冬青油或樱桃香精这样的调味剂。当单位剂型是胶囊时，它除含有上述类型的物质外还可以含有液体载体。可以将各种其它物质作为包衣材料或者用于以别的方式改变所述剂型的物理形态。例如，可以给片剂、丸剂或胶囊包上紫胶、糖或两者。糖浆剂或酏剂可以含有活性化合物、作为增甜剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和诸如樱桃或橙香精这样的调味剂。当然，用于制备任何单位剂型的任何物质应是药物纯的且在所用量下基本上是无毒性的。此外，可以将活性化合物混入缓释制剂和配方。
药物组合物还可以包括诸如能够转染靶细胞的载体这样的遗传分子，其中所述的载体携带编码调节剂的核酸分子。该载体例如可以是病毒载体。
对上文定义的调节剂的筛选可以通过本领域技术人员所公知的几种合适方法中的任何一种来进行，所述的方法包括但不限于：使包括鞘氨醇激酶基因或其功能等同物或衍生物的细胞与活性剂接触并对调节鞘氨醇激酶蛋白质产生或功能活性、调节编码鞘氨醇激酶的核酸分子的表达或调节下游鞘氨醇激酶细胞靶的活性或表达进行筛选。可以使用诸如蛋白质印迹、电泳迁移率位移测定和/或读取鞘氨醇激酶活性报道基因来检测这类调节。
应理解鞘氨醇激酶基因或其功能等同物或衍生物可以天然存在于作为检测对象的细胞中或者其它可能已被转染入用于检测目的的宿主细胞中。此外，可以以组成型方式表达天然存在的或转染的基因，由此为特别用于筛选在核酸或表达产物水平下减量调节鞘氨醇激酶活性的活性剂提供模型；或所述基因可能需要活化，由此为特别用于筛选增量调节鞘氨醇激酶表达的活性剂提供模型。此外，就鞘氨醇激酶核酸分子被转染入细胞而言，该分子可以包括完整的鞘氨醇激酶基因或它可以仅包括该基因的一部分诸如调节鞘氨醇激酶产物表达的部分。例如，可以将鞘氨醇激酶启动子区转染入作为检测对象的细胞中。在这方面，如果仅使用所述的启动子，那么可以例如通过使所述启动子与报道基因连接来检测对该启动子活性的调节。例如，可以使该启动子与荧光素酶或CAT报道分子连接，通过分别调节荧光强度或CAT报道分子活性能够检测对该基因表达的调节。
在另一个实例中，检测的对象可以是下游鞘氨醇激酶调节靶而不是鞘氨醇激酶自身。这类检测可以使用诸如微阵列(例如芯片阵列、尼龙阵列)、SAGE分析、RDA或差异显示这样的技术来进行。
这些方法为进行高流通量筛选诸如包括合成、组合、化学和天然文库的蛋白质或非蛋白质活性剂这样的推定的调节剂提供了机制。这些方法还有利于检测结合鞘氨醇激酶核酸分子或表达产物自身或调节上游分子表达的活性剂，所述的上游分子随后调节鞘氨醇激酶的表达或表达产物的活性。因此，这些方法提供了直接或间接调节鞘氨醇激酶表达和/或活性的活性剂检测机制。
如上所述，应将“鞘氨醇激酶”理解为指的是鞘氨醇激酶表达产物或指的是编码鞘氨醇激酶的核酸分子。还应将其理解为指的是诸如鞘氨醇激酶核酸分子的调节区这样的鞘氨醇激酶分子的一部分或片段。另一方面，所述的分子可以包括所述表达产物的结合/活性部分。在这方面，在细胞中表达所述的鞘氨醇激酶核酸分子和/或表达产物。所述的细胞可以是已经用鞘氨醇激酶核酸分子转染的宿主细胞或它可以是天然含有鞘氨醇激酶基因的细胞。
本文定义的筛选方法可以基于检测“与所述鞘氨醇激酶相关的改变的表达表型”。应将其理解为检测与调节鞘氨醇激酶活性相关的细胞培养条件的改变。这些改变例如作为胞内改变或在胞外可观察到的改变是可检测到的。例如，这种检测包括但不限于检测表达产物水平的改变、细胞培养条件的改变或就鞘氨醇激酶调节区与诸如荧光素酶或CAT这样的报道分子连接的情况而言，检测报道分子表达的改变。另一方面，可以建立这种筛选系统以便检测由鞘氨醇激酶表达产物调节的下游分子表达的改变。
本发明的另一个方面涉及当用于本发明的方法时如上文所定义的调节剂。
本发明的另一个方面涉及基于对个体中存在的鞘氨醇激酶或mRNA或蛋白质或由给定细胞群体转录和/或翻译的特定形式的鞘氨醇激酶进行筛选的诊断方法。这种筛选方法可以涉及定性和/或定量鞘氨醇激酶分析。例如，它在确定给定个体对异常的、不需要的或其它不适当的细胞生长是病情的因素的疾病/疾患是易感染的还是有抵抗力的和/或对某些形式的异常的、不需要的或其它不适当的细胞生长的发展是易感染的还是抵抗力的时特别有用。这类筛选可以使用本领域技术人员所公知的方法来进行，它们包括但不限于：
(i)应用筛选改变的鞘氨醇激酶活性或水平的鞘氨醇激酶测定法。可以在个体的体液或组织中筛选这些参数。尽管一般并不分泌鞘氨醇激酶，但是分泌其下游产物鞘氨醇激酶-1-磷酸。因此可以将对这种分子水平的调节用作鞘氨醇激酶水平或活性改变的指示剂。然而，不应排除对胞外鞘氨醇激酶的筛选。
(ii)可以通过使用LightCycler系统(Roche)对PCR生成的DNA的解链曲线的分析来分析鞘氨醇激酶中可能的突变/多态性(SNPs)和突变。
(iii)应用芯片阵列(例如Affimetrix GeneChipSNP作图)或应用用于发现SNP的Incyte技术平台fSSCP筛选涉及鞘氨醇激酶的SNPs。
通过下列非限制性实施例来进一步描述本发明。
          实施例1
NIH 3T3成纤维细胞的转染和分析
为了研究SphK的致癌作用，用近来在我们的实验室中克隆的人SphK cDNA转染未转化的NIH 3T3成纤维细胞(Piston等，2000)。将收集的稳定转化体(称作SK-3T3)用于避免可能因从单一转染细胞中选择和繁殖各个克隆而导致的表型假象。在SK-3T3细胞库中，SphK活性比空载体转染的NIH 3T3细胞(N3T3)增加了600倍以上(附图1a)。免疫印迹分析显示了具有与仅在SK-3T3细胞库中检测到而在N-3T3细胞中不存在的预计大小的FLAG-标记的人SphK一致的表观分子量的特异性蛋白质带(附图1c)。SphK的直接产物S1P的胞内水平在SK-3T3细胞中也增加了4-5倍，这表明稳定的转染体带有组成型活化的SphK(附图1b)。S1P水平并非与在体外检测的SphK活性的增加成正比，这可能是因S1P被SIP磷酸酶和S1P裂合酶快速降解和作为用于S1P形成的底物的鞘氨醇的利用度有限所导致的。
生长曲线显示SK-3T3细胞库与对照组之间具有显著性差异(附图2a)。SphK的稳定表达显著提高了含有1％或10％血清的培养基中的细胞生长。甚至在不含血清的培养基中长达7天的时间，SK-3T3细胞仍存活并生长，而N-3T3细胞则经历死亡。此外，当细胞达到饱和密度时，SK-3T3细胞持续增殖(附图2b)，这表明避免了接触抑制。用SphK的特异性抑制剂N，N-二甲基鞘氨醇(DMS)处理SK-3T3细胞显著减少了因SphK超表达诱导的增殖加剧，而DMS对N-3T3细胞增殖没有影响(附图2c)。这些结果表明SphK在SphK稳定转染的细胞中的组成型活化降低了两个关键的限制生长的特性：血清依赖性和接触抑制性。
通过NIH 3T3细胞中的转化灶形成检测的转化活性说明用SphK而非空载体转染的细胞诱导了大量转化灶(表1和附图3a)。SphK和对照组载体在G418-抗性集落生成方面均显示出类似的功效，从而表明转化活性并非因转染的非特异性作用所导致。此外，SK-3T3在软琼脂中形成了旺盛的集落(表2和附图3b)，从而显示获得了无贴壁依赖性生长。尽管N-3T3细胞表现出可能因自主转化而导致的背景水平的集落形成，但是SphK的超表达使得集落的数量增加了20～50倍且集落的大小明显增加(表2)。重要的是，DMS以剂量依赖性方式抑制了SphK的转化能力，其中2.5μM DMS导致了向正常表型的完全恢复(附图3b)。这一结果提示SphK活性的增加而非仅是其超表达是该酶转化能力必不可少的。
            实施例2
癌基因转化细胞的转染和分析
当用活化的突变体Ras(V12-Ras)转染NIH 3T3细胞时，SphK活性比亲代细胞显著增加了178±22％(附图3c)。相反，用v-Src转染的细胞(附图3c)或显性失活Ras(N17-Ras)在SphK活性方面没有改变，从而提示SphK在某一致癌转化中的特异性相关性。此外，当用DMS处理细胞时，在V12-Ras转化的细胞中转化灶形成减少了42±4％，而在v-Src转化的细胞中没有改变(附图3d)，从而表明了SphK在Ras转化中的重要作用。DMS在SphK转化细胞中完全有效的剂量(2.5μm)下的部分作用提示存在起作用的不依赖SphK的途径的可能性(附图3d)。另一方面，DMS不能抑制v-Src转化这一结果排除了DMS的非特异性作用或由SphK抑制产生的一般毒性。由此SphK活性提高不仅因超表达而凭借其本身发挥了转化潜能，而且与例如Ras诱导的致癌转化相关。
     实施例3
肿瘤发生能力的分析
然后在超表达SphK的NIH 3T3细胞中直接测试肿瘤发生能力。当经皮下将来自稳定转化体库或选择的克隆的SphK转染的NIH 3T3细胞注入NOD/SCID小鼠时，肿瘤在3-4周内在注射部位变得明显(表4和附图4)。注射了载体转染的3T3细胞的小鼠在10周的观察过程中没有诱发肿瘤。肿瘤切片的组织学外观显示了具有许多有丝分裂象的纤维肉瘤形态(附图4)。对来源于肿瘤的提取物的蛋白质印迹分析显示了高水平的FLAG标记的蛋白质(附图4)，从而表明赘生性细胞保留下来并表达了SphK转基因。因此，肿瘤从注射的SphK转染细胞中发育，而没有从自主转化的NIH 3T3中发育。这是野生型脂质激酶基因人SphK起癌基因的作用的最初证明，从而提供了这种酶与哺乳动物肿瘤发病机制之间的可能的关联。因此，我们的发现扩展了对磷脂类、特别是鞘脂类作为调节细胞生长、转化和致癌的信号转导物的理解。
  实施例4
材料和方法(a)鞘氨醇激酶的转染
NIH 3T3成纤维细胞获自美国典型培养物保藏中心且将它们维持在补充了10％胎牛血清的DMEM(GIBCO BRL)中。如上所述(Pitson等，2000)将用FLAG标记物标记的人SphK cDNA亚克隆入pcDNA3质粒(Invitrogen Corp.)。为了进行瞬时转染，使用Lipofectamine  Plus(GIBCO BRL)，按照制造商的方案将5μg质粒转染至5×105。为了进行稳定表达，使用磷酸钙沉淀法并在含有500μg/ml G418(GIBCO BRL)的培养基中选择转化体。收集G418-抗性转染细胞的非克隆库并用于避免克隆变异性。就某些实验而言，使用稳定转化体的选择克隆。(b)鞘氨醇激酶活性的测定
如上所述(Xia等，1999)通过在37℃下将胞质部分与10μM溶于5％Triton X-100中的鞘氨醇和[γ32P]ATP(1mM，0.5mCi/ml)一起温育15分钟来测定SphK活性。为了测定S1P的胞内水平，将细胞用[3H]鞘氨醇(1μM，2μCi/ml)标记30分钟并提取掺入细胞脂质中的放射性。然后用1-丁醇/甲醇/乙酸/水(8∶2∶1∶2，体积/体积)将[3H]S1P在TLC上解析、肉眼观察并通过Phosphoimager_定量。(c)鞘氨醇激酶-3T3细胞的培养
将稳定转染的NIH 3T3细胞平铺在48孔平板(1,000个细胞/孔)内的含有10％胎牛血清的DMEM中。8小时后，将细胞用DMEM洗涤两次且然后使其生长在含有1或10％血清的DMEM和不含血清的培养基(含有0.1％BSA的DMEM)中。在指定的时间将细胞与1mg/ml MTT一起温育4小时。用溶于10mM HCl的10％SDS溶液使甲_产物溶解并通过570nm和650nm吸光度下的分光光度法进行评估。在某些实验中，将细胞进行胰蛋白酶消化并在血细胞计数器中计数。(d)转化灶形成测定
为了进行转化灶形成测定，使用如上述(a)中所述的Lipofectamine Plus分别用活化的V12Ras、v-Src(Dr.JulianDownward的赠品)、SphK或空载体转染下代NIH 3T3细胞。2天后，将转染的细胞分到6孔平板中。在达到融合后，使它们在含有5％胎牛血清的DMEM中保持2周。用肉眼观察转化灶并在用0.5％结晶紫染色后评分。为了进行软琼脂测定，在没有或有不同浓度DMS的情况下将来自稳定转染库的1×104个细胞在含有0.33％琼脂的生长培养基中的悬浮液铺到0.6％琼脂凝胶上。在14天的温育后，用0.1mg/ml MTT给集落染色并将直径超过0.1mm的集落评定为阳性。(e)肿瘤的诱发
从NOD/SCID小鼠体内取血并维持在无菌条件下。给4-6周龄小鼠经皮下注射来自不同细胞系的溶于200μl无菌PBS的5×105个细胞(稳定的SphK-和载体-转染的NIH 3T3细胞库，SphK转化体的两个集落)。在3只不同的动物中测试各细胞系。
本领域技术人员会认识到本文描述的本发明易于进行除具体描述的那些之外的改变和更改。应理解本发明包括所有这类改变和更改。本发明还包括单独或共同在本说明书中提到或指定的所有步骤、特征、组合物和化合物和所述步骤或特征中的任两个或多个的任何和全部的组合。表2.在转染NIH 3T3细胞中的转化测定。
    细胞系   转化灶形成数量      软琼脂中的集落
数量                         大小(mm)
    N-3T3   1.7±1.5     3.3±2.1   ＜  0.1
    SK-3T3   65.7±9.6     122.3±17.6   0.1～0.45
在用SphK(SK-3T3)或载体(N-3T3)瞬时转染的NIH 3T3细胞中检测转化灶的形成。将转染的细胞平铺在6孔平板上并在结晶紫染色前培养2-3周。在稳定的转染细胞中测定在软琼脂中的集落形成。所示的结果是来自按一式两份或一式三份进行的3-5次实验的平均值±SD。表3.在NOD/SCID小鼠中的致瘤性。
 细胞系   肿瘤/注射            肿瘤大小cm                       cm3
 N-3T3     0/3        0
 SK-3T3稳定的库     3/3  2.8×1.8×1.11.9×1.5×1.01.1×0.9×0.8     5.542.850.79
 克隆KT-2     3/3  3.2×1.8.×1.21.6×1.2×0.52.5×1.6×1.3     6.910.965.20
 克隆KT-5     3/3  2.7×1.6×1.22.2×1.5×1.11.8×1.7×0.9     5.183.632.75
给NOD/SCID小鼠注射来自载体转染或SphK转染的NIH 3T3细胞库(N-3T3或SK-3T3)的细胞(5×105个细胞/小鼠)或两个单独的SphK-转染的克隆(KT-2和KT-5)。在注射后4周时测定肿瘤大小。
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Claims (48)

1.一种调节细胞生长的方法，所述的方法包括在足以调节鞘氨醇激酶的功能活性的时间和条件下使所述细胞与有效量的活性剂接触的步骤。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的功能活性是功能活性水平。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述的生长是增殖。
4.权利要求3所述的方法，其中所述对增殖的调节是对增殖的减量调节且所述对功能活性的调节是对功能活性的减量调节。
5.权利要求3所述的方法，其中所述对增殖的调节是对增殖的增量调节且所述对功能活性的调节是对功能活性的增量调节。
6.权利要求4所述的方法，其中所述的增殖是自由的增殖。
7.权利要求6所述的方法，其中所述的细胞是赘生性细胞。
8.权利要求7所述的方法，其中所述的赘生性细胞是恶性细胞。
9.权利要求8所述的方法，其中所述的恶性细胞是来自结肠、胃、肺、脑、骨、食道、胰腺、乳腺、卵巢或子宫的细胞。
10.权利要求9所述的方法，其中所述的恶性细胞已经因癌基因的增量调节而得到转染。
11.权利要求10所述的方法，其中所述的癌基因是Ras。
12.权利要求9所述的方法，其中所述的恶性细胞已经因鞘氨醇激酶超表达致癌活性而得到转化。
13.权利要求1-4或6-12中任何一项所述的方法，其中所述的活性剂是N，N-二甲基鞘氨醇。
14.权利要求1-4或6-12中任何一项所述的方法，其中所述的活性剂是DL-苏型-二氢鞘氨醇。
15.一种用于治疗和/或预防特征在于哺乳动物体内异常的、不需要的或其它不适当的细胞生长的疾病的方法，所述的方法包括在足以调节鞘氨醇激酶的功能活性的时间和条件下对所述的哺乳动物给予有效量的活性剂的步骤。
16.一种权利要求15的方法，其中所述的功能活性是功能活性水平。
17.权利要求15或16所述的方法，其中所述的生长是增殖。
18.权利要求17所述的方法，其中所述对增殖的调节是对增殖的减量调节且所述对功能活性的调节是对功能活性的减量调节。
19.权利要求17所述的方法，其中所述对增殖的调节是对增殖的增量调节且所述对功能活性的调节是对功能活性的增量调节。
20.权利要求18所述的方法，其中所述的增殖是自由的增殖。
21.权利要求20所述的方法，其中所述的细胞是赘生性细胞。
22.权利要求21所述的方法，其中所述的赘生性细胞是恶性细胞。
23.权利要求22所述的方法，其中所述的恶性细胞形成结肠、胃、肺、脑、骨、食道或胰腺的实体瘤。
24.权利要求23所述的方法，其中所述的恶性细胞已经因癌基因的增量调节而得到转化。
25.权利要求24所述的方法，其中所述的癌基因是Ras。
26.权利要求23所述的方法，其中所述的恶性细胞已经因鞘氨醇激酶超表达致癌活性而得到转化。
27.权利要求15-18或20-26中任何一项所述的方法，其中所述的活性剂是N，N-二甲基鞘氨醇。
28.权利要求15-18或20-26中任何一项所述的方法，其中所述的活性剂是DL-苏型-二氢鞘氨醇。
29.权利要求15-28中任何一项所述的方法，其中所述的哺乳动物是人。
30.能够调节鞘氨醇激酶功能活性的活性剂在制备用于调节哺乳动物细胞生长的药物中的应用。
31.权利要求30的应用，其中所述的功能活性是功能活性水平。
32.权利要求30或31的应用，其中所述的生长是增殖。
33.权利要求32的应用，其中所述对增殖的调节是对增殖的减量调节且所述对功能活性的调节是对功能活性的减量调节。
34.权利要求32的应用，其中所述对增殖的调节是对增殖的增量调节且所述对功能活性的调节是对功能活性的增量调节。
35.权利要求33的应用，其中所述的增殖是自由的增殖。
36.权利要求35的应用，其中所述的细胞是赘生性细胞。
37.权利要求36的应用，其中所述的赘生性细胞是恶性细胞。
38.权利要求37的应用，其中所述的恶性细胞形成结肠、胃、肺、脑、骨、食道、胰腺、乳腺、卵巢或子宫的实体瘤。
39.权利要求38的应用，其中所述的恶性细胞已经因癌基因的增量调节而得到转化。
40.权利要求39的应用，其中所述的癌基因是Ras。
41.权利要求38的应用，其中所述的恶性细胞已经因鞘氨醇激酶超表达致癌活性而得到转化。
42.权利要求30-33或35-41的应用，其中所述的活性剂是N，N-二甲基鞘氨醇。
43.权利要求30-33或35-41的应用，其中所述的活性剂是DL-苏型-二氢鞘氨醇。
44.权利要求30-43的应用，其中所述的哺乳动物是人。
45.一种药物组合物，它包括能够调节鞘氨醇激酶功能活性的活性剂与一种或多种用于权利要求1-44中任何一项所述方法的药物上可接受的载体和/或稀释剂。
46.权利要求45所述的药物组合物，其中所述的活性剂是N，N-二甲基鞘氨醇。
47.权利要求45所述的药物组合物，其中所述的活性剂是DL-苏型-二氢鞘氨醇。
48.一种哺乳动物疾病，或对疾病的易感性或抵抗力的诊断方法，所述疾病的特征在于哺乳动物体内异常的、不需要的或其它不适当的细胞生长，所述方法包括对来自所述哺乳动物的生物样品筛选其中存在的鞘氨醇激酶或编码鞘氨醇激酶的核酸分子的步骤。
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