CN109223777A

CN109223777A - 月桂二胺衍生物在制备用于治疗癌症的药物中的应用

Info

Publication number: CN109223777A
Application number: CN201811034131.6A
Authority: CN
Inventors: 周志诚; 柴梦莹
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-09-05
Filing date: 2018-09-05
Publication date: 2019-01-18

Abstract

本发明提供了一种月桂二胺衍生物在制备用于治疗癌症的药物中的应用，属于癌症领域。发明人研究发现，如式I、式II和式III所示的这三种月桂二胺衍生物能够强有力地调控SDF‑1可能诱导的CXCR4激发的癌变信号，诱导调节SDF‑1在生理或者病理的情况下从强力的激动剂，变为部分或者较低效能激动剂。由此说明，这三种化合物能够特异性的靶向CXCR4，高效杀死发生癌变的癌细胞，可作为癌症的治疗药物使用，应用前景广阔。

Description

月桂二胺衍生物在制备用于治疗癌症的药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物领域，具体而言，涉及一种月桂二胺衍生物在制备治疗癌症的药物中的应用。

背景技术

中国大肠癌的发病率居恶性肿瘤发病谱的第三位，仅次于肺癌和胃癌；死亡率居第五位，居肺癌，肝癌、胃癌和食管癌之后。中晚期结直肠癌中生存期延长更为明显，这主要与中晚期结直肠癌的辅助治疗，如术前放化疗等有关。影像诊断水平的进步提高了结直肠癌肝转移灶的发现率和诊断的准确率，抗EGFR和抗VEGF等一系列靶向治疗药物的应用提高了晚期结直肠癌患者的生存率，一级预防发挥了 35％的作用，二级预防发挥了53％的作用，而对确诊结直肠癌患者的规范性治疗仅发挥了12％的作用。

目前，尚未有明确针对结肠癌癌变机制有效抑制癌细胞生长特异靶向小分子药物。降低肠癌的发病率、研发一线的抗肠癌药物，已经成为医药界的重中之重。

发明内容

本发明的目的在于提供一种月桂二胺衍生物的药物新用途，即月桂二胺衍生物在制备用于治疗癌症相关的药物中的应用，改善癌症患者的生命质量、减轻药物使用负担。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

月桂二胺衍生物在制备用于治疗癌症的药物中的应用，上述月桂二胺衍生物选自如式I、式II和式III所示的化合物中的至少一种：

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述癌症为肠癌。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述肠癌为结肠癌、直肠癌。

月桂二胺衍生物在制备用于抑制CXCR4表达的拮抗剂中的应用，上述月桂二胺衍生物选自如式I、式II和式III所示的化合物中的至少一种。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述CXCR4表达包括 CXCR4激动剂诱导的CXCR4表达；

优选地，上述CXCR4激动剂为SDF-1。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述月桂二胺衍生物通过特异性地竞争抑制CXCR4激动剂与CXCR4的结合来抑制CXCR4 表达。

月桂二胺衍生物在制备用于抑制癌细胞转移的抑制剂中的应用，上述月桂二胺衍生物选自如权利要求1的式I、式II和式III所示的化合物中的至少一种。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述癌细胞转移包括 SDF-1诱导的癌细胞转移。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述癌细胞为肠癌细胞。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述癌细胞为结肠癌细胞。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

发明人通过研究发现，如式I、式II和式III所示的三种月桂二胺衍生物对癌症靶蛋白CXCR4的抑制作用，并通过SDF-1结合 CXCR4或者CXCR7的抑制实验，进一步说明这三种化合物对SDF-1 结合CXCR4有特异性的抑制作用，而对SDF-1结合CXCR7无抑制活性。同时，CXCR4趋化实验以及SDF-1诱导CXCR4趋化抑制实验，证实了这三种化合物既不存在对CXCR4趋化能力的抑制性，也不存在对SDF-1的诱导趋化能力的抑制性。最后，实验证实，这三种化合物对结肠癌细胞系CT26的细胞杀灭功能，且对正常细胞无细胞毒性。

实验发现，这三种化合物在对CXCR4的拮抗剂能力上不及阳性药物AMD3100、P2G，但其对SDF-1与CXCR4的结合是特异性的竞争性抑制，且为不完全的结合抑制。由此说明，这三种化合物能够强有力地调控SDF-1可能诱导的CXCR4激发的癌变信号，诱导调节 SDF-1在生理或者病理的情况下从强力的激动剂，变为部分或者较低效能激动剂。这种调控的好处在于，既能保留了一定的CXCR4/SDF-1 信号以维持正常生理功能，又抑制了CXCR4由于SDF-1强烈刺激而导致癌变信号。由此可见，这三种化合物能够特异性的靶向CXCR4，高效杀死发生癌变的癌细胞，可作为癌症的治疗药物使用，应用前景广阔。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实验例1中受试化合物对12G5抗体结合CXCR4受体的抑制曲线；

图2为实验例2中受试化合物对2D7抗体结合CCR5受体的抑制曲线；

图3为实验例3中受试化合物对趋化因子SDF-1结合CXCR4的抑制曲线；

图4为实验例3中受试化合物对趋化因子SDF-1结合CXCR7的抑制曲线；

图5为实验例4中受试化合物的细胞毒性实验结果图；

图6为实验例5中的细胞SDF-1趋化实验模型图；

图7为实验例5中受试化合物对癌细胞趋化迁移数量的影响图；

图8为实验例5中受试化合物对SDF-1诱导细胞趋化转移抑制的影响图；

图9为实验例6中受试化合物对结肠癌细胞系的生长抑制曲线图；

图10为实验例7中10^-5M的受试化合物(给药体积为0.1ml/10g) 对小鼠的急性毒性实验结果；

图11为实验例7中10^-5M的受试化合物(给药体积为0.3ml/10g) 对小鼠的急性毒性实验结果；

图12为实验例7中10^-3M的受试化合物(给药体积为0.1ml/10g) 对小鼠的急性毒性实验结果；

图13为实验例7中10^-3M的受试化合物(给药体积为0.3ml/10g) 对小鼠的急性毒性实验结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本实施方式的下述实验例中的受试化合物为：m2018A、m2018B 和m2018C，以及结构式相似的同类物m2018D、m2018E和m2018F。

化合物m2018A(即式I所示的月桂二胺衍生物)，其化学名为： N,N'-二(4,5-二氢-1H-咪唑-2-yl)-1，8-辛烷二元胺 (N,N'-Di(4,5-dihydro-1H-imidazol-2-yl)-1,8-octane diamine)，结构如下：

化合物m2018B(即式II所示的月桂二胺衍生物)，其化学名为： N,N'-二(4,5-二氢-1H-咪唑-2-yl)-1，10-癸癸烷二元胺 (N,N'-Di(4,5-dihydro-1H-imidazol-2-yl)-1,10-decane diamine)，结构如下：

化合物m2018C(即式III所示的月桂二胺衍生物)，其化学名为： N,N'-二(4,5-二氢-1H-咪唑-2-yl)-1，12-十二烷二元胺(N,N'-Di (4,5-dihydro-1H-imidazol-2-yl)-1,12-dodecane diamine)，结构如下：

化合物m2018D，其结构式如下：

化合物m2018E，其结构式如下：

化合物m2018F，其结构式如下：

本实施方式的下述实验例中的对照药物为：

SDF-1，其是人源CXCR4唯一的天然激动剂，又叫CXCL12，其氨基酸序列为：GMKPVSLSYR CPCRFFESHV ARANVKHLKI LNTPNCALQI VARLKNNNRQ VCIDPKLKWI QEYLEKALNK。

P2G，为SDF-1突变蛋白，其氨基酸序列为：GMKGVSLSYR CPCRFFESHV ARANVKHLKILNTPNCALQI VARLKNNNRQ VCIDPKLKWI QEYLEKALNK。P2G具有强拮抗剂能力(而非类似 SDF-1作为CXCR4的激动剂，原因是P2G的突变位点)。

AMD3100(Plerixafor，CAS号为110078-46-1)，其为商业化激活干细胞活化的小分子药物，同时也是CXCR4的拮抗剂，其结构式如下：

Maraviroc(简称MVC)(Selzentry,CAS号为376348-65-1),其为商业化CCR5拮抗剂的小分子药物，同时也是CCR5的拮抗剂。

Human MIP1βeta Chemokine(简称CCL4)，其氨基酸序列为： MKLCVTVLSLLMLVAAFCSP ALSAPMGSDP PTACCFSYTA RKLPRNFVVD YYETSSLCSQ PAVVFQTKRS KQVCADPSESWVQEYVYDLE LN。CCL4为人源巨噬细胞炎性蛋白1β,为CCR5 受体天然激动剂和趋化因子。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：

实验例1受试化合物对12G5抗体CXCR4受体结合的抑制实验

CXCR4是癌症细胞增生和恶性分裂的一个细胞膜上的生物标记物，而SDF-1是CXCR4的天然趋化因子和激动剂。因此，通过有效抑制CXCR4结合SDF-1，就可以抑制CXCR4的信号，维持正常的细胞生理功能，避免造血分化细胞(免疫细胞和白细胞)进入恶性增生程式。当CXCR4被刺激信号过强时，无论是正向调节或者负向调节都会引起CXCR4细胞内信号调节失常，从而导致细胞生长失衡。

12G5是通用的作为识别CXCR4的一个鼠源单克隆的商业化抗体。12G5抗体对CXCR4具有较强的结合亲和力，可用于识别 CXCR4。

在本实验中，为了确认受试化合物是否能够与CXCR4受体结合、以及与CXCR4受体的结合位点，发明人选择在A3.01T淋巴细胞系上进行带有荧光标记的12G5anti-CXCR4单克隆抗体膜蛋白标记。

一、实验方法：

a.通过传统细胞扩增方式，即使用含有1X RPMI1640 (THERMOFISCHER)，10％FBS(小牛血清，Biowest),1x盘尼西林和1x链霉素(THERMOFISCHER)以1000000细胞/2毫升的浓度，在75cm²培养皿培育48小时，然后再进行不超过5代的扩增(按比例扩增)。通过活细胞计数仪(Biorad TC-20)，定量使用50000个细胞作为统一受体细胞总量。

b.选择Kd(离解常数)为3.3nM，即12G5抗体的浓度为3.3nM。反应体系为：以25μl缓冲液混匀50000个细胞+25μl、3.3μM 12G5 抗体构成50μl体积的抗体受体细胞结合模型，再分别加入0～10^-5M 浓度的受试化合物(m2018A、m2018B、m2018C、m2018F)以及对照药物(SDF-1、P2G、AMD3100)，将其于4℃下孵育1小时。

c.孵育1小时后，用洗脱液(由0.1μM的EDTA+1X PBS缓冲液+0.01μM叠氮化钠+1％的BSA混合而成)脱液两次，每次分别进行1200rpm，5分钟的离心，弃掉上清液。随后，再在上述缓冲液中加入1/1000稀释(0.1ug/1ml)的Jackson ImmunoResearch提供的 F(ab’)goat-anti-mouse IgG(FITC偶联)，混匀，遮光，孵育30分钟。然后重复用该洗脱液/缓冲液清洗两次，分别于1200rpm下离心5min，弃去上清液。随后，使用传统方法混匀细胞，得到100μl总体积的细胞液。

d.使用流式细胞仪(Canto-II SORP，BD)测定每孔中FITC的荧光值度数,每个浓度3孔重复，以CXCR4受体+12G5抗体(不含其它测试分子)定为B0(Bmax，受体最大被识别量)，测试分子的浓度设定为：10^-12M～10^-5M。使用Flowjo(Treestar)软件进行分析，然后使用PRISM软件(Graphpad)进行数据分析。

二、实验结果

结果如图1所示，与阳性对照SDF-1(即CXCL12，其作为最基础的结合生物活性分子，竞争抑制12G5结合的能力最强)相比，受试化合物m2018F对在12G5抗体结合A3.01T细胞(在正常状态下，表达大量的CXCR4膜受体)的抑制能力弱，其原因可能在于活性基团不同，且两个主要活性基团的碳支链为单数(即n＝9)；本发明的 m2018B、m2018C的抑制能力与P2G和AMD3100相比差别不大， m2018A的抑制能力略低于P2G和AMD3100。由此说明，本发明的三个受试化合物m2018A、m2018B、m2018C均具有识别CXCR4的结合点的能力，且与P2G和AMD3100的能力基本相当。

m2018B、m2018C对比CXCR4激动剂SDF-1、CXCR4拮抗剂 P2G和AMD3100，只有1到2个log的解离常数Kd的差别，m2018A 的Kd值略低于m2018B、m2018C；考虑到过强的抑制信号，对CXCR4 信号的最低维持和细胞生理常态不利，即过强的激动剂或拮抗剂对CXCR4的正常生理功能信号都会有影响。因此，本发明m2018A、 m2018B、m2018C的解离常数Kd是较为适宜的。由此说明，m2018A、 m2018B、m2018C这三个月桂二胺衍生物能够识别部分或新的 CXCR4结合位点，具有维持SDF-1的最低信号诱导能力，可以作为 CXCR4的拮抗剂来使用，抑制趋化因子与SDF-1受体结合诱发癌变信号导致癌变。

实验例2受试化合物对CXCR4的特异性识别实验

CCR5受体是T淋巴细胞在激活状态下表达的一个特别的趋化因子受体。对于T淋巴细胞，在被多种信号激活或者活化的情况下， CXCR4和CCR5都会被诱导表达。CXCR4和CCR5有时候会聚合成杂聚体(heterodimer)，不规则的结合会导致膜受体的信号变化和细胞生理功能的完全改变，从而可能产生不可预估的副作用，导致其产生的膜受体信号诱变恶性的癌变信号。因此，为了确认本申请中的三个月桂二胺衍生物对CXCR4的特异性识别能力，特进行本实验。

为了确认受试化合物对CXCR4的结合特异性而非针对CCR5，发明人选择使用A3.01–R5T淋巴细胞，该细胞同时表达CXCR4和 CCR5两个受体。在细胞膜上在T淋巴细胞系A3.01-R5上进行带有荧光标记的2D7anti-CCR5单克隆抗体膜蛋白标记。

一、实验方法

a.定量使用50000个细胞作为统一受体细胞总量(扩增方式如实施例1)，选择Kd(离解常数)为2.2nM，即CCR5 2D7抗体的浓度为2.2nM。反应体系为：以25μl缓冲液混匀50000个细胞+25μl、 2.2nM的2D7抗体构成50μl体积的抗体受体细胞结合模型，再加入从10^-6M浓度的受试化合物(m2018A,m2018B、m2018C、 m2018D)以及对照药物(CCL4)，将其于4℃下孵育1小时。

b.孵育1小时后，用洗脱液(由0.1μM的EDTA+1X PBS缓冲液+0.01μM叠氮化钠+1％的BSA混合而成)脱液两次，每次分别进行1200rpm，5分钟的离心，弃掉上清液。随后，再在上述缓冲液中加入1/1000稀释(0.1ug/1ml)的Jackson ImmunoResearch提供的 F(ab’)goat-anti-mouse IgG(FITC偶联)，混匀，遮光，孵育30分钟。然后重复用该洗脱液/缓冲液清洗两次，使用传统方法混匀细胞，得到100μl总体积的细胞液。

c.使用流式细胞仪(CantoII SORP，BD)测定每孔中FITC的荧光值度数，每个浓度3孔重复，以受体+2D7抗体不包含(不含其它测试分子)定为B0(Bmax，受体最大识别量)，测试分子的浓度设定为10^-6M。使用Flowjo(Treestar)软件进行分析，然后使用PRISM 软件(Graphpad)进行数据分析。

二、实验结果

结果如图2所示，由于表达CCR5的T细胞常态分泌天然趋化因子CCL4，而基于同源抑制，趋化因子CCL4可以特异性抑制CCR5 和2D7抗体的结合。因此，在CCL4的存在下，2D7抗体与CCR5 的结合能力降低70％，而受试化合物m2018A,m2018B,m2018C,和 m2018D对2D7抗体结合A3.01-R5细胞能力方面不起任何作用(0％的抑制能力)。

由此说明，在T细胞或者巨核细胞同时表达CXCR4和CCR5情况下，m2018A,m2018B,m2018C这三个月桂二胺衍生物不识别 CCR5。再结合实验例1的实验结果，可以说明：m2018A,m2018B, m2018C这三个月桂二胺衍生物，在T细胞或者巨核细胞同时表达 CXCR4和CCR5情况下，能够特异性识别CXCR4，而不会识别 CCR5。因此，m2018A,m2018B,m2018C这三个月桂二胺衍生物可以成为特异性的CXCR4拮抗剂。

实验例3受试化合物对SDF-1结合CXCR4的特异性识别实验

CXCR4和CXCR7受体的表达是淋巴细胞发生迁移、激活、集束和效应的一个存在分子依据。但是在一般情况下，该受体的表达量、激动剂对受体的信号作用使得趋化因子受体变成了癌症或者病毒入侵的一个有利的信号通路。利用表达在细胞膜上的CXCR4和CXCR7 受体作为靶标，特异性抑制SDF-1与CXCR4或者CXCR7的结合，将是重要的靶向CXCR4拮抗剂的重要指标。

SDF-1可以特异性识别CXCR4和CXCR7，为了确认本申请中的月桂二胺衍生物可以特异性阻断SDF-1结合CXCR4，而非 CXCR7，发明人通过如下实验进行证明。

一、实验原理

SDF-1将被偶联Tebium试剂(信号配体)，Tebium试剂应用于 HTRF同源福特能量转移实验；而CXCR4和CXCR7将被偶联上 HTRF的信号受体试剂。当两者产生少于100nm的距离结合后，将会产生能量转移(从Tebium配体到受体)。通过检测能量转移的大小，即能够定量受试化合物抑制SDF-1与CXCR4或CXCR7的结合能力 (即，拮抗剂的IC50)。

二、实验方法

实验细胞：选择人胚胎肾细胞293T(Human Embryonic Kidney Cells 293)稳定转染具有Tag-lite分子标签的CXCR4或者CXCR7受体，称为HEK-293T CXCR4-CLIP和HEK-293TCXCR7-CLIP。

定量信号配体，即带有Tebium荧光剂偶联的SDF-1趋化因子(简称Tb-SDF-1)，以3.3μM和4.8μM的Kd值分别结合5000个 HEK-293T CXCR4-CLIP和HEK-293T CXCR7-CLIP细胞，具体步骤如下：

实验细胞系为来自CISBIO的HEK-293T CXCR4-CLIP和 HEK-293T CXCR7-CLIP稳定细胞系，商业化的细胞。这两种细胞系经过-150℃低温保存直至实验开始后，细胞采用10％DMSO和90％小牛血清(过滤)复苏。细胞解冻后，进行细胞存活率鉴定，细胞存活率为95％以上。

反应体系为：2μl细胞(5000个)+5μl、3.3nM的Tb-SDF-1+3 μl不同浓度(10^-5M到10^-12M)的受试化合物(m2018B、m2018C等) 和对照药物(AMD3100)，将其混合后于20℃下孵育1小时。

使用Cisbio提供的1X洗脱液洗脱2次，然后使用TECAN机械臂自带的自动上样模块进行分光光度的数据分析。

三、实验结果

阳性对照AMD3100，是目前最佳的降低SDF-1与CXCR4或 CXCR7结合率(IC50)的分子。

受试化合物与CXCR4的结合如图3所示，与AMD3100相比，受试化合物m2018A、m2018B、m2018C降低SDF-1与CXCR4结合率的能力仅次于AMD3100，且差别很小(小于1个log)。而m2018E 和m2018F并不能有效地抑制SDF-1与CXCR4的结合。

受试化合物与CXCR7的结合如图4所示，AMD3100能够有效降低SDF-1与CXCR7结合率(降低了80～100％)，在较高浓度下， m2018E也能够降低SDF-1与CXCR7结合率。而受试化合物m2018A、 m2018B、m2018C和m2018F对SDF-1与CXCR7的结合几乎不起作用。

由图3和图4可见，m2018A、m2018B、m2018C对SDF-1与 CXCR7的结合几乎不起作用，同时又能够抑制SDF-1与CXCR4的结合，且其结合亲和力和抑制IC50的水平仅次于AMD3100。由此说明，m2018A、m2018B、m2018C这三个月桂二胺衍生物可以特异性位阻SDF-1抑制CXCR4，并且可以保持CXCR4的最低活性信号；由于SDF-1的信号对CXCR4功能的调控具有很重要的作用，本实验例的数据再次说明：m2018A、m2018B、m2018C起到了强有力地调控CXCR4的重要性。

同时，图3和图4示出，AMD3100对SDF-1与CXCR4和CXCR7 的抑制能力相仿，说明AMD3100能够同时识别SDF-1与CXCR4的结合位点、以及SDF-1和CXCR7的结合位点，并采取了位阻效应抑制SDF-1争夺该结合位点。由于AMD3100会竞争抑制CXCR7信号，这会产生不可预估的副作用和细胞毒性。而m2018A、m2018B、 m2018C这三个月桂二胺衍生物只是针对CXCR4而非CXCR7进行空间位阻作用，并且竞争抑制SDF-1结合受体，副作用小。此外，相比于AMD3100将SDF-1与CXCR4的信号全部抑制，m2018A、 m2018B、m2018C对SDF-1与CXCR4的信号的这种部分抑制，在细胞毒性和耐受性方面有一定的优势。

实验例4细胞毒性和生物耐受性实验

一、实验原理

PI(Propidium Iode)，是一种细胞膜的特殊染色剂。当细胞被阳性的PI标记时，说明该细胞凋亡和细胞膜破裂，从而反映加入的受试化合物对细胞膜和细胞的生理毒性。

二、实验方法

通过PBMC人外周血单核细胞经过Ficoll分离，使用Mitenyli Biotec的CD4+Tcell试剂盒筛选出CD4+T cells(产率30％)，50ml 的全外周血(含血小板)可以获得100,000,000左右的CD4+T淋巴细胞。

以100000 CD4+T淋巴细胞为实验模型，经过1200rpm、5min、 4℃的环境下离心，去除上清液，然后加入50μl缓冲液混匀，再分别加入浓度为1μM、10μM的受试化合物(m2018C、m2018B、 m2018A、m2018E)和阳性对照(CXCR4的拮抗剂AMD3100、CCR5 的拮抗剂MVC(CAS:376348-65-1)。将其混合24小时后，放入37℃ 的细胞培养箱培育，24小时后，洗脱两次，离心，去上清。在细胞中加入稀释浓度1/10000来自THERMOFISCHER的PI，于20℃下培养10分钟，然后洗脱两次，离心，去上清，加入100μl缓冲液，利用Canto II流式细胞仪的SSC和PI通道筛选(以不加PI为阴性对照确定细胞的被检测的位置)，筛选出在总检测的细胞里PI阳性的数量来确定细胞的总存活率。

三、实验结果

如图5所示，在两个实验标准浓度1μM和10μM下，除了阴性对照m2018E在10微摩的浓度下对细胞产生50％的毒性，其余受试分子经过24小时和初代淋巴T细胞混匀共同孵育并不影响细胞的生理状态。

m2018A、m2018B和m2018C在对CXCR4产生拮抗剂的作用过程中，通常只需要2小时结合解离、产生稳定的细胞膜受体和拮抗剂的复合结构，因此，m2018A、m2018B和m2018C这三个月桂二胺衍生物并不对细胞造成毒性作用。

三个活性分子m2018A、m2018B和m2018C在对CXCR4产生拮抗剂的作用的过程中(通常只需要2小时结合解离和产生稳定的细胞膜受体和拮抗剂的复合结构)并不对细胞造成毒性作用。这三个活性分子的生物耐受能力强，进一步证明其结构具有很强的靶向性，只靶向性的针对CXCR4被SDF-1信号刺激诱导癌变信号的通路，同时对SDF-1诱导的细胞生存和正常的趋化活性信号(可以通过CXCR7 提供)无影响。由此说明，这三个活性分子对细胞和人体的正常免疫平衡有很强的药理活性。

实验例五受试化合物对癌细胞趋化作用的影响

一、实验原理

趋化作用是癌细胞癌变的一个重要标记，通常癌细胞转移最基础的活动机制是来自于细胞上粘连分子整联蛋白(integrins)、 desintegrins的相互作用以及趋化因子和趋化因子受体相互结合、信号调控等复杂作用。SDF-1作为CXCR4唯一的激动剂，对于发生癌变的细胞产生不可逆的转移作用。癌细胞、损伤和被感染的组织和寄主细胞都会上调CXCR4和SDF-1表达，使得这个转移和趋化的作用更显强烈。

受到趋化因子的诱导作用，细胞会产生极性细胞膜变化，并形成趋向趋化因子高浓度的地方极化迁移。这个趋化过程受到趋化因子浓度、趋化因子受体的表达量以及细胞的常态的影响。

二、实验方法

A.测试受试分子趋化癌细胞转移的能力：

细胞趋化实验模型如图6所示，实验使用Corning公司的提供的 transwellbicarbonate filter chamber(48X)，首先在分别在上层和下层分别加入50ul和500ul的混合液(RPMI1640培养基+100ug/ml的盘尼西林+100ug/ml的链霉素(Gibco)+10％购自Biowest的100％小牛血清)，放入37℃培养箱中培育4小时，然后在上层加入50ul含有5000个A3.01表达CXCR4的T淋巴细胞，在下层加入50ul不同梯度浓度的受试化合物(m2018B、m2018C和m2018A)和对照分子 (SDF-1、P2G和AMD3100)。

放入37℃培养箱，等待迁移5h。5小时后，将下层细胞全部收集，浓缩到100ul的流式细胞仪分析的缓冲液中，然后经流式细胞仪 CantoII的FSC和SSC的通道，进行180秒的细胞读数分析(每3个孔为一个浓度)，统计分析在每个浓度的受试分子诱导细胞从上层往下层移动的细胞数量，结果如图7所示。

B.测试受试分子对SDF-1趋化癌细胞转移的抑制能力：

细胞趋化实验模型如图6所示，实验使用Corning公司的提供的 transwellbicarbonate filter chamber(48X)，首先在分别在上层和下层分别加入50ul和500ul的混合液(RPMI1640培养基+100ug/ml的盘尼西林+100ug/ml的链霉素(Gibco)+10％购自Biowest的100％小牛血清)，放入37℃培养箱中培育4小时，然后分别在上层加入50ul 含有5000个A3.01表达CXCR4的T淋巴细胞、以及50ul不同梯度浓度的受试化合物(m2018A、m2018B和m2018C)和对照分子(P2G 和AMD3100)，在下层加入一定浓度的SDF-1。

放入37℃培养箱，等待迁移5h。5小时后，将下层细胞全部收集，按照同样的方式进行检测，结果如图8所示。

三、实验结果：

由图7可见，SDF-1诱导的CXCR4趋化过程引起大量的A3.01T 淋巴细胞从上层迁移至下层，当SDF-1浓度在10^-9.5M～10^-8M区间依次增大时，A3.01T淋巴细胞的迁移数量逐渐增多；当SDF-1浓度大于10^-8M时，A3.01T淋巴细胞的迁移数量逐渐减少。说明SDF-1对A3.01T淋巴细胞有正态分布的浓度趋化效应。而受试化合物 (m2018A、m2018B和m2018C)均没有对CXCR4产生特异的趋化效应。

由图8可见，在趋化作用下，CXCR4与趋化因子SDF-1的结合是一个剂量效应的相互作用过程；大量的SDF-1涌入会影响CXCR4 的趋化作用，产生内部的肌动蛋白(actin)和灯丝蛋白(filament) 的聚合，通过活动性较强的趋化爬行机制(pseudopodia)使细胞形成局部极化状态，从上层迁移进入下层(或者平行移动)。而其受试分子则没有对此产生任何趋化作用。

由此说明，SDF-1是目前实验中唯一可以诱导T淋巴细胞(表达 CXCR4)的趋化因子和激动剂。而本实验中的所有阳性或者阴性对照以及m2018A、m2018B、m2018C这三个月桂二胺衍生物均不具备诱导T淋巴细胞趋化移动的作用。而当T淋巴细胞结合上活性分子m2018A、m2018B、m2018C后，SDF-1的诱导趋化能力基本完全被抑制。

实验例六受试化合物对结肠癌细胞系的生长抑制实验

一、实验原理：

使用CT26结肠癌细胞系，用于结肠癌药物筛选的细胞实验。 CT26细胞系来自于老鼠的结肠癌不死细胞系，与人结肠细胞结构和基因同源性十分高。由于目前人源结肠癌细胞系的生理功能尚无法被抗结肠癌药物测试的标准所接纳，因此CT26细胞系是目前结肠癌药物测试的离体实验的必需。

将处于对数生长状态的CT26细胞与受试分子共同培育，利用购自罗氏ROCHE的Cell Proliferation Reagent WST-1细胞生长检测试剂进行检测。该试剂中含有一种特别的盐离子WST-1，这个分子会因为活细胞所释放的线粒体脱氢氧化酶而催化变色(从浅红色变成深红色)，因此，可通过细胞培养液中颜色的变化程度确定细胞凋亡和被杀死的程度及效率，从而可以探究到受试分子靶向杀死结肠癌细胞的药理活性的大小。

二、实验过程：

体外培养满足实验要求的结肠癌不死细胞系CT26，待细胞进入对数生长期前(培养板密集80％的程度下)，加入定量的受试化合物 (m2018A、m2018B)和对照分子(AMD3100、P2G)，重复3个试验点。培育24h后，去除上清，使用培养基(不含小牛血清)洗脱后，观察和控制细胞的粘连状况。然后以100ul/每孔的浓度加入WST-1 试剂。10分钟的裂解反应后，用移液器充分混匀细胞提取物，然后在分光光度计的测量下，计算受试分子对结肠癌细胞CT26的半抑制浓度IC50。

三、实验结果

如图9所示，对照分子AMD3100和P2G，没有对CT26结肠癌癌细胞的生长产生任何的抑制作用，反而在较高浓度下(10²nM，即 10^-7M)尤其是AMD3100(CXCR4的强抑制剂)会对CT26结肠癌癌细胞产生诱导生长作用，间接证明强抑制剂并非对CXCR4诱导的癌细胞信号有抑制作用。而受试化合物m2018A和m2018B，在较低浓度下(例如10^-9M)，即可以产生强力的抑制CT26细胞生长和凋亡作用；在较高浓度下(例如10^-7M)基本上实现了CT26结肠癌细胞的100％抑制，也没有任何的复发状况。由此说明，m2018A和 m2018B能够对CT26结肠癌细胞产生强大的细胞诱导凋亡和细胞发展抑制作用。在前述实验的基础上，发明人有理由推断出与m2018A 和m2018B结构相似的化合物m2018C，也能够对CT26结肠癌细胞产生抑制作用。

由此说明，m2018A和m2018B和m2018C这三种活性分子可以作为潜在的抗癌靶向小分子药物，其可以为最佳的候选活性抗结肠癌癌变细胞奠定化学结构和功能性靶标基础。m2018A将会成为这类化合物的先导化合物。

实验例7受试化合物对小鼠体内的急性毒性作用

以上6个体外实验验证了该系列受试化合物的作用机制，生理功能和安全性，实验例7旨在验证该系列受试化合物的体内稳定性、以及潜在引起急性毒性的可能性。

一、实验过程：

使用体重约为10-15g的出生Balb/c野生型小鼠作为实验的急性毒性作用模型，200只小鼠，随机分为20组，每组10只，雄雌各半。分别以浓度为10e^-5M和10e^-3M的m2018A、m2018B、m2018C 和AMD3100为受试药物。腹腔注射给药，受试药物的给药剂量分别为0.1ml/10g小鼠和0.3ml/10g小鼠，空白对照组腹腔注射相同体积的PBS缓冲溶液。每日给药一次，连续给药14天后，观察各组小鼠的生理状况和计算其生存率。

三、实验结果：

如图10所示，受试药物的给药浓度为10^-5M，给药体积为0.1ml/10g 小鼠时，腹腔注射给药后观察的第14天后，相比于其它的受试化合物，化合物AMD3100对小鼠产生较强的毒性，影响了小鼠的总存活率(80％)。而化合物m2018A、m2018B、m2018C对小鼠产生的毒性小于化合物 AMD3100。同时，化合物m2018A和m2018C对小鼠产生的毒性要相对弱于m2018B(图10中，m2018A和m2018C的曲线与PBS的曲线重合)，待检验的化合物里，只有m2018B对小鼠产生了毒性导致其死亡。而当在此浓度下(即10^-5M)，给药体积为三倍体积(即，0.3ml/10g小鼠)时，如图 11所示，由于灌注体积关系和潜在实验操作的可能，各受试化合物灌注0.3ml引起的死亡率高于灌注体积为0.1ml时各组的死亡率。m2018C和 m2018B表现相接近。m2018A安全性表现的要比其他化合物较佳， AMD3100的存活率最低，但其致死时间要比m2018C要晚。

如图12所示，受试药物的给药浓度为10^-3M的情况下，给药体积为 0.1ml/10g小鼠时。存活率图表跟图11一致：由于灌注体积关系和潜在实验操作的可能，各受试化合物灌注0.1ml引起的死亡率等于10^-5M给药浓度、灌注体积为0.3ml时各组的死亡率，m2018C和m2018B表现相接近。m2018A 安全性表现的要比其他化合物较佳，AMD3100的存活率最低，但其致死时间要比m2018C要晚。如图13所示，同一浓度，三倍体积即0.3ml，AMD3100 的死亡率从第十天开始上升，而m2018C安全性能最差，其次是m2018A，安全性略高，m2018B安全性表现优于其他化合物。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims

1.月桂二胺衍生物在制备用于治疗癌症的药物中的应用，其特征在于，所述月桂二胺衍生物选自如式I、式II和式III所示的化合物中的至少一种：

2.根据权利要求1所述的月桂二胺衍生物在制备用于治疗癌症的药物中的应用，所述癌症为肠癌。

3.根据权利要求2所述的月桂二胺衍生物在制备用于治疗癌症的药物中的应用，所述肠癌为结肠癌、直肠癌。

4.月桂二胺衍生物在制备用于抑制CXCR4表达的拮抗剂中的应用，其特征在于，所述月桂二胺衍生物选自如权利要求1的式I、式II和式III所示的化合物中的至少一种。

5.根据权利要求4所述的月桂二胺衍生物在制备用于抑制CXCR4表达的拮抗剂中的应用，其特征在于，所述CXCR4表达包括CXCR4激动剂诱导的CXCR4表达；优选地，所述CXCR4激动剂为SDF-1。

6.根据权利要求5所述的月桂二胺衍生物在制备用于抑制CXCR4表达的拮抗剂中的应用，其特征在于，所述月桂二胺衍生物通过特异性地竞争抑制CXCR4激动剂与CXCR4的结合来抑制CXCR4表达。

7.月桂二胺衍生物在制备用于抑制癌细胞转移的抑制剂中的应用，其特征在于，所述月桂二胺衍生物选自如权利要求1的式I、式II和式III所示的化合物中的至少一种。

8.根据权利要求7所述的月桂二胺衍生物在制备用于抑制癌细胞转移的抑制剂中的应用，其特征在于，所述癌细胞转移包括SDF-1诱导的癌细胞转移。

9.根据权利要求根据权利要求7或8所述的月桂二胺衍生物在制备用于抑制癌细胞转移的抑制剂中的应用，其特征在于，所述癌细胞为肠癌细胞。

10.根据权利要求根据权利要求9所述的月桂二胺衍生物在制备用于抑制癌细胞转移的抑制剂中的应用，其特征在于，所述癌细胞为结肠癌细胞。