CN1907493A - 含EB病毒潜伏膜蛋白2基因的Ad5F35－LMP2重组腺病毒疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程和肿瘤治疗领域。具体而言，本发明公开了含EB病毒潜伏膜蛋白2基因的Ad5F35－LMP2复制缺陷型重组腺病毒及其制备方法。本发明所述的Ad5F35－LMP2复制缺陷型重组腺病毒可作为开发治疗和/或预防EB病毒相关肿瘤，尤其是鼻咽癌的疫苗和药物的有效候选物。

Description

含EB病毒潜伏膜蛋白2基因的Ad5F35-LMP2重组腺病毒疫苗

发明领域

本发明属于生物工程和肿瘤治疗领域。具体而言，本发明公开了含EB病毒潜伏膜蛋白2基因的Ad5F35-LMP2复制缺陷型重组腺病毒及其制备方法。

背景技术

鼻咽癌(NPC)是中国南方常见的恶性肿瘤之。发病率男性达30/10万以上，女性也超过15/10万。NPC患者主要靠放射治疗。但放疗对机体的非特异性损伤巨大，治疗后完全缓解患者仍有约40％～50％因出现远处转移和局部复发而导致治疗失败，NPC五年生存率仍徘徊在30％。因此在常规治疗的基础上迫切需要寻找新的综合治疗手段，近几十年来，随着分子生物学和肿瘤免疫学的研究进展，使用分子生物学手段提高患者细胞免疫，预防鼻咽癌复发和转移并作为传统治疗方法的补充，已受到人们越来越多的重视。

在恶性肿瘤中病毒性抗原是最具有免疫原性的分子，并且是保护性肿瘤免疫中最具显著意义的肿瘤抗原。EB病毒(Epstein-Barr Vrius，EBV)作为疱疹病毒科成员，是第一个被发现的与人类肿瘤有关的病毒。现已明确EB病毒是导致鼻咽癌(NPC)、Burkitt淋巴瘤(BL)及免疫抑制后淋巴瘤的主要病因之一，与何杰金氏(HD)、非何杰金氏淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤发生有关。在其他肿瘤如胃癌、肺癌、胸腺癌等肿瘤组织也发现有EB病毒DNA的存在。

EB病毒的潜伏膜蛋白2(Latent membrane protein 2，LMP2)是在NPC等EB病毒相关肿瘤的组织中持续表达的病毒蛋白之一，且存在于细胞的表面，它的抗原决定簇在不同病毒株一致且存在于在肿瘤病理切片样本中(Bollard CM，et al.J Immunother 2004；27：317-327)。LMP2基因不引起B淋巴细胞的转化、无致癌性，体内外研究已证明EB病毒LMP2基因可诱导产生特异性CTL。因此，LMP2成为在诱导EB病毒特异性CTL、预防和治疗相关肿瘤的良好靶抗原，目前国内外治疗EB病毒相关的恶性疾病多利用LMP2抗原决定簇。

许多的研究成果(Rooney CM，et al.Ann.Oncol，9(Suppl.5)：s129-s132.1997；Sing A P，et al.Blood.1997，89(6)：1978-1986；Caatherine M，et al.Immunother 2004，27(4)：317-327；Barbara Savoldo.M，et al.Blood.2002，100(12)：4059-4066；等)为利用LMP 2特异性CTL治疗未分化和低分化鼻咽癌提供了科学依据。

为了引发针对LMP 2的特异性CTL反应，就必须首先选择一个适合治疗应用的LMP 2表达系统。腺病毒由于具有下列优势被用作了LMP2的病毒载体：宿主范围广，能感染分裂期、静止期细胞或终末分化细胞，使用方便，尤其是复制缺陷型重组腺病毒更具有安全性好的优点。本发明人曾用携带LMP2编码序列的Ad5型复制缺陷型重组腺病毒免疫小鼠，检测(免疫荧光法)到动物体内特异性抗体的生成和动物的LMP2特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应(LDH方法)(详见专利申请号03128743.3的专利申请)。

但是，Ad5型复制缺陷型重组腺病毒载体有尚需进一步改进之处，首先，其转染需要受转染细胞表面有CAR受体存在，且转染效率与细胞表面的CAR密度密切相关(Li Y，etal.Cancer Res.1999，59：325-330.)，但遗憾的是，在重要目的细胞上，CAR表达通常是低水平或几乎不表达，包括多数肿瘤细胞或骨骼肌细胞、淋巴细胞、纤维细胞、巨噬细胞、单核细胞源性树突状细胞(Okada N，et al.Biochem Biophys Res Commun.2001，282：173-179)及造血干细胞；其次，由于多数人感染过Ad5型腺病毒，体内存在有Ad5型腺病毒中和抗体，使之容易被从体内清除出去。因此，本发明人一直在努力寻找能够进一步提高转染效率的腺病毒载体。

在本发明中，本发明人使用Ad5F35型腺病毒载体(用腺病毒Ad35纤维蛋白基因取代Ad5相应部分构建而成的腺病毒载体)代替Ad5作为LMP2基因的病毒载体，建立了一个更为适当的LMP 2表达系统，并在此基础上成功构建了Ad5F35-LMP2复制缺陷型重组腺病毒，使LMP 2蛋白在细胞内以内源蛋白质的形式表达，然后与组织相容性复合体(MHC)分子结合并一同呈递到细胞表面，激活记忆性T细胞，从而增强EB病毒相关肿瘤病人的抗肿瘤免疫反应。

发明内容

本发明提供了一种携带EB病毒潜伏膜蛋白2(LMP2)编码基因的复制缺陷型重组腺病毒及其制备方法。

本发明还提供了含有所述复制缺陷型重组腺病毒的疫苗及其在预防和/或治疗EB病毒相关肿瘤中的应用。

本发明是建立在下列科学发现和试验结果的基础之上的：

人类腺病毒血清型目前已知有51种，根据其基因组大小、结构、同源性、核酸组成及动物致癌性等再分为A-F组。C组的Ad5型腺病毒是目前最常用的腺病毒载体，但是下述原因制约了其转染效率：1)需要受转染细胞表面有CAR受体的存在，且转染效率与细胞表面的CAR密度密切相关，但是，在主要目的细胞上CAR表达通常是低水平或几乎不表达，包括多数肿瘤细胞或骨骼肌细胞、淋巴细胞、纤维细胞、巨噬细胞、单核细胞源性树突状细胞(Okada N，et al.Biochem Biophys Res Commun.2001，282：173-179)及造血干细胞；2)由于多数人感染过Ad5型腺病毒，体内存在有Ad5型腺病毒中和抗体，使得Ad5易于被从体内清除出去。

在与细胞受体结合过程中，病毒纤维蛋白起重要作用，并且对纤维蛋白的改造又基本不影响腺病毒的包装。病毒纤维蛋白的组织亲和性以头部最为重要，不同血清型腺病毒的纤维结构相似，其纤维尾部区高度同源，一种血清型的腺病毒纤维尾部能够与另一种血清型腺病毒外壳的五邻体基结合。因此考虑对Ad5的纤维蛋白进行修饰，用其它血清型腺病毒编码纤维蛋白部分的基因替代Ad5相应的纤维蛋白基因，构建靶向性不同的腺病毒载体。

B组腺病毒纤维蛋白(Ad11，Ad35)能与普遍存在于细胞表面的受体膜蛋白CD46结合，不依靠CAR受体存在就可感染相应靶细胞；此外，人类自然感染Ad35的个体是非常罕见的，因此，考虑用Ad35纤维蛋白修饰Ad5来改变靶向，提高转染效率。

用Ad35纤维基因相应部分取代Ad5载体全部纤维基因或部分纤维基因，成功构建了Ad5F35腺病毒载体。用构建得到的Ad5F35腺病毒载体转染CD34⁺细胞及K562细胞发现，它不依赖细胞表面的CAR及α_v整合素存在。用能与CAR及α_v整合素结合的Ad5腺病毒未能竞争抑制Ad5F35的粘附细胞或内化，分别用能抑制Ad5粘附的抗CAR抗体或抑制Ad5内化的抗α_v整合素抗体也未能阻断Ad5F35的粘附细胞或内化，且GFP的表达在细胞中不受α_v的影响。已有报道在造血干细胞、DC细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞及NK细胞、人乳腺癌细胞等细胞中Ad5F35腺病毒载体有高效感染力，提示使用该具有高效感染细胞能力的载体将有意义降低治疗或预防用载体量，便于临床应用及降低毒性。且小鼠实验发现Ad5F35腺病毒载体对肝细胞感染力显著下降，可降低机体抗腺病毒的炎症反应及肝脏损害。

因此我们确定以Ad5F35型腺病毒载体取代现有技术中的Ad5作为LMP2基因的病毒载体。

一方面，本发明提供了一种复制缺陷型重组腺病毒，该病毒是携带EB病毒LMP2 cDNA序列的Ad5F35型腺病毒。

为了得到本发明的携带EB病毒潜伏膜蛋白2(LMP 2)的DNA编码序列的复制缺陷型重组腺病毒，我们首先由携带LMP 2的DNA编码序列的已知质粒(例如Psg5-LMP2)中得到LMP 2的全长cDNA序列，并将其定向克隆到腺病毒穿梭质粒中。然后使用所得到的重组腺病毒穿梭质粒与已知的腺病毒骨架质粒一起共转染大肠杆菌宿主细胞，并借助宿主细胞的重组酶使两质粒间发生同源重组。然后基于质粒同源重组后获得的抗生素抗性(例如卡那霉素抗性)筛选阳性菌株，并由之得到所需的重组腺病毒质粒。最后，再借助脂质体将重组腺病毒质粒转染已知的腺病毒包装细胞，并在由所说的包装细胞提供的E1蛋白的反向作用下包装病毒(参见图1-3)。

在一个优选实施方案中，其中所述的腺病毒穿梭质粒是质粒pShuttle-CMV。

在一个优选实施方案中，其中所述的宿主细胞是大肠杆菌BJ 5183。

在一个优选实施方案中，其中所述的重组腺病毒骨架质粒是质粒pAd5F35，Ad5F35腺病毒载体是将Ad5载体纤维蛋白编码基因的全长或部分用Ad35纤维蛋白编码基因相应部分取代而构建得到的。

在一个优选实施方案中，其中所述的腺病毒包装细胞是293细胞。

在本发明的一个优选实施方案中，所述的复制缺陷型重组腺病毒的病毒滴度不小于108PFU/ml。

经PCR，RT-PCR及间接免疫荧光鉴定该病毒载体携带有编码EB病毒潜伏膜蛋白2基因，可在293细胞内有效复制、转录及其蛋白在293细胞膜上得到有效表达。

另一方面，本发明提供了一种含EB病毒潜伏膜蛋白2cDNA序列的Ad5F35型复制缺陷型重组腺病毒制备方法，该方法包括：

(1)将编码LMP2蛋白质的DNA序列克隆到适当的腺病毒穿梭质粒中，得到携带LMP2之DNA编码序列的重组腺病毒穿梭质粒；

(2)用步骤1的重组穿梭质粒和腺病毒骨架质粒共转染适当的宿主细胞；

(3)在适当条件下使步骤2的重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒进行同源重组的，得到携带LMP2之DNA编码序列的重组腺病毒质粒；

(4)将步骤3的重组腺病毒质粒导入适当的腺病毒包装细胞，得到所需的复制缺陷型重组腺病毒。

在本发明方法的一个具体实施方案中，所述的腺病毒穿梭质粒是质粒pShuttle-CMV。

在本发明方法的一个具体实施方案中，所述的宿主细胞是大肠杆菌BJ 5183。

在本发明方法的一个具体实施方案中，所述的重组腺病毒骨架质粒是质粒pAd5F35，Ad5F35腺病毒载体是将Ad5载体纤维蛋白编码基因的全长或部分用Ad35纤维蛋白编码基因相应部分取代而构建得到的。

在本发明方法的一个具体实施方案中，所述的腺病毒包装细胞是293细胞。

本发明所述的Ad5F35腺病毒载体是将Ad5载体纤维蛋白编码基因的全长或部分用Ad35纤维蛋白编码基因相应部分取代，通过基因工程手段构建而成的，可参见ShayakhmetovDM，et al.J Virol，2000，74：2567-2583；Nilsson M，et al.J Gene Med，2004，6：631-641；和Havenga MJ E et al.，J Virol，2002，76：4612-4620。

我们的实验结果显示，本发明的携带LMP2编码序列的Ad5F35-LMP2复制缺陷型重组腺病毒具有高达2-5×10⁹pfu/ml的病毒滴度。用本发明的重组腺病毒免疫恒河猴后，可检测(免疫荧光法)到动物体内特异性抗体的生成，并且可检测(ELISPOT方法)到动物的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。

因此，本发明的另一方面，提供了一种包括复制缺陷型重组腺病毒以及一种或多种药物学上可接受载体的疫苗。

在本发明的一个优选实施方案中，所述的复制缺陷型重组腺病毒为Ad5F35-LMP2。

在本发明的一个优选实施方案中，其中所述的复制缺陷型重组腺病毒Ad5F35-LMP2具有高达2-5×10⁹pfu/ml的病毒滴度。

另一个方面，本发明还提供了本发明所述的Ad5F35-LMP2复制缺陷型重组腺病毒及其疫苗在制备用于预防和/或治疗EB病毒相关肿瘤药物中的用途，尤其是在制备用于预防和/或治疗鼻咽癌药物中的用途。

附图简述

图1图示的是重组腺病毒穿梭质粒的结构示意图。

图2图示的是重组腺病毒骨架质粒的结构示意图。

图3图示的是重组腺病毒包装(构建)流程图。

图4图示的是经本发明重组腺病毒Ad5F35-LMP2转染后的293细胞中的LMP2基因RT-PCR检测结果。其中：泳道1是经Ad5F35-LMP2转染后293细胞RNA的RT-PCR产物，泳道2是阳性对照pCDNA3.1-LMP2为模板的RT-PCR产物，泳道3是正常293细胞总RNA的RT-PCR产物，泳道4是DL2000 DNA Marker。

图5图示的是第二轮单斑挑选及PCR鉴定结果。其中，泳道1-9是第二轮单斑挑选及PCR鉴定结果，泳道10是正常293细胞冻溶物上清作阴性对照；泳道11是PSG5-LMP2为模板作阳性质控，泳道12是DL2000 DNA Marker。

图6图示的是间接免疫荧光法检测经Ad5F35-LMP2感染的293细胞LMP2蛋白的表达。其中，图6A是Ad5F35-LMP2感染的293细胞；图6B为正常的293细胞。

图7图示的是重组非复制型腺病毒的鉴定结果。其中图7A是Ad5F35-LMP2感染的Hela细胞；图7B为Ad5F35-LMP2感染的293细胞。

本发明的优点：

本发明使用Ad5F35腺病毒载体取代现有技术中的A5作为载体构建复制缺陷型重组细胞毒。在造血干细胞、DC细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞及NK细胞、人乳腺癌细胞等细胞中，Ad5F35腺病毒载体有高效感染力，使用该载体将可以有效降低治疗或预防用载体量，便于临床应用及降低毒性。且小鼠实验发现Ad5F35腺病毒载体对肝细胞感染力显著下降，可降低机体抗腺病毒的炎症反应及肝脏损害。

下列实施例旨在进一步举例说明而不是限制本发明。应明确指出的是，在不违背本发明的精神和原则的前提下，对本发明的个别非必要技术特征所做的任何改动和改变都将落入本发明的待批权利要求范围内。另外，如前所述，由于用于实现本发明的分子生物学相关技术和载体质粒等起始材料均是已知的，可从各种来源直接获得或者可通过遗传操作、扩增和/或重组表达等手段间接得到，并且本说明书的详细描述部分和相关实施例部分也已对本发明的方法作了完整、清楚的描述，所以申请人相信本领域技术人员在仔细阅读了本说明书后完全可以重复和再现本发明。

实施例

材料和方法

PSG5-LMP2质粒含LMP2 cDNA全序列，大肠杆菌DH5α、BJ5183和293细胞，由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所肿瘤病毒室保存。质粒大量提取试剂盒QIAGENPlasmid Midi Kits购自德国QIAGEN公司。常用限制性内切酶、T4 DNA Ligase、rTaq酶、核酸凝胶纯化试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。脂质体转染试剂Lipofectamine 2000、Opti-MEM试剂购自美国Invitrogen公司。LMP2特异性大鼠单抗为英国伯明翰大学Rickinson教授馈赠。

Ad5F35Easy腺病毒载体系统的穿梭质粒pShuttle-CMV由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所肿瘤病毒室保存。骨架质粒pAd5F35由瑞典兰德大学樊小龙教授馈赠。

本发明所涉及的分子生物学相关技术如核酸操作技术，蛋白质定性等在科学文献中都已有充分描述(如参见J·萨姆布鲁克E·F·弗里奇T·曼尼要蒂斯，分子克隆实验指南(第二版))。

实施例1含LMP2序列的Ad5F35复制缺陷型重组腺病毒的构建

以下按分步骤详细描述含LMP2序列的Ad5F35复制缺陷型重组腺病毒的构建流程(参见图3)。

1.1LMP2序列的Ad5F35复制缺陷型重组腺病毒穿梭质粒的构建

1.1.1大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：

从37℃培养16～20h的新鲜平板上挑取DH5α单菌落，接种于5ml不含抗菌素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜(12～16h)。次日从上述培养物中吸取0.5ml按1∶100转入50ml LB培养基中继续培养约3h，至菌液的OD600值为3时，在无菌条件下将细菌转移到另一支无菌、冰预冷的50ml离心管中，冰浴30min。在4℃条件下，4000rpm离心10min，弃上清，将管倒置1min，使残留培养液流尽，以10ml用冰预冷的100mmol/L CaCl₂溶液重悬细菌沉淀，冰浴30min。4℃，4000rpm离心10min，弃上清，每50ml初始培养物用2ml预冷的含15％甘油的100mmol/L CaCl₂溶液重悬细菌沉淀，分装成每管200μl，-80℃保存备用。

1.1.2PSG5-LMP2质粒的转化：

用无菌吸头吸取1μl PSG5-LMP2质粒(PSG5-LMP2质粒含LMP2 cDNA全序列，氨苄青霉素抗性，美国哈佛大学Kieff教授馈赠，由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所肿瘤病毒室保存)加入200μl DH5α感受态细胞中，轻轻旋转混匀，冰浴30min。将管移入42℃水浴箱中水浴90s，然后迅速将试管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。每管加入800μl不含抗生素的LB培养基，移至37℃摇床上，温育45min(转速＜150rpm)。取50μl已转化的感受态细胞，用一支无菌的弯头玻棒轻轻涂到含相应抗生素的琼脂平板表面至液体被吸收，倒置平皿，于37℃培养12～16h。

1.1.3PSG5-LMP2质粒的小量制备：

挑取单个PSG5-LMP2质粒转化菌落接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜。将培养物移入1.5ml管中，12000rpm离心30-60s，倒去培养液，倒置离心管，使上清流尽，用100μl预冷的溶液I[50mmol/L Glucose，25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)]重悬菌体，剧烈振荡混匀；加入200μl新鲜配制的溶液II(0.2mol/LNaOH，1％SDS)，温和混匀，冰浴3min，至液体清亮；加入150μl预冷的溶液III(100ml中含5mol/L KAc 60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml)温和混匀，冰浴10min，12000rpm离心10min，小心吸取上清，将上清转移至另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇室温沉淀30min，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用70％乙醇洗一次，室温晾干后，用30μl含RNaseA(100μg/ml)的TE(pH8.0)溶解沉淀，37℃水浴30～60min后置-20℃保存备用。

1.1.4重组Bluescript-LMP2质粒的构建和酶切鉴定：

质粒与基因的限制性内切酶酶切条件均参照供应商提供的条件进行。EcoRI单酶切PSG5-LMP2质粒，切胶回收2.0Kb左右大小的目的基因片段。EcoR I单酶切Bluescript M13，回收2.9Kb左右大小的载体片段。切胶回收具体操作参见TaKaRa公司Agarose Gel DNAPurification Kit试剂盒说明书。

经酶切纯化的载体DNA去磷酸化，方法为载体DNA10μl，加入10×碱性磷酸酶缓冲液2μl、0.5μl碱性磷酸酶、补水至总体积为20μl。37℃水浴15分钟，再加0.5μl碱性磷酸酶，置55℃水浴45分钟；将1/10反应体积的0.5M EDTA(PH8.0)即2μl加入反应管中，65℃灭活1小时；等体积饱和酚/氯仿抽提一次，氯仿/异戊醇抽提一次。上层水相加1/2体积7.5mol/L醋酸铵，2倍体积无水乙醇-70℃沉淀DNA 30分钟，12000rpm离心15分钟收集DNA沉淀；用70％乙醇洗涤一次，干燥后加水至DNA浓度为0.5μg/μl，-20℃保存备用。

将去磷酸化的载体Bluescript M13的酶切片段与回收的LMP2目的基因片段按1∶5比例混合，45℃水浴5分钟后迅速置于冰浴中，加入10×T₄DNA连接酶缓冲液和T₄DNA连接酶(总反应体积10μl)，16℃过夜连接。然后，用所得到的连接反应混合物转化致敏的大肠杆菌DH5α细胞。

以碱裂解法小量提取如上得到的Bluescript-LMP2质粒。SalI酶切判定重组质粒的大小和方向，正向插入且不存在串联现象的重组体经SalI酶消化后得到两条大小分别为788bp和4128bp的片段。挑取插入目的基因片断大小、方向正确的克隆进行扩增，用碱裂解法提取Bluescript-LMP2质粒并切胶回收经KpnI-Xbal双酶切后所得到的约2000bp的LMP2目的片段(序列如SEQ ID NO：1所示)。

1.1.5重组腺病毒穿梭质粒pShuttle-LMP2的构建：

用KpnI-Xbal双酶切带有CMV启动子的穿梭质粒pShuttle-CMV。然后将所回收的片段与KpnI-Xbal双酶切回收的LMP2片段按l∶4比例混合。45℃水浴5分钟后迅速置于冰浴中，加入10×T₄DNA连接酶缓冲液和T₄DNA连接酶(反应体积40μl)，16℃过夜连接。取5μl连接反应物转化致敏的DH5α感受态细菌中。

pShuttle-LMP2质粒克隆的挑取、摇菌扩增、PCR鉴定：挑取单个质粒转化菌落接种于5ml含卡那霉素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜，小量提取质粒。PCR反应体系为去离子ddH₂O 16.2μL，PCR Buffer 2.5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，dNTP4.0μL，Taq酶0.3μL，pShuttle-LMP2 DNA模板1μL，共25μL。ddH₂O替代DNA模板作为阴性对照。PCR上游引物：5′GCTGCAGGAAACAACTCCCAATATCCA 3′；下游引物：5′AACTGGAGGGCAGCATCTAATGACC 3′。PCR反应条件为95℃，5min预变性；95℃、30s，55℃、45s，72℃、1min，共30个循环，72℃、7min。模板扩增的片段长度1300bp。将PCR反应产物以琼脂糖凝胶方法进行电泳。

pShuttle-LMP2的酶切鉴定：经KpnI-Xbal双酶切，连接产物产生的片断大小为一条约2000bp左右的条带及另一条带约为7.5kb条带，表明所得产物为正确连接的重组穿梭质粒pShuttle-LMP2。

1.2含LMP2cDNA序列的Ad5F35第制缺陷型重组腺病毒的构建：

1.2.1穿梭质粒和骨架质粒DNA的制备：

挑取鉴定阳性、插入目的基因片断大小正确的克隆进行扩增、用碱裂解法提取pShuttle-LMP2质粒并用紫外分光光度计测定OD值，判定其浓度和纯度。用PmeI单酶消化后回收酶切片段，-20℃下保存备用。

同时，挑取单个含pAd5F35质粒的细菌菌落，接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃下震荡培养24小时。将培养物冰浴10分钟后离心收集细菌细胞。依次加入上述的溶液I、溶液II和溶液III并进行相似处理后离心(12000rpm、10分钟)收集上清。用等体积异丙醇-20℃沉淀过夜后，用70％乙醇反复洗涤沉淀2-3次。然后加入含RNaseA(100μg/ml)的TE溶液(30μl)溶解沉淀，完全溶解后于-20℃下保存备用。

1.2.2大肠杆菌BJ5183宿主细胞的制备

将大肠杆菌BJ5183细胞接种于含链霉素(30μg/ml)LB培养液(3ml)中，37℃保温过夜后再将1∶1000稀释的此培养物转入新的含链霉素LB(200ml)中继续培养4～5小时，直至OD₅₅₀达到0.6左右。离心(4℃、3000rpm、10分钟)收集细胞后再用体积冰预冷的WB溶液(10％甘油，90％的去离子水)重新悬浮细菌细胞。用WB溶液反复洗涤3次后，分装成每管20μl，-70℃下保存备用。

1.2.3BJ5183细胞的转化和腺病毒重组体的生产与鉴定

将上述PmeI线性化的穿梭质粒(携带卡那酶素抗性)6μl，腺病毒骨架质粒pAd5F35(1μl)加入如上得到的BJ5183细胞(20μl)中，置于无水乙醇浸泡处理并预冷却的电转化仪(Bio-Rad)的小杯中，在2500V，200Ω，25μFD条件下进行电转化。然后，快速加入不含抗生素的LB培养液0.5ml重新悬浮细胞。37℃保温10分钟后将被转化的细胞接种于卡那霉素阳性的LB培养皿中(100μl/皿)，37℃培养过夜。

培养后，挑选最小的10～20个克隆，接种于2ml卡那霉素阳性(25μg/ml)的LB培养液中，继续于37℃下振摇过夜。然后用碱裂解法提取质粒，并进行PacI单酶切鉴定。经PacI酶切后，得到两条大小分别为大约34kb和3000/4500bp的片段，表明穿梭质粒和骨架质粒已在宿主细胞内重组酶的介导下发生了同源重组，并且宿主细胞也获得了卡那酶素抗性。用鉴定正确的重组体转化致敏的DH5α感受态细菌，

使用质粒大量提取试剂盒QIAGEN Plasmid Midi Kits提取重组腺病毒Ad5F35-LMP2质粒具体实验步骤见QIAGEN Plasmid Midi Kits使用手册，用PacI单酶消化后回收得到的酶切大片段，-20℃下保存备用。

1.2.4重组腺病毒的包装

转染前一天传代HEK-293细胞于25cm2细胞培养瓶，培养基用不含抗生素、含5％FCS的DMEM。配制转染液：A液：溶于纯水的经PacI酶切线性化Ad5F35-LMP2重组腺病毒DNA 5μl和Opti-MEM培养基共250μl；B液：5μl LipofectamineTM2000和Opti-MEM培养液共250μl。B液室温放置5min，A和B液轻轻混匀，室温放置20min。吸弃旧细胞培养液，换2ml新鲜的不含抗生素、含5％FCS的DMEM，然后将A+B混合液加入培养细胞上，于37℃，5％CO2孵育8h，补充新鲜的培养基2.5ml。24h后换含2％FCS的DMEM维持。转染后10天，于-70℃和37℃下反复冻融4次，离心(3500rpm，5分钟)收集上清。用1ml上清接种293细胞37℃，5％CO₂孵育1小时。然后加入5ml含2％胎牛血清的DMEM维持液并观察细胞病变。观察结果显示，4天后被转染的293细胞出现肿胀、圆缩等典型的细胞病变。

实施例2复制缺陷型重组腺病毒Ad5F35-LMP2的鉴定、病毒滴度分析和蛋白表达

2.1重组腺病毒感染的293细胞内LMP2基因的转录：

TRIzol一步法分别提取正常293细胞和感染了LMP2的293细胞的总RNA，进行RT-PCR鉴定。RT-PCR反应参数如下：逆转录体系为20μl。以1μg细胞总RNA为模板，Oligod(T)15为引物，50℃30min进行逆转录反应，94℃2min灭活逆转录酶，以合成的cDNA为模板进行PCR反应，上游引物：5′CTTCTACTCTTGGCAGCAGT 3′；下游引物：5′CGCCATCTCCTTCTGTACGC 3′。95℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 60s，30个循环，取5μlRT-PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。结果显示Ad5F35-LMP2感染的293细胞mRNA可扩增到239bp左右特异性条带，而止常293细胞结果为阴性，这表明LMP2基因插入腺病毒基因组中，并且能有效转录(参见图4)。

2.2Ad5F35-LMP2重组腺病毒纯化及PCR鉴定：

将病毒用MOI检测粗略估计上清中病毒颗粒的数量，以不同的MOI再感染293细胞，低熔点琼脂铺板，待出现空斑后，挑取单个克隆的病毒再分别感染293细胞，待细胞全部病变脱落后，对产生的病毒上清进行PCR鉴定，挑取PCR鉴定(同pShuttle-LMP2的PCR鉴定)正确的病毒株扩增进行后续实(参见图5)。

2.3重组腺病毒滴度的测定

TCID₅₀实验的基础是应用极限稀释法使293细胞出现病变从而估计滴度。细胞的准备：准备10ml含2％胎牛血清的DMEM重悬细胞，将细胞浓度调至1×10⁵/ml，接种于96孔细胞培养板，每孔加入100μl。细胞贴壁后，将上清弃去。病毒的稀释：第一管中加入0.9ml含2％胎牛血清的DMEM，其余则加入1.8ml。第一管中加入0.1ml病毒原液。上下抽吸5次使它们混匀。每一次稀释后都更换吸头。从第一管中吸取0.2ml加入第二管。重复这个稀释步骤直到最高稀释度。96孔板的每一排10孔作为一个稀释度。11，12列不加病毒作为阴性对照。实验孔每孔加入0.1ml不同稀释度病毒。把96孔板放在37℃，5％CO₂孵箱培养10天，观察病变。只要有一个小病变此孔即作为阳性对待，如果不易判断可跟阴性对照比较。最后按公式T＝10^1+d(s-0.5)计算病毒的滴度(d为稀释度的对数值，s为病变比例的和)。

检测结果显示，第五代病毒滴度达到4×10⁸PFU/ml。

2.4重组腺病毒感染的293细胞内LMP2基因的蛋白表达：

间接免疫荧光鉴定：收集Ad5F35-LMP2重组腺病毒感染的293细胞，用PBS洗涤两次，将合适浓度的细胞涂于细胞片上，丙酮固定，细胞孔用LMP2单抗覆盖，4℃孵育过夜，PBS洗，再分别覆盖荧光标记的羊抗大鼠IgG，37℃孵育60分钟，PBS洗，伊文氏蓝复染，甘油封片，显微镜下观察照相。可见图6A在病毒感染的细胞涂片中，细胞呈现绿色荧光，而图6B正常的293细胞涂片结果为阴性，表明LMP2在293细胞中得到有效表达(参见图6)。

2.5非复制型重组腺病毒的鉴定：

用上述上清液感染293细胞及Hela细胞，图7A Hela细胞无明显病毒复制导致的CEP现象，而图7B 293细胞受病毒感染出现细胞皱缩、变圆、脱落和死亡等典型细胞病变(CPE)，初步判断为重组复制缺陷型腺病毒株(参见图7)。

实施例3含LMP2序列的Ad5F35复制缺陷型重组腺病毒免疫原性检测

3.1Ad5F35-LMP2重组腺病毒免疫恒河猴后特异性CTL的检测

用Elispot方法检测针对LMP2的CTL：分别在0周，4周肌肉注射Ad5F35-LMP2重组腺病毒后采集肝素钠抗凝的静脉血，分离的PBMC细胞。在Elispot板中加入包被抗体，4℃孵育过夜。PBST洗，加入封闭液，37℃，1-2h。倒出孔中的封闭液体，加入静脉血分离的PBMC细胞，100微升/孔，细胞密度5×10⁵/孔。加入LMP2多肽，盖上盖子，37℃，5％CO2，100％湿度孵育36小时；甩掉孔中细胞，加入200μL/孔4℃的超纯水，冰上放置放置10分钟。PBST洗。加入生物素标记检测抗体。37℃孵育1h。PBST洗，加入GABA溶液，37℃孵育1h。PBST洗，加入新鲜制备的显色剂I/II溶液。室温黑暗下孵育15-30分钟。肉眼观察到清晰的斑点形成后，加入超纯水，洗涤两遍，终止反应。室温空气干燥板，倒置显微镜或者免疫斑点图像分析仪上观察计。结果显示肌肉注射Ad5F35-LMP2重组腺病毒后恒河猴体内产生了针对LMP2的CTL(参见表1)。

表1免疫恒河猴产生的针对LMP2的特异性CTL

动物编号	0周	8周	10周	12周
					1	1	137	126	110
2	0	160	178	158
					3	1	194	214	176
4	2	186	198	124
					5	0	56	68	58
6	1	41	47	36
					7	1	39	50	40
8	2	45	56	50
					9	0	18	20	12
10	1	23	26	20
					11	1	14	14	13
12	1	18	18	12

3.2Ad5F35-LMP2重组腺病毒免疫恒河猴后特异性抗体的检测

3.2.1脂质转染法将pSNAV-LMP2导入BHK-21细胞建立P815-LMP2抗性细胞系：

转染前一天传代BHK-21细胞于25cm2细胞培养瓶，培养基用不含抗生素、含5％FCS的DMEM。配制转染液：A液：pSNAV-LMP2质粒DNA 5μl和Opti-MEM培养基共250μl；B液：5μl LipofectamineTM2000和Opti-MEM培养液共250μl。B液室温放置5min，A和B液轻轻混匀，室温放置20min。吸弃旧细胞培养液，换2ml新鲜的不含抗生素、含5％FCS的DMEM，然后将A+B混合液加入培养细胞上，于37℃，5％CO2孵育8h，补充新鲜的10％胎牛血清的完全培养基37℃5％CO₂培养24小时，然后换为含800μg/mlG418的选择培养基，培养两周左右得到稳定的目的抗性阳性细胞。用LMP2兔血清多抗检测到P815-LMP2抗性细胞中LMP2的表达，挑取LMP2阳性细胞克隆扩增培养作为靶细胞。

3.2.2应用P815-LMP2抗性细胞，采用间接免疫荧光的方法检测中针对LMP2的抗体水平：收集P815-LMP2抗性细胞BHK-21细胞，用PBS洗涤两次，将合适浓度的细胞涂于细胞片上，丙酮固定，细胞孔用免疫后恒河猴血清覆盖，4℃孵育过夜，PBS洗，再分别覆盖荧光标记的羊抗猴IgG，37℃孵育60分钟，PBS洗，伊文氏蓝复染，甘油封片，荧光显微镜下观察。结果显示肌肉注射Ad5F35-LMP2重组腺病毒后恒河猴体内产生了针对LMP2的特异性抗体(参见表2)。

表2Ad5F35-LMP2免疫后恒河猴体内产生了针对LMP2的特异性抗体滴度

动物编号	0周	8周	10周	12周
					1	0	1∶10	1∶10	1∶5
2	0	1∶20	1∶10	1∶10
					3	0	1∶40	1∶40	1∶20
4	0	1∶20	1∶40	1∶20
					5	0	1∶5	1∶10	1∶5
6	0	0	1∶10	1∶5
					7	0	1∶5	1∶10	1∶5
8	0	0	1∶5	0
					9	0	0	0	0
10	0	1∶5	1∶5	0
					11	0	0	0	0
12	0	0	0	0

                            序列表

<110>曾毅

<120>含EB病毒潜伏膜蛋白2基因的Ad5F35-LMP2重组腺病毒疫苗

<130>

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1968

<212>DNA

<213>EB病毒

<220>

<221>基因组DNA

<222>(1)..(1968)

<223>

<400>1

cgctgctgca gctatggggt ccctagaaat ggtgccaatg ggcgcgggtc cccctagccc    60

cggcggggat ccggatgggt acgatggcgg aaacaactcc caatatccat ctgcttctgg    120

ctcttctggg aacaccccca ccccaccgaa cgatgaggaa cgtgaatcta atgaagagcc    180

cccaccgcct tatgaggacc catattgggg caatggcgac cgtcactcgg actatcaacc    240

actaggaacc caagatcaaa gtctgtactt gggattgcaa cacgacggga atgacgggct    300

ccctccccct ccctactctc cacgggatga ctcatctcaa cacatatacg aagaagcggg    360

cagaggaagt atgaatccag tatgcctgcc tgtaattgtt gcgccctacc tcttttggct    420

ggcggctatt gccgcctcgt gtttcacggc ctctattagt accgttgtga ccgccaccgg    480

cttggccctc tcacttctac tcttggcagc agtggccagc tcatatgccg ctgcacaaag    540

gaaactgctg acaccggtga cagtgcttac tgcggttgtc actttctttg caatttgcct    600

aacatggagg attgaggacc caccttttaa ttctcttctg tttgcattgc tggccgcagc    660

tggcggacta caaggcattt acgttctggt gatgcttgtg ctcctgatac tagcgtacag    720

aaggagatgg cgccgtttga ctgtttgtgg cggcatcatg tttttggcat gtgtacttgt    780

cctcatcgtc gacgctgttt tgcagctgag tcccctcctt ggagctgtaa ctgtggtttc    840

catgacgctg ctgctactgg ctttcgtcct ctggctctct tcgccagggg gcctaggtac    900

tcttggtgca gcccttttaa cattggcagc agctctggca ctgctagcgt cactgatttt    960

gggcacactt aacttgacta caatgttcct tctcatgctc ctatggacac ttgtggttct    1020

cctgatttgc tcttcgtgct cttcatgtcc actgagcaag atccttctgg cacgactgtt    1080

cctatatgct ctcgcactct tgttgctagc ctccgcgcta atcgctggtg gcagtatttt    1140

gcaaacaaac ttcaagagtt taagcagcac tgaatttata cccaatttgt tctgcatgtt    1200

attactgatt gtcgctggca tactcttcat tcttgctatc ctgaccgaat ggggcagtgg    1260

aaatagaaca tacggtccag tttttatgtg cctcggtggc ctgctcacca tggtagccgg    1320

cgctgtgtgg ctgacggtga tgtctaacac acttttgtct gcctggattc ttacagcagg    1380

attcctgatt ttcctcattg gctttgccct ctttggggtc attagatgct gccgctactg    1440

ctgctactac tgccttacac tggaaagtga ggagcgccca ccgaccccat atcgcaacac    1500

tgtataaaga atgcccacca gatcgcctgc cacttccaca gcaatggctc ggatgcctgg    1560

cgctttgcta tgaattatcc aagaaacccc acggagcagg gcaacattgc agggctctgt    1620

tcacgcgatg gtcgtcatct ggctctcctg tgtgacccct cactttgtac agacttttgg    1680

caatgggagc acattccccc cgcctttggg caccccacgg ggtgctcccc ctggacactt    1740

atgtttcaag cagctcacct atggtcactc aggcacggtc gcccctccga gtgaccagtc    1800

accttccaga ctatgcatac actgaattta gcctgatatt gtccccctag ccccgggccc    1860

agccctcctc acaaaactcg tcatggagaa gctggacgtg aacctccccc ccagacctgt    1920

gtgctgtatt tacaaacact acaataaacc caatgtgcaa aaaaaaaa                 1968

Claims (10)

1.一种用于预防和/或治疗EB病毒相关肿瘤的重组腺病毒疫苗，其中包含一种复制缺陷型重组腺病毒以及一种或多种药物学上可接受的载体，其中所述的复制缺陷型重组腺病毒是含有EB病毒潜伏膜蛋白2编码基因的复制缺陷型腺病毒载体。

2.权利要求1所述的重组腺病毒疫苗，其中所述的复制缺陷型腺病毒载体为Ad5F35型腺病毒载体。

3.一种复制缺陷型重组腺病毒，该重组腺病毒为含EB病毒潜伏膜蛋白2编码基因的Ad5F35型复制缺陷型腺病毒载体。

4.一种制备权利要求3限定的复制缺陷型重组腺病毒的方法，该方法包括：

(1)将编码LMP2蛋白质的DNA序列克隆到适当的腺病毒穿梭质粒中，得到携带LMP2之DNA编码序列的重组腺病毒穿梭质粒；

(2)用步骤1的重组穿梭质粒和腺病毒骨架质粒共转染适当的宿主细胞；

(3)在适当条件下使步骤2的重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒进行同源重组，得到携带LMP2之DNA编码序列的重组腺病毒载体；

(4)将步骤3的重组腺病毒载体导入适当的腺病毒包装细胞，得到所需的复制缺陷型重组腺病毒。

5.根据权利要求3的方法，其中所述的腺病毒穿梭质粒是质粒pShuttle-CMV。

6.根据权利要求3的方法，其中所述的宿主细胞是大肠杆菌BJ 5183。

7.根据权利要求3的方法，其中所述的重组腺病毒骨架质粒是质粒pAd5F35。

8.根据权利要求3的方法，其中所述的腺病毒包装细胞是293细胞。

9.权利要求1所述重组腺病毒疫苗或权利要求3所述复制缺陷型重组腺病毒在制备用于治疗和/或预防EB病毒相关肿瘤的药物中的用途。

10.权利要求9所述的用途，其中所述的EB病毒相关肿瘤为鼻咽癌。

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